一株无pX01和pX02质粒的炭疽杆菌菌株及其用途

摘要

本发明公开了一株无pX01和pX02质粒的炭疽杆菌菌株AP422，保藏号为CGMCC No.1569。炭疽芽孢杆菌CGMCC No.1569用于制备免疫制剂的用途。本发明的优点是：炭疽杆菌AP422毒性大大降低，同时又能形成芽胞，芽胞成分增强免疫保护的作用不丢失，这为将来以炭疽杆菌AP422株为宿主菌同时又能表达PA的重组疫苗株打下基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一株无pXO1和pXO2质粒的炭疽杆菌菌株AP422及其用途，属于微生物技术领域。

背景技术

911事件之后的炭疽芽胞袭击事件，引起了人们对生物武器的恐慌。炭疽杆菌形成的芽胞具有存活时间长，易于传播，发病时间快和死亡率高等特点，是恐怖主义者首选武器之一。

炭疽杆菌毒性菌株含有两个大质粒，编码毒素的基因位于pXO1质粒(184.5kbp)，与合成荚膜相关的基因位于pXO2质粒(95.3kbp)。强毒株需要两种质粒的存在，缺少pXO1则不产生毒素，即为弱毒菌；缺少pXO2则不形成荚膜，比野生型菌毒力低105倍，因此炭疽杆菌致病因子主要是荚膜和炭疽毒素两个方面，而能够引起机体对其产生免疫保护应答的成分岂今发现主要是炭疽毒素中的保护性抗原(PA)，另外炭疽杆菌的芽胞成分、水肿因子(EF)及致死因子(LF)均有增强免疫保护的作用。

目前世界上炭疽杆菌的疫苗批准应用的是美国和英国的炭疽杆菌培养上清主要成分所做的铝胶苗，我国和俄罗斯用的是活芽胞苗，它们在免疫程序、保护率和毒性方面都各有缺点，活芽胞苗主要是具有一定的毒性。我国当前应用于疫苗的A16R株是只具有pXO1大质粒的弱毒株，但仍具有一定的残留毒性，清除pXO1毒性质粒，建立“无毒”的炭疽杆菌芽胞突变株，为将来研制更安全有效的炭疽杆菌疫苗打下基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株无pXO1和pXO2质粒且能形成芽胞的炭疽杆菌菌株。

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述菌株的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株无pXO1和pXO2质粒的炭疽杆菌菌株AP422，其保藏登记号为CGMCC No.1569。

本发明涉及的炭疽杆菌菌株AP422，命名为炭疽芽孢杆菌Bacillus anthracis AP422，已于2005年12月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCC No.1569。保存地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

我们对炭疽杆菌A16R株经60天42.5℃连续高温培养后，获得一株完全消除大质粒pXO1炭疽杆菌AP422株，它非常容易形成芽胞，这与王秉翔等(中国人兽共患病杂志，2004，20(4))获得炭疽杆菌AAT121株不同。炭疽杆菌质粒pXO1上有LF、PA、EF毒素基因，也有负责它们调控表达的atxA基因，芽胞萌发应答有关的基因gerXA，gerXB，gerXC三个相关基因。而真正调控芽胞形成的基因是位于染色体上的spoOA基因。当环境因素发生变化，使得菌体内一些组氨酸激酶发挥作用，对过磷酸化传导通路对SpoOA因子磷酸化，从而激活SpoOA因子。SpoOA通过直接和间接的通路调控着500多个芽胞形成相关基因的表达，例如spoOB、spoOE、spoOF等，所以芽胞的形成主要由染色体的基因控制，质粒pXO1上参与芽胞形成的基因目前还没有明确。另外，它的其它生物学性状与炭疽杆菌A16R株也没有观察到变化。动物毒性试验表明，炭疽杆菌AP422株毒力大大降低，这主要是由于质粒pXO1的丢失，它不能够表达分泌PA、LF和EF，也就不能产生很大的毒性作用。

