泰山虫草及其人工培育方法

摘要

本发明涉及一种微生物新纪录种－泰山虫草，其无性型为托持拟青霉(Paecilomycessuffultus(Petch)Samson)。将该菌种接种到寄生虫体或代料培养基上，在适宜条件下培养可获得黄白色虫草子实体。该菌种具有适于人工大量培养、有效成分含量高、环境适应力强、发菌速度快、抗逆性强、产量高、培育周期短、菌种无退化现象等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的微生物，具体地说涉及一种泰山虫草菌及其培育方法。

背景技术

蛹虫草又名北虫草，系一种虫生真菌，寄生在多种昆虫蛹(虫)体上，是一种食、药兼用的珍品。近年来，随着国内外的深入研究，进一步认识到蛹虫草滋补和医疗双重作用的重要性，已测定蛹虫草含有虫草菌素，虫草多糖和超氧化物歧化物质。虫草菌素对枯草杆菌、鸟型结核杆菌、人鼻咽癌KB细胞、人表皮样痣等均有明显拮抗或抑制作用。虫草素还在细胞研究中用作RNA合成的抑制剂。此外，用蛹虫草的菌丝和孢子制品用于几种鳞翅目害虫的生物防治也取得了显著的效果。但现在虫草野生资源有限，据报道，青海省某县每年在冬虫夏草生长季节，受暴利驱动，几十万人涌进草地，对虫草进行大肆挖掘，严重损坏植被，掠夺虫草资源，破坏当地生态平衡，造成水土流失，土地荒漠化严重；再有天然冬虫夏草生长周期长、产量低，远不能满足日益增长的消费需求，天然虫草的分布区域狭窄，自然生长需要一年或更长时间，产量极低，因其突出疗效和高昂的价格导致乱挖滥采，资源濒临枯竭，急需开发替代产品。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种适于人工培养、环境适应力强、发菌速度快、抗逆性强、产量高、有效成分含量高、培育周期短的虫草菌种。

本发明的目的之二在于提供适于商品化生产上述虫草菌的培育方法。

以下为本发明的主要内容：

泰山虫草菌株，该菌株已于2005年4月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1341。其无性型为托持拟青霉(Paecilomycessuffultus(Petch)Samson)，目前未见报道，属新纪录种。

本发明所述的菌种是从泰山地区寄生于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)或灯蛾科(Arctiidae)的虫草菌中，用组织分离法、基物分离法分离、纯化获取的。

僵虫体(即菌核)的分离：分离前，先用细毛刷轻轻刷去虫体表面泥土，再用75％的乙醇擦洗2～3次，放入接种箱灭菌，0.5h后，无菌操作，将僵虫体从中间分开，取血腔中的菌丝团，接入斜面试管，23～25℃培养，待菌丝长出时，及时在平板上划线纯化，转接入新的斜面培养基中培养，保存。

子座分离：新鲜的子座从僵虫(蛹)体上取下洗净，放入0.1％升汞消毒3min，用无菌水洗涤，切取中、上部组织，挑入斜面培养基中，进行23～25℃培养，待菌丝萌发后，及时挑取菌落前端菌丝，平板上划线纯化，转接入新的斜面培养基中培养，选择菌丝健壮、无杂菌侵染的斜面菌丝保存。

菌丝体性状：

(1)显微结构：光学显微镜下观察，菌丝无色，平滑，分枝，具横隔，宽1.5um～3.2um。分生孢子梗单生在菌丝上，顶生或轮生瓶状产孢细胞。产孢细胞，单生在菌丝上，2～5个着生在分生孢子梗顶端或轮生在分生孢子梗上，无色，基部膨大，向上变尖细，6.5～7.5um×2.5～4um。分生孢子椭圆形或圆柱形，无色，单细胞，直或稍弯曲，平滑，链生，4.3～8.5(-11)um×2.3～3.2um，个别孢子可达17um×3.9um。

(2)培养性状：在PDA平板培养基上25℃培养10天，菌落圆形，平铺，白色，菌丝稀，呈薄绒状，具放射状沟纹，背面接种点呈黄褐色，其它部位非常浅的黄白色，直径4cm～5.2cm。

