新的日本脑炎病毒的全长基因组PNA、来自它的感染性的 JEV cDNA及其应用

摘要

本发明涉及新的日本脑炎病毒(JEV)的基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA。更具体地，本发明涉及由SEQ.ID.No 15表示的JEV的全长基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA。本发明的JEV基因组RNA和感染性的JEV cDNA不但可以用于鉴别JEV基因，而且可以用于分子生物学研究，包括JEV复制、转录和翻译。而且，它们还可以用于开发日本脑炎的治疗剂、疫苗、诊断剂和诊断装置，还可以用作多种外源基因的表达载体。

说明书

发明领域

本发明涉及可靠的日本脑炎病毒(JEV)基因组RNA序列的测定、感染性的JEV cDNA克隆的构建、和该克隆或其衍生物在治疗、疫苗和诊断应用目的中的利用。另外，本发明还涉及JEV载体，例如用于异源基因的表达系统、遗传免疫和瞬时基因治疗。

背景

JEV是黄病毒科(Flaviviridae)家族的成员，通过蚊子传播。它是一种重要的人病原体，会造成永久性的神经精神后遗症和甚至致命疾病，特别是在儿童中(Tsai，Vaccine，2000，18(Suppl 2)，1-25；Solomon，Neurological Infections和Epidemiology，1997，2，191-199；Umenai等，Bull.W.H.O.，1985，63，625-631)。每年报道高达50,000个病例，其死亡率约25％，约半数存活者表现出永久性的神经精神后遗症(Vaughn和Hoke，Epidemiol.Rev.，1992，14，197-221；Burke和Leake，Japanese encephalitis，1988，63-92，CRC Press Publisher)。JEV主要分布在亚洲，从前苏联至印度。但是，近年来，已经在南半球发现了该病毒的传播，这表明该病毒会威胁全世界的公众健康(Hanna，等，Med.J.Aust.，1999，170，533-536；Hanna，等，Med.J.Aust.，1996，165，256-260；Mackenzie等，Arch.Virol.，1994，136，447-467)。

JEV是小的有包膜病毒，具有长约11kb的单链有义RNA基因组。基因组含有一个由5’和3’非翻译区(NTR)连接的长开放阅读框架(ORF)，它们是用于病毒复制的重要顺式作用元件。JEV的RNA基因组在其5’-端具有I型帽结构，但是在其3’端没有poly(A)尾巴。ORF被翻译成较大的多蛋白，它在共翻译或翻译后被加工成3个结构性的和7个非结构性的蛋白，它们的在基因组中的基因如下：C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5(Lindenbach和Rice，Flaviviridae：The viruses andtheir replication，2001，991-1041，Lippincott Williams & WilkinsPublishers；Venugopal和Gould，Vaccine，1994，12，966-975；Chamber等，Ann.Rev.Microbiol.，1990，44，649-688)。其它信息(例如，大多数JEV基因产物的功能和参与JEV复制的分子机制、神经毒力和发病机理)非常有限，因为没有可靠的反向遗传系统。

反向遗传系统的进展已经显著地促进了关于有义RNA病毒的研究。在这里，构建了所述病毒基因组的感染性cDNA克隆，并将其用作能生成合成病毒的感染性的RNA的合成模板。有两种用于反向遗传系统的方案，使用RNA的方案和使用DNA的方案。在典型的“使用RNA的”方案中，用从感染性的cDNA克隆制备出的RNA转录物转染细胞，然后从这些细胞中回收合成的病毒(Satyanarayana等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1999，96，7433-7438 van Dinten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，991-996；Liljestrom和Garoff，Biotechnology，1991，9，1356-1361Rice等，NewBiol.，1989，1，285-296，Rice等，J.Virol.，1987，61，3809-3819)。在备选的“使用DNA的”方案中，通过将感染性的cDNA克隆直接转染进易感细胞中，生成合成的病毒。该方案首次报道用于脊髓灰质炎病毒(Racaniello和Baltimore，Science，1981，214，916-919)，并且已经用于甲病毒(Schlesinger和Dubensky，Curr.0pin.Biotechnol.，1999，10，434-439)。

这两个方案已用于构建许多有义RNA病毒家族的感染性的cDNA克隆，包括冠形病毒，它具有最大的RNA基因组(Almazan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。这些克隆对于解决许多关于有义RNA病毒的问题是无价的。但是，JEV的全长感染性的cDNA克隆的构建受到了阻碍，主要是因为克隆的cDNA的遗传不稳定性。尽管作了大量努力，仍然没有得到遗传稳定的JEV的全长感染性的cDNA分子克隆(Mishin等，Virus Res.，2001，81，113-123；Zhang等，J.Virol.Methods，2001，96，171-182；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。

因而，本发明人已经公开了JEV株CNU/LP2(从一群韩国传播蚊子(circulating mosquitoes)分离出)的完整的全长核苷酸序列。基于该序列，本发明人还已经通过合成全长感染性的JEV cDNA分子克隆开发了方便可靠的用于JEV的反向遗传系统。基于本发明的新的感染性的JEVcDNA的反向遗传系统可以有效地用于研究JEV基因产物的功能和与JEV的复制、神经毒力和发病机理相关的其它分子生物学机制。而且，本发明人已经通过确认感染性的JEV cDNA能以多种方式有效地用作用于表达异源基因的载体完成了本发明。

优选实施方案的详细描述

本发明的一个目的是提供可靠的JEV基因组RNA序列、来自它的感染性的JEV cDNA克隆、和该克隆或其衍生物在新的基因表达载体中的应用。

为了实现上述目的，

1)本发明提供了可靠的JEV基因组RNA序列。

2)本发明提供了感染性的JEV cDNA克隆，它能生成可自我复制的JEV RNA转录物。

3)本发明提供了基于JEV的载体。

4)本发明提供了从上述基于JEV的载体合成的可自我复制的RNA转录物。

5)本发明提供了重组的JEV病毒，它获自用从基于JEV的载体合成的合成RNA转录物转染的细胞。

6)本发明提供了基于JEV的表达载体。

7)本发明提供了多种使用基于JFV的表达载体表达异源基因的策略。

下文中本发明的其它特征将是明显的。

I.本发明提供了可靠的JEV基因组RNA序列。

本发明的韩国分离物JEV基因组RNA由5’非翻译区(NTR)、多肽编码区和3’NTR组成。具体地，全长RNA基因组的长度为10,968bp，由95bp的5’NTR、随后的10,299bp的单个开放阅读框架和末端的574bp的3’NTR组成。

根据本发明的优选实施方案，JEV的新型基因组RNA具有SEQ.ID.No15.所示的序列。本发明的新型基因组RNA还包括与SEQ.ID.No 15.所示的JEV基因组RNA具有98％同源性的任何序列。

本发明的韩国分离物JEV是通过利用噬斑-纯化技术从韩国JEV株K87P39分离和纯化的，并命名为“JEV CNU/LP2”(见图1)。

为了检测CNU/LP2(韩国分离物JEV)的完整核苷酸序列，本发明人使用长反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了缺少5’和3’端的完整病毒RNA基因组，并且产生了3种重叠的cDNA产物，表示为JVF(核苷酸(nt)1-3865)、JVM(nt 3266-8170)和JVR(nt 7565-10893)(长度分别为约3.9、4.9和3.3kb)(见图2A)。

将合成的寡核苷酸T连接到它上面后，分析了CNU/LP2病毒RNA的3’-末端序列。寡核苷酸T作为cDNA合成和PCR扩增的特异性引发位点(见图2B)。琼脂糖凝胶电泳表明，扩增产物形成2条带：约700bp的较大条带和约450bp的较小条带(见图2C)。纯化并克隆两条带，对20和10个随机选取的含有较大和较小条带的克隆分别进行测序。正如大多数完整测序的JEV分离物已经记载的，本发明人发现，具有较大插入物(约700bp)的所有克隆都用-GATCT¹⁰⁹⁶⁸作为病毒基因组的末端。相反地，具有较小插入物(约450bp)的所有克隆表现出在nt 10,684处被截断的病毒基因组，它生成的更短284bp的条带。在装配全长JEV cDNA的过程中，本发明人使用了较大插入物的核苷酸序列，因为较小的插入物在病毒基因组的3’端不含有284个核苷酸。

通过用烟酸焦磷酸酶孵育除去其5’端的帽结构后，检查CNU/LP2病毒RNA的5’-末端序列。然后让得到的病毒RNA自连接，对3’-5’连接进行cDNA合成和PCR扩增，使用互补于临近病毒3’端(nt 10259-nt 10276)的序列的有义引物和与临近病毒5’端(nt 164-nt 181)的序列相对应的反义引物用于RT-PCR(见图2D)。琼脂糖凝胶电泳表明，扩增产物是约850bp的单独条带(见图2E)。克隆扩增子，对12个随机选取的克隆进行测序。在所有的12个克隆中，病毒3’-末端序列的-GATCT¹⁰⁹⁶⁸后面是5’-末端序列¹AGAAGT-(见图2B和2C)。

因此，本发明人已经确定了SEQ.ID.No 15所示的JEV CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列。JEV CNU/LP2的全长RNA基因组的长度是10,968bp，由95bp的5’NTR、随后的10,299bp的单个开放阅读框架和末端的574bp的3’NTR组成。本发明人对比了CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列和所有可从GenBank数据库得到的26个JEV株(Ishikawa，K94P05，FU，CH2195LA，CH2195SA，RP-2ms，RP-9，CH1392，T1P1，YL，JaGAr01，HVI，TC，TL，Beijing-1，Ling，Vellore P20778，p3，SA14-14-2，SA(A)，SA14-12-1-7，SA14-2-8，SA14，SA(V)，GP78和JaOArS982)的序列。下面简单地说明了关于用于对比的病毒株的分离地点、分离年度、来源和GenBank保藏号的信息(见表1)。

表1

  地理位置  年度  株  来源 GenBank保藏 号  澳大利亚  1995  FU  人血清 AF217620  中国  1954  SA14  蚊子 U14163  SA14-14-2  SA14衍生物 AF315119  SA14-12-1-7  SA14衍生物 AF416457  SA14-2-8  SA14衍生物 U15763  SA(V)  SA14衍生物 D90194  SA(A)  SA14-14-2衍  生物 D90195  1949  北京-1  人脑 L48961  1949  p3  蚊子 U47032  印度  1978  GP78  人脑 AF075723  1958  Vellore  P20778  人脑 AF080251  日本  1982  JaOArS982  蚊子 M18370  IU  Ishikawa  IU AB051292  1959  JaGAr01  蚊子 AF069076  韩国  1994  K94P05  蚊子 AF045551  1987  CNU/LP2  蚊子 本发明  台湾  1997  T1P1  蚊子 AF254453  1994  CH2195LA  CH2195衍生  物  AF221499  1994  CH2195SA  CH2195衍生  物  AF221500  1990  CH1392  蚊子  AF254452  1985  RP-2ms  蚊子  AF014160  1985  RP-9  蚊子  AF014161  1965  Ling  人脑  L78128  IU  YL  IU  AF486638  IU  TC  蚊子  AF098736  IU  TL  蚊子  AF098737  IU  HVI  蚊子  AF098735

IU：信息不明

通过对比CNU/LP2分离物的核苷酸序列与其它JEV株的核苷酸序列，证实了JEV分离物CNU/LP2基因组与这些其它基因组具有不同程度的序列相似度[89.0％(Ishikawa)，89.1％(K94P05)，89.3％(FU)，95.8％(CH2195LA)，95.9％(CH2195SA)，97.1％(RP-2ms)，97.2％(RP-9)，97.3％(CH1392)，97.3％(T1P1)，97.0％(YL)，97.4％(JaGAr01)，97.1％(HVI)，96.9％(TC)，96.7％(TL)，96.4％(北京-1)，96.3％(Ling)，96.0％(VelloreP20778)，97.1％(p3)，97.4％(SA14-14-2)，97.5％(SA(A))，97.5％(SA14-12-1-7)，97.7％(SA14-2-8)，97.9％(SA14)，97.9％(SA(V))，96.3％(GP78)和97.1％(JaOArS982)](见表2)。因此，本发明的权利要求类别中可以包括与SEQ.ID.NO 15所示的本发明的核苷酸序列具有超过98％序列相似度的JEV病毒基因组RNA的核苷酸序列。

表2

   Isolate                                                         ％sequence identity^a  I  s  h  l  k  a  w  e  K  9  4  P  0  5  K  F  U  C  H  2  1  9  5  L  A  C  H  2  1  9  5  S  A  R  P  -  2  m  s  R  P  -  9  C  H  1  3  9  2  T  1  P  1  Y  L  J  a  G  A  r  0  1  H  V  I  T  C  T  L  B  e  i  j  i  n  g  -1  L  i  n  g  V  e  l  l  o  r  e  P20778  p  3  S  A  1  4  -  1  4  -2  S  A  (  A  )  S  A  1  4  -  1  2  -1-7  S  A  1  4  -  2  -  8  S  A  1  4  S  A  (  V  )  C  N  U  /  L  P  2  G  P  7  8  J  a  O  A  r  S  9  82  W  N  VIshikaweK94P05FUCH2195LACH2195SARP-2msRP-9CH1392T1P1YLJaGAr01HVITCTLBeijing-1LingVellore P20778p3SA14-14-2SA(A)SA14-12-1-7SA14-2-8SA14SA(V)CNU/LP2GP78JaOArS982WNV   97.7  97.7  97.7  97.1  97.5  97.6  97.8  97.5  97.4  97.1  97.2  97.0  97.2  97.3  97.4  97.7  97.8  97.9  97.1  97.2  97.7  97.5  97.3  97.4  97.0  97.6  76.2  97.0   97.0  97.0  96.5  96.8  96.9  97.2  96.8  96.7  96.4  96.5  96.4  96.6  96.6  96.7  97.1  97.1  97.1  96.6  96.6  97.3  96.7  96.6  96.7  96.4  96.8  75.8  90.1  89.6   99.9  99.0  99.4  99.5  99.7  99.3  99.2  98.9  98.8  98.8  99.0  99.0  99.1  99.5  99.5  99.5  98.8  98.9  99.4  99.0  98.9  98.9  98.6  97.8  76.6  88.3  88.6  88.9   99.0  99.4  99.5  99.7  99.3  99.2  98.9  98.9  98.8  99.0  99.0  99.1  99.5  99.5  99.5  98.8  98.9  99.4  99.0  98.9  98.9  98.6  97.8  76.6  88.3  88.6  88.9  99.9   98.8  98.9  99.1  98.7  98.7  98.2  98.3  98.2  98.4  98.5  98.6  98.9  98.9  98.9  98.2  98.3  98.8  98.4  98.3  98.2  98.0  97.2  76.1  88.9  89.2  89.3  96.2  96.3   99.7  99.6  99.1  99.1  98.7  98.8  98.7  98.9  98.9  99.0  99.4  99.4  99.3  98.7  98.7  99.3  98.9  98.7  98.7  98.5  97.7  76.4  89.0  89.3  89.4  96.3  96.3  99.9   99.7  99.2  99.2  98.8  98.9  98.8  98.9  99.0  99.1  99.5  99.5  99.4  98.8  98.9  99.4  99.0  98.8  98.8  98.6  97.8  76.5  89.1  89.4  89.4  96.3  96.3  99.5  99.6   99.4  99.4  99.1  99.1  99.0  99.2  99.2  99.3  99.7  99.7  99.7  99.0  99.1  99.6  99.2  99.1  99.0  98.8  98.0  76.7  89.1  89.4  89.4  96.3  96.3  99.5  99.5  99.9   99.0  98.6  98.7  98.6  98.8  98.8  98.9  99.3  99.4  99.2  98.6  98.7  99.2  98.9  98.7  98.6  98.5  97.6  76.5  88.9  88.1  89.2  96.1  96.1  99.3  99.3  99.5  99.5   98.7  98.8  98.5  98.7  98.7  98.9  99.2  99.3  99.2  98.5  98.6  99.2  98.8  98.6  98.6  98.4  97.6  76.5  89.2  89.5  89.6  96.5  96.5  99.4  99.5  997  997  99.4   98.7  98.2  98.4  98.4  98.6  98.9  99.0  98.9  98.2  98.3  98.8  98.6  98.4  98.2  98.0  97.2  76.3  89.0  89.2  89.4  96.2  96.2  98.8  98.8  99.0  99.0  98.8  99.1   98.4  98.5  98.6  98.7  99.1  99.2  99.0  98.3  98.4  98.9  98.7  98.5  98.4  98.1  97.3  76.4  88.9  89.1  89.2  95.9  95.9  98.2  98.2  98.3  98.3  98.1  98.4  98.6   99.7  99.2  99.0  99.1  99.0  98.8  98.1  98.2  98.8  98.4  98.2  98.2  98.0  97.1  76.1  88.8  89.0  89.1  95.6  95.8  98.1  98.2  98.3  98.3  98.0  98.4  98.4  99.0   99.3  99.2  99.2  99.2  99.0  98.3  98.4  98.9  98.5  98.4  98.4  98.2  97.3  76.2  88.9  89.0  89.3  95.6  95.6  97.2  97.2  97.3  97.3  97.1  97.4  97.2  97.2  97.0   99.2  99.3  99.2  99.1  98.4  98.5  99.0  98.6  98.5  98.5  98.3  97.4  76.3  88.8  89.0  89.0  95.7  95.7  97.1  97.2  97.3  97.3  97.1  97.4  97.2  97.1  96.8  99.1   99.4  99.5  99.2  98.5  98.6  99.2  98.7  98.6  98.6  98.3  97.5  76.4  88.8  88.9  89.1  95.1  95.1  96.6  96.7  96.8  96.8  96.5  96.9  96.7  96.4  96.1  96.7  96.7   99.8  99.6  98.9  99.0  99.5  99.1  98.9  98.9  98.7  97.9  76.6  89.1  89.4  89.4  96.3  96.3  97.9  98.0  98.2  98.1  97.9  98.3  98.1  97.7  97.5  97.4  97.3  98.8   99.6  98.9  99.0  99.6  99.2  99.0  99.0  98.7  97.9  76.6  88.8  89.1  89.1  96.6  96.6  98.0  98.1  98.2  98.2  98.0  98.3  98.1  97.8  97.6  97.2  97.1  96.6  98.2   98.9  98.9  99.5  99.2  99.0  99.0  98.7  98.0  76.8  88.9  89.2  89.2  96.7  96.7  98.1  98.1  98.3  98.2  98.0  98.4  98.1  97.9  97.7  97.2  97.2  96.7  98.3  99.8   99.7  99.1  98.5  98.3  98.4  98.1  97.3  76.2  88.9  89.2  89.2  96.7  96.7  98.1  98.1  98.3  98.3  98.0  98.4  98.1  97.9  97.7  97.3  97.2  96.7  98.3  99.6  99.6   99.2  98.5  98.4  98.4  98.2  97.4  76.3  89.1  89.3  89.3  96.8  96.9  98.3  98.3  98.4  98.4  98.2  98.5  98.3  98.1  97.9  97.5  97.4  96.9  98.5  99.4  99.4  99.4   99.2  99.0  99.0  98.7  97.9  76.7  89.2  89.5  89.6  97.1  97.1  98.5  98.5  98.6  98.6  98.4  98.8  98.5  98.3  98.1  97.6  97.6  97.1  98.7  99.4  99.4  99.5  99.6   99.5  98.6  98.2  97.6  76.6  89.2  89.5  89.6  97.1  97.1  98.5  98.5  98.7  98.6  98.4  98.8  98.5  98.3  98.1  97.6  97.6  97.1  98.7  99.4  99.4  99.5  99.6  99.9   98.6  98.2  97.4  76.5  89.0  89.1  89.3  95.8  95.9  97.1  97.2  97.3  97.3  97.0  97.4  97.1  96.9  96.7  96.4  96.3  96.0  97.1  97.4  97.5  97.6  97.7  97.9  97.9   98.2  97.5  76.4  88.8  89.0  88.7  95.7  95.7  96.9  96.9  97.0  97.0  96.8  97.1  96.9  96.7  96.5  96.1  96.2  95.6  97.1  97.3  97.4  97.4  97.6  97.8  97.8  96.3   97.1  76.5  88.9  89.5  89.4  97.3  97.3  97.7  97.8  97.9  97.8  97.6  98.0  97.7  97.4  97.2  97.0  97.2  96.4  97.8  98.1  98.2  98.2  98.3  98.6  98.6  97.1  97.2   76.7  69.0  68.7  69.5  69.4  69.5  69.4  69.4  69.4  69.4  69.2  69.5  69.4  69.5  69.3  69.5  69.5  69.5  69.5  69.4  69.4  69.4  69.5  69.6  69.6  69.5  69.6  69.6

^a完整基因组的核苷酸序列同一性的百分比在右上角。完整基因组的氨基酸序列同一性的百分比在左下角。CNU/LP2序列同一性的百分比表示为粗体字。

除了检测JEV的多肽编码区的核苷酸序列以外，还利用分子生物学方法检测了5’和3’NTR的核苷酸序列，包括参与调节病毒的复制、转录和翻译的顺式作用元件。这两个区域的重要性已经得到了一些早期研究文献的支持，即体外地(You和Padmanabhan，J.Biol.Chem.，1999，274，33714-33722)和体内地(Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)启动黄病毒RNA的复制需要5’-和3’-末端区域。尤其是，高度预期¹AGAAGT-和-GATCT¹⁰⁹⁶⁸(证实了是在本发明中JEV CNU/LP2的5’-和3’-末端区域的核苷酸序列)在病毒的自我复制中起重要作用。

本发明人通过下文所述的实验证实了，用具有JEV的全长核苷酸序列的合成的RNA转录物转染细胞时能生成感染性的合成JEV，而且，发明人首次证实了JEV自我复制所必需的完整全长核苷酸序列的功能。