本发明炭疽芽孢杆菌CGMCC No.1569用于制备免疫制剂的应用。

所述免疫制剂为灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗或合成疫苗。

灭活疫苗是将细菌的培养物，经化学或物理方法灭活制成。使之完全丧失对原来靶器官的致病力，而仍保存相应抗原的免疫原性。减毒活疫苗是将病原微生物在人工驯育的条件下，促使产生定高变异，使其极大程度地丧失致病性，但仍保留一定的剩余毒力、免疫原性和繁衍能力。制成疫苗接种人体后，使机体产生一次亚临床感染而获得免疫力。亚单位疫苗(组分疫苗)是从细菌培养物中，以生物化学和物理方法提取纯化有效特异性抗原制成的疫苗。基因工程疫苗是将有效的特异性抗原的基因插入易于增殖的载体(细菌、细胞)，在载体增殖时可表达有效特异性抗原，作为疫苗。合成疫苗为仿特异性抗原的某些肽链或蛋白人工合成的抗原。

所述免疫制剂为联合疫苗，联合疫苗是指含有二个或多个活的、灭活的生物体或者提纯的抗原，由生产者联合配制而成，用于预防多种疾病或由同一生物体的不同种或不同血清型引起的疾病。

本发明的优点是：炭疽杆菌AP422毒性大大降低，同时又能形成芽胞，芽胞成分增强免疫保护的作用不丢失，这为将来以炭疽杆菌AP422株为宿主菌同时又能表达PA的重组疫苗株打下基础。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为以P1和P2为引物的PCR产物琼脂糖电泳分析；1-5：含有质粒pXO1的炭疽杆菌A16株作为模板；6：丢失质粒pXO1的炭疽杆菌APP422株作为模板；7：DNA Marker。

图2为以P3和P4为引物的PCR产物琼脂糖电泳分析；1-6：含有质粒pXO1的炭疽杆菌作为模板；7：丢失质粒pXO1的炭疽杆菌APP422株作为模板；8：DNA Marker。

图3为炭疽杆菌AP422株革兰氏染色图。

图4为炭疽杆菌AP422株青霉素串珠实验图。

图5为炭疽杆菌AP422株芽胞图。

图6为炭疽杆菌A16R株与炭疽杆菌AP422株生长曲线。

具体实施方式

实施例

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株与试剂

炭疽杆菌菌株A16R(pXO1，pXO2)，来源于中国药品生物制品检定所，由军事医学科学院微生物研究所保存菌种，相关文献：(1)李霆等，炭疽芽孢在巨噬细胞RAW264.7内的萌发过程，世界华人消化杂志13(13)，2005；LBG培养基；(2)肖履中等，PCR检测炭疽杆菌的研究中国动物检疫10，2004；(3)寇志华等；炭疽疫苗A16R诱导小鼠的粘膜与系统免疫应答，中国生物制品学杂志，16(5)，2003，(4)王秉翔等，一株炭疽杆菌无毒株的建立，中国人兽共患病杂志，20(4)，2004；芽胞培养基；引物P1，P2，P3，P4(表1)，由三博远志生物技术公司合成；Taq酶购自TaKaLa公司，SPF级昆明小鼠，豚鼠和家兔由军事医学科学院动物中心提供。

                      表1  引物

  引物  序列  长度  P1  P2  P3  P4  5’ACGGATCCCAGCAATTACTTTGAGTGGTC 3’    5’GCGCGTCGACTACTTATGAGTTAAT 3’    5’ATGGATCCGGCATTGTCTACGATATTAG 3’    5’ACGCTCGAGGAATTACCGTATCCTATCTC 3’  29nt  25nt  28nt  29nt

1.1.2染色液

结晶紫乙醇饱和液：2g结晶紫溶于20ml 95％乙醇，加入1％草酸铵水溶液80ml混匀。碘，碘化钾液：碘1g，碘化钾2g加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加入蒸馏水300ml。碱性美兰染色液：0.3g美兰溶于30ml 95％乙醇中，加蒸馏水100ml及10％KCl溶液0.1ml混合。