在PDA斜面培养基上，菌丝为浓白色，气生菌丝旺盛，爬壁能力强，老熟后试管壁上菌丝易变黑。长期存放易产生粉孢子。

液体培养基培养，菌丝为羽绒状均匀分布于培养基内，成熟后，培养基变黄，但清澈透明。

子实体形态特征：

该菌株初淡黄色，草芽状，单生或丛生；成熟后棒状，基部淡褐色，产孢处膨大，形成瓶颈型产孢组织，产生大量分生孢子，呈白色，粉状。分生孢子直或弯曲，大小为3.2～6.5um×2.2～2.6um，子实体切片显微观察未见子囊壳。

一种上述泰山虫草的培育方法，将由上述菌株制得的菌种接种在活体蚕蛹、柞蚕蛹、蝉若虫上，在适宜条件下继续培养直至长出泰山虫草子实体；上述接种方式可采用注射、扎孔、固体种直接接入、自然感染法中的一种。

另一种泰山虫草的培育方法，将由上述菌株制得的菌种接种到固体培养基上，并加入等质量的营养液，在适宜条件下继续培养直至长出泰山虫草子实体；所述固体培养基可为小麦、大米或它们的混合物。

在菌丝培养阶段，温度控制在18～24℃，暗培养，培养时间为4-7天，PH6-9；

子实体形成阶段温度应控制在18-22℃，湿度在70％-90％，并增光培养，直至采收。

附图说明

图为pH值对液体菌丝生长的影响试验。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明：

具体实施方式

以下未述及的技术内容均可借鉴或采用现有的技术方式：

1、菌种的获取

对泰山地区无污染生态环境的寄生于鳞翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)或灯蛾科(Arctiidae)的泰山虫草标样进行广泛采集，获得农艺性状良好的野生蛹虫草子实体，进行初步分类鉴定，标本保存。

采用常规孢子分离法、组织分离法、基物分离法，分离、纯化野生型菌株，菌种鉴定、保存备用。调查过程中，将子座粗壮、新鲜的蛹虫草，从土中取出，装入事先准备好的硫酸纸三角袋中，带回实验室，放入冰箱(4℃)待分离。

僵虫体(即菌核)的分离：分离前，先用细毛刷轻轻刷去虫体表面泥土，再用75％的乙醇擦洗2～3次，放入接种箱灭菌，0.5h后，无菌操作，将僵虫体从中间分开，取血腔中的菌丝团，接入斜面试管，23～25℃培养，待菌丝长出时，挑取符合菌种性状的菌丝及时在平板上划线纯化，转接入新的斜面培养基中培养，保存。

子座分离：新鲜的子座从僵虫(蛹)体上取下洗净，放入0.1％升汞消毒3min，用无菌水洗涤，切取中、上部组织，挑入斜面培养基中，进行23～25℃培养，待菌丝萌发后，及时挑取菌落前端菌丝，平板上划线纯化，转接入新的斜面培养基中培养，选择菌丝健壮、无杂菌侵染的斜面菌丝保存。

上述菌种可根据需要制成液体菌种或固体菌种。

(1)固体菌种的制备固体菌种培养可采用以下培养基：

配方1小麦1000克，蛋白胨10克，硫酸镁1克，磷酸二氢钾1.5克，葡萄糖10克，维生素B0.5毫克，水1000毫升。

按每瓶40克小麦装瓶，其它成分溶入水中，每瓶倒入与小麦等量的水，聚丙稀膜封口，高压灭菌。无菌操作接种，每支斜面母种接6-7瓶。接种后，在20~22℃温度下进行暗培养。500毫升菌种瓶15~20天菌丝在瓶内长满。

(2)液体菌种的制备

在实际生产中，蛹虫草的人工栽培，大多采用液体菌种接种，其培养液可有如下配方：

配方1土豆200克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁1克，磷酸二氢钠1克，VB适量，水1000毫升，PH值6.5。

配方2土豆200克，葡萄糖20克，蛋白胨10克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1000毫升；PH值6.5。

配方2土豆200克，玉米粉30克，葡萄糖20克，蛋白胨3克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.5克，水1000毫升；PH值6.5。

配方3葡萄糖10克，蛋白胨10克，蚕蛹粉10克，奶粉12克，磷酸氢二钠1克，磷酸二氢钾1.5克，水1000毫升；PH值6.5。

配方4玉米粉30克，磷酸二氢钾1克，硝酸钠1克，水1000毫升；PH值6.5。

在500毫升锥形烧瓶内，装培养液150~200毫升，用聚丙稀膜扎封瓶口，在1.3公斤压力下灭菌30分钟。每支母种接种5~6瓶，静止培养24小时后，置于往复式摇床上，在频率110~120次/分、振幅7~9厘米和21~25℃温度条件下，振荡培养4~6天后备用。若无摇床，可人工摇瓶，每天两次，每次30分钟。培养好的液体菌种有大量菌丝球，培养液清亮，有浓郁虫草香味。若发现培养液浑浊，应禁止使用。

