一株利迪链霉菌及其在植物病害生物防治中的应用

摘要

本发明公开了一株利迪链霉菌及其应用。该菌株是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654。该菌株经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备广谱性抗植物真菌病害的生防制剂，用于植物气传真菌病害的生物防治。

说明书

技术领域

本发明涉及一株利迪链霉菌及其应用，特别涉及该株利迪链霉菌及其在植物病害生物防治中的应用。

背景技术

真菌所引致的植物病害占所有植物病害的80％以上，许多重大病害对农业生产造成的损失惨重，如果蔬类作物的灰霉病、炭疽病、番茄叶霉病、水稻稻瘟病、玉米大小斑病、小麦赤霉病等。其中由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是蔬菜保护地栽培普遍发生的一种世界范围的流行性重要病害，近年其危害的作物种类不断增加，目前已成为番茄、黄瓜、茄子、西葫芦、甜椒、辣椒、菜豆、韭菜、草莓、葡萄等果蔬的主要病害或首要病害，常造成果实腐烂，损失严重。欧美、澳洲、非洲、日本、印度等国家因灰霉病引致的田间产量损失一般20-30％，我国黄淮东北和西北温室集中的地方蔬菜灰霉病发生严重，田间产量损失30％左右，严重的达50-70％。目前蔬菜生产中对灰霉病尚无理想的抗源材料，抗病育种进展缓慢，因此该病的防治仍依赖于化学药剂。但是长期大量应用化学农药，不但严重污染人们的生活环境、破坏生态平衡、威胁人畜的健康和安全，而且也导致病原生物抗药性的产生，致使病害再度猖獗而更难防治。据报道，近年来，防治灰霉病的两类主要农药苯并咪唑类和二甲酰亚胺类的一些药剂已引起灰霉病菌的抗药性，使其田间防效明显下降。同时，果蔬产品的农药残留超标也构成了其出口创汇的重要障碍。而微生物农药源于自然，具有环境兼容性好、持效期长、低毒、对人畜和天敌安全等特点，同时其资源丰富，是植物尤其是果蔬病害控制的重要绿色环保途径之一，符合可持续农业发展的要求。因此，近年微生物农药在全球范围内得到了迅速发展。

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus DeBoer et al.)是习居于土壤的腐生微生物，已有多年的研究历史，作为链霉菌的一种，此菌能够产生多种抗菌活性物质。其著名的代表菌株是S.lydicus NRRL2433，该菌株在医药领域研究和应用广泛，能够产生具有广谱抗细菌和分枝杆菌作用的利迪霉素(Lydimycin)和抗革兰氏阳性细菌和分枝杆菌的利迪链菌素(Streptolydigin)。在植物病害防治上应用较广的菌株是S.lydicus WYEC 108，此菌株最初分离自英国农业土壤，其能够定殖在植物的根尖部位，主要以重寄生的方式作用于土传病害的病原菌，包括腐霉菌(Pythium)、丝核菌(Rhizoctonia)、镰刀菌(Fusarium，)、轮枝菌(Verticillium)、顶囊壳(Gaeumannomyces)等属真菌的种类，也能分泌几丁质酶(chitinase)破坏真菌的细胞壁。在国外该菌株已开发出活菌制剂用于植物根腐病、种子腐烂病等病害的生物防治。

发明内容

本发明的目的是提供一株新的利迪链霉菌，该菌株经过发酵后产生具有强烈抑菌作用的活性代谢产物，该活性代谢产物可用于制备广谱性抗植物真菌病害的生防制剂，用于植物气传真菌病害的生物防治。

本发明所提供的利迪链霉菌，是利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02，已于2006年03月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCC No.1654。

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，是从北京远郊天然次生林土壤中分离得到的。具体方法如下：从北京远郊天然次生林地采集土样，取10g加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100转/min摇床上振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次稀释10^-2，10^-3，10^-4倍，分别取以上土壤悬液0.1ml在高氏一号培养基平板上均匀涂布，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置于28℃恒温箱中培养5-10天，挑取放线菌单菌落进行稀释划线分离纯化。以灰霉病菌等病原真菌为靶标菌，利用平板对峙培养法进行拮抗菌的初筛；对初筛获得的有拮抗性的菌株进行摇瓶发酵培养，发酵液经0.45μm的无菌微孔滤膜过滤除菌获得无菌发酵滤液；进一步测试该无菌发酵滤液对病原菌菌丝生长、孢子萌发的抑制作用和温室防病效果，最终筛选出性状优良的生防菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654。

