一种具有生物活性药物的壳聚糖微球及其制备方法

摘要

本发明涉及一种具有生物活性药物的壳聚糖微球及其制备方法。其为将生物活性药物溶解或分散于壳聚糖的溶液中，与加有表面活性剂的油相物质混合，经搅拌形成稳定的乳液后加入一定浓度的硫酸铵水溶液，搅拌沉淀一定时间后分离洗涤，真空干燥后即得到包埋了生物活性药物的粒径均一的壳聚糖微球控释载体。该方法解决了现有制备方法中药物活性低、粒度分布广的问题，可以得到粒径均一的药物微球，且较高的保留了药物的生物活性，而且具有控释作用，有望在大规模生物技术药物的微球制剂制备上得到使用。

说明书

技术领域

本发明属于医药工程的药物制剂领域，具体地说是涉及一种粒径均一、且具有生物活性药物的壳聚糖微球，及其制备方法。

背景技术

生物技术药物的研究重点之一是应用DNA重组技术开发可应用于临床的多肽激素、多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、细胞因子模拟肽及用于心血管疾病的多肽及蛋白质。据统计目前已有723种生物技术药物正在接受FDA审评(包括I～III期临床及FDA评估)，700种药物正处于早期研究(临床前)，还有200种药物已进入最后批准阶段(III期临床与FDA评估)。正是由于多肽药物在预防和治疗疾病上的巨大作用，各国对多肽药物的研发都非常重视，我国也已将多肽药物作为“十五”期间生物医药研究的重点方向之一。

由于多肽药物能够迅速被胃肠道消化酶降解破坏，所以临床应用受到很大限制，一般只能注射给药。但多肽药物在血液中生物半衰期普遍较短，故需频繁注射，造成患者心理、身体上的痛苦和经济上的巨大负担。因此开发多肽药物的长效、控释制剂能够极大的方便患者，减少医药费用，具有重要的现实意义和广阔的市场前景。制备控释制剂通常是使用化学交联法，溶剂挥发法等制备方法将药物包埋在聚合物中制成微球。但这类方法制备的药物微球的粒径不均一，从而不利于此类多肽药物的精确给药；而且该类方法使用的化学交联剂和有机溶剂，易残留在载药微球中，给药物的安全使用带来隐患。另外，现有方法制备的此类多肽药物微球，其包埋后的药物的生物活性也不高。因此，制备出粒径均一、高生物活性、无毒性物质残留的载药微球是这类药物真正走进临床的关键。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术制备的药物微球的粒径不均一、生物活性不高、有毒性物质残留的缺陷，从而提供一种粒径均一的、无毒的、具有生物活性药物的壳聚糖微球。

本发明的另一目的是提供上述具有生物活性药物的壳聚糖微球的制备方法。

本发明提供的具有生物活性药物的壳聚糖微球，由生物活性药物与壳聚糖组成，两者的质量比是1∶1～20，生物活性药物均匀分散在壳聚糖中。

所述的壳聚糖的分子量是50～160万，脱乙酰度是66～98％，可以是单一壳聚糖，也可是由具有不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖组成的混合物。

本发明提供一种上述具有生物活性药物的壳聚糖微球的制备方法，包括如下的步骤：

1)将生物活性药物溶解或分散在0.5～5％(w/v)的壳聚糖溶液中作为水相，生物活性药物与壳聚糖的质量比是1∶1～40；

所述的壳聚糖的分子量是50～160万，脱乙酰度是66～98％，可以是单一壳聚糖，也可是由具有不同分子量和脱乙酰度的壳聚糖组成的混合物

所述的壳聚糖溶液所用的溶剂是甲酸、乙酸、丙酸、盐酸、柠檬酸、酒石酸、或谷氨酸；

2)将油相和占其0.1～4v％的表面活性剂一起搅拌5～30分钟，转速为500～2000转/分钟；

所述的油相是液体石蜡、棉籽油、花生油、玉米油、大豆油、橄榄油、葵花籽油、或其与石油醚的混合物；

所述的表面活性剂是Span 20、Span 40、Span 60、Span 65、Span 80、Span 83、Span 85、Tween20、Tween40、Tween60、Tween61、Tween80、Tween81、Tween85或其任意比例的混合物；

