用于治疗或预防高血糖症或用于稳定血糖的酵母细胞壁

摘要

本发明涉及以酵母细胞壁为基础的用于治疗或预防高血糖症或用于稳定血糖的试剂及制剂，以及相应的治疗组合物的制备。

说明书

技术领域

本发明涉及治疗和预防高血糖症，以及稳定血糖。

发明背景

已提出很多可用于预防高血糖症，用于治疗高血糖症和/或用于稳定血糖，特别是在糖尿病的病例的化合物。

已提出基于酵母的产品，例如特别是酵母，如酵母提取物、从富含铬的酵母中提取的基于铬的葡萄糖耐量因子(GTF)、以及啤酒酵母的细胞制备物。

因此，JP-A-61-167622提出了一种用于治疗糖尿病的试剂，该试剂是以酿酒酵母的细胞成分为基础的，在本文中称细胞成分为细胞壁，其是通过在50-70℃下至少水解脱苦味啤酒酵母两小时，从水溶性成份的水性提取物中获得。所述酿酒酵母的细胞成分特别地含有大约14.8％的葡聚糖、大约13.9％的甘露聚糖。所述细胞成分还含有大约24.9％的肝糖。肝糖或肝淀粉(德语：“Leberstarke”)是也存在于肌肉中，特别存在于肝脏中的储存的多糖。肝糖也是酵母的储备物质，被其用作生存能源备。然而在该日本申请中被描述为是细胞成分的一个主要物质，其并没有形成酵母中的细胞壁。

发明内容

根据本发明，已经观察到可以获得作为预防和治疗高血糖症的有效试剂的酵母细胞壁，该酵母细胞壁具有低的肝糖含量，可以通过简单的自动裂解或酶水解的过程获得所述酵母细胞壁。

术语“酵母细胞壁”指的是非富含铬的酵母细胞的不溶部分，其可通过自动裂解或酶水解，主要是蛋白酶水解的过程获得，，导致占整个酵母细胞的干物质含量的质量百分比的至少50％、优选至少60％溶解，并维护细胞壁的多糖结构，也就是β-葡聚糖和甘露聚糖，这些甘露聚糖以甘露蛋白的形式存在。

进行自动裂解或酶水解从而溶解酵母细胞壁的大部分储备糖，如肝糖和海藻糖。通过自动裂解或酶水解分离可溶的部分而获得酵母细胞壁，后者持续的时间优选至少18小时。优选的膏质酵母(cream yeast)的自动裂解过程在G.Reed和T.W.Nogodawithana的由Van NostrandReinhold，New York，ISBN 0-442-31892-8出版的指导手册“酵母技术”第二版，1991的第370-377页中描述了。获得酵母细胞壁然后可以通过传统的干燥程序，例如喷雾干燥或在旋转的鼓上干燥而干燥。

根据本发明的酵母细胞壁是酵母属的酵母细胞壁，优选属于酿酒酵母种。

所述酵母优选面包酵母。面包酵母是属于酿酒酵母种的，其主要是通过好氧繁殖或如上述的“酵母技术”的手册中所讲述的培养那样获得，在其自动裂解或酶水解之前不能做任何用途的应用，不像，例如作为啤酒生产的副产物的酿酒酵母，在其自动裂解或酶水解之前可用于生产啤酒。酿酒酵母主要在厌氧条件下繁殖(生产啤酒是一个厌氧的过程)。

根据本发明的酵母细胞壁的总细胞壁的葡聚糖和甘露聚糖的含量(系统地分别表达为等质量的葡聚糖和甘露聚糖-见以下的测量方法)为干物质质量的至少34.0％，肝糖含量(系统地表达为等质量的葡萄糖-见以下的测量方法)为少于干物质质量比的10.0％。