综合利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的形态学特征、培养特性、生理生化特性和16SrDNA序列分析的结果，将其鉴定为利迪链霉菌。具体鉴定结果如下：

(1)菌体的形态特征

革兰氏染色阳性；在GYM琼脂、JCM42^#琼脂、燕麦粉琼脂等培养基上生长7天后，基内菌丝发育良好，无横隔，不断裂；气生菌丝生长良好，多分枝；孢子丝柔曲或弯曲，孢子椭圆形。

(2)培养特性

在6种固体培养基上的培养特性如表1所示。

表1利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的培养特性

 培养基  气生菌丝  基内菌丝  可溶色素 高氏合成1号琼脂 ISP4琼脂 GYM琼脂 Bennett’s琼脂 JCM42^#培养基 燕麦粉琼脂  浅灰白  灰黄  灰白至灰黄  灰白  浅灰黄  灰白  微黄  黄褐  橙褐  黄褐  黄褐  褐灰  无  无  浅棕  浅黄  黄  黄

(3)生理生化特性

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的生理生化特性如表2所示。

表2利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的生理生化特性

  特性  结果  特性  结果  I.生长及其它  3％NaCl  5％NaCl  7％NaCl  10％NaCl  45℃   纤维素分解  淀粉水解  七叶苷降解  明胶液化  柠檬酸盐产酸  II.碳源利用  甘露糖  葡萄糖  甘露醇   +  +  W  -  -  -  -  +  +  -   W  +  +  II.碳源利用  山梨醇  山梨糖  菊糖  果糖  乳糖  半乳糖  阿拉伯糖  核糖  鼠李糖  棉子糖  蔗糖  木糖  肌醇  α-甲基-D-葡萄糖苷  丙二酸盐   +  -  -  W  +  +  -  -  -  +  +  -  +  W  -

注：“W”表示弱阳性结果；“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。

4.16SrDNA序列分析

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的部分16SrDNA序列如序列表中序列1所示。与GenBank中相关序列Blast比较的结果表明其属于链霉菌属；利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的16SrDNA序列与目前发表的利迪链霉菌相关菌株相比相似性很高，为99.9％。

本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654能够向培养基中产生大量的生物活性物质。平板对峙培养试验表明这种活性代谢产物对灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternayia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola)、大葱紫斑病菌(Alternaria poprri)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)等多种植物真菌性气传病害的病原菌有明显的抑制作用；但通过平板打孔法和滤纸片法测定抑菌圈的实验表明，其对黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)、辣椒疮痂病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌无抑菌活性；经培养皿中直接对峙培养观察和菌核重寄生试验证明，该菌株不具菌寄生性。可见它的抗菌谱与前述已知菌株S.lydicus NRRL2433明显不同，其主要抑菌作用方式则与WYEC 108的不同。

利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，接种于种子培养基，28℃，200rpm/min摇瓶培养24h-30h后，按5％(体积比)的种子量接种发酵培养基，装液量以三角瓶体积的1/5为标准，在31℃条件下，以13mm的旋转半径，240rpm/min的转速摇瓶发酵96h，可使该菌株在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物，其发酵液的无菌滤液对灰霉病菌的抑菌圈直径可达40mm以上，温室盆栽防病效果为82％-90％。

本发明的另一个目的是提供一种抗植物真菌病害的生防制剂。

本发明所提供的抗植物真菌病害的生防制剂，是发酵利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654得到的代谢产物。

所述代谢产物可从除去利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654菌体的发酵滤液中获得。

所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654发酵培养基的pH为7-8，由如下物质配成：15g黄豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，1g碳酸钙，加水定容至1000ml。其中，所述15g黄豆粒是将15g黄豆粒加水煮沸0.5-1h，取滤液。

所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的发酵温度可为28-31℃。

所述发酵中的通气量可由装液量为摇瓶体积的1/5，13mm旋转半径240rpm/min振荡的条件控制；发酵时间可为90-100小时。

本发明还提供了上述抗植物真菌病害的生防制剂的制备方法。

本发明所提供的抗植物真菌病害的生防制剂的制备方法，是发酵利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，从其发酵液中分离得到的代谢产物即为抗植物真菌病害的生防制剂。