II.本发明提供了能生成可自我复制的JEV RNA转录物的感染性的JEV cDNA克隆。

用SEQ.ID.No 15所示的核苷酸序列或与其具有超过98％序列相似度的全长JEV基因组RNA的核苷酸序列合成了本发明的感染性的JEVcDNA克隆，并且用作通过体外转录合成可自我复制的JEV RNA转录物的模板。为了构建全长JEV cDNA克隆，通过RT-PCR扩增病毒基因组RNA(包括5’-和3’-末端区域)，随后顺序装配得到的重叠的cDNA。

为了通过体外失控转录(runofftranscription)反应生产全长的合成的JEV RNA转录物，使SP6或T7启动子转录起始位点位于JEV基因组RNA的5’-端前面，使独特的限制内切酶识别位点位于病毒基因组的末端(见图3A)。在本发明的优选实施方案中，通过使用3个重叠的JEV cDNA(JVF，JVM和JVR)和2个另外的cDNA构建了3个SP6-驱动的全长JEV cDNA和3个T7-驱动的全长JEV cDNA；一个对应着5’-末端区域(包括SP6或T7启动子序列)，其它的对应着3’-末端区域(包括作为失控位点的XhoI和Xba I识别序列)(见图3B和3C)。但是，也可以使用上述2种启动子以外的其它启动子，这是本领域普通技术人员的常识。本发明开发的全长JEV cDNA使用Xho I和Xba I作为失控位点，但是其它的限制酶可以如通常所知的那样使用。

使用细菌人工染色体(BAC)质粒pBeloBAC11作为载体，通过生产含有许多重叠的cDNA的亚克隆并随后将这些亚克隆连接到全长JEV cDNA中，构建了本发明的JEV cDNA克隆。

在本发明的优选实施方案中，本发明的发明人提供了一组3种具有SP6启动子的JEV cDNA克隆，分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示。另外，本发明的发明人还提供了其它组3种具有T7启动子的JEVcDNA克隆组，分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示(见图3B和3C)。为了保证病毒基因组的3’端在失控转录后是可靠的，在所有的实验中，本发明的发明人在病毒基因组的末端设置了独特的限制内切酶识别位点Xho I或Xba I(见图3B和3C)。

III.本发明提供了基于JEV的载体。

本发明的载体的特征在于包含全长的感染性的JEV cDNA。在本发明的优选实施方案中，本发明的发明人提供了载体“pBAC^sp6/JVFL/XhoI”、“pBAC^sp6/JVFLx/XhoI”和“pBAC^sp6/JVFLx/Xba I”，它们都具有SP6启动子，且分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示，还提供了载体“pBAC^T7/JVFL/XhoI”、“pBAC^T7/JVFLx/XhoI”和“pBAC^T7/JVFLx/XbaI”，它们都具有T7启动子，且分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示。本发明的发明人于2002年10月2日将上面的两种最有效的载体pBAC^T7/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10346BP，KCTC 10347BP)。

IV.本发明提供了从上述基于JEV的载体合成的可自我复制的RNA转录物。

为了体外失控转录，通过用Xho I或Xba I酶切使JEV cDNA模板线性化，其在工程上用于在紧邻病毒基因组3’-末端区域后的失控位点(run-off site)(见图3)。两种Xho I-线性化的质粒(pBAC^SP6/JVFL/Xho I和pBAC^SP6/JVFLx/Xho I)在存在m⁷G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在它们的3’端含有与病毒无关的序列的3个核苷酸(CGA)(见图3B)。这是复制Xho I酶切剩下的5’突出物的结果。类似地，Xba I-线性化的pBAC^SP6/JVFLx/XbaI质粒在存在m⁷G(5′)PPP(5′)A帽结构类似物的情况下的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在它们的3’端含有与病毒无关的序列的4个核苷酸(CTAG)(见图3B)。

本发明的发明人已经进行了侵染中心试验，以检测合成的JEV RNA转录物的特异感染性。结果，当用合成的RNA转录物转染易感的BHK-21细胞时，全部是高感染性的(3.4-4.3×10⁵PFU/μg)(见表3)。从T7聚合酶失控转录的T7-驱动的cDNA构建体转录的合成RNA得到了类似结果(2.9-3.8×10⁵PFU/μg)(见表3)。

已经报道，对于一些黄病毒，存在于从感染性的cDNA转录的合成RNA的3’端的与病毒无关的序列会减少或消除它们的特异感染性(Yamshchikov等，Virology，2001，281，294-304)。基于该报道，本发明的发明人生成了在它们的3’端缺少与病毒无关的序列的合成RNA，并对比了它们的特异感染性。具体地，通过在转录反应之前用绿豆核酸酶(MBN)处理Xba I-线性化的pBAC^sp6/JVFLx/Xba I质粒除去4个多余的核苷酸CTAG，本发明的发明人生成了缺少无关序列的合成RNA。为了验证MBN活性，使Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBAC^SP6/JVFLx/Xba I质粒自连接，对其病毒3’端测序，证实去除了4个多余的核苷酸CTAG。与未处理的转录物相比，来自Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBAC^SP6/JVFLx/Xba I和pBAC^T7/JVFLx/Xba I(pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN见图3B，pBAC^T7/JVFLx/Xba I^MBN见图3C)的RNA转录物都具有增强的特异感染性。更准确地，估计从pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN转录的RNA的特异感染性为3.1×10⁶PFU/μg，约是未修饰模板的特异感染性(3.4×10⁵PFU/μg)的10倍(见表3，感染性)。源自pBAC^T7/JVFLx/Xba I的RNA在MBN修饰后也具有增强的特异感染性(2.7×10⁶PFU/μg)(见表3，感染性)。因此，本发明的发明人确信，应当存在JEV基因组的可靠的3’端，以确保生成高感染性的合成的JEV RNA转录物。因而，本发明的感染性的JEVcDNA克隆能用作失控转录的模板，生成高感染性的合成的RNA，其特异感染性为10⁵～10⁶PFU/μg。

以前的装配全长的感染性的JEV cDNA的尝试(Mishin等，Virus Res.，2001，81，113-123；Zhang等，J.Virol.Methods，2001，96，171-182；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)都失败了，因为克隆的JEV cDNA的遗传不稳定性。一项研究尝试通过设计下述系统来克服该问题：其中体外地连接2个重叠的JEVcDNA来生成模板(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。该模板然后用于体外地合成感染性的RNA转录物。但是，这些转录物的特异感染性是约100PFU/μg，该值太低，使得该系统不能用于病毒生物学的分子和遗传分析(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。

在本发明中，本发明人能通过将JEV cDNA克隆进BAC质粒(它在大肠杆菌中维持1或2个拷贝)中来克服它的遗传不稳定性。在大肠杆菌中繁殖的过程中，感染性的cDNA质粒的遗传结构和功能完整性能在至少180代中维持稳定(见图7)。所以，本发明的发明人通过导入BAC解决了制备全长的感染性的JEV cDNA时的遗传不稳定性问题，并且具有稳定地处理合成的感染性的JEV cDNA的技术。

生产全长的感染性的JEV cDNA是重要的，在体外转录中它能生成具有可靠的5’和3’端的RNA转录物，因为几项研究已经证实，体外地(You和Padmanabhan，J.Biol.Chem.，1999，274，33714-33722)和体内地(Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)启动黄病毒RNA转录需要5’-和3’-末端区域。为实现该目的，本发明的发明人采用了先前用于其它黄病毒的方法(van der Werf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83，2330-2334；Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)。JEV基因组RNA的帽结构后面是双核苷酸AG，它是黄病毒的绝对保守的特征(Rice，Flaviviridae：The viruses and their replication，1996，931-960，Lippincott-RavenPublisher)。通过将SP6或T7启动子转录起点置于病毒基因组的起始，确保了5’端的可靠性。通过将m⁷G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物整合进SP6或T7聚合酶驱动的转录反应(Contreras等，Nucleic Acids Res.，1982，10，6353-6362)，本发明的发明人合成了具有可靠的5’端的带帽的RNA转录物，它们在转染进易感细胞中时是高感染性的。另外，将m⁷G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物整合进SP6或T7的聚合酶驱动的转录反应(Contreras等，Nucleic Acids Res.，1982，10，6353-6362)会将不相关的G核苷酸置于双核苷酸AG的上游。如以前报道(Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)的，本发明的发明人确实发现，回收的JEV子代的基因组RNA丢失了多余的核苷酸。而且，本发明的发明人未观察到，如果发明人添加额外的核苷酸，会改变从感染性的cDNA模板转录的合成RNA的感染性或复制。

在黄病毒中，位于JEV RNA的3’端的双核苷酸CT是绝对保守的(Rice，Flaviviridae：The viruses and their replication，1996，931-960，Lippincott-Raven Publisher)。这表明，这些核苷酸在病毒复制中是重要的，来自感染性的cDNA的转录物必须具有可靠的3’端。因而，本发明的发明人设计了用于JEV的反向遗传系统，使合成的RNA能以可靠的3’端结束。实际上，本发明的发明人证实了，具有可靠的3’端的RNA转录物比在它们的3’端连接有3或4个与病毒无关的核苷酸的转录物的感染性高10倍。

V.本发明提供了获自用从基于JEV的载体合成的RNA转录物转染的细胞的重组JEV病毒。

在本发明中，生产了用从全长的感染性的JEV cDNA合成的JEV RNA转录物转染的细胞生产的合成JEV病毒。转染的细胞表现出明显的由JEV病毒感染诱导的细胞病理效应，在噬斑形态学、致细胞病性、生长动力学、蛋白表达和RNA积累方面，所有的合成病毒都不能与CNU/LP2亲代病毒区分开(见图5)。而且，通过诱导JEV cDNA的特定区域上的定点突变可以生成重组的JEV病毒突变株，这表明，可以在大肠杆菌中操纵感染性的JEV cDNA。因而，使用本发明的感染性的JEV cDNA的反向遗传系统可以有效地用于关于JEV基因组的复制机制的遗传研究。

VI.本发明提供了基于JEV的表达载体。

本发明提供了JEV cDNA作为新型表达载体在多种细胞类型中的应用。甲病毒也是RNA病毒，可以在多种常用的动物细胞中复制并因而已经成功地开发用作细胞培养和体内中的真核表达载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12944；Frolov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93，11371-11377；Schlesinger，Trends Biotechnol.，1993，11，18-22)。有报道说，JEV跟甲病毒一样，也能在来自人、小鼠、猴子、猪和仓鼠的多种初始的和传代细胞培养物中复制(Burke和Monath，Flaviviruses，2001，1043-1125，Lippincott Williams & Wilkins Publishers)。这表明，JEV可以用作在多种不同细胞中表达异源基因的载体。当全长的感染性的JEV cDNA用作表达载体(其中插入了异源基因)时，通过体外转录反应生成了具有异源基因的RNA转录物。那些转录物由于转染进了细胞中而能自我复制，所以可以生产大量外源蛋白。

表达盒有效地插入在用于表达外源基因的JEV 3’NTR的起始处。在CNP/LP2和3种其它的完全测序的JEV株的病毒的3’NTR的起始处缺失9-25bp(Williams等，J.Gen.Virol.，2000，81，2471-2480；Nam等，Am.J Trop.Med.Hyg.，2001，65，388-392；Jan等，Am.J.Troop.Med.Hyg.，1996，55，603-609)，表明这可以是良好的插入外源基因的位点。因而，本发明开发的感染性的JEV cDNA可以用作在多种细胞(包括哺乳动物细胞)中快速表达外源基因的载体。

VII.本发明提供了多种使用基于JEV的表达载体表达外源基因的策略。

表达载体的一个功能是将目标外源基因输送进用于表达这些基因的细胞中。在本发明中，已经证实了全长的感染性的JEV cDNA在多种细胞类型(包括哺乳动物细胞)中起外源基因表达载体的作用。

在这里，本发明的发明人还描述了基于全长的感染性的JEV cDNA(它起BAC的作用)的外源基因表达系统(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。作为瞬时表达系统，JEV具有多个优点：(i)快速生成高滴度的病毒，(ii)该病毒能感染广范围的宿主细胞，包括昆虫和哺乳动物细胞类型，(iii)遗传稳定的感染性的cDNA是可以得到的，并且可以容易地操作，和(iv)RNA基因组的细胞质复制使其整合进行宿主基因组中的可能性和后续的不希望发生的突变结果最小化。

本发明的发明人在这里证实了，基于JEV的系统可以用于以3种不同的方式表达外源基因。一种包括编码外源基因的感染性的重组载体RNA/病毒，第二种包括生产能进行病毒复制但是增殖缺陷型的JEV病毒复制子载体RNA。第三种包括使用用于形成病毒复制子颗粒(VRP)的包装系统。因而，本发明的发明人已经在这里证实了，JEV系统可以用来生产JEV病毒/感染性的RNA/复制子RNA/VRP载体，它们能在多种哺乳动物细胞类型中快速表达目标外源基因。

使用本发明的感染性的或复制子JEV cDNA载体表达外源基因的基本方法由下述步骤组成：

1)通过将外源基因插入到感染性的或复制子JEV cDNA载体中，制备重组JEV cDNA表达载体；

2)从上述的重组JEV cDNA表达载体生产JEV RNA转录物；

3)用上述的JEV RNA转录物转染宿主细胞，制备转化体；

4)通过培养上述转化体表达外源蛋白。

根据前文所述的方法，本发明的发明人生产了表达绿荧光蛋白(GFP)、增强的GFP(EGFP)、荧光素酶(LUC)、LacZ基因和显性选择性标记嘌呤霉素N-乙酰基转移酶(PAC)(它能赋予对药物嘌呤霉素的抗性)的全长的感染性的重组JEV cDNA(见图8和9)。用从重组JEV cDNA转录出的JEV RNA转录物转染BHK-21细胞。GFP、EGFP、LUC、LacZ和PAC表达如图8和10所示。另外，从培养上清液中制备了含有那些外源基因的重组的感染性JEV病毒颗粒。在用重组病毒感染了多种动物细胞系(BHK-21，Vero，NIH/3T3，ST，HeLa，MDCK，CRFK，B103和SHSY-5Y)(它们已经常规地用于生物和医药领域)之后，进一步研究了那些外源基因的表达。结果，在所有的测试细胞中都表达了插入在病毒基因组中的GFP或LUC基因(见表4)。因而，证实了重组的JEV cDNA、JEVRNA转录物和重组的JEV病毒颗粒可以有效地用作在多种细胞类型中表达外源基因的载体。

为了用JEV RNA复制机器独立地表达外源基因，本发明的发明人通过删除1个、2个或全部病毒结构基因生成了一组能自我复制、自限制的且满足严格安全要求的病毒复制子(图11A)。这些病毒复制子能依靠RNA转染启动复制和基因表达(见图11B和11C)。

通过开发能一组包装细胞系(PCL)的稳定复制子(它们能组成型地反向表达所有JEV病毒结构蛋白(C、prM和E))，进一步说明了基于JEV复制子的表达载体的使用(见图12)。这些PCL能反向补充JEV病毒复制子的有效包装。因而，证实了这些PCL用于通过导入JEV病毒复制子有效地生产高滴度的病毒VRP(见图12)。

本发明的发明人还证实，可以将编码高达3kb的外源基因的感染性的JEV重组病毒RNA包装进病毒颗粒中。通过选择JEV病毒复制子载体如JEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE和JEV/Rep/NS1，估计可以将至少5kb的外源基因包装进JEV VRP中。令人感兴趣的是，检查可以包装进JEV病毒粒子的外源序列的大小上限。如果想表达长基因(例如囊性纤维化跨膜电导调节物，其编码序列约4.5kb)，这可能是一个重要的问题(Flotte等，J.Biol.Chem.，1993，268，3781-3790)。另外，如果想添加2个或多个表达单元，大包装容量的JEV病毒复制子会是有用的(Thiel等，J.Virol.，2003，77，9790-9798；Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。在基于腺相关病毒的载体的情况下，已经优越地扩展了其包装容量，避免了其自然大小的限制(Duan等，Nat.Med.，2000，6，595-598；Yan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6716-6721)，这表明，可以以类似的方式扩展JEV病毒复制子的包装容量。

至于源自RNA病毒的其它载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994；Pushko等，Virology，1997，239，389-401；Berglund等，Nat.Biotechnol.，1998，16，562-565；Basak等，J.Interferon Cytokine Res.，1998，18，305-313；Barclay等，J.Gen.Virol.，1998，79，1725-1734；Khromykh和Westaway，J.Virol.，1997，71，1497-1505；Molenkamp等，J.Virol.，2003，77，1644-1648；Shi等，Virology，2002，296，219-233；Varnavski和Khromykh，Virology，1999，255，366-375；Perri等，J.Virol.，2000，74，9802-9807；Curtis等，J.Virol.，2002，76，1422-1434)，本发明的发明人还能构建多种JEV病毒复制子载体RNA，通过使用基于甲病毒的表达系统反向提供结构蛋白时，可以包装它们(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。因而，已经清楚地证实了包装系统有效地生成生物安全的JEV载体的能力。与甲病毒(Frolova等，J.Virol.，1997，71，248-258；White等，J.Virol.，1998，72，4320-4326)和反转录病毒(Rein，Arch.Virol.Suppl.，1994，9，513-522)不同，关于黄病毒(包括JEV)所采用的包装信号所知甚少。我们的JEV反向互补系统提供的证据表明，整个JEV结构区域不太可能在包装中起作用。因而，该系统可以用于定义JEV RNA中的包装信号和结构蛋白中的参与RNA包壳和形态发生的区域。该信息会进一步增加我们的基于JEV的表达系统的效用。

总之，本发明的全长JEV基因组RNA和来自它的感染性的JEV cDNA不但能鉴别与神经毒力和发病机制相关的JEV基因，而且可以用于研究JEV复制、转录和翻译的分子机制。另外，全长JEV基因组RNA和感染性的JEV cDNA可以有效地用于开发针对JEV的治疗剂、疫苗、诊断试剂和诊断试剂盒，和在真核细胞中表达外源目标基因的载体。而且，本发明所述的基于JEV的载体系统是一种有前途的系统，通过它可以将外源基因体外地输送进细胞中，并且可能体内地用于DNA免疫和瞬时基因治疗。

附图简述

参考附图会很好地理解本发明的优选实施方案的应用，其中：

图1中的一组照片对比了形成大噬斑的JEV分离物CNU/LP2和原始的K87P39株。(A-B)中的一组照片显示了使用(A)BHK-21细胞或(B)Vero细胞时的噬斑形态学。用原始的JEV K87P39株模拟感染(模拟感染的)或感染(K87P39-感染的)(A)BHK-21或(B)Vero细胞，形成病毒噬斑大小的异源混合物。在本发明中纯化的CNU/LP2分离物形成了大噬斑的同源群体(CNU/LP2-感染的)。(C)JEV蛋白表达的水平和图谱。用K87P39、CNU/LP2或黄热病病毒株YF17D模拟感染或感染BHK-21细胞。18小时后，将其固定，依次用JEV-特异性的小鼠超免疫腹水、异硫氰酸荧光素-缀合的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(绿色荧光)染色，随后进行共焦显微镜检查。在存在Rnase A的情况下用碘化丙锭(红荧光)染色，使胞核可视化。

图2中的一组简图和一对电泳照片显示了用于对CNU/LP2的基因组RNA进行测序的策略。(A)该示意图显示了代表脱离5’和3’末端的整个JEV基因组RNA的3个重叠的cDNA扩增子的RT-PCR扩增。RNA表示为灰色，cDNA用实平行线表示。上区块示意性地说明了CNU/LP2 JEV基因组RNA(长10,968bp)。下区块描绘了3个重叠的cDNA：JVF(nt 1-3865)、JVM(nt 3266-8170)和JVR(nt 7565-10893)。(B)该示意图显示了对CNU/LP2基因组RNA的3’端进行测序的程序。用T4RNA连接酶将5’-磷酸化的和3’-封闭的寡核苷酸T(寡T)连接到JEV基因组RNA的3’端，然后用得到的RNA进行cDNA合成，并用箭头所示的引物进行扩增。对得到的产物进行克隆和测序。(C)该电泳照片显示了从(B)所述的寡核苷酸T-连接的JEV基因组RNA合成的JEV-特异性的扩增子。用寡核苷酸TR(与寡核苷酸T互补)合成第一链cDNA，在存在(泳道1)或没有(泳道2)上标II逆转录酶(Superscript II reverse transcriptase)的情况下进行RT反应。用寡核苷酸TR和引物J35(它与nt 10259-10276互补)扩增cDNA。预期PCR产物的大小是727bp。在1.2％琼脂糖凝胶上分离产物，通过溴化乙锭(EtBr)染色使其可视化。(D)该示意图显示了对CNU/LP2基因组RNA的5’端进行测序的程序。用烟酸焦磷酸酶除去病毒基因组RNA的帽结构，然后用T4RNA连接酶使脱帽的病毒RNA自连接，并用于cDNA合成和扩增。对得到的扩增产物进行克隆和测序。(E)该电泳照片显示了从(D)所述的自连接的JEV基因组RNA合成的JEV-特异性的扩增子。用与nt 215-232互补的引物J40进行第一链cDNA的合成。在存在(泳道1)或没有(泳道2)上标II逆转录酶的情况下进行RT反应。用引物J35和引物J39(它与nt 164-181互补)扩增cDNA。预期PCR产物的大小是890bp。在1.2％琼脂糖凝胶上分离扩增产物，通过EtBr染色使其可视化。泳道M表示100bp的DNA大小梯度标记物(按碱基对数)。