1.2方法

1.2.1炭疽杆菌突变株的筛选

采用连续传代42.5℃高温培养的方法：将炭疽杆菌A16R接种于LBG固体培养基表面，放在42.5℃培养箱中培养48h；一个平板各挑取5个菌落，再在一个平板上划线培养，最多只划五十个平板。在第10天、20天、40天、60天，各选取50个单个菌落，保存，留待检测和鉴定。50个单菌落接种于5ml LBG培养基中，42.5℃，200rpm培养过夜，取50μl培养液做检测。

1.2.2PCR鉴定

模板制备：取50μl培养液，离心，去上清，加500μl生理盐水洗涤，再离心去上清，最后加入50μl生理盐水稀释，取2μl作模板。引物P1和P2配对，P3和这P4配对，进行PCR反应。PCR反应条件：94℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃3min)×30循环，72℃10min。PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳观察。

1.2.3革兰氏染色光镜检查

取10μl培养液涂片固定，滴加结晶紫乙醇饱和液染1min，水洗；滴加碘，碘化钾液染1min，水洗；将玻片上的残水甩掉，滴加95％乙醇脱色，到没有明显的紫色继续脱掉为止，水洗；然后加入10倍稀释的石炭酸复红液复染30s，水洗，干燥；显微镜1000倍镜下观察。

1.2.4青霉素串珠试验

2％兔血清胰胨肉汤2.7ml中，接种4ml增菌4小时的被检定培养物，其浓度以每个低倍镜视野内含菌10个为宜，然后加入5u/ml的青霉素0.3ml，混匀，放入37℃水浴箱中作用1-2h，加入20％福尔马林0.3ml，室温下作用10分钟，取培养物50μl，涂片固定，显微镜镜下观察。

1.2.5CO₂条件下培养试验

取普通琼脂172ml，融化稍冷后，加入10％活性炭粉悬液(2g活性炭粉未加蒸馏水20ml，高压灭菌)80ml，再加入7％NaHCO₃20ml，混匀，倾注平板。取待检炭疽杆菌接种于该培养基上，将平板放入37℃CO₂培养箱中，培养箱中的CO₂浓度为20％，培养16h小时后，取出培养皿，观察菌落形成特征。

1.2.6芽胞形成实验

将A16R和筛选得到的菌株接种液体芽胞培养基中，37℃，250rpm培养72小时，取100μ10,000rmp离心2min，弃上清加入500μl去离子水洗涤，再加入100μl去离子水稀释，50μl涂片固定。涂片滴加石炭酸复红液，加热至出现蒸汽，染色10min，水洗；95％乙醇脱色2min，至淡红色为止，水洗；用碱性美兰复染1min，水洗，干燥，镜下观察。

1.2.7毒性试验

将A16R和筛选得到的菌株接种芽胞培养基，37℃培养72小时，10000rpm离心10min，菌体制成20％甘油悬液，小鼠60只分为A16R组和突变株组，每组又分3组，分别在鼠蹊部皮下注射1×10⁹CFU，1×10⁸CFU，1×10⁷CFU不同剂量的细菌芽胞，观察反应30天；豚鼠10只，分为A16R组和突变株组，每组5只，分别在蹊部皮下注射5×10⁷CFU剂量的细菌芽胞，观察20天；家兔10只，分为A16R组和突变株组，每组5只，分别在蹊部皮下注射5×10⁸CFU剂量的细菌芽胞，观察20天。

1.2.8细菌生长曲线的测定

在菌种的平板培养基上挑取一个菌落，接种于5mlLBG液体培养基中，静止培养12h左右，此菌液为测定时所用的种子培养液。取100μl种子培养液接种于50mlLBG液体培养基中，37℃，250rpm培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀值和涂板数菌。以测定的时间为横坐标，菌数的对数(OD₆₀₀值)为纵坐标，在半对数坐标纸上描点绘图，所得的曲线为被测菌在实验条件下的生长曲线。

