用于维持近交动物品系遗传稳定性的方法

摘要

本发明提供了维持非－人动物近交系遗传稳定性的新方法。该方法中，产生了源自原代群体的追踪－谱系的冷藏胚胎且以合适的时间间隔用于重建原代群体。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2003年8月22日提交的美国临时申请60/497,451的优先权；此处全文引入该申请作为参考。

政府基金

此处所述工作完全或部分地由来自国家癌症研究所，NIH的拨款No.R01-GM020919资助。美国政府享有本发明的相应权利。

发明背景

实验动物可用作研究人类疾病的有效模型。转基因和靶突变技术的发展使得小鼠不仅成为用于人基因组分析的成功的替代生物体，而且成为研究人类疾病的遗传学和发病原理最有价值的模型系统。对获自小鼠研究的实验结果的正确解释依赖于所用的小鼠模型是遗传上纯种并且明确界定的保证。为此，研究人员一般利用近交系用于试验，因为这些小鼠与远交小鼠原种不同，其提供基因型的均一性和恒定性。近交系小鼠可以纯合的实验个体重复获得，其具有可预计的表型和既定的等位基因组成。

然而，由于新突变的出现以及与残留杂合性的连续等位基因固定的逐步积累，近交系小鼠中基因型的恒定性还未曾完全实现。近交小鼠内基因型的这些变化称作遗传漂变。在每个世代，都有自发新突变产生的可能性。这些突变最初以杂合突变存在。当近交系的两个原代碰巧成为一个自发突变的纯合子时，该突变就在该近交系中固定，随后所有该近交小鼠品系的后代将携带该突变。

作为自发突变增长的结果，遗传漂变将影响对源自一个近交系的动物进行的遗传分析。对利用近交动物生成的实验数据的正确解释受到遗传漂变的破坏。最近的出版物例举了这一点。在2001，Specht和Schoepfer发现C57BL/6JOlaHsd小鼠中(参见Specht和Schoepfer，Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6Jinbred mice，BMC Neurosci.2，11(2001))的染色体缺失。该突变为超过79kb的α-共核蛋白(synuclein)位点的切除。该基因编码突触前终脑蛋白，其与帕金森和阿尔茨海默疾病的病因有关。许多研究人员已将C57BL/6JOlaHsd小鼠作为野生型对照用于他们的实验或者与其他的突变体回交，而没有意识到该问题。现在他们的试验结果需要根据该品系中存在的α-共核蛋白缺失而重新评估。参见Wotjak，C57Black/Box？The importance of exact mouse strain nomenclature，Trends in Genetics 19：183-184(2003)。

此外，研究人员常常需要比较很长时期内获自近交动物的数据。由于遗传漂变的影响，随着时间的推移，在较早的时间点近交系小鼠变得在遗传上不同于“同样的”近交小鼠。时间间隔越长，则遗传学差异越可能积累且固定。遗传漂变的存在因此破坏了很长时期内进行有效比较的能力。

为此，需要在近交动物品系中减少遗传漂变并且长时间维持其遗传稳定性。本领域中急需用于维持近交动物品系遗传稳定性的方法。在此提供了所述方法。

发明概述

本发明提供了维持非-人动物近交小鼠品系遗传稳定性的新的方法。在本发明中，维持了纯种原代群体用于获得近交小鼠品系。该近交小鼠品系的原代群体源自单一的兄妹交配个体。每年两次至四次，从该原代群体选择新的兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建克隆。利用该方法，由于随着时间的过去在近交小鼠品系中自发突变的累积以及等位基因的固定，现今的原代群体将在遗传上不同于今后数年的原代群体。

申请人设计了通过产生源自原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种以及利用该原种以合适的时间间隔重建原代群体而限制近交小鼠的遗传漂变以及维持遗传稳定性的新方法。冷藏原种作为该原代群体的贮藏库且利用该冷藏原种定期重建原代群体降低了在既定时期内的世代数目且因此有效地降低了遗传漂变的实际比率。由于原种中每个胚胎的谱系是已知的，可以选择性地仅恢复兄-妹配偶的胚胎。因此，该近交小鼠品系通过连续的兄-妹交配，保持该小鼠品系完整的近交状态而繁殖。该方法可以合适的时间间隔重复，由此允许维持具有有限遗传漂变的近交小鼠品系而不影响该品系近交状态。

通过获得和冷藏来自源自原代群体的兄-妹配偶的胚胎而产生冷藏胚胎的追踪-谱系的原种。可通过该兄-妹配偶交配而获得胚胎。可通过交配(性交)或通过体外或体内的人工方法产生胚胎。人工方法包括，但不限于，人工受精、体外或体内的成熟卵细胞的体外受精、胚胎移植、胞质内精子注射、无性繁殖、受精卵细胞的体外培养和胚胎分裂等等。

该追踪-谱系的冷藏原种也可以是胚胎干细胞的原种、配子的原种或前-配子的原种。配子、前-配子或胚胎干细胞源自近交小鼠品系的原代群体。上述冷藏原种可用作原代群体的冷冻贮藏库以维持近交系的遗传稳定性。本发明提供了产生追踪-谱系的冷藏原种的方法以及利用该原种维持近交系遗传稳定性的方法。

本发明还提供了冷藏的非-人动物胚胎、配子、前-配子或胚胎干细胞的追踪-谱系的原种。每个这些原种源自一个近交系的原代群体。追踪并记录每个品系各自胚胎、配子、前-配子或胚胎干细胞的谱系以允许在将来有选择的恢复。