2、菌株培育

方法1    活虫体人工培育(全草种植)

将菌种接种到活体寄主上，活体寄主可选用柞蚕蛹、蚕蛹、蝉若虫等，优选柞蚕蛹或蚕蛹。

虫体接种可选用以下方法：一是注射法。在供接种用的液体菌种内，加入灭菌的玻璃珠或玻璃碎片，充分摇动，将菌丝球打碎成菌丝碎片。用无菌注射器吸取菌液，注入体表灭菌蚕蛹的节间膜，每个蛹注入菌液0.2～0.5毫升，随即放入灭菌的罐头瓶中，用薄膜封口培养。二是组织块法。用灭菌解剖刀在体表消毒后的蛹体节间膜处割开一个长0.2～0.3厘米的小口，然后挑取米粒大小的菌块塞入蛹体创口处包好，放入灭菌罐头瓶内封口培养。三是涂抹法。用毛笔或棉球蘸取菌液，涂刷在经消毒的蛹体表面，反复涂数次，放入灭菌罐头瓶内培养。

                  表1  不同虫体接种试验

  大豆天蛾  蝉若虫  柞蚕蛹  蚕蛹  接种数量  感染虫数  感染率(％)  出原基时间(d)  子实体长度(cm)  50  15  30  30  27  90％  30  1.5～3.5  60  58  96.7％  17～20  4.5～9.5  60  56  93.3％  14～17  3.5～7.5

注：出原基时间为从接种到出原基

将接种后的罐头瓶排放在干净的培养室内。在室温10~25℃，相对湿度60％~85％，无光，保持通风的条件下培养。被感染的蚕蛹，从接种到死亡需10~15天。接种20天左右，蛹体节间膜出现突起物，如小米粒状，淡黄色，即子实体原基。此时应提供适宜子实体发育的环境条件，促进子实体生长发育。10天后，子实体逐渐伸长，此时要加强通风，增加光照，保持空气相对湿度在85％~90％之间，室温18~25℃，并将瓶口塑料薄膜松开通风换气，防止霉烂。

接种后35~45天培养，子实体成熟，高3~8厘米，呈淡黄白色，外包一层白色粉末时开瓶采收。经低温(30℃)以下烘干保藏。

方法2    代料培养基培育

营养液配方：每一千毫升水中加入马铃薯20g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄ 1.5g、VB₁ 0.1mg，pH值为6-9；还应加入适量的碳源和有机氮源，上述碳源可选用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖中的一种或几种，有机氮源可选用蛋白胨、蚕蛹粉、麸皮中的一种或几种。

固体基可有以下配方(配比均为重量配比)：

配方1小麦98％，蛋白胨(蛹蛋白)2％，另加维生素B微量。

配方2大米98％，蛋白胨(蛹蛋白)2％，另加维生素B微量。

配方3大米68.5％，蚕蛹粉10％，小麦15％，蔗糖5％，蛋白胨1.5％；另加维生素B微量。

配方4大米50％，小麦35％，蔗糖2％，蚕蛹粉6％，硫酸镁1％。，0.1％的维生素B。

配方5大米90％，小麦10％。0.2％的蛋白胨，0.1％的磷酸二氢钾，0.05％的硫酸镁。

配方6大米70％，小麦30％。另加总重量1％的葡萄糖，1％的蚕蛹粉1％，1％的蛋白胨，0.1％磷酸二氢钾，0.05％的硫酸镁，维生素B微量。

装瓶、灭菌    用500毫升罐头瓶装料，每瓶装干料约35~45克，辅助原料加入水中调匀，每瓶加水45~50克。瓶口用聚丙稀薄膜包扎封口，在0.12兆帕压力下灭菌45分钟，或于100℃温度常压下维持4~6小时。灭菌后培养基要求上下湿度一致，培养基间有空隙，不能呈糊状。