2.结果

2.1无毒炭疽杆菌菌株获得

在连续传代高温培养60天以后，挑选出了50株做为候选株，经接种5ml培养基，取50μl过夜培养液离心洗涤，作为模板进行PCR反应。筛选获得一株编号为AP422菌株。图1是特异性引物P1和P2配对获得的PCR产物电泳图，图2是特异性引物P3和P4配对获得的的PCR产物电泳图。由图中可以看出图1的第6泳道，图2的第6泳道均没有扩增出特异片段，而此二泳道进行PCR反应的模板就是AP422炭疽杆菌株。

2.2革兰氏染色光镜检查

取10μl培养液涂片固定，经结晶紫乙醇饱和液，碘和碘化钾液，95％乙醇脱色，石炭酸复红液复染后，显微镜1000倍镜下观察，呈典型的竹节状，为炭疽杆菌典型特征，见图3。

2.3青霉素串珠试验

兔血清胰胨肉汤接种增菌4小时的AP422，青霉素使得终度为0.22u，37℃水浴2h小时后，加福尔马林，室温下作用10分钟，取培养物50μl，涂片固定，显微镜镜下观察，炭疽杆菌AP422株在细菌体边缘形成有明显串珠，结果见图4。

2.4CO₂条件下培养试验

将炭疽杆菌AP422株划线含有炭酸氢钠的平板，放入CO₂培养箱中培养16h，观察形成的菌落特征。炭疽杆菌AP422株的菌落经16h培养后，直径约2-4mm，扁平，灰白色，似毛玻璃状，边缘不整齐，常有小尾巴突起，为粗糙型菌落。在液体培养基中炭疽杆菌呈絮状生长，并且易在培养基液体培养基中下沉。

2.5芽胞形成实验

将炭疽杆菌AP422菌株接种液体芽胞培养基中，37℃，250rpm培养3天后进行芽胞染色，发现有大量的芽胞形成。染色观察芽胞单个存在，呈卵圆形，与竹节状的炭疽杆菌繁殖体形态上有明显的区别，见图5。

2.6毒性试验

注射炭疽杆菌A16R芽胞组的小鼠蹊部部位有炎症反应，精神极度萎靡不振，其中1×10⁹CFU剂量组的小鼠在3日内全部死亡，其余两组的小鼠在7天内全部死亡；注射炭疽杆菌AP422组的小鼠在注射部位炎症反应不明显，精神状态正常，全身未观察到任何毒性反应，在30天的观察期内全部存活。注射炭疽杆菌A16R芽胞组的豚鼠蹊部部位有炎症反应，在10天内全部死亡；注射炭疽杆菌AP422组的豚鼠在注射部位炎症反应不明显，精神状态正常，全身未观察到任何毒性反应，全部存活。注射炭疽杆菌A16R芽胞组的家兔蹊部部位有炎症反应，水肿症状，并且出现化脓，精神状态不佳，身体消瘦；注射炭疽杆菌AP422组的家兔在注射部位炎症反应不明显，精神状态正常，全身未观察到任何毒性反应，全部存活。

2.7细菌生长曲线的测定

分别取10μl炭疽杆菌A16R和AP422种子培养液接种于50mlLBG液体培养基中，37℃，250rpm培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀值。以测定的时间为横坐标，菌数的对数(OD₆₀₀值)为纵坐标，在半对数坐标纸上描点绘图，所得的24小时生长曲线见图6。由生长曲线可以看出，炭疽杆菌A16R和AP422生长状态相似，在14小时达到最高值，其中A16R的OD₆₀₀值是16.32，AP422的OD₆₀₀值是17.96，说明pXO1质粒的丢失对炭疽杆菌AP422生长没有明显的影响。