所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654发酵培养基的pH为7-8，由如下物质配成：15g黄豆粒，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，1g碳酸钙，加水定容至1000ml。其中，所述15g黄豆粒是将15g黄豆粒加水煮沸0.5-1h，取滤液。

所述利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的发酵温度为28-31℃；所述发酵中的通气量可由装液量为摇瓶体积的1/5、13mm旋转半径240rpm/min振荡培养的条件控制；发酵时间为90-100小时。

实验证明，本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的无菌发酵滤液(抗植物真菌病害的生防制剂)对番茄灰霉病和甜椒灰霉病均有很好的防效；其2倍稀释液对二者的平均防效分别达89.34％和90.04％，方差分析和均值多重比较结果表明其效果显著高于目前生产上灰霉病防治的优良用药50％灰康悬浮剂；其5倍稀释液对二者的平均防效分别达83.63％和82.74％，与灰康的防效无显著差异。因此，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654和用它制备的抗植物真菌病害的生防制剂在果蔬灰霉病的防治中有良好的应用前景。

本发明的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的无菌发酵滤液(抗植物真菌病害的生防制剂)对番茄和甜椒种子的萌发和生根有明显的促进作用，对其它供试作物的种子萌发没有抑制作用。

附图说明

图1为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654与黄瓜灰霉病菌的平板对峙培养实验

图2为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵滤液抑制番茄灰霉病菌菌丝生长的平板照片

图3为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对番茄灰霉病菌产生的抑菌圈的平板照片

图4为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对番茄灰霉病菌分生孢子萌发的抑制作用照片

图5为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654发酵滤液对番茄灰霉病的温室防效照片

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实现本发明所采用的培养基具如下所述：

1、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654平板分离和斜面保存采用高氏一号培养基：K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，KNO₃ 1.0g，FeSO₄·7H₂O0.01g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，水1000ml；pH 7.2-7.4。

2、平板对峙培养采用PDA培养基：马铃薯200g，蔗糖10-20g，琼脂17-20g，水1000ml；pH自然。

3、经正交试验优化得到的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654发酵培养基：15g黄豆粒(加蒸馏水煮沸0.5-1h，取滤液)，5g蛋白胨，2.5g硫酸铵，10g蔗糖，10g淀粉，0.25g硫酸镁，0.2g磷酸二氢钾，5g氯化钠，配成水溶液，调pH7-8后，加1g碳酸钙，加水定容至1000ml。0.10342Mpa灭菌20min。

4、种子培养基：将发酵培养基配方中的10g蔗糖代之以20g葡萄糖，其它成分不变。

实施例1、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌种培养和抗植物真菌病害的生防制剂样品制备

将利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654接种到上述高氏一号斜面培养基上，28℃培养7-10天，待其产生足量的孢子，用无菌铂环刮取其孢子2-3环接种于250ml三角瓶内的50ml上述种子培养基内，置可控温摇床上，在28℃条件下，200rpm/min(旋转半径13mm)恒温振荡培养24h-30h；然后在无菌条件下将其分接于10个500ml三角瓶内的上述发酵培养基内(每瓶装液量为100ml)；接种后的摇瓶在31℃条件下，以240rpm/min(旋转半径13mm)的转速振荡培养96h；此时菌株已在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物。

将以上步骤获得的发酵液5000rpm/min离心10-15min沉降菌丝体及固形物，上清液用0.45μm的无菌微孔滤膜过滤，收集滤液(该滤液中无利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌体)，该利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的无菌发酵滤液即为抗植物真菌病害的生防制剂样品，置4℃贮存备用。

实施例2、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654及其代谢产物的抑菌活性试验

在本实施例中供试的培养基有：高氏一号培养基、PDA培养基、种子培养基和发酵培养基，其组成均如上所述；供试靶标病原菌为灰葡萄孢菌(Botrytis cinereaPers.)的3个菌株，即黄瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌。

1.平板菌落的抑菌活性试验采用平板对峙培养法，先将固体斜面上利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的孢子用无菌水制成菌悬液，取200-500μl菌悬液均匀涂在直径90mm的高氏一号固体平板上，28℃培养2-4d，使其长满平板；用直径7mm的无菌打孔器打制菌饼，然后在事先准备好的PDA平板一侧接种利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654菌饼，另一侧对称位置接种无拮抗性的对照菌株菌饼，28℃培养2天后，以同样的方法利用PDA平板打制靶标病原菌菌饼；在上述已接种好利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654和对照菌株的PDA平板中央接种靶标病原菌菌饼，28℃下培养，观察拮抗反应。每处理三个重复。