申请人进一步提供了遗传稳定的非-人动物近交小鼠品系，其通过此处所述方法制得。非-人动物可以是啮齿类，例如大鼠或小鼠。

申请人进一步提供了用于进行提供遗传稳定的非-人动物近交系的业务的方法。根据本发明，原代群体用于近交系的维持，并且产生源自该原代群体的胚胎的追踪-谱系的冷藏原种。以合适的时间间隔，选择源自单一兄-妹配偶的兄-妹胚胎对且由该同胞胚胎产生活的动物。从产生的动物中选择兄-妹配偶且用作新的原代配偶以重建原代原种。根据顾客的要求，提供给顾客遗传稳定的近交小鼠品系的一个或多个动物。

这些方法的进行使得有可能维持具有有限遗传漂变的近交系而不影响该品系的近交状态。因此，动物研究人员可得到具有长时期明确-界定基因型的真正遗传均一的近交动物，其非常有助于进行正确的数据解释和有价值的数据比较。

附图简述

该附图显示了生成足够数量源自原代群体的追踪-谱系的胚胎以产生用于维持近交系遗传稳定性的追踪-谱系的冷藏胚胎的示意图。

发明详述

本发明提供了维持非-人动物近交系遗传稳定性的新方法。如此处所述的，近交动物品系的遗传稳定性通过产生源自原代群体的追踪-谱系的冷藏胚胎并且以合适的时间间隔用此重建原代群体而维持。该方法的使用降低了既定时期内传代的次数并且因此降低了遗传漂变的风险。由于每个冷藏胚胎的谱系是已知的，可以选择性地仅恢复兄妹的胚胎，即源自相同父母。因此，该近交小鼠品系通过持续的兄-妹交配，保持该小鼠品系完整的近交状态而进行繁殖。

I.利用冷藏胚胎维持遗传稳定性：

本发明提供了维持非-人动物近交系遗传稳定性的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(1)培养近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔选择近交配偶的冷藏胚胎，并且从该胚胎产生活的动物；(4)从产生的动物中选择近交配偶对且利用该配偶作为新的原代配偶以产生该品系的动物；和(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)。如此，该近交小鼠品系的遗传漂变减到最低程度并且该品系的遗传稳定性得以有效维持。

如此处使用的术语″遗传稳定性″指和如果利用现行的方法维持近交系将出现的遗传漂变相比，近交系中的遗传漂变得以有效降低。遗传漂变有效降低指近交系中基因型改变的降低。取决于基因组中发生的改变，该基因型的改变可能或未必引起表型的改变。例如，基因组非编码区中的突变可能导致动物表型的无变化。重要的是，在该遗传稳定性方案下维持的品系的原代种中发生的突变将不会在该品系中持续，因为其将随冷藏胚胎的解冻以及利用其作为新的原代种而从全部的动物群体中被清除。遗传漂变可通过检验各种指数，包括，例如毛色、生化和免疫标记同工酶、主要组织相容性复合体(MHC)、红细胞抗原、溶血补体(Hc-前C5)、尾部植皮以及行为改变而评价。遗传漂变也可以通过利用现有技术中任何可用的技术包括，例如双向蛋白质凝胶、PCR、SNPs、基因表达图谱和测序检验各种分子标记而评价。

通过引起杂合性降低的可控制的育种方案产生近交系。可接受的育种方案包括：亲-子交配和兄-妹交配。近交系一般通过兄弟与姐妹10或更多连续世代的交配产生。近交系第10代或其后代中的动物可追溯到单一的祖先配偶。在一个优选的实施方案中，近交系通过兄弟与姐妹20或更多连续世代的交配产生，且第20代或其后代中的动物可追溯到单一的祖先配偶。

如此处使用的术语″近交配偶″指任何其交配引起杂合性降低的配偶。近交配偶可以是亲-子对或兄-妹配偶。在一个优选的实施方案中，近交配偶是兄-妹配偶。为了便于说明，兄-妹配偶将用作贯穿整个申请的例证以描述本发明。然而，本领域的技术人员将意识到在本申请中亲-子配偶可代替兄-妹配偶。

a.近交系的原代群体的维持

利用本领域熟知的技术维持近交小鼠品系的原代群体。如此处使用的，术语″原代群体″指该品系所有后代的动物都源于其的群体。原代配偶为近交配偶，其产生特定品系的所有后代动物。原代选自该原代群体。

非-人动物优选啮齿类，例如大鼠或小鼠。非-人动物也可以是仓鼠、豚鼠、马、猪、山羊、绵羊、鸡、火鸡、灵长类或用于培养近交小鼠品系的任何其他的非-人动物。

近交小鼠品系包括但不限于129S1、129T2、129X1、129P3、129P1、A、AKR、BALB/c、C3H、C57BL/10、C57BL/6、C57BLKS、C57BR/cd、C57L、CBA、DBA/1、DBA/2、FVB、MRL、NOD、SJL、SWR、NOR、NZB、NZW、RBF、BUB、I、LP、NON、P、PL、RIIS、SM、C58、ALR、ALS、BPH、BPL、BPN、DDY、EL、KK、LG、MA、NH、NZM2410、NZO、RF、SB、SEA、SI、SOD1、YBR和每个这些小鼠品系的所有近交亚系。公认的小鼠品系命名惯例要求每个品系通过在其品系代码的末尾添加实验室代码而进一步标识，实验室代码的当前列表通过维持世界实验室代码登记的实验动物研究机构维持，且可在http://dels.nas.edu/ilar/codes.asp登录。