接种  培养基冷却至30℃以下时，在无菌条件下接种(无菌过程参考母种接种)。每瓶接种固体菌种10克，或液体菌种10毫升。

以小麦为主要基质，添加其他辅助成分，用于培养菌丝体和子实体，生产周期为35~50天，较其它培养基提前10天左右，可采收2次。除子实体之外，培养基培养的菌丝体亦含有与子实体相似的生物活性成分及维生素，可供药用或作食品加工原料。

培养接种后，将栽培瓶置于清洁避光的环境中暗培养。保持室温在16~21℃，空气相对湿度控制在65％左右，待料面菌丝布满90％左右时，室内应增加光照，白天利用自然散射光，保持在200勒克斯左右；夜间用日光灯作光源。每天光照时间不少于10小时，以促进菌丝转色和刺激原基形成。当培养基表面及四周有淡黄色色素出现，并有大小不一的圆丘状隆起时，为子实体即将形成的前兆。此时室内温度应保持在19~25℃之间，并提高空气相对湿度至85％~90％。蛹虫草有明显的趋光性，因此，在子实体形成后，应根据情况适当调整培养瓶与光源的相对方向，或调整室内光源方向，使受光均匀，以保证子实体的正常生长，提高产量和质量。子实体生长期间要适当通风，补充新鲜空气。整个培养期不揭去封口塑料薄膜，可在塑料薄膜上用针穿刺小孔，以利瓶内气体交换。

采收及加工当子实体长高到5~8厘米时即停止生长，表面可见白色粉末状物，此时应及时采收，以防采收过迟，子实体枯萎。采收时，用无菌手术镊子将子实体从培养基上摘下。采收后，10~20天后可长出第二批子实体。

子实体采收后，将子实体根部整理干净，及时晒干、低温下烘干或冻干。然后喷雾使其回软，整理平直后扎成小捆，用防潮包装保藏。

3、泰山虫草与北虫草品种对比试验：

菌种：A、北虫草；B、泰山虫草。设平板培养、液体培养、代料培养三种培养方式进行对比。表2、3、4的结果表明：泰山虫草菌比北虫草发菌速度快，且菌丝浓密、粗壮；泰山虫草菌丝体在液体培养条件下为羽毛状，引进北虫草菌丝体绒状；在相同的液体培养基和培养条件下，泰山虫草生长快；泰山虫草菌丝体较其他菌种在大米培养基中发菌快，出原基早，而且接近或超过北虫草，泰山虫草较其他品种抗逆性强，对光线要求不高，栽培成功率高。

              表2  虫草菌在加富PDA培养基上生长情况

  A  B  菌丝长势  菌丝长速(mm/d)  浓密、壮  5.97  浓密，粗壮  6.01

              表3  虫草菌在液体培养基中生长情况

  A  B  接种24h  48h菌丝形态  5天菌丝量(g/100ml)  萌发  绒状  0.93  萌发  羽毛状  1.04

         表4  虫草菌在大米培养基中生长情况

  A  B  接种24h  气生菌丝  发菌速度  污染率(％)  见光变色情况  室内自然光照  白天增加日光灯照  射出原基时间(d)  萌发  强  +++  2.2  橘红色  不出原基  21  萌发  强  +++  0.56  淡黄白色  出原基  19

4、人工培养泰山虫草有效成分化验分析

由表可以看出，泰山虫草人工培养子实体虫草素分析证明(表5)：泰山虫草含有虫草素，且含量超过天然冬虫夏草，是天然冬虫夏草的2倍；尿苷含量为0.160％，腺苷含量为0.063％，腺膘呤含量为0.016％，尿嘧啶含量为0.005％，均高于天然冬虫夏草。说明泰山虫草可以代替天然冬虫夏草，进行大量开发，这对于保健品和医药品产业开发，缓解日益昂贵的天然冬虫夏草供需矛盾，保护野生资源，维护生态平衡和生物多样性，保护生态环境都具有显著的经济和社会效益。

                            表5  核苷含量％(n＝3)

  名称  尿苷  腺苷  腺膘呤  虫草素  尿嘧啶  天然冬虫夏草  泰山虫草  0.075  0.160  0.053  0.063  0.008  0.016  0.006  0.012  0.004  0.005