对峙培养的结果如图1所示，接种靶标病原菌4天后在利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654与靶标菌株黄瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌及甜椒灰霉病菌菌落之间产生明显的抑菌带，其宽度分别为20.9mm、21.2mm和22.4mm，且抑菌带宽度不随时间的推移而改变；而在对照菌株与靶标病原菌菌落间则无抑菌带产生(图1)。图1中，A02为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654，黄灰为黄瓜灰霉病菌，CK为无拮抗性的对照菌株。

2.菌株代谢产物抑菌活性测定

采用实施例1的方法制备利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的供试真菌抑制剂(无菌发酵滤液)，然后分别测定以下指标：

(1)菌丝生长速率抑制测定：将制备好的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵液与PDA培养基混合，分别制备成含有5，10，20，100，200倍稀释发酵液的PDA平板，以含有相应稀释倍数发酵培养基的PDA平板为对照；平板中央接种番茄灰霉病菌菌饼，28℃下培养，分别在第1，2，3，4，5天用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。每处理三个重复。

实验结果如表3所示，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654不同浓度无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌菌丝生长均有显著的抑制作用，其抑制率随着发酵滤液稀释倍数的增加而降低，随着时间延长而有所下降。在处理后经120h，其5倍和10倍稀释液对病原菌菌丝生长的抑制率仍达100％，即可以完全抑制番茄灰霉病菌的生长(图2)。图2中，CK为未接种利迪链霉菌(Streptomyceslydicus)A02 CGMCC No.1654的发酵培养基，5倍、10倍、20倍、100倍、200倍分别为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵液的稀释倍数。

表3利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌菌丝生长速率的抑制

  处理后  时间  (h)  CK       200倍液        100倍液        20倍液        10倍液        5倍液  菌落直径  (mm)  菌落直径  (mm)  抑制率  (％)  菌落直径  (mm)  抑制率  (％)  菌落直径  (mm)  抑制率  (％)  菌落直径  (mm)  抑制率  (％)  菌落直径  (mm)  抑制率  (％)  24  72  120  16.5  65.3  85.0  15.2  61.4  80.5  7.8  6.0  5.3  0.0  31.8  57.1  100  51.3  32.8  0.0  0.0  7.3  100  100  91.4  0.0  0.0  0.0  100  100  100  0.0  0.0  0.0  100  100  100

注：CK为含有相应稀释倍数发酵培养基的PDA平板对照。

(2)抑菌圈测定：采用平板打孔法。刮取PDA平板上培养产生的番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌的分生孢子，用无菌水制成菌悬液，均匀地涂于新制备的PDA平板上，置超净工作台内吹干；用直径7mm的无菌打孔器在平板四周对称位置打孔，然后每孔中注入利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的无菌发酵滤液100μl，以未接种利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的发酵培养基为对照；28℃下培养3d，十字交叉法测量抑菌圈直径。每处理三个重复。

实验结果表明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵滤液在PDA平板上可对番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌均产生明显的抑菌圈，其三次重复的抑菌圈平均直径分别为41.0mm和40.4mm(图3)。图3中，A、B、C为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵滤液；D为对照。

(3)孢子萌发抑制率测定：刮取平板上产生的番茄灰霉病菌分生孢子，用发酵培养基配成10×10倍显微镜下每视野50-100个孢子的菌悬液，然后用其将利迪链霉菌A02(CGMCC No.1654)的无菌发酵滤液稀释成5倍、10倍、20倍、100倍、200倍等5个不同浓度的处理，以不接种利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654的发酵培养基为对照，用无菌凹玻片在28℃下静置培养，分别于处理后4h，8h，12h，24h镜检孢子萌发情况，以芽管长度超过分生孢子直径的一半作为萌发标准，统计萌发数量并计算萌发抑制率；每处理三个重复。

结果表明利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对番茄灰霉病菌分生孢子萌发的抑制作用十分显著(如表4)；其无菌发酵滤液稀释倍数≤20时几乎可以完全抑制病菌孢子萌发；稀释倍数大于20倍而小于100倍时，虽不能完全抑制孢子萌发，但可显著降低其萌发率和芽管伸长速度；100倍稀释液对孢子萌发后的芽管顶端具有明显的致畸抑制作用，使其至少在24h内不再继续伸长，失去侵染寄主的能力(图4)。图4中，1为利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654无菌发酵滤液的100倍稀释液处理后24h；2为对照处理后24h。