如此处使用的术语″亚系″指相同的小鼠品系内彼此遗传不同的群体。当同样的近交系的两个群体已经分离超过10个世代时可能出现亚系，或者当已知同样的品系的分离群体之间存在遗传差异时可能出现。不同亚系之间的遗传差异可能是祖先在分离的时候残留的杂合性固定的结果，和/或在随后的世代中自发突变的结果(遗传漂变)。亚系的实例包括但不限于，129S1/SvImJ、129T2/SvEmsJ、129X1/SvEmsJ、129X1/SvJ、129P3/J、A/J、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/6J、CBA/CaHN-Btkxid/J、CBA/J、DBA/1J、DBA/1LacJ、DBA/2J、FVB/NJ、MRL/MpJ、NOD/LtJ、SJL/J、SWR/J、NOR/LtJ、NZB/B1NJ、NZW/LacJ、RBF/DnJ、129S6/SvEvTac、AJTAC、BALB/cAnNTac、BALB/cJBomTac、BALB/cABomTac、C57BL/6NTac、C57BL/6JBomTac、C57BL/10SgAiTac、C3H/HeNTac、CBA/JBomTac、DBA/1JBomTac、DBA/2NTac、DBA/2JBomTac、FVB/NTac、NOD/MrkTac、NZM/AegTac、SJL/JcrNTac、BALB/cAnNCrlBR、C3H/HeNCrlBR、C57BL/6NCrlBR、DBA/2NCrlBR、FVB/NCrlBR、C.B-17/IcrCrlBR、129/SvPasIcoCrlBR、SJL/JorlIcoCrlBR、A/JolaHsd、BALB/cAnNHsd、C3H/HeNHsd、C57BL/10ScNHsd、C57BL/6NHsd、CBA/JCrHsd、DBA/2NHsd、FVB/NHsd、SAMP1/KaHsd、SAMP6/TaHsd、SAMP8/TaHsd、SAMP10/TaHsd、SJL/JCrHsd、AKR/OlaHsd、BiozziABH/RijHsd、C57BL/6JOlaHsd、FVB/NhanHsd、MRL/MpOlaHsd、NZB/OlaHsd、NZW/OlaHsd、SWR/OlaHsd、129P2/OlaHsd和129S2/SvHsd。

近交小鼠品系还包括通过任何转基因的、基因敲除或siRNA(小干扰RNA)或将来的遗传操作技术产生的所有品系，其已经过兄弟与姐妹交配10或更多的连续世代。

b.产生冷藏胚胎的追踪-谱系的原种

如此处所述，本发明的一个方面涉及产生源自原代群体的冷藏动物胚胎的追踪-谱系原种的方法。

追踪-谱系的原种为其中该原种中每个胚胎的谱系已知的原种。胚胎的谱系可通过沿着胚胎的家谱并且记载该家谱的信息而追踪。例如，每个胚胎可用其谱系信息独立标记。或者，同胞胚胎可以一起物理保藏和标记。如此处使用的术语″同胞胚胎″指源自单个兄-妹配偶(或一个近交配偶)交配的胚胎。冷藏胚胎可通过本领域技术人员所知的方法保藏。在一个实施方案中，冷藏胚胎保藏在无菌的塑料受精管中。每个管仅包含同胞胚胎。一个管可能仅包含一个胚胎或可能包含多个同胞胚胎。或者，冷藏胚胎可以保藏在其他合适的容器例如塑料小瓶或玻璃安瓿瓶中。

本发明追踪-谱系的原种的胚胎可以是能被成功冷藏和恢复产生活动物的任何阶段的胚胎。所述胚胎包括从受精卵到胚泡的移植前胚胎的所有阶段。因此，本发明的胚胎可以是，例如单细胞的胚胎(受精卵)、双细胞胚胎、四细胞胚胎、八细胞胚胎、桑椹胚或胚泡。桑椹胚是单细胞胚胎裂解产生的球状细胞团块；胚泡由桑椹胚发育而来且具有囊胚腔和不对称位置的细胞簇，内细胞团。

如此处使用的术语″冷藏″指被冷冻。本发明的细胞、胚胎、配子或前-配子在通常低于0℃的温度下冷冻。例如，-80℃可用于短期保藏，而-196℃或更低温度可用于长期保藏。本发明中的细胞、胚胎、配子或前-配子可以冷藏不定长度的时间。用于冷藏的方法和设备是本领域技术人员熟知的。参见，例如美国专利5,160,312,题为″CryopreservationProcess for Direct Transfer of Embryos″，Glenister和Hall，″Cryopreservation and rederivation of embryos and gametes″，in MouseGenetics & Transgenics：A Practical Approach，2^nd Edition(I Jackson &CAbbott，eds.)Oxford Univ.Press，Oxford，pp.27-29。

如此处使用的″源自原代群体的胚胎″包括直接获自原代配偶的胚胎和获自原代配偶子代的胚胎。

需要冷藏的胚胎数目取决于许多因素，包括例如维持遗传稳定性方案所经过的持续时间、冷藏原种用于重建原代群体的频率以及从冷藏胚胎产生活的动物的效率。这些因素在不同的动物种类中和在相同动物种类的不同品系中不同。例如，已知来自不同近交系的小鼠在冷藏胚胎的回收率方面有差异。