图3中的一组图表显示了细菌人工染色体(BAC)pBeloBAC11中的全长JEV cDNA克隆的构建。(A)在pBeloBAC11中构建的全长JEV cDNA的示意图。在代表病毒基因组的5’和3’NTR的两个末端用粗实线指示病毒蛋白。SP6和T7启动子转录起始位点和独特的限制内切酶识别位点(确保失控转录)分别显示在5’和3’端。(B-C)该组示意图显示了全长JEVcDNA克隆的5’和3’末端。JEV基因组RNA的核苷酸序列显示为粗斜体小写字母。解释了4个SP6-驱动的(B)和4个T7-驱动的(C)全长JEV cDNA模板的5’末端。为了产生SP6和T7RNA聚合酶失控产物，通过Xho I酶切，对2个SP6-驱动的(B，pBAC^SP6/JVFL/Xho I和pBAC^SP6/JVFLx/Xho I)和2个T7-驱动的(C，pBAC^T7/JVFL/Xho I和pBAC^T7/JVFLx/Xho I)JEVcDNA模板的3’末端进行线性化，在3’末端生成3个核苷酸的与病毒无关的序列(CGA)。类似地，用Xba I剪切SP6-驱动的(B，pBAC^SP6/JVFLx/Xba I)和T7-驱动的(C，pBAC^T7/JVFLx/Xba I)JEV cDNA模板的3’末端，在3’末端得到4个核苷酸(CTAG)的与病毒无关的序列。相反地，当用Xba I酶切线性化SP6-驱动的(B，pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN)和T7-驱动的(C，pBAC^T7/JVFLx/Xba I^MBN)JEV cDNA模板时，存在可靠的JEV基因组RNA的3’端，然后用绿豆核酸酶(MBN)处理，除去不相关的单链序列。导入在病毒基因组的3’端的限制内切酶识别位点标有下划线。箭头表示剪切位点。

图4中的一组照片和图片证实了下述事实，单独的全长JEV cDNA模板不是感染性的，但是在体外地转录生成感染性的合成RNA的过程中需要它。(A)电泳照片显示了cDNA模板和合成的RNA转录物。(B)图片显示了用体外转录反应混合物(其含有全长JEV cDNA模板和合成的RNA转录物)转染BHK-21细胞得到的感染性。在没有(A，泳道1；B，未处理)或有(A，泳道2；B，Dnase I处理过程中)Dnase I存在的情况下，将Xba I线性化的和用MBN处理过的pBAC^SP6/JVFLx/Xba I(100-200ng)用于SP6聚合酶转录。合成后，用Dnase I(A，泳道3；B，Dnase I处理后)或RNase A(A，泳道4；B，Rnase A处理后)在37℃处理转录反应混合物30分钟。作为对照，在没有SP6RNA聚合酶(A，泳道5；B，没有SP6 Po1)存在的情况下进行反应。(A)处理后，在0.6％琼脂糖凝胶上分离5％的反应混合物，通过用EtBr染色使cDNA模板和RNA转录物可视化。(B)用反应混合物转染BHK-21细胞，评估噬斑的感染中心。

图5中的一组照片和图片对比了合成的JEV和亲代病毒CNU/LP2。(A)合成的JEV和亲代CNU/LP2的代表性的噬斑试验。用亲代或合成的病毒感染BHK-21细胞，覆盖琼脂糖，3天后用结晶紫染色。(B)合成的JEV和亲代CNU/LP2(以0.01、1和10感染复数(MOI))的BHK-21细胞的生长动力学。在指定的感染后小时(h.p.i)收集病毒，通过噬斑试验确定滴度。(C-D)分别通过(C)免疫印迹和(D)RNA印迹分析病毒蛋白和RNA水平。用MOI为1的合成的JEV(泳道1-4)或CNU/LP2(泳道5)感染或模拟感染(泳道6)BHK-21细胞，并培养18小时。(C)从约3×10⁴细胞制备蛋白提取物，在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离。通过用JEV-特异性的小鼠超免疫腹水进行免疫印迹，使病毒蛋白可视化(上区块)。平行地，检测作为装载和转移对照的肌动蛋白(下区块)。与病毒蛋白相关的切割中间产物和肌动蛋白的位置用左边的箭头标示。以kDa为单位的分子量标记标示在右边。(D)从约1×10⁵细胞提取总RNA，通过使用³²p-标记的反义核探针(它与包含nt 9143-9351的NS5基因序列杂交)的RNA印迹进行分析(上区块)。Etbr-染色的18S rRNA条带显示为装载对照(下区块)。全长基因组病毒RNA(11kb)和18S rRNA标示在左边。

图6中的一组简图和电泳照片显示了在来自pBAC^SP6/JVFLx/gm/Xba I的重组JEV中存在Xho I遗传标记。(A)Xho I酶切后预期的JVFLx/Xba I^MBN和JVFLx/gm/Xba I^MBN RT-PCR片段的示意图。标示的是用于RT-PCR(箭头)的引物、导入的Xho I位点(星号)和RT-PCR产物的大小(2,580bp)，以及用Xho I酶切JVFLx/gm/XbaI^MBN后预期的2个Xho I酶切产物(1,506bp和1,074bp)。(B)用从pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN或pBAC^SP6/JVFLx/gm/Xba I^MBN转录出的合成的RNA转染BHK-21细胞。24小时后收获病毒，在0.1感染复数下对BHK-21细胞连续传代。在每一代中，进行下一轮感染之前，将病毒与DNase I和RNaseA一起孵育。在第1代和第3代，从含有释放出来的病毒的培养上清液中提取病毒RNA，用于RT-PCR。在有(+)或没有(-)Xho I的情况下孵育PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上分离，用EtBr染色。未酶切的和酶切的PCR产物的预计大小显示在左边。泳道M标示了1-kb的DNA梯度标记物(按碱基对)。

图7中的图显示了从繁殖了180代的感染性的JEV cDNA克隆(pBAC^SP6/JVFLx/Xba I)转录的合成RNA的特异感染性。在37℃，将两个携带有pBAC^SP6/JVFLx/Xba I(实心和空心圆)的独立克隆在含有氯霉素的2xYT中培养过夜。通过10⁶倍稀释和添加用于过夜生长的新鲜培养基，每天繁殖原代培养物，进行9天。每个传代细胞估计为约20代。在指定的传代细胞，纯化DNA质粒，通过Xba I酶切线性化，并用MBN处理，用作使用SP6RNA聚合酶的失控转录的模板。然后用转录物转染BHK-21细胞，以检测特异感染性。

图8是显示了用JEV cDNA作为载体表达外源基因的一组简图、照片和图片。(A)用于SP6RNA聚合酶的失控转录的cDNA模板的示意图。标示的是脑心肌炎病毒(EMCV)内部核糖体进入位点(IRES)-驱动的GFP或LUC基因(它们插入在病毒基因组3’NTR的起点)、SP6启动子转录起点和失控位点(通过Xba I酶切和MBN处理(XbaI/MBN)生成)。在pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN中，垂直的实线表示在NS3基因(它在nt 5596(星号)预先终止病毒的翻译)的中间的83个核苷酸缺失(nt5580-5663)。(B)GFP蛋白的表达。用2μg从pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI^MBN模板(JVFLx/GFP/XbaI^MBN)转录出来的合成RNA模拟转染(模拟)或转染BHK-21细胞，孵育30小时，然后固定并通过共焦显微镜检查。(C)LUC蛋白的诱导。用2μg从pBAC^SP6/JVFLx/IUC/Xba I^MBN(●)或pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/Xba I^MBN(○)模板转录出来的合成RNA模拟转染(模拟)或转染BHK-21细胞(8×10⁶)，以6×10⁵细胞/孔的密度接种6-孔平板。在指定的时间点裂解细胞，检测LUC活性。从3个独立实验得到的标准偏差用误差棒标示。

图9显示了基于双顺反子的全长感染性的JEV cDNA(它作为BAC)编码外源基因的感染性重组JEV的构建和特征。(A)构建感染性的重组JEV cDNA的策略。亲代感染性的JEV cDNA(pJEV/FL)的结构记载在(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。通过两端(它们表示病毒基因组的5’和3’NTR)的粗实线解释了病毒的ORF。使用独特的天然Nsi I位点，将由EMCV IRES驱动的其它表达单元插入到3’NTR的起点。标示了SP6启动子转录起始位点(SP6启动子)和通过Xba I酶切和MBN处理生成的失控位点(XbaI/MBN)。×标示目标外源基因。(B)显示了在本发明中构建的感染性的重组JEV cDNA的结构。将3中常用的报道基因(EGFP，768bp；LUC，1653bp；和LacZ，3012bp)或显性选择性标记PAC(600bp)工程地构建到3’NTR的起点。关于能复制的pJEV/FL/LUC cDNA，还用不能复制的pJEV/FL/LUC^REP-cDNA作为阴性对照，这通过将83个核苷酸缺失(■)引入到NS3基因的中间来实现，这会导致病毒翻译在nt 5596(^*)提前终止，如以前所述(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。(C-D)对比了重组JEV和亲代的感染性。如标示的，用2μg亲代或重组JEV RNA(它们已经从相关的JEV cDNA转录出来)模拟转染或转染BHK-21细胞(8×10⁶)。(C)代表性的噬斑。将转化后的细胞覆盖琼脂糖，5天后用结晶紫染色。(D)病毒蛋白积累。在指定的时间点，用1X样品装载缓冲液裂解转染的细胞(4×10⁵)，将蛋白提取物溶解到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。通过使用JEV-特异性的小鼠超免疫血清的免疫印迹使病毒蛋白可视化(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。病毒蛋白(E和NS1)和与切割有关的中间产物的位置通过左边的箭头标示。分子量标记(按kDa)标示在右边。V标示了用JEV CNU/LP2-感染的BHK-21细胞，而N标示了原初BHK-21细胞。

图10显示了常用的报道基因和用感染性的JEV cDNA作载体的显性选择标记的表达。用2μg亲代或重组JEV RNA(它们已经从每个质粒转录出来)模拟转染或转染BHK-21细胞(8×10⁶)。(A-B)pJEV/FL/EGFP，(C)pJEV/FL/LacZ，(D)pJEV/FL/LUC或pJEV/FL/LUC^REP-，(E)pJEV/FL/PAC。(A-B)EGFP的表达。转染后36小时，制备转染的细胞，用于(A)共焦显微镜检查和(B)流式细胞分析。—标示了JEV/FL/EGFP RNA-转染的细胞，……标示了模拟转染的细胞。(C)LacZ的表达。转染后36小时，处理转染的细胞，进行X-gal染色。(D)LUC的诱导。以4×10⁵细胞/孔的密度，将转染的细胞接种到6-孔平板上。在指定的时间点，用细胞裂解物进行LUC试验。试验一式三份，平均值通过误差棒表示。●标示了JEV/FL/LUC RNA-转染的细胞，○标示了JEV/FL/LUC^REP-RNA-转染的细胞，—标示了原初细胞的背景荧光的水平。(E)PAC的表达。将转染的细胞涂布到6-孔平板上，并在完全培养基(平皿1，3，5，和7)中或含有0.5％琼脂糖的涂层(平皿2，4，6，和8)中孵育。孵育2天后，在有(平皿5-8)或没有(平皿1-4)10μg/ml嘌呤霉素存在的情况下，将平皿再孵育3天。然后固定细胞，用结晶紫染色。

图11显示了JEV病毒复制子的结构和载体特征。(A)显示了JEV病毒复制子的结构。实框(■)表示已经导入感染性的pJEV/FL/LUC构建体的基因组中的框架内缺失。4个构建体，即pJEV/Rep/ΔCC/LUC，pJEV/Rep/ΔC/LUC，pJEV/Rep/ΔprM/LUC和pJEV/Rep/ΔE/LUC都有单一的在每个JEV结构基因中的框架内缺失。pJEV/Rep/ΔCC/LUC具有一个延伸至猜想的在C基因的5’区域中环化序列基序的缺失，这与pJEV/Rep/ΔC/LUC不同。3个构建体，即pJEV/Rep/ΔC+ΔprM/LUC，pJEV/Rep/ΔC+ΔE/LUC和pJEV/Rep/ΔprM+ΔE/LUC含有2个框架内缺失，而pJEV/Rep/ΔC+ΔprM+ΔE/LUC在所有的结构蛋白中具有3个框架内缺失。pJEV/Rep/NS1/LUC也是工程化的，其编码C蛋白的35个N-末端和24个C-末端氨基酸，该C蛋白的后面紧跟着NS1蛋白的N-末端和其它病毒基因组。(B)LUC的诱导。用2μg亲代或JEV病毒复制子RNA(它们已经从每个质粒转录出来)转染原初BHK-21细胞(8×10⁶)，然后以4×10⁵细胞/孔的密度接种到6-孔平板上。在指定的时间点，对细胞裂解物进行LUC试验。试验一式三份地进行，并显示平均值。●黑色，pJEV/FL/LUC；◆黑色，pJEV/FL/LUC^REP-；◆蓝色，pJEV/Rep/△CC/LUC；■蓝色，pJEV/Rep/△C/LUC；▲蓝色，pJEV/Rep/△prM/LUC；●蓝色，pJEV/Rep/△E/LUC；■红色，pJEV/Rep/△C+△prM/LUC；▲红色，pJEV/Rep/△C+△E/LUC；●红色，pJEV/Rep/△prM+△E/LUC；■绿色，pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC；●绿色，pJEV/Rep/NS1/LUC。—标示了原初细胞的背景荧光水平。(C)病毒蛋白的积累。转染后48小时，用1X样品装载缓冲液裂解转染的细胞(4×10⁵)，将蛋白提取物溶解到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用JEV-特异性的小鼠超免疫血清进行免疫印迹。

图12显示了用于JEV病毒复制子的包装系统的构建。(A)以基于新培斯病毒的表达载体为基础的JEV结构蛋白表达盒的结构。pSinRep19是双亚基因组的无致细胞病性的RNA载体。使用分开的亚基因组启动子表达外源基因和PAC基因，如箭头所示。pSinRep19/JEV C-E盒编码JEV C、prM和E基因。pSinRep19/JEV C-E-BglII盒编码JEV C、prM和E基因，其后是NS1的N末端的58个残基，而pSinRep19/JEV C-NS1携带NS1基因的剩余物。MCS标示了多克隆位点。(B)从3个JEV结构蛋白表达盒表达出的JEV结构蛋白的蛋白质印迹分析。用每种JEV结构蛋白表达载体RNA模拟转染或转染BHK-21细胞，48小时后获得裂解物。将等量的细胞裂解物溶解到SDS-PAGE上，用JEV-特异性的超免疫血清检测。标示在右边的是病毒蛋白E和NS1的位置，在左边的是分子量标记(按kDa)。(C)该示意图显示了如何通过下述方法生成JEV VRP：(i)共转染JEV结构蛋白表达载体RNA和JEV病毒复制子RNA，或(ii)用JEV病毒复制子RNA转染能表达JEV结构蛋白的PCL。(D-E)JEVVRP的生产。使用了两个方案。一个方案包括用2种载体RNA，即(D)所示的JEV结构蛋白表达载体RNA和JEV病毒复制子载体RNA共转染原初BHK-21细胞。另一个方案包括用(E)所示的JEV病毒复制子载体RNA转染的JEVPCL。使用的JEV病毒复制子RNA如下：□绿色，JEV/Rep/△C+△prM+△E/EGFP；■绿色，JEV/Rep/NS1/EGFP；□蓝色，JEV/Rep/△C+△prM+△E/LacZ；■蓝色，JEV/Rep/NS1/LacZ；□黑色，JEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC；■黑色，JEV/Rep/NS1/LUC。转染后48小时收集上清液，并用来感染原初BHK-21细胞来滴定VRP和检测各报道基因表达。—标示了原初细胞的背景荧光水平。

实施例

下面的实施例解释了本发明的可行的和目前优选的实施方案。

但是，本领域的技术人员能够明白，参考公开的内容，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。

实施例1：JEV病毒的分离

<1-1>细胞系和病毒

BHK-21细胞系由Rockefeller大学的Charles M.Rice博士提供，并维持在α-极限必需培养基(MEM)中，该培养基中添加了10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、维生素和抗生素。在细胞培养中使用的所有试剂均购自Gibco/BRL Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD。韩国JEV株K87P39(Chung等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，1996，55，91-97)是从韩国国家健康研究所(Korean National Institute ofHealth)得到。该JEV K87P39在1987年分离自韩国野生型蚊子，并在乳小鼠脑中经历了5代。YF17D黄热病毒株由感染性的cDNA pACNR/YF17D(Charles M.Rice博士提供)通过如下所述的SP6聚合酶失控转录生成。

<1-2>噬斑纯化

用MEM覆盖感染了JEV K87P39株的细胞，所述MEM含有10％胎牛血清和0.5％ SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)，并在5％ CO₂、37℃的培养箱中孵育3至4天。培养3至4天后，用3.7％甲醛在室温固定感染的细胞4小时。然后，除去覆盖细胞的琼脂糖。通过结晶紫染色使噬斑可视化。结果，K87P39株形成了病毒噬斑大小的异源混合物(图1A，K87P39-感染的)。

随后，本发明的发明人用BHK-21细胞进行了噬斑纯化试验，以分离同源群体的形成大噬斑的变体，本发明的发明人命名为CNU/LP2。用MEM覆盖感染了JEV K87P39株的BHK-21细胞，所述MEM含有10％胎牛血清和0.5％ SeaKem LE琼脂糖，并在5％ CO₂、37℃的培养箱中孵育3至4天。用无菌的巴氏滴管挑取单独的噬斑，重新悬浮到1ml MEM中。在4℃从琼脂糖洗脱病毒2小时。将洗脱液在BHK-21细胞中仅扩增一次，并在-80℃储存。

进行噬斑试验，对比用JEV K87P39和JEV CNU/LP2株感染的易感BHK-21细胞的病毒噬斑大小。结果，用K87P39感染的易感BHK-21细胞的病毒噬斑大小发生了变化(图1A，K87P39-感染的)。另一方面，在本发明中纯化的CNU/LP2形成了同源群体的大噬斑(图1A，CNU/LP2-感染的)。另外，当用JEV K87P39和JEV CNU/LP2株感染Vero细胞时，还观察到了类似的噬斑形态学(图1B)。

<1-3>免疫荧光

为了通过共焦显微镜检查感染的BHK-21细胞中的JEV表达，将细胞(2×10⁵)接种到4孔分室载玻片中，孵育12小时，然后用MOI为1的原始的JEV K87P39株、JEV CNU/LP2分离物或YF17D株模拟感染或感染18小时。在含有0.37％(v/v)甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在25℃孵育30分钟，第一次固定细胞，完成JEV病毒蛋白的免疫染色。然后用PBS洗涤细胞3次，用含有0.2％(v/v)Triton X-100的PBS在37℃透化处理10分钟。此后，用PBS洗涤细胞4次，在PBS中再水化15分钟，用含有5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS在37℃封闭1小时。然后用对JEV特异性的1∶500-稀释的小鼠超免疫腹水液在25℃孵育细胞2小时，用PBS洗涤3次，用1∶500-稀释的FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG(JacksonImmunoResearch Labs Inc.)在25℃孵育2小时，再用PBS洗涤3次。此后，将细胞在含有5μg/ml碘化丙锭和5μg/ml RNase A的PBS中在37℃孵育30分钟，以定位核，并用0.2ml 80％甘油封固。在Zeiss Axioskop共焦显微镜成像，其装配有带有Bio-Rad MRC 1024的63X物镜和LaserSharp软件。

用抗-JEV的超免疫腹水进行的共焦显微镜检查表明，感染了CNU/LP2的BHK-21细胞在核膜周围表达JEV病毒蛋白(图1C，CNU/LP2-感染的)，这类似于K87P39-感染的细胞(图1C，K87P39-感染的)。在模拟感染的BHK-21细胞中没有观察到这样的荧光染色(图1C，模拟感染的)。作为阴性对照，用黄热病毒17D(与JEV密切相关的黄病毒)感染的BHK-21细胞没有染上抗-JEV的超免疫腹水(图1C，YF17D-感染的)。多种动物细胞系(包括神经元的SHSY-5Y(人)和B103(小鼠)细胞系和无神经元的Vero(猴子)和MDCK(狗)细胞系)的CNU/LP2感染在培养上清液中产生了高病毒滴度(10⁶-10⁷PFU/ml)。因而，本发明的发明人决定使用CNU/LP2作为亲代株来开发用于JEV的反向遗传系统。

实施例2：JEV CNU/LP2基因组RNA的完整核苷酸序列分析

根据生产商(Gibco/BRL)的推荐，使用300μl TRIzol LS试剂从100μl含有病毒的培养液中提取病毒的基因组RNA，然后重新悬浮到20μl无RNase的水中。为了分析病毒基因组RNA的完整核苷酸序列，通过长RT-PCR扩增了代表整个病毒RNA基因组的5个重叠的cDNA(JVF，JVM，JVR，JV3NTR和JV35NTR)(图2)。根据可以从GenBank数据库得到的全部16个完整测序的JEV RNA基因组(CH2195LA、CH2195SA、FU、GP78、HVI、JaGAr01、JaOArS982、K94P05、Vellore P20778、p3、SA(A)、SA(V)、SA14、SA14-14-2、TC和TL株)的共有序列设计了用于cDNA合成和扩增的寡核苷酸。