优选地，根据本发明的酵母细胞壁的总葡聚糖和甘露聚糖的含量为干物质质量的至少40.0％，更优选地为干物质质量的至少45.0％。

优选地，根据本发明的酵母细胞壁的肝糖含量为少于干物质质量比的8.0％，更优选地为少于干物质质量比的5.0％，更优选地为少于干物质质量比的3.0％。

有用地，根据本发明的酵母细胞壁含有为干物质质量比的17.0-35.0％，优选干物质质量比的18.0-26.0％的N X 6.25蛋白质的含量。

有利地，根据本发明的酵母细胞壁的干物质含量为质量比的至少90％、优选至少94％、更优选质量的至少96％。

一般地，根据本发明的酵母细胞壁的总葡聚糖和甘露聚糖的含量小于或等于干物质质量的70％。特别地小于或等于干物质质量比的65％。也可以小于或等于干物质质量的55％。

根据本发明的一个改变，为了完全地或几乎完全地从酵母细胞壁除去肝糖，将通过上述方法获得的根据本发明的酵母细胞壁悬浮于水性悬浮液中，在碱性介质中，在70-100℃之间，最多加热3小时，通过此处理除去溶解的部分，收回余下的不溶部分并大体上干燥。例如，含有大约12％的酵母细胞壁干物质的悬浮液在含钠的碱性介质中可以在85℃加热2小时。含有所有肝糖的，以及还有大部分，甚至全部的甘露蛋白的可溶部分被离心和洗脱而除去。

这种处理使生产根据本发明的酵母细胞壁成为可能，所述酵母细胞壁含有干物质质量的55-70％的总葡聚糖和甘露聚糖、优选按质量计，干物质的60-70％、更优选干物质的60-65％。这种处理特别使制备含有少于干物质质量的1％、优选含有少于干物质的0.1％的肝糖的酵母细胞壁成为可能。这些酵母细胞壁可以不含有甘露聚糖。

含有高的总葡聚糖和甘露聚糖的酵母细胞壁对应于本发明的一个试剂的实施方案，其用于治疗或预防高血糖症或用于稳定血糖。

他们适合用于制备根据本发明的用于治疗或预防高血糖症或用于稳定血糖的制剂。根据本发明，他们可用于制备用于治疗或预防高血糖症或用于稳定血糖的治疗组合物。

检测肝糖含量的方法

向20mg干酵母细胞壁样品中加入0.5ml 0.25M的Na₂CO₃，即使干物质含量在质量上至少为90％，将混合物在95℃下保持4小时。

然后通过加入0.3ml 1M的醋酸和1.2ml 0.2M的醋酸钠，并混合将混合物的pH调整到5.2。加入蒸馏水使总体积达2ml。

在过量的黑曲霉(aspergillus niger)淀粉葡糖苷酶存在的条件下在55℃孵育15小时以获得0.5ml悬浮液，黑曲霉的淀粉葡糖苷酶Roche商品号为102857。

离心后，用酶分析法测量释放的葡萄糖。

葡萄糖的酶分析法专门在Boehringer Mannheim GmbH Biochemica，1989年出版的“Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis-using Single Reagents”中的50-55页中描述，优选使用“检测结合的D-葡萄糖/果糖”试剂，其在德国达姆施塔特的Roche的子公司：Boehringer Mannheim GmbH/R-Biopharm GmbH的商品号为139 106。

因此分析的葡萄糖的量(mg)与样品中表达的葡萄糖的质量相当。

检测总葡聚糖和甘露聚糖含量的方法

通过与20ml 2N的HCL混合将20mg干酵母细胞壁样品，即按质量计干性物质含量至少为90％的样品酸性水解，将混合物在有螺旋盖的密封瓶中在103℃的孵育箱中保持4小时，每15分钟进行晃动。

