球虫卵囊的分离纯化及子孢子制备方法

摘要

一种球虫卵囊分离、纯化及子孢子制备方法，经常规处理鸡盲肠、内容物或粪便，获得卵囊的粗分离物，加2.5％重铬酸钾，放入培养箱孢子化培养2～4天，取孢子化卵囊储备悬液，离心洗涤，除去重铬酸钾，加入30％NaClO溶液，离心，取上清中白色漂浮物，加入蒸馏水混匀，离心弃上清，再用蒸馏水离心洗涤沉淀，除去NaClO和其它的有机物质，保留沉淀物，将纯化处理后的孢子化卵囊沉淀物用生理盐水悬浮后移入组织匀浆器内，研磨15－20分钟，显微镜镜检90％以上子孢子囊破碎即可。本发明方法设计合理，与传统分离制备方法相比，具有(1)操作简便、快捷，(2)提取的卵囊纯度高、杂质少；(3)子孢子活性高等优点。

说明书

技术领域：

本发明属生物技术，主要涉及球虫卵囊分离纯化及子孢子制备方法。

背景技术：

鸡球虫分布广、危害大、严重威胁养禽业的发展，特别对于雏鸡，往往是毁灭性的。集约化养鸡场是球虫病爆发的最适宜场所，其发病率为50％-70％，死亡率20-30％，严重时高达80％。在各种鸡病中，球虫病的发病率最高，占1/6-1/5。据Bhogal等报道，全世界每年因鸡球虫病造成的损失达20亿美元，抗球虫药的年消费为3.2亿美元。随着养鸡业的不断发展，这一数据还呈加倍上升趋势。我国年支出抗球虫药费用6-18亿元，迄今为止，控制球虫病的主要手段仍然是化学药物防治。由于耐药性与药物残留两大问题的日趋严重，免疫预防研究引起了广泛重视。随着球虫病研究的深入，体外培养技术和分子生物学技术在该领域中得到广泛应用。卵囊的分离、纯化及子孢子的制备是体外培养和分子生物学研究的基础和前提。传统的方法比较费时、费力。

发明内容：

本发明的目的是提供一种球虫卵囊分离、纯化及子孢子制备方法，通过以下步骤实现：

1.卵囊的分离

(1)从鸡只盲肠及内容物中分离

剖杀鸡只，取盲肠及内容物放入组织搅拌机内加水适量，捣碎若干分钟(100克组织3-5分钟)。在悬液中加入2mg/ml胰蛋白酶39℃消化1小时，然后用蒸馏水洗涤3次除去酶。在40目、200目铜筛中依次过滤，过滤液5000rpm离心5分钟，沉淀即为卵囊的粗分离物。

(2)从鸡只粪便中分离

采集适量粪便用蒸馏水悬浮，静置15分钟，在40目、200目铜筛中依次过滤，过滤液5000rpm离心5分钟，沉淀即为卵囊的粗分离物。

2.卵囊的孢子化

取卵囊粗分离物，按1∶10的比例加入2.5％重铬酸钾溶液搅拌均匀后分装入平皿(溶液深度不超1厘米)，置28℃培养箱培养，每隔1小时通气一次，孢子化2～4天，取少许培养液镜检，如有85％以上的卵囊孢子化即可收获，置4℃保存备用。

3.孢子化卵囊的纯化

(1)离心洗涤

取适量孢子化卵囊储备悬液放入离心管中，5000rpm离心2分钟，去除上清，加入适量蒸馏水洗涤，反复离心洗涤3-5次以除去重铬酸钾。

(2)次氯酸钠漂洗纯化

除去重铬酸钾后，在离心沉淀物中加入30％NaClO溶液，吹打混匀，4℃放置10分钟后以5000rpm，吸取上清中白色漂浮物，转入另一新的离心管，加入5倍体积的蒸馏水混匀，12000rpm离心弃上清，再用蒸馏水离心洗涤沉淀2次，除去NaClO和其它的有机物质，备用。

4.子孢子悬液的制备

将纯化处理后的孢子化卵囊沉淀物用生理盐水悬浮后移入组织匀浆器内，研磨15-20min，显微镜镜检90％以上孢子囊破碎即可。

本发明方法与传统分离制备方法相比，具有以下优点：(1)操作简便、快捷；(2)提取的卵囊纯度高、杂质少；(3)子孢子活性高。应用本发明方法可以简便、快速地制备高纯度卵囊或子孢子，用于分子生物学研究和体外培养等。

附图说明

图1为纯化后的孢子化卵囊。

图2为制备的子孢子。

图3为鸡胚中体外培养出的卵囊。

图4为柔嫩艾美尔球虫TA4基因的表达与检测。

具体实施方式：

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

取适量孢子化卵囊储备悬液放入离心管中，5000rpm离心2分钟，去除上清，加入适量蒸馏水洗涤，反复离心洗涤3-5次以除去重铬酸钾。然后在离心沉淀物中加入30％NaClO溶液，吹打混匀，4℃放置10分钟后以5000rpm，吸取上清中白色漂浮物，转入另一新的离心管，加入5倍体积的蒸馏水混匀，12000rpm离心弃上清，再用蒸馏水离心洗涤沉淀2次，除去NaClO和其它的有机物质，备用。

用本法纯化的孢子化卵囊参见图1。

实施例2

将实例1方法制备的孢子化卵囊沉淀物用生理盐水悬浮后移入组织匀浆器内，研磨15-20min，显微镜镜检90％以上孢子囊破碎即可。

用本法制备的子孢子参见图2。

实施例3

取实施例2方法制备的子孢子，以3×10⁴个量接种10日龄非球虫免疫AA肉鸡鸡胚，感染后第7天，取绒毛尿囊膜经2mg/ml胰蛋白酶39℃消化1小时后在悬液中发现卵囊，结果参见图3。

实施例4

取实施例2制备的子孢子，用Trizol试剂(-20℃下预冷)，参照TrizolReagent Total RNA Isolation Kit(总RNA提取试剂盒)说明书步骤进行操作，成功提取柔嫩艾美尔球虫浙江株总RNA，通过RT-PCR成功克隆其TA4子孢子表面抗原基因，并在原核表达载体中成功表达，结果参见图4。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。