<2-1>JEV CNU/LP2基因组RNA的核苷酸序列分析

对于JVF扩增子(nt 1-3865)，将引物J7(由SEQ.ID.No 1标示，且与JEV基因组的nt 3986-4003互补)用于cDNA合成(图2A)。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No 2所代表的且与nt 1-18互补的引物J8、由SEQ.ID.No 3所代表的且与nt 3845-3865互补的引物J6。对于JVM扩增子(nt3266-8170)，将引物J4(由SEQ.ID.No 4标示，且与JEV基因组的nt8150-8170互补)用于cDNA合成。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No 5所代表的且与nt 3266-3283互补的引物J20和引物J4。对于JVR扩增子(nt7565-10893)，将引物J1(由SEQ.ID.No 6标示，且与JEV基因组的nt10947-10967互补)用于cDNA合成。用于PCR扩增的引物是SEQ.ID.No7所代表的且与nt 7565-7582互补的引物J12、由SEQ.ID.No 8所代表的且与nt 10870-10893互补的引物J2。在20μl反应混合物中进行标准的RT反应，所述反应混合物含有10ul提取的病毒RNA、5pmol合适的引物、100U上标II逆转录酶(Gibco/BRL)、40U RNaseOUT(Gibco/BRL)、0.1mM二硫苏糖醇(DTT)、10mM三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)混合物和由生产商(Gibco/BRL)提供的RT缓冲液。将反应混合物在37℃孵育1小时，然后在70℃加热15分钟。随后用RT混合物的5μl等份试样进行PCR扩增，使用Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)和合适的引物对。PCR进行30个循环，其中在94℃变性30秒、在60℃退火30秒并在72℃延伸5分钟，最后在72℃延伸10分钟。为了避免由于克隆导致的选择偏差，用自动化的3700DNA测序仪对扩增产物的未克隆物在两个方向直接测序。对2种独立分离的病毒RNA制品的测序分析产生了等同的序列。

结果，检测了除3’-和5’-末端区域以外的JEV CNU/LP2整个病毒基因组的完整核苷酸序列，并由SEQ.ID.No 9表示。

<2-2>检测JEV CNU/LP2基因组RNA的3’-末端序列

为了对JEV CNU/LP2基因组RNA的3’-末端序列进行测序，将SEQ.ID.No 10所示的合成的寡核苷酸T连接到病毒基因组RNA的3’端，以提供用于cDNA合成和PCR扩增的引物结合位点(Kolykhalov等，J.Virol.，1996，70，3363-3371)。首先通过用末端脱氧核苷酸转移酶(Takara)(它会阻断寡核苷酸T的分子内和分子间连接)整合ddATP修饰寡核苷酸T的3’端。寡核苷酸T的5’端还用T4多核苷酸激酶(Takara)磷酸化。此后，通过T4 RNA连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)将修饰的寡核苷酸T连接到病毒基因组RNA的3’端。20μl连接反应混合物含有10UT4 RNA连接酶、40U RNaseOUT、10pmol寡核苷酸T、病毒基因组RNA和由生产商(NEB)提供的缓冲液。在16℃孵育12小时后，用苯酚提取连接的病毒RNA，用乙醇沉淀，用20μl无RNase的水重新悬浮。随后，将10μl寡核苷酸-连接的病毒RNA和SEQ.ID.No 11代表的寡核苷酸TR(如前所述，它与寡核苷酸T互补)用于cDNA合成。用SEQ.ID.No 12表示的且与nt 10259-10276互补的引物J35和引物TR扩增第一链cDNA。为了PCR，用Pyrobest DNA聚合酶和30个循环(94℃30秒、60℃30秒、和72℃1分钟)并最后在72℃延伸10分钟来扩增5μl等份试样的RT反应混合物。PCR混合物如上所述。使用分别整合进正义引物和反义引物中的Hind III和EcoR I位点，将命名为JV3NTR的cDNA扩增子克隆进pRS2载体(由Charles M.Rice博士提供)(图2B)。

琼脂糖凝胶电泳的结果表明，扩增产物迁移成2条带，较大的带约700bp，较小的带约450bp(图2C)。纯化和克隆两条带，分别对20个和10个随机挑取的含有较大带和较小带的克隆进行测序。如已经记载的大多数完全测序的JEV分离物，本发明的发明人发现所有的含有较大插入物(约700bp)的克隆的病毒基因组末端都是-GATCT¹⁰⁹⁶⁸。相反地，所有的含有较小插入物(约450bp)的克隆的病毒基因组在nt 10684处被截断，产生的带短了284bp。在装配全长JEV cDNA的过程中，本发明的发明人使用了较大插入物的核苷酸序列，因为较小的插入物在病毒基因组的3’端缺少284个核苷酸。

<2-3>检测JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列

通过病毒RNA的自连接检测JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列(Campbell和Pletnev，Virology，2000，269，225-237)。首先用烟酸焦磷酸酶(TAP)切除病毒基因组RNA的帽结构。剪切反应混合物(20μl)含有10U TAP(Epicentre Technology Co.，Madison，WI)、10μl病毒RNA和生产商(Epicentre Technology Co.)提供的缓冲液。在37℃孵育1小时后，用苯酚提取TAP-处理的病毒RNA，用乙醇沉淀，用20μl无RNase的水重新悬浮。如上所述，用T4RNA连接酶使一半(10μl)去帽的病毒RNA在20μl反应混合物中自连接。将四分之一(5μl)自连接的病毒RNA和SEQ.ID.No 13表示的且与nt 215-232互补的引物J40一起用于cDNA合成。用SEQ.ID.No 14表示的且与nt 164-181互补的引物J39和引物J35进行PCR扩增第一链cDNA(图2D)。琼脂糖凝胶电泳表明，作为单一带的扩增产物是约850bp(图2E)。用Apo I和Spe I酶切扩增的cDNA扩增子(JV35NTR)，并连接进已经用Apo I和Xba I酶切的pRS2载体，生成构建体pRS2/JV3′5′。

为了对JEV CNU/LP2基因组RNA的5’-末端序列测序，对12个随机挑取的克隆进行了测序。在所有的12个克隆中，本发明的发明人发现，病毒3’-末端序列的-GATCT¹⁰⁹⁶⁸后面跟着5’-末端序列¹AGAAGT-(图2B和2C)。通过对未克隆物进行直接循环测序，也得到了相同的结果。因而，本发明的发明人已经检测了CNU/LP2分离物的完整核苷酸序列，并确定其序列如SEQ.ID.No 15所示。

实施例3：构建用于JEV的全长感染性的cDNA

在我们初始尝试克隆CNU/LP2RNA基因组的cDNA时，发现病毒基因组的特定区域与在大肠杆菌中克隆高拷贝数的质粒不相容，因为克隆的DNA要经历遗传重排。这些困难在其它黄病毒中也已经有报道(Campbell和Pletnev，Virology，2000，269，225-237；Polo等，J.Virol.，1997，71，5366-5374；Gritsun和Gould，Virology，1995，214，611-618；Sumiyoshi等，J.Infect.Dis.，1995，171，1144-1151；Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431；Rice等，New Biol.，1989，1，285-296)。由于遗传不稳定性和低DNA产率，将该区域克隆进低拷贝数的细菌质粒中的尝试也没有成功。因此，本发明的发明人使用细菌人工染色体(BAC)质粒pBeloBAC11作为载体来容纳JEV的全长感染性的cDNA。

<3-1>亚克隆3个长的重叠的JEV cDNA扩增子

本发明的发明人使用了根据标准方法的重组DNA技术(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring Harbor Laboratory)。首先，将3个起始用于完整核苷酸序列分析的重叠的cDNA扩增子(JVF，JVM和JVR)亚克隆进SEQ.ID.No 42表示的pBAC/SV(pBeloBAC11质粒的衍生物)中。pBAC/SV质粒含有pACNR/NADL的49ibp的Not I-Aat II(T4DNA聚合酶处理过的)片段(Mendez等，J.Virol.，1998，72，4737-4745)、pSINrep19的9,215bp的Sac I(T4DNA polymeras处理过的)-Ssp I(T4 DNA聚合酶处理过的)片段(Frolov等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，1996，93，11371-11377)和pBeloBAC11的6,875bp的Sfi I(T4DNA聚合酶处理过的)-Not I片段。因而，JVF扩增子的3,863bp的Rsr II-Avr II片段、JVM扩增子的4,717bp的BspE I-Mlu I片段和JVR扩增子的3,326bp的Rsr II-Bgl II片段被插入到了pBAC/SV质粒(它已经用相同的酶酶切)中。这分别生成了pBAC/JVF、pBAC/JVM、pBAC/JVR亚克隆构建体。使这些BAC质粒在大肠杆菌DH10B细胞中生长，并测序。克隆的cDNA的核苷酸序列与CNU/LP2的相同，只是在pBAC/JVR的NS5基因中有点突变：T⁸⁹⁰⁶→C(沉默)。T⁸⁹⁰⁶→C的取代是翻译水平的沉默，并且一定是在克隆过程中产生的，因为对8个随机挑取的单个克隆进行的测序表明在nt 8906处有T残基。尽管T⁸⁹⁰⁶→C的取代没有改变对应的氨基酸，但是该变化可能会影响病毒复制(van Dinten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94，991-996)，因此，本发明的发明人将该取代修正回T残基。T⁸⁹⁰⁶→C取代是通过再克隆315bp的Apa I-Hind III片段(对应于nt 8827-9142)来修正的，生成构建体pBAC/JVRR。在它们的操作和在大肠杆菌菌株DH10B中繁殖的过程中，所有3个亚克隆的JEV cDNA保持遗传稳定。

<3-2>将SP6启动子插入全长JEV cDNA的5’端

为了有利于将噬菌体SP6启动子转录起点精确连接到全长JEV cDNA的5’端，本发明的发明人修饰了pBAC/JVF。首先，通过pBAC/SV的PCR(使用SEQ.ID.No 16表示的引物J41和SEQ.ID.No 17表示的引物J43，它整合了SP6启动子的反义序列)和pBAC/JVF的PCR(使用SEQ.ID.No18表示的引物J42和SEQ.ID.No 19表示的引物J40)分离了两个片段。通过第二轮的PCR(使用引物J41和J40)，将这2个片段融合。用Pac I和Pme I酶切得到的扩增子，连接到pBAC/JVF(它已经用相同的两种酶酶切)。这生成pBAC^SP6/JVF。

<3-3>构建全长的含有SP6启动子的JEV cDNA

为了在病毒基因组的3’端被线性化的质粒失控转录的过程中生成可靠的或近乎可靠的3’末端，本发明的发明人修饰了pBAC/JVRR，使可靠的3’末端的核苷酸序列后跟着独特的限制内切酶Xho I或Xba I的识别位点。为了创建在病毒基因组的末端含有独特的Xho I位点的pBAC/JVRR/XhoI亚克隆，用使用SEQ.ID.No 20表示的引物J90和SEQ.ID.No 21表示的引物J45(它整合有Xho I位点)的pRS2/JV3’5’的PCR扩增合成了片段I。用pBAC/JVRR(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)连接片段I扩增子的298bp的Sfi I-Spe I部分。为了创建pBAC/JVRRx/XbaI(其在病毒基因组的末端具有Xba I位点)，首先通过PCR导入沉默点突变(A⁹¹³⁴→T)，使NS5基因中的核苷酸9,131至9,136处的Xba I位点失活。在该构建体中，“x”表示存在破坏原始的Xba I位点的沉默点突变(A⁹¹³⁴→T)。更具体地，用SEQ.ID.No 22表示的引物J31和用SEQ.ID.No 23表示的引物J47(其包含A⁹¹³⁴→T的取代)扩增了pBAC/JVRR。将cDNA扩增子的315bp的Apa I-Hind III部分(与核苷酸8,828至9,143对应)克隆进pBAC/JVRR，生成构建体pBAC/JVRRx。随后，按照对于pBAC/JVRR/Xho I描述的相同方式，构建了pBAC/JVRRx/Xba I。通过pRS2/JV3’5’(使用引物J90和SEQ.ID.No 24表示的引物J46，其包含XbaI位点)的PCR扩增得到了片段II。然后将片段II扩增子的298bp的Sfi I-SpeI部分连接进pBAC/JVRRx(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)。为了创建含有独特的Xho I位点和A⁹¹³⁴→T取代的pBAC/JVRRx/Xho I，将片段I扩增子的298bp的Sfi I-Spe I部分连接进pBAC/JVRRx(它已经用Sfi I和Nhe I酶切)。

因而，本发明的发明人构建了5个质粒：pBAC^SP6/JVF、pBAC/JVM、pBAC/JVRR/Xho I、pBAC/JVRRx/Xba I和pBAC/JVRRx/Xho I。这些质粒含有JEV基因组的邻接区域，并且现在可以用于组装3个不同的全长JEVcDNA(图3)。首先，通过将pBAC/JVM的4,717bp的BspE I-Mlu I片段、pBAC^SP6/JVF的8,970bp的BspE I-Xba I片段和pBAC/SV的3,670bp的XbaI-Mlu I片段连接到一起，构建了pBAC^SP6/JVFM亚克隆。随后，将pBAC^SP6/JVFM的2个片段(8,142bp的Pac I-Sap I片段和4,801bp的PacI-BsrG I片段)与i)pBAC/JVRR/Xho I的5,620bp的Sap I-BsrG I片段相连生成pBAC^SP6/JVFL/XhoI，与ii)pBAC/JVRRx/Xba I的5,662bp Sap I-BsrGI片段相连生成pBAC^SP6/JVFLx/Xba I，或与iii)pBAC/JVRRx/Xho I的5,620bp的Sap I-BsrG I片段相连生成pBAC^SP6/JVFLx/Xho I。最后，将3个组装的全长JEV cDNA命名为pBAC^SP6/JVFL/Xho I、pBAC^SP6/JVFLx/Xho I和pBAC^SP6/JVFLx/Xba I，并且分别由SEQ.ID.No 43、No 44和No 45表示(图3B)。这些cDNA克隆都在病毒基因组的起始处具有SP6启动子转录起点，所以使用SP6RNA聚合酶进行体外转录能生成具有可靠的5’端的合成的RNA转录物(图3B，灰框)。为了确保失控转录后的病毒基因组的3’端是近乎可靠的，本发明的发明人在病毒基因组的末端设置了一个独特的限制内切酶Xho I或Xba I的识别位点(图3B，标有下划线的)。因而，pBAC^SP6/JVFL/Xho I携带有位于病毒基因组末端的Xho I位点。对于含有Xba I位点(紧挨病毒基因组末端)的构建体，由于该病毒基因组在NS5基因中已经含有Xba I位点，该位点必须通过导入沉默点突变(A⁹¹³⁴→T)来破坏掉。该构建体命名为pBAC^sP6/JVFLx/Xba I，其中“x”表示存在能破坏原始的Xba I位点的沉默点突变。第三个克隆pBAC^SP6/JVFLx/Xho I含有在病毒基因组末端的Xho I位点和A⁹¹³⁴→T的取代。

本发明的发明人于2002年10月2日将pBAC^SP6/JVFLx/Xba I保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscienceand Biotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10347BP)。

<3-4>构建含有T7启动子的全长JEV cDNA

除了SP6-驱动的JEV cDNA以外，本发明的发明人还以与实施例<3-3>类似的方式构建了一组3个T7-驱动的全长JEV cDNA。首先，用SEQ.ID.No 25表示的引物J81和SEQ.ID.No 26表示的引物J80进行PCR，合成了来自pBAC/NADLcIn-/PAC(由Charles M.Rice博士提供)的片段。还用SEQ.ID.No 27表示的引物J42和SEQ.ID.No 28表示的引物J82合成了来自pBAC^SP6/JVFLx/Xba I的片段。通过用引物J81和J82的第二轮的PCR，使这2个片段融合。将得到的扩增子的793bp的EcoR I-SpeI片段插入用EcoR I和Xba I酶切过的pRS2载体，生成构建体pRS2^T7/5’JV。将pRS2^T7/5’JV的675bp的Pvu I-Pme I片段，与i)pBAC^SP6/JVFL/Xho I的18,364bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBAC^T7/JVFL/Xho I，与ii)pBAC^SP6/JVFLx/Xho I的18,364bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBAC^T7/JVFLx/Xho I，或与iii)pBAC^SP6/JVFLx/Xba I的18,366bp的Pac I-Pme I片段相连接，生成pBAC^T7/JVFLx/Xba I。最后，将3个组装的全长JEV cDNA命名为pBAC^T7/JVFL/Xho I、pBAC^T7/JVFLx/Xho I和pBAC^T7/JVFLx/Xba I，并分别由SEQ.ID.No 46、No 47和No 48表示(图3C)。在组装过程中的每一个步骤，通过广泛的限制和核苷酸序列分析判断克隆的cDNA的结构完整性。没有观察到导致缺失或重排的结构不稳定性。

本发明的发明人于2002年10月2日将pBAC^T7/JVFLx/Xba I保藏在韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute of Bioscience andBiotechnology)(KRIBB)的基因库中(保藏号：KCTC 10346BP)。

实施例4：转录和转染

本发明的发明人通过体外转录合成了RNA转录物。更具体地，将100至200ng模板DNA(用Xho I或Xba I酶切线性化，并且在有些情况下用MBN修饰过)加入到25-μl由下述组分组成的反应混合物中：生产商提供的缓冲液(Gibco/BRL)+0.6mM帽类似物[m⁷G(5′)ppp(5′)A或m⁷G(5′)ppp(5′)G，NEB Inc.]，0.5μM[³H]UTP(1.0mCi/ml，50Ci/mmol，NewEngland Nuclear Corp.，Boston，MA)，10mM DTT，1mM各UTP、GTP、CTP和ATP，40U RNaseOUT和15U SP6RNA聚合酶(Gibco/BRL)。将该反应混合物在37℃孵育1小时。通过RNA向DE-81(Whatman，Maidstone，UK)滤纸的吸附检测[³H]UTP的整合，在此基础上对RNA定量(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring Harbor Laboratory)。通过琼脂糖凝胶电泳检测反应混合物的1-至1.5-μl等份试样，并在使用前将等份试样储存在-80℃。

为了进行RNA转染，使用型号为ECM 830的电穿孔仪(BTX Inc.，SanDiego，CA)，按照生产商的说明，用合成的RNA对细胞进行电穿孔。简要而言，用胰蛋白酶处理分汇合的细胞，用冰冷却的无RNase的PBS洗涤3次，以2×10⁷细胞/ml的密度重新悬浮到PBS中。将悬浮液的400-μl等份试样与2μg合成的RNA相混合，立即在预先确定为最佳的条件(980V，99-μs脉冲长度，和5个脉冲)下进行电穿孔细胞。然后将电穿孔后的混合物转移至10ml新鲜培养基。

用感染性中心试验定量合成的RNA的特异感染性。更具体地，为了失控转录，通过用Xho I或Xba I酶切，使JEV cDNA模板线性化。在存在m⁷G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下，2个Xho I-线性化的质粒(pBAC^SP6/JVFL/Xho I和pBAC^SP6/JVFLx/Xho I)的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在其3’端含有3个核苷酸(CGA)的与病毒无关的序列(图3B)。这是复制Xho I酶切剩下的5’突出物的结果(图3B)。类似地，在存在m⁷G(5′)ppp(5′)A帽结构类似物的情况下，Xba I-线性化的pBAC^SP6/JVFLx/Xba I质粒的SP6聚合酶失控转录生成了带帽的合成的RNA，在其3’端含有4个核苷酸(CTAG)的与病毒无关的序列(图3B)。将电穿孔的细胞系列稀释10倍，在6-孔平板涂布未转染的细胞的单层(5×10⁵)。让细胞向平板吸附6小时，然后如上所述用含有0.5％SeaKem LE琼脂糖的MEM覆盖它们。将平板在37℃、5％CO₂下孵育3至4天，通过结晶紫染色使感染性的噬斑中心可视化。

当易感的BHK-21细胞受到来自这些构建体的合成的RNA的转染时，都是高度感染性的(表3)。也就是说，在最佳电穿孔条件转染的来自pBAC^SP6/JVFL/Xho I，pBAC^SP6/JVFLx/Xho I和pBAC^SP6/JVFLx/Xba I的合成的RNA分别具有3.5×10⁵、4.3×10⁵和3.4×10⁵PFU/μg的特异感染性(表3，感染性)。还从来自T7-驱动的cDNA构建体转录的合成的RNA(通过T7聚合酶失控转录)得到了类似的结果(表3，感染性)。

表3从全长JEV cDNA生成的体外RNA转录物的特异感染性和病毒滴度

  用于转录的模板^a  感染性^b  (PFU/μg的  RNA)        病毒滴度^C(PFU/ml)  24小时  48小时  pBAC^SP6/JVFL/XhoI  pBAC^T7/JVFL/XhoI  3.5×10⁵  2.9×10⁵  4.4×10⁵  2.0×10⁵  3.6×10⁶  2.3×10⁶  pBAC^SP6/JVFLx/XhoI  pBAC^T7/JVFLx/XhoI  4.3×10⁵  3.8×10⁵  2.1×10⁵  3.3×10⁵  5.2×10⁶  4.1×10⁶  pBAC^SP6/JVFLx/XbaI  pBAC^T7/JVFLx/XbaI  3.4×10⁵  3.0×10⁵  3.5×10⁵  2.4×10⁵  3.2×10⁶  2.7×10⁶  pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN  pBAC^T7/JVFLx/XbaI^MBN  3.1×10⁶  2.7×10⁶  6.2×10⁶  5.6×10⁶  1.4×10⁶  2.4×10⁶

^a：所有的全长JEV cDNA都用用于失控转录的合适的限制内切酶(如在cDNA的名字中标示的)线性化。关于pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN和pBAC^T7/JVFLx/XbaI^MBN，这些cDNA模板是通过Xba I酶切线性化、然后用MBN处理来制备的。