表4S.lydicus A02无菌发酵滤液对番茄灰霉病菌分生孢子萌发的抑制

  处理后  时间  (h)  CK        200倍液        100倍液        20倍液        10倍液          5倍液  萌发率  (％)  萌发率  (％)  抑制率  (％)  萌发率  (％)  抑制率  (％)  萌发率  (％)  抑制率  (％)  萌发率  (％)  抑制率  (％)  萌发率  (％)  抑制率  (％)  4  12  24  21.5  89.7  95.1  13.9  62.1  67.8  35.3  30.8  28.7  8.2  35.9  42.2  61.9  60.0  55.6  0.0  0.0  4.8  100  100  95.0  0.0  0.0  0.0  100  100  100  0.0  0.0  0.0  100  100  100

实施例3、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的温室防病实验

供试靶标病原菌：番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌

供试作物品种；中蔬6号番茄、茄门甜椒

供试对照药剂：50％灰康悬浮剂(农药登记号Ls20041062，内蒙古清源保生物科技有限公司)

按照实施例1的方法制备利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654的无菌发酵滤液。番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌在PDA平板上22℃培养7-10天，待其长出大量分生孢子后，用无菌水洗下孢子，配制成10×10倍镜下每视野30-50个孢子的菌悬液备用。

实验设4个处理：利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的无菌发酵滤液5倍稀释液和2倍稀释液(A02发酵滤液(5×)和A02发酵滤液(2×))；50％灰康悬浮剂1000倍稀释液(50％灰康(1000×))；清水对照。每个处理15株苗，三次重复；各处理随机排列。

在番茄和甜椒苗长至现蕾开花期接种，先均匀喷施各处理药剂和清水对照，以叶面滴水为度；待叶面稍干后，再喷雾接种番茄灰霉病菌和甜椒灰霉病菌的孢子悬液。接种后用塑料薄膜遮盖，并以加湿器加湿，22℃条件下保湿48小时；去掉遮盖后，经常喷水勿使过干。接种后第7-10天调查发病情况，计算发病率、病情指数和防治效果，并利用统计分析软件SPSS11.0，选择Duncan法对实验结果进行方差分析和多重比较。

病情调查以叶片为单位进行普查，病害分级标准如下：

0级：无病斑；

1级：单叶片有病斑3个；

3级：单叶片有病斑4-6个；

5级：单叶片有病斑7-10个；

7级：单叶片有病斑11-20个，部分密集成片；

9级：单叶片有病斑密集占叶面积25％以上；

病情指数＝〔∑(各级病叶数×相对级数值)/(调查总叶数×9)〕×100

防治效果(％)＝〔(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数〕×100

实验数据及统计分析结果如表5至表8和图5。图5中，1为50％灰康(1000×)；2为A02发酵滤液(2×)；3为A02发酵滤液(5×)；4为清水对照。

表5.利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654发酵滤液对番茄灰霉病的温室防治效果

  代号  处理  平均发病率  (％)            病情指数  平均防效  (％)  重复1  重复2  重复3  平均  A  50％灰康(1000×)  37.79  13.11  12.96  13.72  13.26  83.11  B  A02发酵滤液(5×)  43.83  13.88  12.69  11.97  12.85  83.63  C  A02发酵滤液(2×)  36.56  7.93  8.24  8.95  8.37  89.34  D  清水对照  96.83  75.38  78.50  81.66  78.51

表6Duncan法对表5进行均值多重比较齐次子集结果

  处理 样本含量 (重复次数   临界值取0.05时的齐次子集  1  2  3  C 3  8.3733  B  3  12.8467  A  3  13.2633  D  3  78.5133  概率值  1.000  0.768  1.000

表7.利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654发酵滤液对甜椒灰霉病的温室防治效果

  代号  处理  平均发病率  (％)            病情指数  平均防效  (％)  重复1  重复2  重复3  平均  A  50％灰康(1000×)  18.22  4.13  4.03  3.99  4.05  84.11  B  A02发酵滤液(5×)  16.54  4.38  4.65  4.17  4.40  82.74  C  A02发酵滤液(2×)  12.05  2.42  2.63  2.58  2.54  90.04  D  清水对照  43.37  26.01  24.89  25.59  25.49

