法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-05-07
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N33/53 授权公告日:20100721 终止日期:20130313 申请日:20060313
专利权的终止
2011-08-10
著录事项变更 IPC(主分类):G01N33/53 变更前: 变更后: 申请日:20060313
著录事项变更
2010-07-21
授权
授权
2006-10-11
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-08-16
公开
公开
(一)技术领域
本发明涉及的是一种酶抗体结合物及其制备方法,具体地说是辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体。
(二)背景技术
酶免疫检测技术是以酶的反应放大作用和抗原-抗体特异性结合特性为原理、以酶抗体和/或抗原结合物为基础的一种新型检测技术。其包括酶免疫组织化学染色和酶免疫检测技术(包括固和非固相酶免疫检测技术),前者主要用于组织、细胞的免疫检测,后者主要用于抗原/抗体的检测。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫检测技术中发展最快、应用最广泛的一种,其以快速、准确、灵敏的特点逐渐成为一种公认的检测技术。目前,该检测技术已在部分动物疫病检测中使用,但仅有极少数鹅类疾病的检测使用该技术。原因很多,其中缺乏一种高质量、可商品化生产的酶标记抗体是阻碍其发展的主要原因之一。
我国是世界养禽大国,更是世界主要鹅类养殖地和消费国,鹅类养殖业的持续、稳定、健康发展不仅直接关系到我国农村发展、农民增收,而且关系到我国畜牧业的持续稳定发展。而酶标记抗鹅抗体不仅为鹅类疫病的检测搭建物质平台,更为鹅类整体免疫机理的研究提供物质支持,并最终为鹅类养殖业的发展提供技术平台。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体及其制备方法。
本发明的目的是这样实现的:本发明中所使用的缩写分别代表:PBS:磷酸盐缓冲液;PB:磷酸缓冲液;DE52:阴离子交换纤维素;Sephodex G200:葡聚糖G200;IgY:免疫球蛋白Y:IgY(ΔFc):免疫球蛋白Y(ΔFc)。
本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是:(1)它是由辣根过氧化物酶与兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体组成的酶抗体结合物,其可与鹅免疫球蛋白IgY和IgY(□Fc)特异性结合,并可使辣根过氧化物酶的底物显色;(2)它是克分子比在1.0-2.0之间,酶活性>1000U/mg(临联茴香氨法),ELISA使用浓度>1∶1000,Weston-Blotting使用浓度>1∶500的产品。
本发明的兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)辣根过氧化物酶标记抗体是采用这样的方法来制备的:
1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)
按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿=1∶2∶3的比例混匀,3000r/min离心30min,取上清,用终浓度(w/v)分别为18%、14%、9%、14%的无水Na2SO4依次盐析,3000r/min离心30min,其中,第三次取上清,其余三次取沉淀,末次沉淀用适量PBS悬浮,4℃PBS透析72h,将透析物2000r/min离心10~15min,以PB(PH7.4,0.01mol/L)为洗脱液,过DE52纤维素柱,1ml/min,1管/5min,收集第一峰;
2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化
首免,弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合,2ml/只兔背部皮下多点注射;以后每隔14~28d加强免疫,二免改用弗氏不完全佐剂,剂量方式同上;三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射,心脏采血,37℃,1h,4℃过夜析出并收集血清;10ml血清经50%和33%饱和硫酸铵依次盐析3次,末次沉淀用2~4m1的PBS(0.01mol/L,pH7.4)溶解并对其透析除盐,以PB(0.01mo1/L,pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化,1ml/min,1管/5min,收集第一峰;
3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体
将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水,加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L),20~25℃搅拌20min,于醋酸钠缓冲液(pH4.4,0.001mol/L)4℃透析过夜,加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体,立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5,20~25℃搅拌2h(注:N为常数);