3)将步骤1)的水相加入到步骤2)的油相中，搅拌形成稳定的乳液；其中水相与油相的体积比是1∶1～20，搅拌30～60分钟，转速为500～2000转/分钟；

4)向步骤3)制得的乳液中加入浓度为1～65％(w/v)的硫酸铵溶液，壳聚糖溶液与硫酸铵溶液的体积比为1∶1～20，继续搅拌0.5～5小时后停止；

5)离心分离步骤4)制得的分散体系，将上层液体倒出，分出下层硫酸铵沉淀的微球，依次用纯水、石油醚、无水乙醇充分洗涤，低温真空干燥后即得本发明的具有生物活性药物的壳聚糖微球。

使用本方法得到的具有生物活性药物的壳聚糖微球的粒径均一，其直径分布系数(如式I定义，CV值)可控制在25％以内，在优化条件下可控制在15％以内，直径可在25～2000微米内自由调节。

直径分布系数(coefficientof variation，cv)＝{[(di-d)²/N]^1/2/d}×100％    (式I)上式中，di为各个微球的直径，d为数平均直径，N为用于计算直径的微球数量，N＞300个。

本发明提供的具有生物活性药物的壳聚糖微球的生物活性药物的包埋率在90％以上，在优化的条件下达到99.2％；生物活性药物包埋后，药物的活性在50％以上，在优化的条件下达到93.5％；在37℃下，一定释放介质中微球可以控制释放出有活性的药物。

本发明使用乳化分散/硫酸铵沉淀法制备的壳聚糖微球作为药物的载体，在保持了壳聚糖的良好的生物相容性、生物可降解性、生物粘附性的同时，解决了现有制备方法中药物活性低、粒度分布广的问题，可以得到粒径均一的药物微球，且较高的保留了药物的生物活性，而且具有控释作用，有望在大规模生物技术药物的微球制剂制备上得到使用。

本发明提供的具有生物活性药物的壳聚糖微球及其制备方法还能够带来下列效应：

1、本发明提供的粒径均一的具有生物活性药物的壳聚糖微球，除可用作该类药物的长效注射制剂外，调节制备参数还可作为口服制剂和靶向制剂使用；

2、本发明提供的制备方法可用于所有的生物活性药物的包埋，如蛋白质、核酸、酶、激素、疫苗等生物活性物质，温和的制备条件可保持这类药物的生物活性；

3、本发明提供的温和的制备方法，也可用于包埋化学药物。

附图说明

图1实施例1制备的溶菌酶壳聚糖微球的放大40倍的扫描电镜图。

图2比较例1制备的溶菌酶壳聚糖微球的放大40倍的扫描电镜图。

图3实施例1和比较例1制备的溶菌酶壳聚糖微球的粒径分布图(测定仪器：激光粒度仪COULTER LS230)，其中曲线1代表实施例1制得的微球，曲线2代表比较例1制得的微球。

图4实施例1制备的溶菌酶壳聚糖微球在37℃，pH＝7.4的PBS缓冲液中的释放曲线。

具体实施方式

实施例1(乳化分散/硫酸铵沉淀法)

将2g壳聚糖(分子量60万，脱乙酰度87.2％)溶于100mL 0.2mol/L乙酸溶液制成壳聚糖溶液。取10mL该溶液，溶入30.2mg溶菌酶形成水相。取50mL液体石蜡(油相)加入到反应器中，加入1mLspan80和1mLTween80，搅拌，转速为1500转/分钟，分散10分钟后，加入上述配制的溶有溶菌酶的壳聚糖溶液(水相)，以同样的转速继续搅拌分散30分钟，形成稳定的乳液；向此乳液中加入浓度为50％(w/v)的硫酸铵溶液40mL，继续搅拌1小时后停止。离心分离，将上层液体倒出，分出下层硫酸铵沉淀的微球，依次用纯水、石油醚、无水乙醇充分洗涤沉淀，室温真空干燥，即得本发明的包埋有溶菌酶的壳聚糖微球。

用激光粒度仪(COULTER LS230)测试包埋有溶菌酶的壳聚糖微球的直径，平均直径是153.24微米，其形态如图1的扫描电镜图所示，其粒径分布系数是20.01％，如图3所示，粒径均一。

取100mg上述包埋有溶菌酶的壳聚糖微球放入醋酸-醋酸钠缓冲液中降解，定时用还原糖法测定溶菌酶的活性，并用紫外分光光度法在A＝280nm处测定溶菌酶的浓度，16小时后溶菌酶全部释放出后，测定其浓度，并换算为包埋率。在该条件下溶菌酶的包埋率是92.4％。释放出的溶菌酶的活性为包埋前活性的93.1％。