表8Duncan法对表7进行均值多重比较齐次子集结果

  处理  样本含量  (重复次数      临界值取0.05时的齐次子集  1  2  3  C  3  2.5433  A  3  4.0500  B  3  4.4000  D  3  25.4967  概率值  1.000  0.210  1.000

表5-8表明，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的发酵滤液对番茄灰霉病和甜椒灰霉病均有很好的防效；其2倍稀释液对二者的平均防效分别达89.34％和90.04％，方差分析和均值多重比较结果表明其效果显著高于目前生产上灰霉病防治的优良用药50％灰康悬浮剂；其5倍稀释液对二者的平均防效分别达83.63％和82.74％，与灰康的防效无显著差异。因此，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654和用它制备的抗植物真菌病害的生防制剂在果蔬灰霉病的防治中有良好的应用前景。

用按照实施例1的方法制备的利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCCNo.1654无菌发酵滤液处理番茄、甜椒、黄瓜、白菜、茄子、甘蓝、小麦、玉米等8种植物种子，结果表明该生防制剂对番茄和甜椒种子的萌发和生根有明显的促进作用，对其它供试作物的种子萌发没有抑制作用。

实施例4、菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654抑菌谱的测定

采用实施例2中的平板对峙培养法，在PDA平板上检测利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对17个供试靶标植物病原真菌菌株的抑制作用，并利用SPSS软件进行方差分析和多重比较。结果如表9所示，利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对供试的全部病原菌均有明显的抑制作用；这些病原菌共9属12种，几乎在半知菌亚门两大纲的各个目中均有分布；它们对利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的敏感性有一定的差异，Duncan法多重比较的结果将其分为7个齐次子集；总的看灰霉病菌的6个菌株和番茄早疫病菌、小麦赤霉病菌、瓜类炭疽病菌的敏感性较高。

本实施例中供试靶标仅仅是随机选用的植物病原真菌的少数代表种，而它们无一例外地对利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654具有敏感性；可见本发明的菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的抑菌谱不会受此限制，至少其对半知菌类应该是广谱的。

表9利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654对供试病原菌的拮抗试验

  序号  供试病原菌  抑菌带均值  (mm)  差异  显著性  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  甜椒黑斑病菌(Alternaria alternata)  大葱紫斑病菌(Alternaria poprri)  番茄早疫病菌(Alternaria solani)  番茄灰斑病菌(Ascochyta lycopersici)  黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)  番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)  甜椒灰霉病菌(Botrytis cinerea)  茄子灰霉病菌(Botrytis cinerea)  草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)  葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)  瓜类炭疽病菌(Colletotrichum orbicular)  辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)  玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)  番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)  小麦赤霉病菌(Fusarium graminearium)  茄子褐纹病菌(Phomopsis vexans)  稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)  16.6  15.7  22.4  17.5  20.9  21.2  22.4  21.5  19.5  20.8  18.7  17.9  17.3  16.8  21.7  17.4  16.6  fg  g  a  ef  b  b  a  ab  c  b  cd  de  ef  f  ab  ef  fg

注：字母a-g分别代表7个齐次子集，凡标有同一字母的各菌株归在同一子集内，其对菌株利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)A02 CGMCC No.1654的敏感性无显著差异

                                 序列表

<160>1

<210>1

<211>1361

<212>DNA

<213>利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)

<400>1

gtcgaacgat gaacctcctt cgggagggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg    60

caatctgccc ttcactctgg gacaagccct ggaaacgggc tctaataccg gatacgacac    120

ggggtcgcat gacctccgtg tggaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc    180

agcttgttgg tggggtgatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg    240

accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat    300

attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg    360

ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg agagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg    420

gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt    480

gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc    540

cgggtctgca ttcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg ggagatcgga attcctggtg    600

tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcgga tctctgggcc    660

gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc    720

cacgccgtaa acgttgggaa ctaggtgtgg gcgacattcc acgtcgtccg tgccgcagct    780

aacgcattaa gttccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga    840

cgggggcccg cacaagcagc ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta    900

ccaaggcttg acatacaccg gaaaaccctg gagacagggt cccccttgtg gtcggtgtac    960

aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga    1020

gcgcaaccct tgttctgtgt tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga    1080

ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc    1140

ttgggctgca cacgtgctac aatggccggt acaatgagct gcgataccgc gaggtggagc    1200

gaatctcaaa aagccggtct cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg    1260

gagttgctag taatcgcaga tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca    1320

caccgcccgt cacgtcacga aagtcggtaa cacccgaagc c                        1361