产生所需胚胎数所要求的雌性动物数目也将不同。所需雌性动物的数目与可从每个雌性获得的卵细胞数目、受精卵细胞的比例以及胚胎转移后发育至分娩期的胚胎比例负相关。因此，所需雌性的数目是每个步骤效率的函数。每个步骤的高效率降低了所需雌性的总数。

在一个实施方案中，冷藏胚胎的追踪-谱系的原种可通过首先从原代群体的兄-妹配偶(原代配偶)获得胚胎，随后冷藏该胚胎而产生。追踪和记载谱系信息以使每个冷藏胚胎具有确切的谱系。在该实施方案中，胚胎通过原代配偶交配直接产生。因此，该追踪-谱系的原种仅包括同胞胚胎。

或者，首先扩大原代群体以产生足够多数量的兄-妹配偶。因此，在另一实施方案中，源自原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种可由下方法产生：(1)从原代群体获得子代以使该子代包括合适数量的兄-妹配偶；(2)从获自(1)的子代中的兄-妹配偶产生胚胎；以及(3)冷藏(2)中产生的胚胎。追踪和记载谱系信息以使每个冷藏胚胎具有确切的谱系。该实施方案中产生的追踪-谱系的原种包括源自将超过一个兄-妹配偶交配获得的胚胎。

两对之间只要雄性或雌性不同，则一个兄-妹配偶就不同于另一对。例如，雄性A和雌性B与雄性A和雌性C以及雄性D和雌性B不同。如此处使用的″子代″指源自原代配偶动物的世代，包括，例如F1、F2、F3和F4世代。″不同兄-妹配偶的合适数目″是为了创建冷藏原种以维持近交系遗传稳定性而生成足够数量胚胎的数目。

从原代群体获得子代可通过本领域技术人员所知的育种技术实现，包括，例如自然交配、人工受精和体外受精。

可通过兄-妹原代配偶交配而获得胚胎。如此处使用的″交配″指雌雄配子的结合以发生受精。所述结合可通过交配(性交)或体外或体内的人工方法完成。人工方法包括但不限于，人工受精、体外受精、胚胎移植、胞质内精子注射、无性繁殖、受精卵细胞的体外培养和胚胎分裂。可利用产生合适时期胚胎的任何方法。

人工受精是通过精子的人工注射或施用而对雌性动物受精的方法。在上述方法中，受精的时候并不需要雄性动物，精子从之前的动物获得。参见Wolfe，1967以及Sato和Kumura，2002。当通过自然交配或人工受精完成交配时，可通过交配和人工受精后冲洗雌性的输卵管或子宫获得胚胎。参见Hogan等，2003。胚胎分裂技术为本领域技术人员熟知。胚胎分裂可通过，例如用显微操作或类似的方法分裂正常的胚胎(从2细胞到桑椹期)进行。

体外受精(IVF)也是本领域熟知的。参见，例如Hogan等.，Manipulating the Mouse Embryos，A Laboratory Manual，2^nd Ed.Page146-147(1994)。IVF通常包括分别从雌性和雄性收集卵细胞和精子、将来自雌性的卵细胞用来自雄性的精子受精且为了受精卵到胚胎的发育，在适宜条件下培养得到的受精卵。可在不同阶段收集胚胎。在卵细胞收集用于IVF之前雌性可以超排卵。参见，例如Hogan等，2003。如此处所述的，卵细胞和精子从兄-妹配偶获得。IVF可以是提高从单个雌性获得的胚胎数目的有效方法。

胞质内的精子注射(ICSI)可用于提高受精率。ICSI方法包括通常通过玻璃吸管除去卵细胞周围的卵丘细胞以及将精子注入卵细胞。参见Kimura和Yanagimachi，1995。

作为从雌性收集用于IVF的成熟卵细胞的一个选择，可获得未成熟的卵细胞且允许其体外成熟，称为“体外成熟”技术。哺乳动物中，未成熟卵细胞仅小部分发育为成熟卵细胞，其他的退化和死亡。通过从动物分离未成熟的卵细胞且允许其体外成熟，可以从给定的雌性获得更多的适于IVF的卵细胞。哺乳动物卵细胞经受体外成熟是已知的。至于小鼠、牛及其他哺乳动物，体外成熟的卵细胞已在体外受精且当将胚胎转入合适的子宫时产生正常健康的后代(Schroeder和Eppig1984 Dev.Biol.102：493；Sirard等.1988，Biol.Reprod.39：546)。体外成熟技术在本领域为大家所熟知。参见，例如Chiu等.，Effects ofMyo-inositol on the in-vitro Maturation and Subsequent Development ofMouse Oocytes，Human Reprod.18：408-416(2003)和O′Brien等.，ARevised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes fromPrimordial Follicles Dramatically Improves Their DevelopmentalCompetence，Biol.Reprod.68：1682-1686(2003)。

在另一选择中，可从″宿主″雌性收集卵细胞，之前来自所需雌性的卵巢部分已经植入其中。所需的雌性来自源于原代群体的兄-妹配偶的妹，需要其卵细胞用于IVF。此通过从兄-妹配偶的妹采集卵巢、亚-分割该卵巢为几部分、通过对宿主雌性的外科手术将每部分植入切除卵巢的或是经化学或遗传学处理的宿主雌性，以及从每个宿主雌性收集卵细胞而完成。该方法产生更多获得用于所给雌性的卵细胞。

c.从冷藏胚胎的原种产生活的动物

在合适的时间间隔，选择冷藏的同胞胚胎且从这些同胞胚胎产生活的动物。在一个实施方案中，活的动物从一组同胞胚胎中产生。在另一个实施方案中，活的动物从超过一组以上的同胞胚胎中产生。