将溶菌酶的壳聚糖微球置于37℃，pH＝7.4的PBS缓冲液中，以100转/分钟的速度振荡，每隔一定时间取样，用紫外分光光度法在A＝280nm处测定溶菌酶的浓度。溶菌酶在该条件下可以以一定速度释放，见图4。

比较例1(戊二醛交联法)

将2g壳聚糖(分子量60万，脱乙酰度87.2％)溶于100mL 0.2mol/L乙酸溶液制成壳聚糖溶液。取10mL该溶液，溶入30.2mg溶菌酶形成水相。取50mL液体石蜡(油相)加入到反应器中，加入1mLspan80和1mLTween80，搅拌，转速为1500转/分钟，分散10分钟后，加入上述配制的溶有溶菌酶的壳聚糖溶液(水相)，以同样的转速继续搅拌分散30分钟后，加入10mL 15％(v/v)的戊二醛水溶液，继续搅拌1小时后停止。离心分离，用石油醚充分洗涤，室温真空干燥后即得用戊二醛交联的包埋有溶菌酶的壳聚糖微球。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试其直径，平均直径149.5微米，其形态如图2的扫描电镜图所示，其粒径分布系数是51.29％，如图3所示，粒径不均一。

取100mg用戊二醛交联法制备的溶菌酶的壳聚糖微球放入醋酸-醋酸钠缓冲液中降解，定时用还原糖法测定溶菌酶的活性，并用紫外分光光度法在A＝280nm处测定溶菌酶的浓度，25小时后溶菌酶全部释放出后，测定其浓度，并换算为包埋率。在该条件下溶菌酶的包埋率是67.2％。释放出的溶菌酶的活性为包埋前活性的5.46％。

实施例2(乳化分散/硫酸铵沉淀法)

将3g壳聚糖(分子量85万，脱乙酰度76.3％)溶于100mL 0.25mol/L乙酸溶液制成壳聚糖溶液。取10mL该溶液，溶入10.5mg溶菌酶形成水相。取50mL花生油(油相)加入到反应器中，加入0.5mLspan80和1.0mLTween60，搅拌，转速为1000转/分钟，分散10分钟后，加入上述配制的溶有溶菌酶的壳聚糖溶液(水相)，以同样的转速继续搅拌分散30分钟后，加入浓度为60％(w/v)的硫酸铵溶液80mL，继续搅拌1小时后停止。离心分离，依次用纯水、石油醚、无水乙醇充分洗涤沉淀，室温真空干燥后即得本发明的包埋有溶菌酶的壳聚糖微球。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试包埋有溶菌酶的壳聚糖微球的直径，平均直径是284.3微米，其粒径分布系数是22.41％。

取100mg包埋有溶菌酶的壳聚糖微球放入醋酸-醋酸钠缓冲液中降解，定时用还原糖法测定溶菌酶的活性，并用紫外分光光度法在A＝280nm处测定溶菌酶的浓度，20小时后溶菌酶全部释放出后，测定其浓度，并换算为包埋率。在该条件下溶菌酶的包埋率是98.4％。释放出的溶菌酶的活性为包埋前活性的91.1％。

实施例3(乳化分散/硫酸铵沉淀法)

将4g壳聚糖(分子量101万，脱乙酰度67.9％)溶于100mL 0.25mol/L乙酸溶液制成壳聚糖溶液。取10mL该溶液，溶入100.5mg溶菌酶形成水相。取50mL大豆油(油相)加入到反应器中，加入1mLspan80和1mLTween81，搅拌，转速为1200转/分钟，分散10分钟后，加入上述配制的溶有溶菌酶的壳聚糖溶液(水相)，以同样的转速继续搅拌分散30分钟后，加入浓度为10％(w/v)的硫酸铵溶液60mL，继续搅拌1小时后停止。离心分离，依次用纯水、石油醚、无水乙醇充分洗涤沉淀，室温真空干燥后即得本发明的包埋有溶菌酶的壳聚糖微球。用激光粒度仪(COULTER LS230)测试包埋有溶菌酶的壳聚糖微球的直径，平均直径是200.4微米，其粒径分布系数是19.08％。

取100mg包埋有溶菌酶的壳聚糖微球放入醋酸-醋酸钠缓冲液中降解，定时用还原糖法测定溶菌酶的活性，并用紫外分光光度法在A＝280nm处测定溶菌酶的浓度，21小时后溶菌酶全部释放出后，测定其浓度，并换算为包埋率。在该条件下溶菌酶的包埋率是90.4％。释放出的溶菌酶的活性为包埋前活性的83.1％。