                            表6  微量元素含量测定

  检测项目  天然冬虫夏草  泰山虫草  铝(Aluminum)  硼(Boron)  钡(Barium)  钙(Calcium)  铬(Chromium)  铜(Coppetr)  铁(Iron)  钾(Potassium)  镁(Magnesium)  锰(Manganese)  钼(Molybdenum)  钠(Sodium)  镍(Nickel)  磷(Phosphurus)  钛(Titanium)  锌(Zinc)  硫(Sulfur)  汞(Melenium)  硒(Selenium)  氮(Nitrogen)  2.4mg/kg   0.29mg/kg  1220.9mg/kg   11.62mg/kg  1998.1mg/kg  9396mg/kg  1492mg/kg  0.201mg/kg   1001.2mg/kg  0.892mg/kg  278mg/kg  ＜0.5mg/kg  301.6mg/kg    0.383mg/kg  20.9mg/kg  1.85mg/kg  1.00mg/kg  954mg/kg  0.14mg/kg  17.7mg/kg  38.0mg/kg  13145mg/kg  3562mg/kg  15.2mg/kg  0.66mg/kg  80.9mg/kg  0.33mg/kg  8830mg/kg  0.16mg/kg  199.5mg/kg  5545mg/kg  0.032mg/kg  0.12mg/kg  11.39％

微量元素分析证明(表6)，泰山虫草所含微量元素种类超过天然冬虫夏草；泰山虫草钾元素含量为13145mg/kg，天然冬虫夏草钾元素含量为9396mg/kg，两者之差为3749mg/kg。缺钾是糖尿病的发病原因之一，因此该菌株可考虑开发为糖尿病人的专用食品添加剂或药物。汞元素含量为0.032mg/kg，仅占国家标准中食用菌卫生标准GB 7096-1996规定的0.2mg/kg的0.16。人工培养的蛹虫草含有微量汞，这与所用蚕蛹在饲养过程中所用饲料、水等遭受环境污染有关，在选择蚕蛹时，用无污染蚕蛹是保证人工培养泰山虫草高质量的重要措施。

氨基酸含量分析结果(表7)，天然冬虫夏草含有16种氨基酸，而泰山虫草含有19种氨基酸，且总含量为22.584mg/100mg超过天然冬虫夏草(20.12mg/100mg)；泰山虫草除含有人体必须的8种氨基酸外，还含有牛磺酸、γ氨基丁酸等特殊成分，牛磺酸、γ氨基丁酸是广普消炎、止痛药物。因此泰山虫草比天然冬虫夏草更具药用价值。

                    表7  氨基酸含量测定

  氨基酸含量  天然冬虫夏草中氨基酸  含量(mg/100mg)  泰山虫草中氨基酸  含量(mg/100mg)Asp(门冬)Thr(苏)Ser(丝)Glu(谷)Gly(甘)Ala(丙)Cys(胱)Val缬)Met(蛋)Ile(异亮)Leu(亮)Tyr(酪)Phe(苯丙)Lys(赖)His(组)Arg(精)Pro(脯)Tau(牛磺酸)γ-ABC(γ氨基丁酸)总含量  2.19  1.10  1.07  3.50  1.04  1.27   1.11  0.40  0.76  1.26  0.64  0.69  1.73  1.07  1.91  1.19    20.12  1.683  1.137  0.959  2.070  1.091  1.487  0.388  0.928  1.282  0.593  0.894  2.264  0.793  1.654  0.642  1.268  3.053  0.118  0.280  22.584

本发明较已有技术相比主要具有以下优点和积极效果：

1、菌丝生长所需要的温度范围比较广，10～30℃范围内均能生长；如图所示，泰山虫草菌丝在pH值为12时，能正常生长，说明该菌株耐碱性能力强，也可以说该菌株适应环境能力强；

2、泰山虫草在菌丝发菌速度、抗逆性、子实体产量上均超过现有品种，易人工培养，且在4℃条件下经冷藏一年期内菌种生活力仍然较强。

3、通过泰山虫草有效成分化验分析证明，人工培养的泰山蛹虫草含冬虫夏草的特征性成分--虫草素，且含量超过天然冬虫夏草。其他成分如腺嘌呤、腺苷、尿苷、氨基酸及一些微量元素含量均高于冬虫夏草。特别是钾元素的含量高于冬虫夏草和其他蛹虫草，缺钾是糖尿病的发病原因之一，因此该菌株可用于糖尿病人专用食品添加剂或药物的开发；

4、上述培养方法中，以小麦作为培养基主料时，产量最高、且生产周期短，易于降低成本和在北方地区种植；

5、蝉若虫活体培养该菌株能出子实体(即蝉花)，可进一步研究利用。