从冷藏胚胎产生活的动物可利用本领域技术人员所知的技术进行。在一个实施方案中，活的动物通过以下从冷藏胚胎产生：(1)解冻冷藏胚胎；(2)将解冻的胚胎植入至少一个假孕雌性受体中；和(3)在适于产生活的动物的条件下培养假孕雌性受体。由此，产生活的动物。

如此处使用的术语″解冻″指提高冷藏材料温度的过程。解冻冷藏材料的方法，即能在解冻过程后产生活的动物的方法是本领域技术人员熟知的。

如此处使用的关于胚胎的术语″植入″指一个或多个胚胎向具有此处所述胚胎的雌性动物的移植。假孕雌性受体是即使自身的未受精的卵退化，其生殖道也能接纳所移植胚胎的雌性动物。假孕雌性动物例如通过雌性和不育雄性交配生成。植入假孕雌性的技术是本领域技术人员熟知的。参见，例如，Recovery，Culture and Transfer of Embryos inHogan等，Manipulating the Mouse Embryos，A Laboratory Manual，2^ndEd.Page170-181。胚胎可以在子宫内发育，或者胎儿可在分娩之前从子宫环境移走。

d.从产生的活的动物中选择新的原代配偶

从步骤(c)产生的活的动物选择兄-妹配偶成为新的原代配偶以重建原代群体。小鼠品系中所有后代动物将源自该新的原代配偶，直至重复如下节所描述的利用冷藏原种重建原代群体的过程。

可随机选择兄-妹配偶作为原代配偶。或者，可通过表型筛选、基因型筛选或两者相结合的方法选择原代配偶。表型筛选可通过例如毛色和行为改变的外观检查而进行。表型筛选也可通过肌肉握力的定量分析、在有或没有呼吸刺激时呼吸速率、潮气量及其他呼吸指数的自由测定、同时进行CO₂产量、O₂吸收量、食物和进水量、运动活力和昼夜节律模式的测定、临床化学检验和血液化学检验、组织样品的表达特征而进行。基因型筛选可通过检验各种指数，包括，例如生化和免疫标记同工酶、主要组织相容性复合体(MHC)、红细胞抗原、溶血补体(Hc-前C5)、微卫星和单核苷酸多态性(SNP)而进行。基因型筛选可通过现有技术中的任何可用技术，包括例如PCR和测序进行。

e.重复步骤(c)-(d)

以合适的时间间隔，重复从追踪-谱系的原种产生活的动物以及选择兄-妹作为新的原代配偶的过程。″合适的时间间隔″是用于利用冷藏原种重建原代群体从而维持近交系遗传稳定性的时间间隔。对于一个品系，可以凭经验确定合适的时间间隔，例如通过对该品系中遗传漂变速率的评估。由此确定的合适的时间间隔在不同的近交动物种类中和在相同动物种类内不同品系中不同。或者，合适的时间间隔可以是之前定义的时间间隔。合适的时间间隔可以是1至40间的任何世代数，例如举例来说，每个世代、每5个世代、每10个世代每20个世代或每40个世代。

本发明的另一个方面涉及维持一个近交动物品系遗传稳定性的方法。该方法包括从源自近交系原代群体的追踪-谱系的原种的冷藏胚胎产生活的动物、利用选自该活的动物的兄-妹配偶作为新的原代配偶以及以合适的时间间隔重复该过程。

本发明另一个方面还提供了源自原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种。该谱系-原种可通过此处所述的任何方法或这些方法的任何改变的方法产生。上述追踪-谱系的冷藏胚胎可以合适的时间间隔用于重建原代群体。在一个实施方案中，追踪-谱系的冷藏胚胎仅包括通过将兄-妹原代配偶交配获得的胚胎。在另一个实施方案中，追踪-谱系的冷藏胚胎包括通过将源自原代群体的超过一对兄-妹配偶交配获得的胚胎。

此外，本发明的一方面涉及通过此处所述方法制得的遗传稳定的非-人动物近交系。

本发明更进一步的方面提供了供应具有有限遗传漂变的非-人动物近交系的经营方法。该方法包括：(1)培养近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔，选择同胞的冷藏胚胎并且从该胚胎产生活的动物；(4)从所产生的动物选择兄-妹配偶并且利用其作为新的原代配偶以得到该品系将来的动物；(5)以合适的时间间隔重复步骤(1)至(4)和(6)根据客户订货单给顾客提供动物。

II.利用冷藏配子或前-配子原种维持遗传稳定性

为了维持近交系的遗传稳定性，或者，使用源自近交系的原代群体的胚胎、配子或前-配子用以创建追踪-谱系的原种。

因此，本发明提供了维持近交系遗传稳定性的方法，包括(1)维持近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏配子或前-配子的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔，选择获自单一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其产生活的动物；(4)从所得的动物选择兄-妹配偶并且利用其作为新的原代配偶以产生该品系将来的动物；和(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)。

此处使用的术语″配子″指能促使新的二倍体个体生成的任何雄性或雌性生殖细胞。配子的实例为精子和卵细胞。配子可存在于获自动物的液体、组织和器官中(例如，精子存在于精液中)。