然后，将获得的酸性溶液中和，使用酶方法在中和的溶液中分别定量葡萄糖和甘露糖的量。

葡萄糖和甘露糖的酶分析法也在上述的手册50-55页中描述了，优选使用商品号为139 106的“检测结合”试剂完成检测。

计算在一方面通过此方法分析的葡萄糖的量(以mg表示)与通过上述肝糖量的测量方法分析的这些酵母细胞壁的葡萄糖的量(也以mg表示)之间的差。

两种葡萄糖分析的量之间的差(mg)对应了样品中总的葡聚糖的量，其量以葡萄糖的相应的质量表示。

分析的甘露糖的量(mg)对应样品中总的甘露聚糖的量，其量以甘露糖的相应质量表示。

首先，本发明涉及含有上述酵母细胞壁的用于治疗高血糖症的试剂，即含有根据本发明的酵母细胞壁。高血糖症的治疗主要包括降低血糖、即降低血中葡萄糖的水平。

根据本发明的试剂可用于多种高血糖症，特别是例如下述病例：

(a)用于治疗2型糖尿病的高血糖症(2型糖尿病在下文中称为“疾病(a)”)；

(b)用于治疗妊娠期(gestational)或妊娠糖尿病的高血糖症(妊娠期或妊娠糖尿病在下文中称为“疾病(b)”)；

(c)用于治疗前驱糖尿病的高血糖症(前驱糖尿病在下文中称为“疾病(c)”)；

(d)用于治疗餐后高血糖症(餐后状态在下文中称为“疾病(d)”)。

本发明还涉及用于预防高血糖症的试剂，所述试剂含有本发明的酵母细胞壁。预防高血糖症主要包括维持血糖水平在高血糖症以下。

特别地所述试剂是可以在上述疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下预防高血糖症。

本发明还涉及用于稳定血糖的试剂，所述试剂由根据本发明的酵母细胞壁组成。稳定血糖主要包括维持血糖在高血糖症之下而在低血糖症之上。

特别地所述试剂可以是在上述疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于稳定血糖的试剂。

根据本发明的试剂，在其多个实施方案中，可以以多种形式或存在方式给药，可以单独或与其他成分共同给药，例如，与一个或多个其他治疗活性成分和/或一个或多个赋形剂共同给药。

因此本发明涉及用于治疗高血糖症的含有上述的根据本发明的酵母细胞壁的制剂。换句话说，所述制剂包括本发明的试剂。

特别地根据本发明的制剂可以是在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于治疗高血糖症的制剂。

本发明还涉及用于预防高血糖症的含有根据本发明的酵母细胞壁的制剂。

特别地所述制剂可以是在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于预防高血糖症的制剂。

本发明还涉及用于稳定血糖的含有根据本发明的酵母细胞壁的制剂。

特别地所述制剂可以是在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于稳定血糖的制剂。

根据上述实施方案的任何一个的制剂通常是经口给药的制剂。

该制剂特别地可以以片剂、胶囊、丸、粉末、颗粒或悬浮液的形式提供。

根据本发明的制剂还可以包括一个或多个治疗活性试剂，特别地包括一个或多个低血糖试剂。因此制剂可以包括一种或多种维生素、一种或多种食用矿物质等等。

制剂还可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

特别地根据本发明的制剂可以以用于摄取的相对本发明的酵母细胞壁干物质含量小于10g、优选1-8g、更优选1-7g的剂量形式提供。

本发明还涉及根据本发明的酵母细胞壁在制备上述多种实施方案中的治疗组合物或药物中的应用。

特别地本发明涉及这些酵母细胞壁在生产上述本发明的组合物的一种中的应用。

因此本发明涉及本发明的酵母细胞壁在制备用于治疗高血糖症的治疗组合物中的应用。

特别地根据本发明的酵母细胞壁还可以用于制备在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于治疗高血糖症的治疗组合物。

本发明还涉及根据本发明的酵母细胞壁在制备用于预防高血糖症的治疗组合物中的应用。

特别地根据本发明的酵母细胞壁可以用于制备在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于预防高血糖症的治疗组合物。

本发明还涉及根据本发明的酵母细胞壁在制备用于稳定血糖的治疗组合物中的应用。

特别地根据本发明的酵母细胞壁可以用于制备在疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况下用于稳定血糖的治疗组合物。