^b：用SP6或T7RNA聚合酶体外转录后，如标示的，将样品用于电穿孔BHK-21细胞，并检测感染性的噬斑中心。

^C：在电穿孔后24和48小时时的病毒滴度。

<4-1>构建在其3’端缺失与病毒无关的序列的JEV RNA转录物

已经报道，对于一些黄病毒，存在于从感染性的cDNA转录的合成RNA的3’端的无关序列会减少或消除它们的特异感染性(Yamshchikov等，Virology，2001，281，294-304)。基于该报道，本发明的发明人生成了在它们的3’端缺少与病毒无关的序列的合成RNA，并对比了它们的特异感染性。更具体地，通过在转录反应之前用MBN处理Xba I-线性化的pBAC^sp6/JVFLx/Xba I质粒除去4个多余的核苷酸CTAG，本发明的发明人生成了缺少与病毒无关的序列的合成JEV RNA。与未处理的转录物相比，来自Xba I-线性化的和MBN-处理过的pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^T7/JVFLx/XbaI(pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN，图3B；和pBAC^T7/JVFLx/XbaI^MBN，图3C)的RNA转录物都具有增强的特异感染性。更精确地，估计从pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN转录出的RNA的特异感染性为3.1×10⁶PFU/μg，约是未修饰模板的特异感染性(3.4×10⁵PFU/μg)的10倍(表3，感染性)。源自pBAC^T7/JVFLx/Xba I的RNA在MBN修饰后也具有增强的特异感染性(2.7×10⁶PFU/μg)(表3，感染性)。因此，本发明的发明人证实了，应当存在JEV基因组的可靠的3’端，以确保生成高度感染性的合成的JEV RNA转录物。

另外，由于在3’端存在3或4个与病毒无关的核苷酸，改变的RNA转录物的特异感染性还会影响从转染的BHK-21细胞的培养上清液中收获的病毒滴度。从未用MBN处理过的pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI得到RNA转录物转染的BHK-21细胞释放出的病毒滴度的范围在转染后24小时为2.1×10⁵至4.4×10⁵PFU/ml(表3，病毒滴度24小时)，这时仍有半数转染的细胞吸附在培养皿上，证实了病毒诱导的强烈的细胞病理效应。在转染后48小时，这些滴度升高了约10倍，达到3.2×10⁶至5.2×10⁶PFU/ml(表3，病毒滴度48小时)，这时大多数细胞已经死亡，并且从培养皿底部脱落。相反地，从用来自MBN-处理过的pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN的RNA转录物转染BHK-21细胞释放的病毒滴度在转染后24小时已经达到了6.2×10⁶PFU/ml，这时大多数转染的细胞已经死亡，(表3，病毒滴度24小时)。在转染后48小时，该滴度略微下降，达到1.4×10⁶PFU/ml(表3，病毒滴度48小时)。用T7聚合酶驱动的RNA转录物观察到了类似的病毒生成情况(表3)。

实施例5：确认合成的RNA转录物的特异感染性

本发明的发明人确认了，特异性的感染性需要来自全长JEV cDNA模板的RNA的转录，它使用全长cDNA克隆pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN(图4)。单独的cDNA模板不是感染性的(图4A，泳道5和B，无SP6 Pol)，但是在转录反应的过程中需要完整的cDNA模板，因为DnaseI处理会消除感染性(图4A，泳道2和B，DNaseI处理过程中)。转录反应后的添加DNaseI相对于完整的反应混合物(图4A，泳道1和B，未处理)没有作用(图4A，泳道3和B，DNaseI处理后)，但是RNaseA处理消除转录的合成RNA的感染性(图4A，泳道4和B，RNaseA处理后)。

实施例6：从全长的感染性的cDNA回收的合成JEV和CNU/LP2亲代病毒之间的对比

本发明的发明人对比了从全长感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/Xba I和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)回收的合成JEV和原始用于cDNA构建的亲代病毒CNU/LP2(噬斑形态学、生长动力学、蛋白表达、RNA生产等)。

<6-1>通过噬斑试验对比噬斑形态学

从全长感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)回收的合成JEV和亲代病毒CNU/LP2感染BHK-21细胞。用含有10％胎牛血清和0.5％SeaKemLE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)的MEM覆盖细胞，在5％CO₂、37℃的培养箱中孵育3至4天。培养3至4天后，用3.7％甲醛在室温固定感染的细胞4小时。然后，除去覆盖细胞的琼脂糖。通过结晶紫染色使噬斑可视化。如图5A所示，与感染了CNU/LP2(盘5)的细胞类似，感染了从pBAC^SP6/JVFL/Xho I(盘1)、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI(盘2)、pBAC^SP6/JVFLx/Xba I(盘3)和pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN(盘4)回收的合成的JEV的BHK-21细胞形成了同源大噬斑。

<6-2>生长动力学的对比

本发明的发明人用从全长的感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/Xba I和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)回收的合成JEV和亲代病毒CNU/LP2感染了BHK-21细胞。用低(0.01PFU/细胞)、中(1.0PFU/细胞)和高(10PFU/细胞)MOI感染BHK-21细胞，此后周期地收集细胞培养液，用于检测感染性病毒随时间释放的动力学。更具体地，在指定的时间点收集病毒，通过噬斑试验检测滴度。如图5B所示，MOI-依赖性的病毒滴度随时间的积累类似于4种回收的病毒(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)和亲代病毒CNU/LP2。

<6-3>通过蛋白质印迹分析对比病毒蛋白水平

本发明的发明人对比了在感染了从全长的感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN)回收的合成JEV的BHK-21细胞中表达的病毒蛋白和在感染了亲代病毒CNU/LP2的BHK-21细胞中的表达的病毒蛋白。更具体地，用200μl样品装载缓冲液[80mM Tri-HCl(pH 6.8)，2.0％ SDS，10％甘油，0.1M DTT，0.2％溴苯酚蓝]裂解BHK-21细胞(3×10⁵)，将十分之一裂解液沸腾5分钟，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分级。用Trans-Blot SD电泳转细胞仪(Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，CA)，将蛋白电泳地转移到甲醇活化的聚偏氟乙烯膜上，在室温下，用5％脱脂奶粉的洗涤液(0.2％Tween 20的PBS溶液)封闭膜1小时。用洗涤液洗涤3次后，在室温下，将膜与单克隆抗-肌动蛋白抗体(A4700，Sigma，St.Louis，MO)(它能识别在所有肌动蛋白异构体的C末端保守的表位)或对JEV特异性的小鼠超免疫腹水液(ATCC VR-1259AF，American Type Culture Collection)一起孵育2小时。然后用洗涤液洗涤膜3次，在室温下，与碱性磷酸酶(AP)-缀合的山羊抗-小鼠免疫球蛋白G(Jackson ImmunoResearch Labs Inc.，West Grove，PA)一起孵育2小时。将膜用洗涤液洗涤3次，用PBS洗涤1次。通过与底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑一起孵育，使肌动蛋白和JEV蛋白带可视化。结果表明，合成的JEV和亲代病毒生成了类似量的和相同带型的病毒-特异性的蛋白(图5C，上区块)。检测作为内部样品装载对照的肌动蛋白，发现在模拟感染的和感染的细胞中存在等同水平的肌动蛋白(图5C，下区块)。

<6-4>通过RNA印迹分析对比病毒RNA水平

本发明的发明人对比了在感染了从全长的感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)回收的合成JEV的BHK-21细胞中表达的病毒RNA和在感染了亲代病毒CNU/LP2的BHK-21细胞中表达的病毒RNA。更具体地，用1ml TRIzol试剂(Gibco/BRL)，从感染的BHK-21细胞(3×10⁵)中提取总RNA。通过RNA印迹分析，对三分之一RNA分析JEV-特异性的RNA(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring HarborLaboratory)。将RNA在变性2.2M甲醛-1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙膜(Amersham Biosciences Inc.，Piscataway，NJ)上。通过用254-nm光源(Stratalinker UV cross-linker，Stratagene，La Jolla，CA)辐照，使膜上的RNA交联，通过与[³²p]CTP-标记的反义核探针(它能结合JEV基因组的核苷酸9,143至9,351)杂交，检测JEV-特异性的RNA。已经通过从BamHI-线性化的cDNA克隆pGEM3Zf(+)/JV9143(它通过将pBAC^SP6/JVFLx/XbaI的209bp的Hind III-Sac I片段与用相同酶酶切的pGEM3Zf(+)相连来构建)体外地转录合成了该探针。根据生产商的说明，使用T7-MEGAscript试剂盒(Ambion，Austin，TX)，使用20-μl含有3.12μM[α-³²p]CTP(800Ci/mmol，Amersham)的反应混合物转录了该克隆。用DNaseI处理后，将反应混合物在Quick Spin G-50Sephadex柱(BoehringerMannheim)中离心，除去未整合的核糖核苷三磷酸。在55℃，将膜在杂交溶液[5×SSPE(0.9M NaCl，50mM NaH₂PO₄和5mM EDTA pH 7.7)，5×Denhardt氏试剂，0.5％ SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA，50％甲酰胺]中预杂交6小时，然后在含有10⁷cpm标记的核探针的杂交溶液中在55℃孵育过夜。用1×SSPE-0.5％ SDS在55℃洗涤膜3次10分钟，用0.1×SSPE-0.5％ SDS洗涤1次10分钟。通过放射自显影法使病毒RNA带可视化，并用分子成像机(Bio-Rad Lab)定量。结果，病毒RNA的水平都是类似的(图5D)。通过图像分析对这些印迹进行定量，发现病毒基因组RNA(图5D，上区块)与18S rRNA(图5D，下区块)的比例没有显著变化，表明所有病毒基因组RNA都以类似水平生成。

因而，在噬斑形态学、致细胞病性、生长动力学、蛋白表达和RNA生成方面，从全长的感染性的cDNA(pBAC^SP6/JVFL/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XhoI、pBAC^SP6/JVFLx/XbaI和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI^MBN)回收的所有合成病毒与亲代病毒CNU/LP2没有差别。而且，分析3’端序列后，在源自任何合成病毒的病毒RNA基因组的3’端没有发现多余的3个(CGA)或4个(CTAG)核苷酸的与病毒无关的序列。这些结果验证了本发明开发的感染性的JEV cDNA克隆在将来的分子遗传学中的应用。

实施例7：检查转染的培养物被亲代病毒污染的可能件

尽管上面的结果已经有力地证明了JEV cDNA克隆能在SP6或T7聚合酶转录后生成高感染性的RNA转录物，仍未正式排出转染的培养物受到亲代病毒CNU/LP2污染的可能性。为了评价这种极小的可能性，本发明的发明人使用了基于PCR的定点诱变，以将一个遗传标记(gm)导入pBAC^SP6/JVFLx/XbaI构建体。更具体地，通过基于PCR的定点诱变，将点突变A⁸¹⁷¹→C(沉默)置于pBAC^SP6/JVFLx/XbaI中的NS5基因内，以生成pBAC^SP6/JVFLx/gm/Xba I(图6A)。点突变的结果是得到了独特的XhoI限制内切酶识别位点。首先通过使用SEQ.ID.No 29表示的引物J48(其中Xho I通过A⁸¹⁷¹→C取代来创建)和SEQ.ID.No 30表示的引物J3的PCR生成了来自pBAC^SP6/JVFLx/XbaI的片段。然后将得到的扩增子的665bp的Mlu I-Apa I片段连接到4,802bp的Apa I-BsrG I和pBAC^SP6/JVFLx/XbaI的5,874bp的BsrG I-Mlu I片段，生成pBAC^SP6/JVFLx/gm/Xba I构建体。感染了来自Xba I-线性化的MBN-处理过的pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI^MBN的RNA转录物的BHK-21细胞会生成含有遗传标记的感染性病毒(指示为JVFLx/gm/Xba I^MBN)(图6A)。JVFLx/gm/XbaI^MBN的表型特征与起始病毒JVFLx/XbaI^MBN的没有差别，表明A⁸¹⁷¹→C的取代没有影响病毒复制。

为了证实已经从pBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI^MBN的cDNA模板回收了JVFLx/gm/Xba I^MBN病毒，本发明的发明人将回收的病毒在BHK-21细胞中进行了连续传代(MOI＝0.1)。将在每一代中得到的病毒与RNaseA和DNaseI一起孵育，防止带出导入的转录物RNA和模板质粒cDNA(Mendez等，J.Virol.，1998，72，4737-4745)。从第1代和第3代释放的JVFLx/gm/Xba I^MBN和JVFLx/Xba I^MBN病毒提取病毒RNA，用于RT-PCR，扩增包含A⁸¹⁷¹→C取代的2,580bp的产物(图6B，泳道1、3和5)。用Xho I酶切来自JVFLx/gm/XbaI^MBN的扩增产物，生成2个1,506和1,074bp的片段(图6B，泳道2和4)。另一方面，来自JVFLx/XbaI^MBN的RT-PCR产物未受到Xho I酶切(图6B，对比泳道5和泳道6)，表明在JVFLx/gm/XbaI^MBN病毒中确实存在A⁸¹⁷¹→C的取代。因此，证实了回收的病毒JVFLx/gm/XbaI^MBN源自全长的感染性的cDNApBAC^SP6/JVFLx/gm/XbaI^MBN。

实施例8：全长的感染性的JEV cDNA的遗传稳定性

早期的研究已经证实，含有全长JEV cDNA的构建体经常在编码结构蛋白prM和E的区域发生稳定无意义的突变(Sumiyoshi等，J.Virol.，1992，66，5425-5431)。由于对JEV的分子遗传学的研究必不可少地需要使用可靠的感染性的JEV分子克隆用于操纵，本发明的发明人以几种方式调控pBAC^SP6/pJVFLx/XbaI，并广泛地研究了其遗传结构和功能完整性。

更具体地，如下分析了感染性的JEV cDNA的遗传结构和功能完整性。用pBAC^SP6/JVFLx/Xba I转化大肠杆菌菌株DH10B，使两个独立来源的克隆在37℃、在10ml 2×YT(含有12.5μg/ml氯霉素)中生长过夜。通过每天稀释10⁶倍，将来自原代培养物的细胞维持9天(Almazan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。在本发明的实验条件下，每传代细胞代表了约20代，它与以前进行的观察一致(Alamzan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5516-5521)。第3、6和9代后，通过SDS-碱性方法大规模制备感染性的cDNA质粒，并进一步通过氯化铯密度梯度离心纯化(Sambrook等，Molecular cloning，1989，Cold Spring HarborLaboratory)。通过其限制内切酶图谱，监测质粒DNA的遗传结构。通过限制酶分析，检测从第0、3、6和9代的两种培养物中提取的质粒。第3、6和9代的限制酶图谱与第0代的图谱没有可视的差异。因而，在琼脂糖凝胶电泳分析的分辨率内，两种感染性的cDNA克隆在结构上看起来是稳定的。

通过检测从cDNA模板(它通过Xba I酶切线性化和MBN处理)转录出的合成的RNA的特异感染性，还研究了JEV cDNA质粒的功能完整性。结果，从两种cDNA克隆制备出的RNA转录物的感染性在第0代和第9代之间没有差异(图7)。上述结果证实了，在大肠杆菌中的系列生长中，感染性的JEV cDNA保持功能稳定性。

实施例9：感染性的JEV cDNA作为外源基因表达的载体

如已经记载的(Burke和Monath，Flaviviruses，2001，1043-1125，Lippincott Williams & Wilkins Publishers)，本发明的发明人发现，JEV能在广范围的源自许多种属(包括人、鼠、猴子、猪、狗、锚和仓鼠)的真核细胞中复制。这表明，JEV可以在多种不同细胞中用作表达外源基因的载体。为了证实这一点，将两种常用的报道基因(Aequeorea victoria GFP和Photinus pyralis LUC)插入到pBAC^SP6/JVFLx/XbaI的病毒3’NTR的起点，作为由EMCV的IRES元件驱动的表达盒(图8A)。

为了创建pBAC^SP6/JVFLx/GFP/Xba I构建体(图8A)，用SEQ.ID.No31表示的引物J72和SEQ.ID.No 32表示的引物J73进行PCR，扩增来自pBAC^SP6/JVFLx/Xba I的片段。还用SEQ.ID.No 33表示的引物J74和SEQ.ID.No 34表示的引物J75，从pRSGFP-C1扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J72和J75)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的913bp的KpnI-NsiI片连接到pBAC^SP6/JVFLx/XbaI的8,011bp的Nsi I-PacI和11,021bp的PacI-Kpn I片段，生成pBAC^SP6/JVFLx/GFP/XbaI构建体。

为了生成pBAC^SP6/JVFLx/LUC/Xba I构建体(图8A)，用引物J72和SEQ.ID.No 35表示的引物J76扩增了pBAC^SP6/JVFLx/Xba I片段。还用SEQ.ID.No 36表示的引物J77和SEQ.ID.No 37表示的引物J78，从pACNR/NADLcIn-/LUC(由Charles M.Rice博士提供)扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J72和J78)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的1,801bp的Xpn I-Nsi I片段连接到pBAC^SP6/JVFLx/Xba I的8,011bp的Nsi I-Pac I和11,021bp的Pac I-Kpn I片段，生成pBAC^SP6/JVFLx/LUC/Xba I。

为了生成在其NS3基因的中间含有83个核苷酸缺失(核苷酸5,581至5,663)(该缺失会在核苷酸5,596处造成病毒翻译的过早终止)的pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/Xba I(图8A)，用SEQ.ID.No 38表示的引物J89和SEQ.ID.No 39表示的引物J91扩增了pBAC^SP6/JVFLx/LUC/Xba I片段。还用SEQ.ID.No 40表示的引物J92和SEQ.ID.No 41表示的引物J93，从pBAC^SP6/JVFLx/LUC/Xba I扩增了一个片段。通过第二轮PCR(使用引物J89和J93)，将这两个片段融合。然后将得到的扩增子的3,960bp的SfiI-Eag I片段连接到pBAC^SP6/JVFLx/LUC/Xba I的6,493bp的Eag I-Sfi I和10,297bp的Sfi I-Sfi I片段，生成pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/Xba I。

在CNP/LP2的病毒3’NTR的起点和3种其它的完全测序的JEV株中存在9至25核苷酸的缺失(Williams等，J.Gen.Virol.，2000，81，2471-2480；Nam等，Am.J.Trop.Med.Hyg.，2001，65，388-392；Jan等，Am.J.Troop.Med.Hyg.，1996，55，603-609)，表明这是插入外源基因的较好位点。因此，当BHK-21细胞转染了从pBAC^SP6/JVFLx/GFP/Xba I和pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI cDNA转录出的合成的RNA时，该插入不会改变合成的RNA转录物的特异感染性。

为了检测GFP表达，用从pBAC^SP6/JVFLx/GFP/Xba I^MBN模板转录出的感染性的合成的RNA转染原初BHK-21细胞，并通过共焦显微镜检查。更具体地，用2μg JVFLx/GFP/XbaI^MBN RNA模拟转染或转染BHK-21细胞。将转染的细胞(1×10⁵)在4孔分室载玻片中孵育30小时。用PBS洗涤细胞2次，通过在25℃、在含有0.37％(v/v)甲醛的PBS中孵育30分钟予以固定，用0.2ml 80％甘油封固。通过共焦显微镜检查细胞，并分析。结果，表达GFP的BHK-21细胞在核和细胞质中都显示出绿荧光(图8B，JVFLx/GFP/XbaI^MBN)，因为GFP足够小，能在核和细胞质之间扩散。如预期的，在模拟转染的细胞(图8B，模拟的)或用来自pBAC^SP6/JVFLx/Xba I^MBN的RNA转录物转染的细胞中没有观察到该荧光。

为了以定量的方式监视LUC随时间的诱导，本发明的发明人不但生成了能复制的来自pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI^MBN的RNA转录物、而且生成了不能复制的来自pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN的RNA转录物(图8A)。pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN模板在NS3基因的中间含有83个核苷酸的缺失(核苷酸5,581至核苷酸5,663)，它在核苷酸5,596处过早终止病毒翻译(见图8A中的^*，pBAC^SP6/JVFLx/LUC^REP-/XbaI^MBN)。

关于LUC试验，用2μg JVFLx/LUC/XbaI^MBN RNA或JVFLx/LUC^REP-/Xba I^MBN RNA模拟转染或转染BHK-21细胞(8×10⁶)。以6×10⁵细胞/孔的浓度，将细胞接种到6孔平板中，培养。在给定的时间点，用无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS溶液洗涤细胞，然后通过向每孔细胞加入0.2ml裂解缓冲液[25mM Tris-磷酸盐(pH 7.8)，2mM DTT，2mM 1，2-二氨基环己烷-N，N，N′，N′-四醋酸，10％甘油，1％Triton X-100(v/v)]进行裂解。将细胞裂解物在室温孵育10分钟，然后通过离心除去细胞碎片。迅速将上清液置于-80℃保藏，直至使用。为了检测LUC活性，将20μl细胞裂解物置于含有100μl LUC试验试剂[20mM Tricine，1.07mM(MgCO₃)₄Mg(OH)₂·5H₂O，2.67mM MgSO₄，0.1mM EDTA，33.3mM DTT，270μM辅酶A，470μM荧光素(Promega)，530μM ATP]的发光计管中。通常检测活性10秒。每一个数据点代表了3个独立实验的结果。

结果，在用能复制的JVFLx/LUC/XbaI^MBN RNA转染的BHK-21细胞中(图8C，●)，转染后6小时的原始LUC活性是2.4×10³±0.2×10³相对光单位(RLU)。转染后30小时，该活性急剧增加至5.3×10⁴±0.1×10⁴RLU，在转染后54小时，达到7.8×10⁵±0.6×10⁵RLU小时，这时超过50％的细胞是死亡的。相反地，用不能复制的JVFLx/LUC^REP-/Xba I^MBNRNA的转染的BHK-21细胞中，转染后6小时的原始LUC活性是1.9×10³±0.4×10³RLU(图8C，○)，这类似于JVFLx/LUC/Xba I^MBN-转染的细胞(图8C，●)，但是该活性随着时间逐渐地降低，在转染后54小时降至16±1.2RLU，这是原初细胞的背景荧光水平(图8C，○)。因而，随时间表达的LUC活性的水平根据是否存在病毒复制而变化。