术语″前-配子″包括能产生配子的任何前体细胞。这种前体细胞可以是配子的祖细胞。精子的祖细胞包括，但不限于，原生殖细胞、精原细胞(包括A1、A2、A3和A4型精原细胞)、精原细胞干细胞、中间型精原细胞、B型精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精细胞。卵细胞的祖细胞包括，但不限于，原生殖细胞、卵原细胞、初级卵细胞和次级卵细胞。上述前体细胞也可以是胚胎干细胞，其能产生配子。参见，例如Hubner等，Science 300：1251-6(2003)。术语″前-配子″也指能产生配子的任何细胞、组织或器官，包括例如，卵巢和睾丸。

原生殖细胞是能成为生殖细胞的二倍体体细胞。原生殖细胞可例如从生殖嵴分离。生殖嵴是正发育胚胎已知确定的区域，且是本领域技术人员熟知的。参见，例如Strelchenko，1996，Theriogenology 45：130-141和Lavoir 1994，J.Reprod.Dev.37：413-424。

本发明的一个方面涉及产生源自原代群体的冷藏配子或前-配子的追踪-谱系原种的方法。

利用对胚胎原种相同的考虑确定创建用于维持遗传稳定性追踪-谱系的原种所需的配子或前-配子数目。同样地，基于如上所述对上下文中胚胎原种相同的考虑，确定产生足够数目原种的配子或前-配子所需的动物数。由此，配子或前-配子可直接从原代配偶中获得。或者，对于胚胎原种，原代群体首先扩大至产生足够数量的不同的兄-妹配偶，并且随后可从这些兄-妹配偶中获得配子和前-配子。

配子和前-配子获自活的动物或胚胎的兄-妹配偶。获得配子或前-配子的技术在本领域是已知的。参见，例如Ogura和Yanagimachi，1995，以及Kubota等，2003。

配子和前-配子可利用本领域已知的任何方法冷藏。参见，例如美国专利5,758,763，题为″Methods for Cryopreservation of Primordial GermCells and Germ Cells″，美国申请20020131957，题为″Cryopreservation ofSperm″，Sztein等，Biol.Reprod.58：1071-1074(1998)以及Candy等，2000。

追踪-谱系的配子或前-配子原种是原种内每个配子或前-配子的谱系已知的原种。配子或前-配子的谱系可通过沿着其谱系并且记载该谱系的信息而追踪。例如，每个配子或前-配子可用其谱系信息独立标记。另一个实例，来自单一个体的配子或前-配子可以物理保藏并且标记为同胞组。如此，可以仅选择获自单一兄-妹将来配偶的配子或前-配子。例如，配子可以使得能够仅选择来自特定雌性的卵细胞以及来自该雌性兄弟的精子的方式保藏。

以合适的时间间隔，可以选择获自单一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其产生活的动物。冷藏的前-配子可经解冻并且在适宜条件下培养以使前-配子产生配子，其随后经体外受精而产生活的动物。

在一个实施方案中，卵细胞收集自超排卵的雌性并且冷藏。精子收集自各自的雄性同胞并且冷藏。以合适的时间间隔，解冻来自同胞的卵细胞和精子并且通过IVF用于产生胚胎。将得到的胚胎移植入假孕受体以产生后代。

本发明的另一个方面涉及维持一个近交动物品系遗传稳定性的方法。该方法包括从源自近交系原代群体的追踪-谱系的原种的冷藏配子或前-配子产生活的动物、利用选自该活的动物的兄-妹配偶作为新的原代配偶并且以合适的时间间隔重复该过程。

本发明另一个方面还提供了源自原代群体的冷藏配子或前-配子的追踪-谱系的原种。这种追踪-谱系的原种可以合适的时间间隔用于重建原代群体。

本发明另一方面涉及通过此处所述方法制得的遗传稳定的非-人动物近交系。

本发明更进一步的方面提供了供应具有有限遗传漂变的非-人动物近交系的经营方法。该方法包括：(1)维持近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏配子或前-配子的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔选择获自单一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其产生活的动物；(4)从所得的动物中选择兄-妹配偶并且利用其自作为新的原代配偶以产生将来的该品系的动物；和(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)；和(6)根据客户订货单给顾客提供小鼠。

III.利用冷藏的ES细胞原种维持遗传稳定性

为了维持近交系的遗传稳定性，作为一个选择，使用源自近交系的原代群体的胚胎、胚胎干细胞用以创建追踪-谱系的原种。

因此，本发明提供了维持近交系遗传稳定性的方法，包括(1)培养近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间间隔选择获自单一兄-妹配偶的冷藏的胚胎干细胞，并且由其产生活的动物；(4)从所得的动物中选择兄-妹配偶并且利用其作为新的原代配偶以产生将来的该品系的动物；和(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)。

胚胎干细胞(ES细胞)是分离自胚胎的多能细胞。ES细胞可在有或没有饲养细胞时体外培养。ES细胞可从分离自早期胚胎，主要来自胚泡阶段胚胎的胚细胞建立。用于ES细胞确立和培养的方法是本领域技术人员熟知的。参见，例如1997年10月9日公开的WO97/37009，题为″Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derived from UngulateEmbryos，″Stice和Golueke，以及Yang & Anderson，1992，Theriogenology 38：315-335，两者在此处全文引入作为参考。此处使用的术语″胚胎干细胞″或″ES细胞″包括ES细胞系。

追踪-谱系的原种的ES细胞可通过从原代群体的兄-妹配偶交配而产生的胚胎获得。所述技术为本领域技术人员熟知。随后冷藏ES细胞并且以允许仅选择获自单一兄-妹配偶的ES细胞的方式保藏。优选该ES细胞在早期传代时，例如举例来说，3-20代内冷藏。