4)标记物的纯化
将上述标记物平均分为2份,一份用50%饱和硫酸铵盐析30min,离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L,pH7.4),并于PBS透析除盐;另一部分以PB(0.02mol/L,pH7.2)透析过夜,并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱,1ml/15min,2ml/管,将两部分合并;
5)酶标记抗体的质量鉴定
280nm和403nm测定其OD值,计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100%)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量),联茴香胺法测定标记物及的酶学活性,直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30%-60%之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率>60%,酶活性>1000U/m g、使用浓度>1∶1000时符合制备标准。
采用本发明的方法可用于:
①本方法可用于提纯鹅类卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc);
②本方法可用于兔抗鹅辣根过氧化物酶标记坑体的质量鉴定;采用本发明生产的产品可用于:
①本产品可用于鹅类相关酶免疫组织化学染色。
②本产品可用于鹅类相关的各种匀相和非匀相免疫酶检测技术,主要包括各种ELISA试验、Weston-Blotting、酶免疫沉淀试验等。
本发明的产品优点表现在:应用此酶标记抗体可以建立多种鹅类疫病检测技术,预防鹅类多种传染病。
(四)具体实施方式
1)纯化鹅卵黄免疫球蛋白IgY和IgY(ΔFc)
按v/v为卵黄∶PBS(pH7.40.01mol/L)∶氯仿=1∶2∶3的比例混匀,3000r/min离心30min,取上清,用终浓度(w/v)分别为18%、14%、9%、14%的无水Na2SO4依次盐析,3000r/min离心30min,其中,第三次取上清,其余三次取沉淀,末次沉淀用适量PBS悬浮,4℃PBS透析72h,将透析物2000r/min离心10~15min,以PB(PH7.4,0.01mol/L)为洗脱液,过DE52纤维素柱,1ml/min,1管/5min,收集第一峰;
2)兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体的制备和纯化
首免,弗氏完全佐剂与鹅卵黄免疫球蛋白(0.4mg/ml)按v/v为1∶1的比例混合,2ml/只兔背部皮下多点注射;以后每隔14~28d加强免疫,二免改用弗氏不完全佐剂,剂量方式同上;三免1ml(0.4mg/ml)耳缘静脉注射,心脏采血,37℃,1h,4℃过夜析出并收集血清。10ml血清经50%和33%饱和硫酸铵依次盐析3次,末次沉淀用2~4ml的PBS(0.01mol/L,pH7.4)溶解并对其透析除盐,以PB(0.01mol/L,pH7.4)为洗脱液过DE52离子交换层析柱纯化,1ml/min,1管/5min,收集第一峰;
3)改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgY+IgY(ΔFc)(H+L)抗体
将N×4mg辣根过氧化物酶溶于N×1ml去离子水,加入200-400μlNaIO4(0.1mol/L),20~25℃搅拌20min,于醋酸钠缓冲液(pH4.4,0.001mol/L)4℃透析过夜,加入N×mg纯化的兔抗鹅抗体,立即加入0.2mol/L的碳酸钠缓冲液(pH9.5)调节pH值致9-9.5,20~25℃搅拌2h(注:N为常数);
4)标记物的纯化
将上述标记物平均分为2份,一份用50%饱和硫酸铵盐析30min,离心取沉淀部分溶于少量PBS(0.01mol/L,pH7.4),并于PBS透析除盐;另一部分以PB(0.02mol/L,pH7.2)透析过夜,并以其为洗脱液过SephodexG200层析柱,1ml/15min,2ml/管,将两部分合并;
5)酶标记抗体的质量鉴定
280nm和403nm测定其OD值,计算其IgG含量((A280-A403×0.3)×0.62mg/ml)、酶含量(A403×0.4mg/ml)、克分子比((酶含量/IgG含量)×4)、结合物标记率(A403/A280×100%)酶结合物产率(酶含量×结合物总体积/最初加入酶量),联茴香胺法测定标记物及的酶学活性,直接ELISA测法定其最佳使用浓度。当酶标记抗体的酶结合物产率在30%-60%之间、克分子比在1.0-2.0之间、酶结合物标记率>60%,酶活性>1000U/mg、使用浓度>1∶1000时符合制备标准。
机译: 冻干组合物,其包含辣根过氧化物酶标记的抗人干扰素β单克隆抗体的Fab'片段和海藻糖;包含该成分的EIA试剂盒
机译: 冻干组合物,其包含辣根过氧化物酶标记的抗人干扰素β单克隆抗体的Fab'片段和海藻糖;包含该成分的EIA试剂盒
机译: 分离的抗fc15抗体或其抗原结合片段,分离的抗fc155 scfv抗体,分离的抗体或其抗原结合部分,组成,免疫缀合物,双特异性分子,分离的核酸,表达载体,宿主细胞,fcrl5的检测方法整个细胞或组织,个体治疗癌症的方法,抗体或其抗原结合片段的使用,癌症治疗试剂盒