根据前文所述的方法，本发明的发明人生成了具有GFP和LUC基因的全长的感染性的重组JEV cDNA。用从重组JEV cDNA转录出的JEVRNA转录物转染BHK-21细胞，然后从培养上清液中回收含有GFP和LUC基因的重组JEV JVFLx/GFP/Xba I^MBN和JVFLx/LUC/Xba I^MBN。在用病毒感染了多种已经普遍用于生物和医学领域的动物细胞系(BHK-21，Vero，NIH/3T3，ST，HeLa，MDCK，CRFK，B103和SHSY-5Y)之后，研究了GFP和LUC基因在重组JEV中的表达。结果，插入到病毒基因组中的GFP或LUC基因在所有的检验细胞中都有表达(表4)。因而，证实了重组的JEVcDNA、JEV RNA转录物和重组的JEV病毒颗粒可以有效地用作在多种细胞类型中表达外源基因的载体。

表4在感染性的JEV cDNA中工程化的GFP和LUC基因的表达

  细胞系  GFP表达^a  LUC诱导^b  BHK-21  有表达  有表达  Vero  有表达  有表达  HeLa  有表达  有表达  MDCK  有表达  有表达  CRFK  有表达  有表达  NIH/3T3  有表达  有表达  ST  有表达  有表达  B103  有表达  有表达  SHSY-5Y  有表达  有表达

a：用重组JEV JVFLx/GFP/XbaI^MBN感染细胞后，分析GFP蛋白的表达。

b：用重组JEV JVFLx/LUC/XbaI^MBN感染细胞后，分析LUC蛋白的表达。

实施例10：感染性的JEV cDNA作为新型外源基因表达系统的应用。

本发明的发明人还研究了基于JEV的表达系统在表达目标外源基因中的应用。首先，本发明的发明人构建了全长病毒基因组，以表达3个常用的和不同大小的异源报道基因，即改进版的Aequorea victoria GFP基因(EGFP，768bp)、来自Photinus pyralis的LUC基因(1653bp)，和LacZ(3012bp)基因(图9B)。本发明的发明人还导入了显性选择标记PAC(600bp)，它会赋予对药物嘌呤霉素的抗性(图9B)。

<10-1>异源基因编码的感染性的重组JEV(它以作为BAC的双顺反子的全长的感染性的JEV cDNA为基础)的构建和表征。

<10-1-1>感染性的重组JEV载体的质粒构建

所有的质粒都通过标准的分子生物方法构建(Sambrook等，Molecularcloning：a laboratory manual，2^nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)，并通过测序验证了PCR扩增的所有区域。本发明中使用的所有重组JEV载体都是在pBAC^SP6/JVFLx/XbaI(它在下文中称作pJEV/FL)的基础上构建(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)(图9A)。

本发明的发明人构建了一组4个表达LUC、EGFP、LacZ和PAC基因的感染性的重组JEV载体。pJEV/FL/LUC与前面在实施例9中命名为pBAC^SP6/JVFLx/LUC/XbaI的构建体相同(图9B)。为了构建pJEV/FL/LacZ，首先将pJEV/FL/LUC的2,409bp的Kpn I-Avr II片段亚克隆进用Xpn I和Xba I酶切的pGEM3Zf(+)中，生成pGEM/LUC。将pSinRep3/LacZ(由Charles Rice博士惠赠)的3,177bp的Nco I-Stu I片段连接到pGEM/LUC的3,935bp的Nco I-Nsi I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，生成pGEM/LacZ。将pGEM/LacZ的3,873bp的Xpn I-Not I片段连接到pJEV/FL/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和11,021bp的Pac I-Kpn I片段，生成pJEV/FL/LacZ(图9B)。为了有利于pJEV/FL/EGFP的构建，将pJEV/FL/LacZ的5,792bp的Sac II-Not I片段插入用相同酶处理的pRS2，生成pRS/LacZ。使用引物EGFPF(由SEQ.ID.No 49表示)和EGFPR(由SEQ.ID.No 50表示)进行pEGFP-C1的PCR扩增，生成了编码EGFP的序列片段。将EGFP片段扩增子的773bp的Nco I-Stu I部分连接到pRS/LacZ的3,241bp的EcoR V-SacII和2,062bp的Sac II-Nco I片段，生成pRS/EGFP。将pRS/EGFP的3,406bp的Sac II-Not I片段连接到pJEV/FL/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和9,102bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/FL/EGFP(图9B)。为了生成pJEV/FL/PAC，使用引物PACF(由SEQ.ID.No 51表示)和PACR(由SEQ.ID.No 52表示)PCR扩增pACNR/NADLcIns^-/PAC(由Charles Rice博士惠赠)片段。将得到的扩增子的881bp的Dra III-Nsi I部分连接到pJEV/FL/LUC的8,011bp的Nsi I-Pac I、10,096bp的Pac I-Nde I和842bp的Nde I-Dra III片段，生成pJEV/FL/PAC(图9B)。将EMCV IRES驱动的表达盒插入到pJEV/FL的病毒3’NTR的起点(图9A和9B)。

<10-1-2>EGFP表达的试验

转染后36-48小时，将细胞接种到4孔分室载玻片中。孵育后，通过在含有0.37％(v/v)甲醛的PBS中孵育固定细胞，然后用0.2ml 80％甘油封固。在配备由合适滤镜的共焦显微镜下观察细胞。还通过流式细胞仪分析检测了EGFP的表达。更具体地，用胰蛋白酶处理细胞，用PBS洗涤一次，重新悬浮到在0.37％(v/v)甲醛的PBS溶液中，随后用FACScan流式细胞仪FACSCalibur(Becton Dickinson)分析。通过合适的前和侧光散射门排除死细胞。计数一万存活的细胞。

<10-1-3>β-半乳糖苷酶试验

用PBS洗涤细胞1次，用0.05％(v/v)戊二醛的PBS溶液在室温固定15分钟，用PBS小心地洗涤3次。通过在染色溶液[5mM铁氰化钾，5mM亚铁氰化钾，2mM MgCl₂的PBS溶液]中与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-吡喃半乳糖苷(Sigma)一起在37℃孵育，检测细胞的β-gal活性。

<10-1-4>荧光素酶试验

如前所述，通过使用底物荧光素(Promega)分析细胞的LUC活性(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。每个实验进行一式三份，取平均值。

<10-1-5>嘌呤霉素筛选

将细胞接种到6-孔平板中，在37℃培养6小时。为了检测PurR foci的形成，用在MEM(含有10％热灭活的FBS和青霉素/链霉素)中的0.5％SeaKem LE琼脂糖(FMC BioProducts，Rockland，Maine)覆盖细胞，在37℃孵育2天。此后，在有或没有嘌呤霉素(10μg/ml)存在的情况下将平板再孵育3天。筛选后，通过对甲醛固定的细胞进行结晶紫染色，使Pur^R foci可视化(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。对于Pur^R细胞培养物，细胞不覆盖琼脂糖，在完全培养基中在37℃培养2天。随后，在含有10μg/ml嘌呤霉素的完全培养基中培养细胞，筛选后24-48小时，通过结晶紫染色使存活的细胞可视化。

<10-1-6>在转染了/感染了重组合成的含有其它表达单元的JEV RNA/病毒的BHK-21细胞中表达异源蛋白

为了检测插入的表达盒是否会改变其特异性的感染性/复制，本发明的发明人检测了合成的RNA(它已经从4个携带有SP6-驱动的外源基因的感染性的JEV cDNA构建体转录出来)的特异性的体外感染性(表5)。通过Xba I酶切使纯化的pJEV/FL和其衍生物质粒线性化，随后用MBN处理。如前所述，将线性化的质粒用于采用SP6RNA聚合酶的体外转录反应(25μl)。转录后，用10U Dnase I进一步孵育反应混合物30分钟，并用苯酚-氯仿-异戊醇提取。通过RNA向DE-81滤纸(Whatman，Maidstone，UK)的吸附检测[³H]UTP的整合，在此基础上对RNA的产量进行定量。如前所述，通过电穿孔，将RNA(2μg)转染进细胞(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。

导入易感的BHK-21细胞中的源自pJEV/FL/PAC、pJEV/FL/EGFP、pJEV/FL/LUC和pJEV/FL/LacZ的合成的RNA分别具有3.5×10⁶、2.5×10⁶、3.4×10⁶和1.1×10⁶PFU/μg的特异感染性，这与亲代pJEV/FL的感染性(3.2×10⁶PFU/μg)类似。但是，转染了重组合成的RNA的BHK-21细胞确实形成了比pJEV/FL-转染的细胞更小的同源噬斑(图9C)。这与感染性病毒的迟延生成(表5，病毒滴度)和在重组RNA-转染的细胞中观察到的降低的致细胞病性(表5，CPE)相一致。本发明的发明人还证实了，重组RNA-转染的BHK-21细胞中的病毒蛋白的迟延积累(图9D)与已经插入的外源基因的长度相关(图9B)。

表5从含有不同报道基因的全长JEV cDNA衍生物生成的体外RNA转录物的特异感染性和重组病毒滴度

  用于转录的模板^a  感染性^b  (PFU/μgRNA)        病毒滴度^C(PFU/ml)  CPE^d  48小时  72小时  pJEV/FL  3.2×10⁶  3.0×10⁶  5.1×10⁵  ++++  pJEV/FL/PAC  3.5×10⁶  6.2×10⁴  4.0×10⁵  ++  pJEV/FL/EGFP  2.5×10⁶  9.0×10⁴  2.1×10⁵  ++  pJEV/FL/LUC  3.4×10⁶  2.0×10⁴  3.2×10⁵  +  pJEV/FL/LUC^REP-  0  0  0  -  pJEV/FL/LacZ  1.1×10⁶  1.1×10⁴  1.3×10⁵  +

a：用于体外转录反应的所有JEV cDNA模板都是通过Xba I酶切进行线性化、随后用MBN处理制备的。

b：用SP6RNA聚合酶体外转录后，将样品用于电穿孔BHK-21细胞，检测感染性的噬斑中心(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。

c：电穿孔后48小时和72小时时的病毒滴度。

d：用RNA转录物(从全长JEV cDNA衍生物生成)电穿孔后观察到了病毒诱导的CPE。在电穿孔后24小时，在亲代pJEV/FL观察到强烈的CPE，如++++所示。对于pJEV/FL/PAC和pJEV/FL/EGFP，在电穿孔后60小时观察的CPE，如++所示。对于pJEV/FL/LacZ，在电穿孔后72小时出现清楚的CPE，如+所示。-表示无CPE。

使用感染性的JEV cDNA进行的EGFP、LUC、LacZ和PAC表达如图10所示。JEV/FL/EGFP RNA-转染的BHK-21细胞在荧光显微镜下显示出明亮的绿色荧光(图10A)。如通过流式细胞仪分析所测定的，与模拟转染的细胞(……)相比，绿色荧光的细胞(-)包含99.7％的细胞(图10B)。图10C说明了表达JEV/FL/LacZ RNA的BHK-21细胞的X-gal染色图案。本发明的发明人还监测了已经用能复制的JEV/FL/LUC RNA(●)或不能复制的JEV/FL/LUC^REP-RNA(○)(它缺少能在核苷酸5596(^*)处过早终止病毒翻译的部分)转染的BHK-21细胞随时间的LUC活性。这表明，增强的病毒复制与增强的LUC活性相关(图10D)，如前所述(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。而且，用嘌呤霉素对JEV/FL/PAC RNA-转染的BHK-21细胞进行的筛选(图10E)表明，JEV/FL/PAC RNA-转染的细胞能存活，并且在含有嘌呤霉素的培养基(平皿7)中汇合，或在用含有嘌呤霉素的培养基(平皿8)铺成的半固体琼脂层下形成Pur^R foci，而模拟转染的细胞则在筛选24小时内死亡(平皿5-6)。如预期的，两种细胞类型在没有嘌呤霉素的情况下都能汇合(平皿1-4)。

<10-2>JEV病毒复制子的构建和载体特征

<10-2-1>JEV病毒复制子载体的质粒构建

在pJEV/FL/LUC(在结构蛋白的编码序列中工程地框架内缺失)的基础上构建了用于所有JEV病毒复制子的质粒。所有的缺失通过新的Xho I位点(它会插入两个残基，即Leu和Glu)予以区别。首先，本发明的发明人生成了一组4个在每个结构蛋白中含有一个框架内缺失的JEV病毒复制子载体。为了构建在C基因中含有273个核苷酸缺失(核苷酸132-404)的pJEV/Rep/△CC/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL合成了2个片段，即片段C1使用引物DelF(由SEQ.ID.No 53表示)和C1R(由SEQ.ID.No54表示)，片段C2使用引物C2F(由SEQ.ID.No 55表示)和DelR(由SEQ.ID.No 56表示)。将2个片段(C1片段扩增子的267bp的Pac I-Xho I部分和C2片段扩增子的226bp的Xho I-BsiW I部分)连接到pJEV/FL/LUC的20,073bp的BsiW I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/△CC/LUC构建体。为了生成在C基因中含有204个核苷酸缺失(核苷酸201-404)的pJEV/Rep/△C/LUC，通过使用引物DelF和C3R(由SEQ.ID.No 57表示)的PCR从pJEV/FL扩增片段C3。将得到的扩增子的336bp的Pac I-Xho I片段连接到pJEV/Rep/△CC/LUC的12,850bp的Xho I-Rsr II和7,449bp的Rsr II-Pac I片段，生成pJEV/Rep/△C/LUC构建体。为了创建在prM基因中含有282个核苷酸缺失(核苷酸531-812)的pJEV/Rep/△prM/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL得到2个片段，即，片段prM1使用引物DelF和prMlR(由SEQ.ID.No 58表示)，片段prM2使用引物prM2F(由SEQ.ID.No 59表示)和DelR。将2个片段(prM1片段扩增子的666bp的Pac I-Xho I部分和prM2片段扩增子的1,616bp的Xho I-Sfi I部分)连接到pJEV/FL/LUC的10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/△prM/LUC构建体。为了生成在E基因中含有1,170个核苷酸缺失(核苷酸1,032-2,201)的pJEV/Rep/△E/LUC，通过PCR扩增pJEV/FL生成了2个片段，即，片段E1使用引物DelF和E1R(由SEQ.ID.No 60表示)，片段E2使用引物E2F(由SEQ.ID.No 61表示)和DelR。将2个片段(prM1片段扩增子的1,167bp的Pac I-Xho I部分和prM2片段扩增子的227bp的Xho I-Sfi I部分)连接到pJEV/FL/LUC的10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/△E/LUC构建体(图11A)。

其次，本发明的发明人构建了一组3个在JEV结构基因中含有2个框架内缺失的JEV病毒复制子载体。将2个pJEV/FL/LUC片段(10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-Pac I片段)连接到(i)pJEV/Rep/△C/LUC的438bp的Pac I-Hind III片段和pJEV/Rep/△prM/LUC的1,646bp的HindIII-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/△C+△prM/LUC，(ii)pJEV/Rep/△C/LUC的866bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/△E/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/△C+△E/LUC，或(iii)pJEV/Rep/△prM/LUC的788bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/△E/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段，生成pJEV/Rep/△prM+△E/LUC(图11A)。

再次，本发明的发明人创建了一组2个JEV病毒复制子载体，其中缺失所有的JEV结构蛋白。为了生成pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC，将pJEV/FL/LUC的2个片段(10,264bp的Sfi I-Nsi I和8,011bp的Nsi I-PacI片段)连接到pJEV/Rep/△C+△prM/LUC的590bp的Pac I-Mlu I片段和pJEV/Rep/△E/LUC的330bp的Mlu I-Sfi I片段。本发明的发明人还构建了pJEV/Rep/NS1/LUC，它含有C蛋白(其后紧跟着NS1蛋白的N-末端)的35个N-末端和24个C-末端氨基酸、和病毒基因组的其余部分。首先通过使用引物DelF和NSlR(由SEQ.ID.No 62表示)的PCR，从pJEV/Rep/△C/LUC合成了1个片段。然后用引物NSlF(由SEQ.ID.No 63表示)和RR(由SEQ.ID.No 64表示)，从pJEV/FL合成了1个片段。通过使用引物DelF和RR的第2轮PCR，将这2个片段融合。将得到的扩增子的474bp的Pac I-ApaL I片段连接到pJEV/FL/LUC的3,038bp的ApaLI-BamH I和15,122bp的BamH I-Pac I片段，生成pJEV/Rep/NS1/LUC(图11A)。

除了pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC和pJEV/Rep/NS1/LUC之外，本发明的发明人还构建了8个其它的JEV病毒复制子载体。将pJEV/FL/EGFP的6,797bp的BamH I-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC的11,529bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/△C+△prM+△E/EGFP，或(ii)pJEV/Rep/NS 1/LUC的10,968bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/NS1/EGFP。将pJEV/FL/LacZ的5,792bp的Sac II-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和7,464bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LacZ，或(ii)pJEV/Rep/NS 1/LUC的7,456bp的Not I-Pac I和6,903bp的Pac I-Sac II片段，生成pJEV/Rep/NS1/LacZ。将pJEV/FL/PAC的6,663bp的BamH I-Not I片段连接到(i)pJEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC的11,529bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/△C+△prM+△E/PAC，或(ii)pJEV/Rep/NS 1/LUC的10,968bp的BamH I-Not I片段，生成pJEV/Rep/NS1/PAC。

<10-2-2>在多种自我复制的、自限制的JEV病毒复制子中表达异源蛋白

为了利用JEV RNA复制机制独立地表达外源基因，本发明的发明人生成了一组能满足严格安全要求的自我复制的、自限制的病毒复制子(图11A)。开始，本发明的发明人使用了LUC报道基因作为外源基因，因为它有利于以敏感的和定量的方式监测病毒复制。因而，考虑每种蛋白的膜定位，通过使pJEV/FL/LUC在框架内缺失1个、2个或全部病毒结构基因(C、prM和E)，小心地构建了多种复制子载体(图11A)。

用已经转染了不同病毒复制子的BHK-21细胞的LUC活性，对时间作图(图11B)。用转染了能复制的JEV/FL/LUC RNA(●，黑色)的BHK-21细胞作为阳性对照，转染后6小时的起始LUC活性是5.5±0.3×10³RLU。该活性在转染后48小时急剧增加至2.7±0.5×10⁶RLU，并且维持至转染后96小时。在转染了不能复制的JEV/FL/LUC^REP-RNA(◆，黑色)的BHK-21细胞中，在转染后6小时，从导入的病毒RNA表达的初始LUC活性近似，即5.2±0.6×10³RLU。但是，该活性随着时间逐渐降低，在转染后96小时降至8.8±1.0RLU，这与原初细胞的背景荧光等同。且不说pJEV/Rep/△CC/LUC(◆，蓝色)，其缺少与猜想的3’NTR(它在所有黄病毒中都是保守的)中的环化序列互补的序列(Bredenbeek等，J.Gen.Virol.，2003，84，1261-1268；Lo等，J.Virol.，2003，77，10004-10014；Khromykh等，J.Virol.，2001，75，6719-6728)，转染了病毒复制子(其缺少一个或多个结构蛋白基因的一部分)的BHK-21细胞的LUC活性在转染后6-48小时与能复制的JEV/FL/LUC RNA-转染的BHK-21细胞(●，黑色)几乎相同。但是，这些活性此后随着时间急剧下降，因为不能进行病毒扩散，这类似于JEV/FL/LUC^REP-。有趣的是，由于JEV/Rep/NS1/LUC RNA(●，绿色)而不是JEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC RNA(■，绿色)造成的LUC活性在全部时间点都约是其它能复制的病毒复制子的活性的5倍。

如通过使用JEV-特异性的超免疫血清的免疫印迹所定量的，LUC的表达图谱与病毒蛋白的积累相一致(图11C)。本发明的发明人还证实了，通过使用基于JEV的复制子载体例如pJEV/Rep/NS1和pJEV/Rep/△C+△prM+△E，其它报道基因也能在多种常用的动物细胞中有效地表达。

<10-3>用于JEV病毒复制子的包装系统的构建

<10-3-1>以pSinRep19载体为基础的JEV结构蛋白表达载体的质粒构建

本发明的发明人以pSinRep19为基础构建了3个JEV结构蛋白表达载体(Agapov等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998，95，12989-12994)。对于pSinRep19/JEV C-E，用包含Xba I位点(标有下划线的)的引物JEVCF(5’-GATTCTAGAATGACTAAAAAACCA，由SEQ.ID.No 65表示)和包含Pme I位点(标有下划线的)的引物JEVER(5’-GATGTTTAAACTATTAAGCATGCACATTGGT，由SEQ.ID.No 66表示)扩增了pJEV/FL片段。将得到的扩增子的2,393bp的Xba I-Pme I片段连接到pSinRep 19的10,864bp的Xba I-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，构建pSinRep19/JEV C-E(图12A)。对于pSinRep19/JEV C-NS1，用引物JEVCF和包含Pme I位点(标有下划线的)的引物JEVNS1R(5’-GATGTTTAAACTATTAAGCATCAACCTGTGA，由SEQ.ID.No 67表示)PCR扩增pJEV/FL得到1个片段。然后将得到的扩增子的3,449bp的Xba I-Pme I片段连接到pSinRep19的10,864bp的Xba I-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段，构建pSinRep19/JEV C-NS 1(图12A)。对于pSinRep 19/JEV C-E-Bgl II，将pSinRep 19/JEV C-NS 1的2,559bp的Xba I-BglII(T4DNA聚合酶处理过的)片段连接到pSinRep19的10,864bp的XbaI-Mlu I(T4DNA聚合酶处理过的)片段(图12A)。