用于创建维持遗传稳定性的追踪-谱系的原种所需的ES细胞冷冻单位数取决于许多因素，包括例如，将要维持遗传稳定性所经过的持续时间、该冷藏原种用于重建原代群体的频率、从冷藏ES细胞产生活的动物的效率以及ES细胞产生完全来自该ES细胞的活的动物的效率。这些因素不仅在不同的动物种类中而且在相同动物种类的不同品系中不同。

ES细胞可从原代配偶交配而得到的胚胎中获得。或者，原代群体首先扩大至产生足够数量的不同的兄-妹配偶，并且随后可从这些兄-妹配偶交配而得到的胚胎中获得ES细胞。

ES细胞可利用本领域已知的方法冷藏。参见，例如Hogan等.，2003。

可以合适的时间间隔解冻追踪-谱系的原种的冷藏ES细胞并且用于重建原代群体。在一个实施方案中，源自雄性和雌性(兄-妹)胚胎的ES细胞被分别导入桑椹胚或胚泡阶段的胚胎中并且使得其参与该动物的发育。得到的子代一般为嵌合体，嵌合体的部分发育自宿主胚胎或是供体雄性或雌性的ES细胞。嵌合体的胚系可包含宿主和供体ES细胞的衍生物。通过利用毛色和/或其他的遗传标记，可以选择完全源自所用ES细胞的子代。得到的子代因此可用于重建原代群体。

在一个可选择的实施方案中，追踪-谱系的原种的雄性ES细胞和雌性ES细胞分别与四倍体宿主胚胎聚合(四倍体胚胎互补)，其可通过用例如电脉冲融合双细胞期胚胎而制备。这种ES细胞将非常成功地定殖于小鼠胚胎，而另外的胚胎组织通过该四倍体宿主提供。这将产生完全源自雄性ES细胞或雌性ES细胞的子代，取决于用于和该四倍体宿主胚胎聚合的ES细胞。利用毛色和/或其他的遗传标记合适的监控该过程可以将任何可能为宿主-胚胎-起源的子代和源自ES细胞的子代区分开。因此可以选择完全源自每个ES细胞的子代。随后可从源自雄性ES细胞(兄弟)和来自该雌性ES细胞的子代(姊妹)中选择兄-妹配偶以重建原代群体。

所述技术是本领域已知的。参见，例如Hogan等，2003。Derivationof completely cell culture-derived mice from early-passage embryonicstem cells，Proc Natl Acad Sci USA.90，8424-8428。也可参见

http://www.mshri.on.ca/nagy/diploid/diploid.htn，和

http://www.mshri.on.ca/nagy/Tetraploid/tetra.htm。

在另外的实施方案中，可从追踪-谱系的原种的单一雄性ES细胞系产生雌雄子代。雄性ES细胞包含X染色体和Y染色体(XY)。已显示在XY细胞系的亚克隆中Y染色体以高频率消失，使得需要例行鉴定XY ES细胞系的亚克隆中的XO细胞。这些XO ES细胞可用于产生经四倍体胚胎互补或嵌合体生成(参见Eggan等，2002)而可育的雌性子代。可选择一个雌性子代和源自该雄性ES细胞(XY)的一个雄性子代交配以重建原代群体。

已知ES细胞能在体外形成生殖细胞。参见Toyooka，Y.等，2003。因此，在另一个实施方案中，追踪-谱系的原种的ES细胞用于在体外产生生殖细胞，其随后用于产生源自该ES细胞的子代。

本发明的另一个方面涉及产生源自原代群体的冷藏ES细胞的追踪-谱系原种的方法。

本发明进一步的一个方面涉及维持近交小鼠品系遗传稳定性的方法。该方法包括五个步骤：(1)从源自近交系原代群体的追踪-谱系的冷藏ES细胞原种中选择获自单一兄-妹配偶的冷藏的ES细胞并且由这些ES细胞产生活的动物；(2)从所产生的活的动物中选择兄-妹配偶作为新的原代配偶；和(3)以合适的时间间隔重复步骤(1)-(2)。

本发明的另一个方面提供了源自原代群体的冷藏ES细胞的追踪-谱系的原种。上述追踪-谱系的原种可以合适的时间间隔用于重建原代群体。

本发明更进一步的方面提供了供应具有有限遗传漂变的非-人动物近交系的经营方法。该方法包括：(1)维持近交系的原代群体；(2)产生源自该原代群体的冷藏ES细胞的追踪-谱系的原种；(3)以合适的时间选择获自单一兄-妹配偶的冷藏的ES细胞，并且由其产生活的动物；(4)从所产生的活的动物中，选择兄-妹配偶且利用其作为新的原代配偶以产生该品系将来的动物；(5)以合适的时间间隔重复步骤(3)至(4)；并且根据客户订货单提供动物。

除非另有陈述，本发明的实验操作将应用小鼠遗传学、发育生物学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规方法，其均在本领域的技术内。所述技术描述在文献中。参见，例如Bonifacino、Dasso、Lippincott-Schwartz、Harford和Yamada、John Wiley和Sons，Inc.，New York，1999的Current Protocolsin Cell Biology，Hogan等.的Manipulating the Mouse Embryos，ALaboratory Manual，3^rd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，2003，Gene Targeting：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，1993和Gene TargetingProtocols，Human Press，Totowa，New Jersey，2000。此处引用的所有专利、专利申请和参考文献全文引入作为参考。