药物组合物是经口给药的常规使用的组合物。

特别地药物组合物可以以片剂、胶囊、丸、粉末、颗粒或悬浮液的形式提供。

特别地根据本发明的酵母细胞壁可以用于制备还含有下列成分的药物组合物：

·一种或多种治疗活性试剂，特别为一种或多种低血糖试剂，和/或

·一种或多种维生素，一种或多种食用矿物质，等等

药物组合物还可以包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。

特别地根据本发明的酵母细胞壁可以用于制备摄取剂量为本发明的酵母细胞壁干物质含量小于10g、优选1-8g、更优选1-7g的剂量形式的治疗组合物。

另外，本发明涉及在病人中治疗高血糖症的方法，其包括向病人给药一种本发明的用于治疗高血糖症的试剂或根据本发明的用于治疗高血糖症的制剂。

用于治疗高血糖症的方法可以特别地为治疗疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况的高血糖症的方法。

本发明还涉及根据本发明的试剂或制剂在治疗病人高糖血症、预防高糖血症、或在稳定血糖中的应用。

本发明还涉及用于预防病人高糖血症的方法，其包括向病人给药根据本发明的用于预防高糖血症的试剂或根据本发明的用于预防高糖血症的制剂。

预防高糖血症的方法可以特别地为预防疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况的高血糖症的方法。

本发明还涉及稳定病人血糖的方法，其包括向病人给药根据本发明的用于稳定血糖的试剂或根据本发明的用于稳定血糖的制剂。

稳定血糖的方法可以特别地为稳定疾病(a)、(b)、(c)或(d)的至少一种情况的血糖的方法。

本发明特别地涉及一种方法，其中通过口服途径向病人给药试剂或制剂。

根据本发明的各种方法可以特别地包括向病人给药每日剂量为相应本发明的酵母细胞壁1-10g，优选2-8g，更优选3-6g的试剂或制剂，所述的每日剂量可以一次给药或在一个时刻给药，例如在早餐中给药，或者可以分几次给药，即一天分次给药。

根据本发明的方法还可以包括在给药试剂或制剂后检测患者血糖的步骤。

特别地这些方法还可以包括在向患者给药试剂或制剂前检测患者血糖的步骤，和在向患者给药试剂或制剂后检测患者血糖的步骤。

具体实施方式

实施例

A.生产根据本发明的酵母细胞壁的方法

按质量计，将具有12-18％的干性成分的酿酒酵母的水乳(即水中的酵母悬浮液)用所述酵母细胞的内源性的酶水解，可选择地向酵母细胞加入外源性蛋白酶，例如木瓜蛋白酶。在50℃下水解24小时，从而使至少按质量计，60％的酵母细胞的干性成分溶解。

实际上，通常根据本发明，在45-55℃之间，进行18-36小时的自动裂解或酶水解，而不使用任何可以溶解葡聚糖或甘露蛋白的酶。

通过连续的离心和用水洗脱的步骤从不溶的部分中分出溶解的部分。

在加热的鼓上将不溶的部分干燥至按质量计，干燥物质占95％。通过过滤除去形成的大块物。

从而得到酵母细胞壁具有：

·按质量计，为95％的干物质，

·按干物质质量计含量为20.2％的N X 6.25蛋白质，

·按干物质质量计含量为43％的总葡聚糖和甘露聚糖，

·按干物质质量计含量为8％的肝糖。

B.应用本发明的制剂预防和治疗高糖血症

一位82岁的残障病人被诊断为2型糖尿病。

不能参加所要求的体育锻炼，早期治疗局限于使用低脂肪和可吸收的糖含量的的饮食。

这种饮食疗法所取得的效果是有限的。特别是观察到病人的血糖持续在血中葡萄糖含量介于10.0-12.0mmol/l，已知的理想的血中葡萄糖含量介于4.0-7.0mmol/l，优选介于4.2-6.0mmol/l。

尔后，通过向早餐的谷类中加入3-4g上述A中的酵母细胞壁来补充上述的饮食疗法。

第一次摄取所述的酵母细胞壁12小时后，病人的血糖降到血中葡萄糖6mmol/l。

在每天的早餐中持续吸收3-4g酵母细胞壁后，病人的血糖至少4个月维持在血中葡萄糖介于4.5-6.0mmol/l。

在这四个月中，没有发生餐后高血糖，即使是违背了所规定的饮食后，如在食用巧克力后。

没有观察到负面影响。