<10-3-2>源自JEV的复制子载体RNA的包装细胞系的生成。

通过开发能组成型表达所有的JEV结构蛋白(C、prM和E)并反向补充JEV病毒复制子的有效包装的包装细胞系(PCL)，详述了基于JEV复制子的表达载体的应用。在含有亚基因组启动子(它有利于筛选)驱动的PAC基因的pSinRep19表达载体的基础上(图12A)，本发明的发明人构建了3个不同的JEV结构蛋白表达盒构建体，它们编码C-E(pSinRep19/JEVC-E)、C-E+NS1的58个N-末端残基(pSinRep 19/JEV C-E-Bgl II)和C-NS1(pSinRep19/JEV C-NS1)的序列。

在转染了合成的RNA(它们已经从相应载体体外地转录)的BHK-21细胞中评价了这些载体产生的蛋白表达。通过Xho I酶切，使pSinRep19和其衍生物线性化。如前所述，线性化的质粒用于使用SP6RNA聚合酶的体外转录反应(25μl)。转录后，用10U DNase I进一步孵育反应混合物30分钟，用苯酚-氯仿-异戊醇提取。通过RNA向DE-81滤纸(Whatman，Maidstone，UK)的吸附检测[³H]UTP的整合，在此基础上对RNA的产量进行定量。如前所述，通过电穿孔将RNA(2μg)转染进细胞(Yun等，J.Virol.，2003，77，6450-6465)。当用JEV-特异性的超免疫血清进行免疫印迹、分析转染的细胞的细胞裂解物时，在转染了3种载体中的每一种的BHK-21细胞中检测到了等量的病毒糖蛋白E(图12B)。如设计的，只在SinRep19/JEVC-NS1 RNA-转染的细胞中检测到了NS1蛋白(图12B)。

图12C解释了生产JEV病毒复制子颗粒(VRP)的2个方法。一个包括用能表达JEV结构蛋白的SinRep19载体RNA瞬时共转染体外转录的JEV复制子载体RNA。通过用VRP感染原初BHK-21细胞然后检测报道基因的表达，可以滴定和监测包装的VRP。在几个实验中，用表达EGFP的JEV病毒复制子RNA[JEV/Rep/△C+△prM+△E/EGFP(□，绿色)或JEV/Rep/NS1/EGFP(■，绿色)]共转染SinRep19/JEV C-NS1RNA，生成了1.1-4.3×10⁴感染单位/ml(IU/ml)的VRP(图12D)。使用表达LacZ的JEV病毒复制子，即，JEV/Rep/△C+△prM+△E/LacZ(□，蓝色)或JEV/Rep/NS1/LacZ(■，蓝色)得到了类似结果。当使用SinRep19/JEVC-NS1或SinRep19/JEV C-E-Bgl II JEV结构蛋白表达盒时，没有观察到差异。但是，将SinRep19/JEV C-E载体RNA和表达EGFP或LacZ的病毒复制子共转染生成了少了≈100倍的VRP(图12D)。通过将所有的JEV结构蛋白表达载体RNA和表达LUC的JEV复制子RNA，即JEV/Rep/△C+△prM+△E/LUC(□，黑色)或JEV/Rep/NS1/LUC(■，黑色))共转染，证实了该结果(图12D)。

生产JEVVRP的其它方法以使用连续的PCL(通过用JEV结构蛋白表达载体RNA转染细胞和用嘌呤霉素筛选建立)为基础。如前所述，用JEV结构蛋白表达载体RNA转染BHK-21细胞。转染后，将细胞接种培养约24小时，将培养基替换为新鲜的含有10μg/ml嘌呤霉素(Sigma)的完全培养基。此后，将细胞维持在存在嘌呤霉素的条件下，并传代和冷冻作为亲代BHK-21细胞。

证实选择的细胞能稳定地表达JEV结构蛋白，并且对宿主细胞没有任何有害作用，在生产基于JEV的VRP方面也比亲代BHK-21细胞略微更有效。在所有的情况下，与包括用2个载体RNA共转染亲代BHK-21细胞的方法相比，用JEV病毒复制子载体RNA转染这些PCL得到了更高的VRP滴度(1.0×10³-1.2×10⁵IU/ml)(图12E)。

为了检测在本发明开发的包装系统中存在能复制的病毒颗粒，用3×10⁵IU VRP(MOI＝1)感染原初BHK-21细胞72小时。将从感染的细胞得到的未稀释的上清液进一步传代3次，扩增可能存在的非常小量的能复制的病毒颗粒。在这些传代结束时，使用JEV-特异性的超免疫血清进行IFA，检测感染的细胞中的报道基因或病毒蛋白的表达。没有检测出能复制的病毒颗粒。而且，表达JEV结构蛋白的Sindbis复制子RNA没有包封在释放的VRP中。

工业实用性

如前所述，本发明的JEV基因组RNA的可靠的核苷酸序列和从其合成的全长的感染性的JEV cDNA不但可以用于鉴别JEV基因，而且可以用于分子生物学研究，包括JEV复制、转录和翻译。而且，它们还可以用于开发日本脑炎的治疗剂、疫苗、诊断剂和诊断装置，还可以用作表达多种外源基因的载体。

本领域的技术人员应当明白，前面的说明书中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作实现本发明的相同目的的其它实施方案的修改基础和设计基础。本领域的技术人员还应当明白，这样的等同实施方案没有脱离权利要求书所述的发明精神和范围。

         用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约

                            国际表格

                        微生物保藏证明

                     按照细则Rule 7.1发行

致：李荣敏

医学院，国立忠北大学，(College of Medicine，Chungbuk National University)#48，Gaeshin-dong，Heungduk-ku，Cheongju-si，Chungbuk，361，763

韩国

  I.微生物的鉴定  保藏人给予的鉴定参考  pBAC^T7/JVFLx/Xba I(质粒)  国际保藏中心给予的保藏号  KCTC 10346BP  II.科学描述和/或提议的分类命名  对上文I中表示的微生物附有：  [x]科学描述  []提议的分类命名  (在适用的地方标注叉号)  III.接收和接受  本国际保藏中心接受了上述I中表示的微生物，该微生物于2002年10月02日  收到.  IV.转保藏请求的接收  本国际保藏中心于     接受了上述I中表示的微生物，并且于  收到了将原始保藏转化为根据布达佩斯条约的保藏的请求.  V.国际保藏机构  名称：韩国典型培养物保藏中心  地址：韩国生物科学和生物技术研究所  (KRIBB)  #52，Oun-dong，Yusong-ku，  大田305-333.  韩国  有权代表本国际保藏机构的官员签字     PARK，Yong-Ha，，Director  日期：2002年10月04日

    用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约

                        国际表格

                    微生物保藏证明

                  按照细则Rule 7.1发行

致：李荣敏

医学院，国立忠北大学，(College of Medicine，ChungbukNational University)#48，Gaeshin-dong，Heungduk-ku，Cheongju-si，Chungbuk，361，763

韩国

  I.微生物的鉴定  保藏人给予的鉴定参考  Pbac^SP6/JVFLx/Xba I(质粒)  国际保藏中心给予的保藏号  KCTC 10347BP  II.科学描述和/或提议的分类命名  对上文I中表示的微生物附有：  [x]科学描述  []提议的分类命名  (在适用的地方标注叉号)  III.接收和接受  本国际保藏中心接受了上述I中表示的微生物，该微生物于2002年10月02日  收到.  IV.转保藏请求的接收  本国际保藏中心于      接受了上述I中表示的微生物，并且于  收到了将原始保藏转化为根据布达佩斯条约的保藏的请求.  V.国际保藏机构  名称：韩国典型培养物保藏中心  地址：韩国生物科学和生物技术研究所  (KRIBB)  #52，Oun-dong，Yusong-ku，  大田305-333.  韩国  有权代表本国际保藏机构的官员签字     PARK，Yong-Ha，，Director  日期：2002年10月04日

                            序列表

<110>CID有限公司和李承翰

<120>新的日本脑炎病毒全长基因组RNA和来自它的感染性JEV cDNA，及其应用

<130>3fpo-06-03

<150>KR 2002-61589

<151>2002-10-09

<160>67

<170>Kopatent In 1.71

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J7，互补于JEV基因组的nt 3986-4004

<400>1

agcgctaaga ctggcatg                                                    18

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J8，互补于JEV基因组的nt 1-18

<400>2

gatcggaccg agaagtttat ctgtgtga                                         28

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J6，互补于JEV基因组的nt 3845-3865

<400>3

gcccctagga ccagaaccac g                                                21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J4，互补于JEV基因组的nt 8150-8170

<400>4

aggacgcgta gtgtgcgttg t                                                21

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J20，互补于JEV基因组的nt 3266-3283

<400>5

aaaccaggga ccttggga                                                    18

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J1，互补于JEV基因组的nt 10947-10967

<400>6

gatcctgtgt tcttcctcac c                                                21

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J12，互补于JEV基因组的nt 7565-7582

<400>7

gatcggaccg aattccacca cagccac                                         27

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J2，互补于JEV基因组的nt 10870-10893

<400>8

agaagatctc ccagtctatt ccca                                            24

<210>9

<211>10818

<212>DNA

<213>日本脑炎病毒

<400>9

agagattagt gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca     60

ggagggcccg gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc    120

ccactagtgg gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt    180

ttcgtgctgg ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt    240

ttaggccgat ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa    300

cgagaacttg gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga    360

ggaggaaatg aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta    420

ggagccatga agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac    480

attgcagacg tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca    540

atcgatgtcg gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg    600

ggcaatgatc cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat    660

ggacggtgca cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca     720

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cgatatctca tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg     840

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ctgctgttgg tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc     960

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catgggaatt attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc    1440

aatgctcctt cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa    1500

ccaaggagtg gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt    1560

ctggtccata gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca    1620

gcgtggagaa acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc    1680

gttgttgctc ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg    1740

gtggagtact caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg    1800

gacaaactgg ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg    1860

aaaaatccgg cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt    1920

gatggcccct gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt    1980

gggcggctgg tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg    2040

gtcgagatgg aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag    2100

atcaaccacc attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg    2160

aagggagctc aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga    2220

ggggtcttca actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca    2280

ctctttgggg gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg    2340

ggcatcaacg cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc    2400

gtgttcttag cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa    2460

gagatgagat gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg    2520

tataaatatt tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag    2580

gaaggcgtgt gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg    2640

cgggacgaat tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac    2700

aagcccgtgg ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt    2760

gaaatgggct ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc    2820

acatttgttg tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac    2880

agcatgcaaa tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt    2940

agagaggaaa gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat    3000

gtggcagttc atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa    3060

cttgagaggg cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt    3120

tggggagatg gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa    3180

agcaagcaca atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac    3240

ggcatagtct tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt    3300

ggcaagagag gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg    3360

tgctgtcgca gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac    3420

ggaatggaaa tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat    3480

gctttcaatg gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc    3540

acccaggagg tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg    3600

gccctgcttg tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg    3660

ctagtcgctg ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg    3720

attgccgttt ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg    3780

acgaaccaag aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta    3840

gatctgcaaa tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt    3900

cgagcgatca ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact    3960

ccgggaatga gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt    4020

tgctccctgc tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg    4080

ggcttagcgc tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggacttatg    4140

gtctgcaacc caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga    4200

ttgatgtttg ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc    4260

ttcatgctgg caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg    4320

tggctcgaac gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt    4380

cggaggctgg atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc    4440

gttccatgga aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct    4500

tgggccattg ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg    4560

ggcgtgtttt gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga    4620

gtctaccgaa tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg    4680

tacgagaatg ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga    4740

gaaggaaaat tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc    4800

ccatggagat ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa    4860

ccggggaagg ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg    4920

gaggttgggg ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat    4980

tccaatggag acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac    5040

gtcagcgcca tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca    5100

aacatgttaa gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc    5160

aggaaaattc tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg    5220

ttggcaccga cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta    5280

cgataccaaa cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg    5340

tgccacgcca ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatcta    5400

tttgtcatgg atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc    5460

gctaccaagg tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga    5520

accacggatc cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca    5580

gacagggcat ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg    5640

tttgtggcga gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa    5700

aaggtcatcc aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga    5760

gactgggatt ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc    5820

agggtcatcg actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga    5880

gtcatcctcg gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga    5940

gtaggcagaa accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa    6000

gatgacagta acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg    6060

cccaatgggc tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat    6120

ggcgaatacc gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct    6180

gaccttccgg tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga    6240

aagtggtgtt ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag    6300

atagtcaccc ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta    6360

tacgcagatc accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc    6420

gttagcttca tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa    6480

gctttagaca ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg    6540

gctctcgaag agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta    6600

atgacaggag gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt    6660

ggagctctag tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc    6720

aaaatagcag ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg    6780

gaaaaacaga ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc    6840

gtggttggag tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc    6900

aagagcatgt ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca    6960

ctggacctgc gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc    7020

cctcttctga agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac    7080

tcacaagctg gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg    7140

accgttggcc tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca    7200

gccatggttc tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca    7260

ctcagggctg cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga    7320

atggtcgcca ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc    7380

ggacaggtgc tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc    7440

actgtgagag aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga    7500

gccagtgccg tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc    7560

tacctggctg gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg    7620

aaaaggggaa ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc    7680

atgagcagag aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact    7740

gaagcacgca gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc    7800

tcagcaaaac tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt    7860

gatctagggt gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag    7920

gaagtcagag gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc    7980

tacggctgga acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag    8040

cctagtgaca ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa    8100

caacgcacac tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag    8160

ttctgcataa aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg    8220

cagcgccgct tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag    8280

atgtattggg ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag    8340

gtactactgg ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc    8400

aacctaggta gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa    8460

atcaagaaga gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct    8520

gaacacccat accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca    8580

gccagctctc tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc    8640

aacgtcacca ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag    8700

gagaaagttg acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag    8760

accaccaact ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag    8820

gaagaattta taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag    8880

aatcaatgga gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat    8940

gaagagaggg aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga    9000

aaaagagaga agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc    9060

atgtggcttg gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac    9120

tggctgagcc gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga    9180

tacatcctcc gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc    9240

gggtgggaca ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc    9300

ctagatggtg aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa    9360

gtggtcaagg tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga    9420

gaagaccaaa gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc    9480

gctgtccagc tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa     9540

cagctgccta ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag     9600

agagtgacca ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga     9660

ttcgccacgg ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa     9720

tggaagcctt cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt     9780

caggagattg tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag     9840

ctgataggca gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc     9900

ctggcaaaag catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt     9960

ctcatggcaa atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca    10020

tcctggtcaa tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg    10080

aacagagtct ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg    10140

acagacgttc cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg    10200

cgttccagag caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc    10260

attgggaaag aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg    10320

atccaggaag acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga    10380

gaaaatgcat gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg    10440

tgctgcctgc gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag    10500

aaagccctca gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg    10560

tcaggccacg aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac    10620

tgggttacca aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg    10680

aggtgtaagg actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc    10740

ccctcgaagc tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat    10800

caaacagcat attgacac                                                  10818

<210>10

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡脱氧核苷酸T

<400>10

ccagtgttgt ggcctgcagg gcgaatt                                          27

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸TR，其与SEQ ID NO.10的寡核苷酸T互补

<400>11

gatgaattcg ccctgcaggc cacaaca                                          27

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J35，互补于JEV基因组的nt 10259-10276

<400>12

agcaacctgg gctgagaa                                                    18

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J40，互补于JEV基因组的nt 215-232

<400>13

aaacgtactg gtcctctg                                                    18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J39，互补于JEV基因组的nt 164-181

<400>14

cccactagtg ggaatacg                                                    18

<210>15

<211>10968

<212>DNA

<213>日本脑炎病毒

<400>15

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg    600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc    660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca    720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga    780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctattgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggacttatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatcta tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca    7800

gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc    9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca    9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg    9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgact tacaggcacaaa gtggtcaagg    9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa    9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc    9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta    9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatct                 10968

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J41

<400>16

tccgtggaat gaacaatg                                                    18

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J43

<400>17

acagataaac ttctctatag tgtcccctaa                                       30

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J42

<400>18

gagaagttta tctgtgtg                                                    18

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J40

<400>19

aaacgtactg gtcctctg                                                    18

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J90

<400>20

ttgaggcccc cacggcccaa                                                  20

<210>21

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J45

<400>21

agtactagtc ggtccgcggc cgctcgagat cctgtgttct t .                        41

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J31

<400>22

ggctgtgggc ccacttgt                                                    18

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J47

<400>23

ccaaagcttc aaactcaaga tacc                                             24

<210>24

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J46

<400>24

agtactagtc ggtccgcggc cgctctagag atcctgtgtt ctt                        43

<210>25

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J81

<400>25

tcttgcccgc ctgatgaa                                                    18

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J80

<400>26

acagataaac ttctctatag tgagtcgtat                                       30

<210>27

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J42

<400>27

gagaagttta tctgtgtg                                                    18

<210>28

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J82

<400>28

gcccatggta agcttagg                                                    18

<210>29

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J48

<400>29

actgagctca cgcgtcctcg agatgac                                          27

<210>30

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J3

<400>30

gatttaatta acacctcctc tacagcttcg                                       30

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J72

<400>31

gaaggtaccc cattgtatgg                                                  20

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J73

<400>32

ttctccttta cccatggttg tggcaagctt                                       30

<210>33

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J74

<400>33

atgggtaaag gagaagaa                                                    18

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J75

<400>34

aagatgcatt cattaaccgt cgactgcaga                                       30

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J76

<400>35

tttggcgtct tccatggttg tggcaagctt                                       30

<210>36

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J77

<400>36

atggaagacg ccaaaaac                                                    18

<210>37

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J78

<400>37

cttaagatgc attcattaca cggcgatctt                                       30

<210>38

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J89

<400>38

tgctttggcc ttcttggcca                                                  20

<210>39

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J91

<400>39

acccgcatat tctgtgatcc gtggttccag                                       30

<210>40

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J92

<400>40

acagaatatg cgggtaaa                                                    18

<210>41

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物J93

<400>41

agctaacggc cgatctctttc                                                 21

<210>42

<211>16847

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBAC/SV载体的序列

<400>42

attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caattgcact accatcacaa      60

tggagaagcc agtagtaaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gtgcaactgc     120