例证

参考下列实施例将更容易理解当前进行一般性描述的本发明，其存在仅仅是为了本发明某些方面和实施方案的例证，而并意味着限制本发明。

实施例1.利用胚胎原种维持近交系的遗传稳定性

附图描述了创建用于维持遗传稳定性的源自原代群体的冷藏胚胎的追踪-谱系的原种的示意图。这仅是本发明的一个实施方案。附图中的左侧方格显示第一个步骤：选择原代配偶(P代)并且多次交配以产生多个同窝仔。在所示的示意图中，挑选六个姊妹和两个兄弟(F1代)用于下一步。附图中中间的方格显示第二个步骤：每个F1代姊妹分别装入笼中以使其同窝仔能被追踪。在所示的示意图中，同一个雄性轮流与一组三个F1代姊妹交配。六个F1代姊妹的每个将与其各自的兄弟交配多次以产生多个F2代同窝仔。附图右侧的方格显示第三个步骤：九个F2代姊妹和源自单一F1代姊妹的一个兄弟将用于IVF以产生胚胎。对于约九个姊妹和一个兄弟的六个或更多组的每个进行IVF。来自54个雌性(6×9)的每个的胚胎冷藏在单独的管中。这将提供超过两倍的覆盖25年的丰余部分并且包括了用于对照和/或意外偶发事件的胚胎。

来自冷藏原种的同胞胚胎以合适的时间间隔解冻且移植入假孕雌性受体以产生子代。随后从子代选择兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建原代群体。

本领域技术人员将理解以上所述的仅仅代表用于产生本发明追踪-谱系的冷藏胚胎原种的一个实施方案。显然，可以改变该方案的许多细节，包括例如，在制备胚胎原种前扩大原代群体所需的世代数目、每代所用的雌性数目以及所用的近交配偶的类型。例如，可以选择配偶并且从该配偶产生F(x+1)子代(其中x为选择时的世代编号)。同时，获得来自该配偶雄性的精子并且等份冷藏。雌性F(x+1)子代可通过IVF与解冻的精子配种(亲-子配种)以产生F(x+2)胚胎，其可冷藏用以产生追踪-谱系的原种。

实施例2.利用配子原种维持近交系的遗传稳定性

在一个实施方案中，源自原代群体的雌性小鼠超排卵并且收集卵细胞以及冷藏。也收集和冷藏来自该雌性各个雄性同胞的精子。以合适的时间间隔，解冻来自同胞的卵细胞和精子并且通过IVF用于产生胚胎。得到的胚胎移植入假孕受体以生产后代。随后从子代选择兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建原代群体。

实施例3.利用前-配子原种维持近交系的遗传稳定性

冷藏的卵巢和精子

与来自其各自的雄性同胞的精子一样，冷藏源自原代群体的雌性的卵巢。以合适的时间间隔解冻和转移卵巢。一旦证实受体雌性的受孕，其超排卵并且利用来自其一个同胞的冷藏精子人工受精以产生子代。随后从子代选择兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建原代群体。冷藏的卵巢和精原细胞干细胞

收集卵巢且如上所述冷藏。从该雄性同胞收集精原细胞干细胞自并且冷藏。解冻精原细胞干细胞并且以合适的时间间隔移植以产生可育的雄性。一旦证实该雄性的受孕，解冻来自其雌性同胞的卵巢并且移植。随后交配动物以产生子代。随后从子代选择兄-妹配偶作为新的原代配偶以重建原代群体。参见Candy等.，2000，以及Nagano和Brinster1998。

实施例4.利用ES细胞原种维持近交系的遗传稳定性

从近交、有谱系的兄-妹交配分离雌雄ES细胞并且冷藏。以合适的时间间隔，从保藏库恢复源自兄妹交配的雌雄ES细胞。从遗传不同，例如来自ES细胞的不同毛色的品系制备宿主胚胎，并且经电脉冲诱导融合产生四倍体胚胎。存活的胚胎培养至桑椹期。多组雄性ES细胞(1-40个细胞)置于紧靠一个四倍体宿主胚胎处。同样，多组雌性ES细胞(1-40个细胞)置于紧靠另一个四倍体宿主胚胎处。ES细胞和其各自的四倍体胚胎接合成单个胚胎后(过夜培养)，胚胎引入假孕的雌性受体中。出生后合适的毛色和/或其他遗传标记可用于选择源自ES细胞的子代。随后可利用这些子代得到兄-妹配偶以重建原代群体。

虽然本发明已对本领域技术人员很详细地描述和举例说明了其制备和应用，在不背离本发明的精神和范围内各种替代、修饰和改进应该是显而易见的。

本领域技术人员将很容易意识到，本发明非常适宜于实现所述目的并获得结果及所提到的优点以及那些固有的优点。所述方法、胚胎原种和配子原种为优选实施方案的代表，是例证性的，并不打算限制本发明的范围。对本领域技术人员而言，将出现其中的修改及其他用途。这些修改包括在本发明的精神范围内，其通过权利要求的范围限定。

对本领域技术人员显而易见的是对在此公开的发明可做不同的替代和改进，只要不背离本发明的范围和精神。

人们应理解尽管已通过优选实施方案和任选的特征详细公开本发明，在此公开的改进和概念的变化可由本领域技术人员采用，并且认为如同所附的权利要求定义的那样，这样的改进和变化在本发明的范围内。

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