aaaaaagctt cccgcaattt gaggtagtag cacagcaggt cactccaaat gaccatgcta     180

atgccagagc attttcgcat ctggccagta aactaatcga gctggaggtt cctaccacag     240

cgacgatctt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccagtatc     300

attgtgtctg ccccatgcgt agtccagaag acccggaccg catgatgaaa tacgccagta     360

aactggcgga aaaagcgtgc aagattacaa acaagaactt gcatgagaag attaaggatc     420

tccggaccgt acttgatacg ccggatgctg aaacaccatc gctctgcttt cacaacgatg     480

ttacctgcaa catgcgtgcc gaatattccg tcatgcagga cgtgtatatc aacgctcccg     540

gaactatcta tcatcaggct atgaaaggcg tgcggaccct gtactggatt ggcttcgaca     600

ccacccagtt catgttctcg gctatggcag gttcgtaccc tgcgtacaac accaactggg     660

ccgacgagaa agtccttgaa gcgcgtaaca tcggactttg cagcacaaag ctgagtgaag     720

gtaggacagg aaaattgtcg ataatgagga agaaggagtt gaagcccggg tcgcgggttt     780

atttctccgt aggatcgaca ctttatccag aacacagagc cagcttgcag agctggcatc     840

ttccatcggt gttccacttg aatggaaagc agtcgtacac ttgccgctgt gatacagtgg     900

tgagttgcga aggctacgta gtgaagaaaa tcaccatcag tcccgggatc acgggagaaa     960

ccgtgggata cgcggttaca cacaatagcg agggcttctt gctatgcaaa gttactgaca    1020

cagtaaaagg agaacgggta tcgttccctg tgtgcacgta catcccggcc accatatgcg    1080

atcagatgac tggtataatg gccacggata tatcacctga cgatgcacaa aaacttctgg    1140

ttgggctcaa ccagcgaatt gtcattaacg gtaggactaa caggaacacc aacaccatgc    1200

aaaattacct tctgccgatc atagcacaag ggttcagcaa atgggctaag gagcgcaagg    1260

atgatcttga taacgagaaa atgctgggta ctagagaacg caagcttacg tatggctgct    1320

tgtgggcgtt tcgcactaag aaagtacatt cgttttatcg cccacctgga acgcagacct    1380

gcgtaaaagt cccagcctct tttagcgctt ttcccatgtc gtccgtatgg acgacctctt    1440

tgcccatgtc gctgaggcag aaattgaaac tggcattgca accaaagaag gaggaaaaac    1500

tgctgcaggt ctcggaggaa ttagtcatgg aggccaaggc tgcttttgag gatgctcagg    1560

aggaagccag agcggagaag ctccgagaag cacttccacc attagtggca gacaaaggca    1620

tcgaggcagc cgcagaagtt gtctgcgaag tggaggggct ccaggcggac atcggagcag    1680

cattagttga aaccccgcgc ggtcacgtaa ggataatacc tcaagcaaat gaccgtatga    1740

tcggacagta tatcgttgtc tcgccaaact ctgtgctgaa gaatgccaaa ctcgcaccag    1800

cgcacccgct agcagatcag gttaagatca taacacactc cggaagatca ggaaggtacg    1860

cggtcgaacc atacgacgct aaagtactga tgccagcagg aggtgccgta ccatggccag    1920

aattcctagc actgagtgag agcgccacgt tagtgtacaa cgaaagagag tttgtgaacc    1980

gcaaactata ccacattgcc atgcatggcc ccgccaagaa tacagaagag gagcagtaca    2040

aggttacaaa ggcagagctt gcagaaacag agtacgtgtt tgacgtggac aagaagcgtt    2100

gcgttaagaa ggaagaagcc tcaggtctgg tcctctcggg agaactgacc aaccctccct    2160

atcatgagct agctctggag ggactgaaga cccgacctgc ggtcccgtac aaggtcgaaa    2220

caataggagt gataggcaca ccggggtcgg gcaagtcagc tattatcaag tcaactgtca    2280

cggcacgaga tcttgttacc agcggaaaga aagaaaattg tcgcgaaatt gaggccgacg    2340

tgctaagact gaggggtatg cagattacgt cgaagacagt agattcggtt atgctcaacg    2400

gacgccacaa agccgtagaa gtgctgtacg ttgacgaagc gttcgcgtgc cacgcaggag    2460

cactacttgc cttgattgct atcgtcaggc cccgcaagaa ggtagtacta tgcggagacc    2520

ccatgcaatg cggattcttc aacatgatgc aactaaaggt acatttcaat caccctgaaa    2580

aagacatatg caccaagaca ttctacaagt atatctcccg gcgttgcaca cagccagtta    2640

cagctattgt atcgacactg cattacgatg gaaagatgaa aaccacgaac ccgtgcaaga    2700

agaacattga aatcgatatt acaggggcca caaagccgaa gccaggggat atcatcctga    2760

catgtttccg cgggtgggtt aagcaattgc aaatcgacta tcccggacat gaagtaatga    2820

cagccgcggc ctcacaaggg ctaaccagaa aaggagtgta tgccgtccgg caaaaagtca    2880

atgaaaaccc actgtacgcg atcacatcag agcatgtgaa cgtgttgctc acccgcactg    2940

aggacaggct agtgtggaaa accttgcagg gcgacccatg gattaagcag cccactaaca    3000

tacctaaagg aaactttcag gctactatag aggactggga agctgaacac aagggaataa    3060

ttgctgcaat aaacagcccc actccccgtg ccaatccgtt cagctgcaag accaacgttt    3120

gctgggcgaa agcattggaa ccgatactag ccacggccgg tatcgtactt accggttgcc    3180

agtggagcga actgttccca cagtttgcgg atgacaaacc acattcggcc atttacgcct    3240

tagacgtaat ttgcattaag tttttcggca tggacttgac aagcggactg ttttctaaac    3300

agagcatccc actaacgtac catcccgccg attcagcgag gccggtagct cattgggaca    3360

acagcccagg aacccgcaag tatgggtacg atcacgccat tgccgccgaa ctctcccgta    3420

gatttccggt gttccagcta gctgggaagg gcacacaact tgatttgcag acggggagaa    3480

ccagagttat ctctgcacag cataacctgg tcccggtgaa ccgcaatctt cctcacgcct    3540

tagtccccga gtacaaggag aagcaacccg gcccggtcaa aaaattcttg aaccagttca    3600

aacaccactc agtacttgtg gtatcagagg aaaaaattga agctccccgt aagagaatcg    3660

aatggatcgc cccgattggc atagccggtg cagataagaa ctacaacctg gctttcgggt    3720

ttccgccgca ggcacggtac gacctggtgt tcatcaacat tggaactaaa tacagaaacc    3780

accactttca gcagtgcgaa gaccatgcgg cgaccttaaa aaccctttcg cgttcggccc    3840

tgaattgcct taacctagga ggcaccctcg tggtgaagtc ctatggctac gccgaccgca    3900

acagtgagga cgtagtcacc gctcttgcca gaaagtttgt cagggtgtct gcagcgagac    3960

cagattgtgt ctcaagcaat acagaaatgt acctgatttt ccgacaacta gacaacagcc    4020

gtacacggca attcaccccg caccatctga attgcgtgat ttcgtccgtg tatgagggta    4080

caagagatgg agttggagcc gcgccgtcat accgcaccaa aagggagaat attgctgact    4140

gtcaagagga agcagttgtc aacgcagcca atccgctggg tagaccaggc gaaggagtct    4200

gccgtgccat ctataaacgt tggccgacca gttttaccga ttcagccacg gagacaggca    4260

ccgcaagaat gactgtgtgc ctaggaaaga aagtgatcca cgcggtcggc cctgatttcc    4320

ggaagcaccc agaagcagaa gccttgaaat tgctacaaaa cgcctaccat gcagtggcag    4380

acttagtaaa tgaacataac atcaagtctg tcgccattcc actgctatct acaggcattt    4440

acgcagccgg aaaagaccgc cttgaagtat cacttaactg cttgacaacc gcgctagaca    4500

gaactgacgc ggacgtaacc atctattgcc tggataagaa gtggaaggaa agaatcgacg    4560

cggcactcca acttaaggag tctgtaacag agctgaagga tgaagatatg gagatcgacg    4620

atgagttagt atggattcat ccagacagtt gcttgaaggg aagaaaggga ttcagtacta    4680

caaaaggaaa attgtattcg tacttcgaag gcaccaaatt ccatcaagca gcaaaagaca    4740

tggcggagat aaaggtcctg ttccctaatg accaggaaag taatgaacaa ctgtgtgcct    4800

acatattggg tgagaccatg gaagcaatcc gcgaaaagtg cccggtcgac cataacccgt    4860

cgtctagccc gcccaaaacg ttgccgtgcc tttgcatgta tgccatgacg ccagaaaggg    4920

tccacagact tagaagcaat aacgtcaaag aagttacagt atgctcctcc accccccttc    4980

ctaagcacaa aattaagaat gttcagaagg ttcagtgcac gaaagtagtc ctgtttaatc    5040

cgcacactcc cgcattcgtt cccgcccgta agtacataga agtgccagaa cagcctaccg    5100

ctcctcctgc acaggccgag gaggcccccg aagttgtagc gacaccgtca ccatctacag    5160

ctgataacac ctcgcttgat gtcacagaca tctcactgga tatggatgac agtagcgaag    5220

gctcactttt ttcgagcttt agcggatcgg acaactctat tactagtatg gacagttggt    5280

cgtcaggacc tagttcacta gagatagtag accgaaggca ggtggtggtg gctgacgttc    5340

atgccgtcca agagcctgcc cctattccac cgccaaggct aaagaagatg gcccgcctgg    5400

cagcggcaag aaaagagccc actccaccgg caagcaatag ctctgagtcc ctccacctct    5460

cttttggtgg ggtatccatg tccctcggat caattttcga cggagagacg gcccgccagg    5520

cagcggtaca acccctggca acaggcccca cggatgtgcc tatgtctttc ggatcgtttt    5580

ccgacggaga gattgatgag ctgagccgca gagtaactga gtccgaaccc gtcctgtttg    5640

gatcatttga accgggcgaa gtgaactcaa ttatatcgtc ccgatcagcc gtatcttttc    5700

cactacgcaa gcagagacgt agacgcagga gcaggaggac tgaatactga ctaaccgggg    5760

taggtgggta catattttcg acggacacag gccctgggca cttgcaaaag aagtccgttc    5820

tgcagaacca gcttacagaa ccgaccttgg agcgcaatgt cctggaaaga attcatgccc    5880

cggtgctcga cacgtcgaaa gaggaacaac tcaaactcag gtaccagatg atgcccaccg    5940

aagccaacaa aagtaggtac cagtctcgta aagtagaaaa tcagaaagcc ataaccactg    6000

agcgactact gtcaggacta cgactgtata actctgccac agatcagcca gaatgctata    6060

agatcaccta tccgaaacca ttgtactcca gtagcgtacc ggcgaactac tccgatccac    6120

agttcgctgt agctgtctgt aacaactatc tgcatgagaa ctatccgaca gtagcatctt    6180

atcagattac tgacgagtac gatgcttact tggatatggt agacgggaca gtcgcctgcc    6240

tggatactgc aaccttctgc cccgctaagc ttagaagtta cccgaaaaaa catgagtata    6300

gagccccgaa tatccgcagt gcggttccat cagcgatgca gaacacgcta caaaatgtgc    6360

tcattgccgc aactaaaaga aattgcaacg tcacgcagat gcgtgaactg ccaacactgg    6420

actcagcgac attcaatgtc gaatgctttc gaaaatatgc atgtaatgac gagtattggg    6480

aggagttcgc tcggaagcca attaggatta ccactgagtt tgtcaccgca tatgtagcta    6540

gactgaaagg ccctaaggcc gccgcactat ttgcaaagac gtataatttg gtcccattgc    6600

aagaagtgcc tatggataga ttcgtcatgg acatgaaaag agacgtgaaa gttacaccag    6660

gcacgaaaca cacagaagaa agaccgaaag tacaagtgat acaagccgca gaacccctgg    6720

cgactgctta cttatgcggg attcaccggg aattagtgcg taggcttacg gccgtcttgc    6780

ttccaaacat tcacacgctt tttgacatgt cggcggagga ttttgatgca atcatagcag    6840

aacacttcaa gcaaggcgac ccggtactgg agacggatat cgcatcattc gacaaaagcc    6900

aagacgacgc tatggcgtta accggtctga tgatcttgga ggacctgggt gtggatcaac    6960

cactactcga cttgatcgag tgcgcctttg gagaaatatc atccacccat ctacctacgg    7020

gtactcgttt taaattcggg gcgatgatga aatccggaat gttcctcaca ctttttgtca    7080

acacagtttt gaatgtcgtt atcgccagca gagtactaga agagcggctt aaaacgtcca    7140

gatgtgcagc gttcattggc gacgacaaca tcatacatgg agtagtatct gacaaagaaa    7200

tggctgagag gtgcgccacc tggctcaaca tggaggttaa gatcatcgac gcagtcatcg    7260

gtgagagacc accttacttc tgcggcggat ttatcttgca agattcggtt acttccacag    7320

cgtgccgcgt ggcggatccc ctgaaaaggc tgtttaagtt gggtaaaccg ctcccagccg    7380

acgacgagca agacgaagac agaagacgcg ctctgctaga tgaaacaaag gcgtggttta    7440

gagtaggtat aacaggcact ttagcagtgg ccgtgacgac ccggtatgag gtagacaata    7500

ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca    7560

tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat    7620

ctgactaata ccacaacacc accacctcta gacgcgtaga tctcacgtga gcatgcagga    7680

ttacacctgt cctactggca ttgagaactt ttgcccagag caaaagagca ttccaagcca    7740

tcagagggga aataaagcat ctctacggtg gtcctaaata gtcagcatag tacatttcat    7800

ctgactaata ctacaacacc accacctcta gctagagctt accatgaccg agtacaagcc    7860

cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt cccccgggcc gtacgcaccc tcgccgccgc    7920

gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgacccg gaccgccaca tcgagcgggt    7980

caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt    8040

cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc    8100

ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca    8160

gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc    8220

caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc    8280

cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg    8340

caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg agtgcccgaa    8400

ggaccgcgcg acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc    8460

gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc ccatgatcgc tagaccatgg ggtaccgagc    8520

tcgaattcgc ctcgtcgcta ttaattatag gacttatgat ttttgcttgc agcatgatgc    8580

tgactagcac acgaagatga cgggcccaat gatccgacca gcaaaactcg atgtacttcc    8640

gaggaactga tgtgcataat gcatcaggct ggtacattagatccccgct t accgcgggca    8700

atatagcaac actaaaaact cgatgtactt ccgaggaagc gcagtgcata atgctgcgca    8760

gtgttgccac ataaccacta tattaaccat ttatctagcg gacgccaaaa actcaatgta     8820

tttctgagga agcgtggtgc ataatgccac gcagcgtctg cataactttt attatttctt     8880

ttattaatca acaaaatttt gtttttaaca tttcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     8940

aaaaaaaaaa agggaattcc tcgattaatt aagcggccgc tcgaggggaa ttaattcttg     9000

aagacgaaag ggccaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta     9060

tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt     9120

caataatccc tcgtccacgt ggcatctcga gacctttatt ccaaggcgtc gaaccactga     9180

cgactaccct gtactcaggg cttaagccat ccaacgaact caccactgtt gctacccccc     9240

tcattatgct agtcctacta agggcatggc tagcctcttt tcggccttcg ctgagaggga     9300

tttgttccct aggcctaatt attattttta attgcccaat acgtatacga gtgccttttc     9360

taattctcgt atactatagt gagtcgtatt atctagccgc ccgggccgtc gaccaattct     9420

catgtttgac agcttatcat cgaatttctg ccattcatcc gcttattatc acttattcag     9480

gcgtagcaac caggcgttta agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc     9540

tgccactcat cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca     9600

caaacggcat gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa     9660

tatttgccca tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca     9720

aaactggtga aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct     9780

ttagggaaat aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga     9840

aactgccgga aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca     9900

tggaaaacgg tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt     9960

gccatacgga attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga    10020

taaaacttgt gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg    10080

gtctggttat aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc    10140

cattgggata tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta    10200

gctcctgaaa atctcgataa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg    10260

tgaaagttgg aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag    10320

ggcttcccgg tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc    10380

acaggtattt attcgcgata agctcatgga gcggcgtaac cgtcgcacag gaaggacaga    10440

gaaagcgcgg atctgggaag tgacggacag aacggtcagg acctggattg gggaggcggt    10500

tgccgccgct gctgctgacg gtgtgacgtt ctctgttccg gtcacaccac atacgttccg    10560

ccattcctat gcgatgcaca tgctgtatgc cggtataccg ctgaaagt tctgcaaagcct    10620

gatgggacat aagtccatca gttcaacgga agtctacacg aaggtttttg cgctggatgt    10680

ggctgcccgg caccgggtgc agtttgcgat gccggagtct gatgcggttg cgatgctgaa    10740

acaattatcc tgagaataaa tgccttggcc tttatatgga aatgtggaac tgagtggata    10800

tgctgttttt gtctgttaaa cagagaagct ggctgttatc cactgagaag cgaacgaaac    10860

agtcgggaaa atctcccatt atcgtagaga tccgcattat taatctcagg agcctgtgta    10920

gcgtttatag gaagtagtgt tctgtcatga tgcctgcaag cggtaacgaa aacgatttga    10980

atatgccttc aggaacaata gaaatcttcg tgcggtgtta cgttgaagtg gagcggatta    11040

tgtcagcaat ggacagaaca acctaatgaa cacagaacca tgatgtggtc tgtcctttta    11100

cagccagtag tgctcgccgc agtcgagcga cagggcgaag ccctcgagtg agcgaggaag    11160

caccagggaa cagcacttat atattctgct tacacacgat gcctgaaaaa acttcccttg    11220

gggttatcca cttatccacg gggatatttt tataattatt ttttttatag tttttagatc    11280

ttctttttta gagcgccttg taggccttta tccatgctgg ttctagagaa ggtgttgtga    11340

caaattgccc tttcagtgtg acaaatcacc ctcaaatgac agtcctgtct gtgacaaatt    11400

gcccttaacc ctgtgacaaa ttgccctcag aagaagctgt tttttcacaa agttatccct    11460

gcttattgac tcttttttat ttagtgtgac aatctaaaaa cttgtcacac ttcacatgga    11520

tctgtcatgg cggaaacagc ggttatcaat cacaagaaac gtaaaaatag cccgcgaatc    11580

gtccagtcaa acgacctcac tgaggcggca tatagtctct cccgggatca aaaacgtatg    11640

ctgtatctgt tcgttgacca gatcagaaaa tctgatggca ccctacagga acatgacggt    11700

atctgcgaga tccatgttgc taaatatgct gaaatattcg gattgacctc tgcggaagcc    11760

agtaaggata tacggcaggc attgaagagt ttcgcgggga aggaagtggt tttttatcgc    11820

cctgaagagg atgccggcga tgaaaaaggc tatgaatctt ttccttggtt tatcaaacgt    11880

gcgcacagtc catccagagg gctttacagt gtacatatca acccatatct cattcccttc    11940

tttatcgggt tacagaaccg gtttacgcag tttcggctta gtgaaacaaa agaaatcacc    12000

aatccgtatg ccatgcgttt atacgaatcc ctgtgtcagt atcgtaagcc ggatggctca    12060

ggcatcgtct ctctgaaaat cgactggatc atagagcgtt accagctgcc tcaaagttac    12120

cagcgtatgc ctgacttccg ccgccgcttc ctgcaggtct gtgttaatga gatcaacagc    12180

agaactccaa tgcgcctctc atacattgag aaaaagaaag gccgccagac gactcatatc    12240

gtattttcct tccgcgatat cacttccatg acgacaggat agtctgaggg ttatctgtca    12300

cagatttgag ggtggttcgt cacatttgtt ctgacctact gagggtaatt tgtcacagtt    12360

ttgctgtttc cttcagcctg catggatttt ctcatacttt ttgaactgta atttttaagg    12420

aagccaaatt tgagggcagt ttgtcacagt tgatttcctt ctctttccct tcgtcatgtg    12480

acctgatatc gggggttagt tcgtcatcat tgatgagggt tgattatcac agtttattac    12540

tctgaattgg ctatccgcgt gtgtacctct acctggagtt tttcccacgg tggatatttc    12600

ttcttgcgct gagcgtaaga gctatctgac agaacagttc ttctttgctt cctcgccagt    12660

tcgctcgcta tgctcggtta cacggctgcg gcgagcgcta gtgataataa gtgactgagg    12720

tatgtgctct tcttatctcc ttttgtagtg ttgctcttat tttaaacaac tttgcggttt    12780

tttgatgact ttgcgatttt gttgttgctt tgcagtaaat tgcaagattt aataaaaaaa    12840

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taaacgctgg tcatgaaatg acgaaggcta tcgccattgc acagtttaat gatgacagcc    12960

cggaagcgag gaaaataacc cggcgctgga gaataggtga agcagcggat ttagttgggg    13020

tttcttctca ggctatcaga gatgccgaga aagcagggcg actaccgcac ccggatatgg    13080

aaattcgagg acgggttgag caacgtgttg gttatacaat tgaacaaatt aatcatatgc    13140

gtgatgtgtt tggtacgcga ttgcgacgtg ctgaagacgt atttccaccg gtgatcgggg    13200

ttgctgccca taaaggtggc gtttacaaaa cctcagtttc tgttcatctt gctcaggatc    13260

tggctctgaa ggggctacgt gttttgctcg tggaaggtaa cgacccccag ggaacagcct    13320

caatgtatca cggatgggta ccagatcttc atattcatgc agaagacact ctcctgcctt    13380

tctatcttgg ggaaaaggac gatgtcactt atgcaataaa gcccacttgc tggccggggc    13440

ttgacattat tccttcctgt ctggctctgc accgtattga aactgagtta atgggcaaat    13500

ttgatgaagg taaactgccc accgatccac acctgatgct ccgactggcc attgaaactg    13560

ttgctcatga ctatgatgtc atagttattg acagcgcgcc taacctgggt atcggcacga    13620

ttaatgtcgt atgtgctgct gatgtgctga ttgttcccac gcctgctgag ttgtttgact    13680

acacctccgc actgcagttt ttcgatatgc ttcgtgatct gctcaagaac gttgatctta    13740

aagggttcga gcctgatgta cgtattttgc ttaccaaata cagcaatagt aatggctctc    13800

agtccccgtg gatggaggag caaattcggg atgcctgggg aagcatggtt ctaaaaaatg    13860

ttgtacgtga aacggatgaa gttggtaaag gtcagatccg gatgagaact gtttttgaac    13920

aggccattga tcaacgctct tcaactggtg cctggagaaa tgctctttct atttgggaac    13980

ctgtctgcaa tgaaattttc gatcgtctga ttaaaccacg ctgggagatt agataatgaa    14040

gcgtgcgcct gttattccaa aacatacgct caatactcaa ccggttgaag atacttcgtt    14100

atcgacacca gctgccccga tggtggattc gttaattgcg cgcgtaggag taatggctcg    14160

cggtaatgcc attactttgc ctgtatgtgg tcgggatgtg aagtttactc ttgaagtgct    14220

ccggggtgat agtgttgaga agacctctcg ggtatggtca ggtaatgaac gtgaccagga    14280

gctgcttact gaggacgcac tggatgatct catcccttct tttctactga ctggtcaaca    14340

gacaccggcg ttcggtcgaa gagtatctgg tgtcatagaa attgccgatg ggagtcgccg    14400

tcgtaaagct gctgcactta ccgaaagtga ttatcgtgtt ctggttggcg agctggatga    14460

tgagcagatg gctgcattat ccagattggg taacgattat cgcccaacaa gtgcttatga    14520

acgtggtcag cgttatgcaa gccgattgca gaatgaattt gctggaaata tttctgcgct    14580

ggctgatgcg gaaaatattt cacgtaagat tattacccgc tgtatcaaca ccgccaaatt    14640

gcctaaatca gttgttgctc ttttttctca ccccggtgaa ctatctgccc ggtcaggtga    14700

tgcacttcaa aaagccttta cagataaaga ggaattactt aagcagcagg catctaacct    14760

tcatgagcag aaaaaagctg gggtgatatt tgaagctgaa gaagttatca ctcttttaac    14820

ttctgtgctt aaaacgtcat ctgcatcaag aactagttta agctcacgac atcagtttgc    14880

tcctggagcg acagtattgt ataagggcga taaaatggtg cttaacctgg acaggtctcg    14940

tgttccaact gagtgtatag agaaaattga ggccattctt aaggaacttg aaaagccagc    15000

accctgatgc gaccacgttt tagtctacgt ttatctgtct ttacttaatg tcctttgtta    15060

caggccagaa agcataactg gcctgaatat tctctctggg cccactgttc cacttgtatc    15120

gtcggtctga taatcagact gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag    15180

tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgattat tagtctggga ccacggtccc    15240

actcgtatcg tcggtctgat aatcagactg ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct    15300

gattattagt ctgggaccat ggtcccactc gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac    15360

cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg aaccacggtc ccactcgtat    15420

cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta    15480

gtctgggacc acgatcccac tcgtgttgtc ggtctgatta tcggtctggg accacggtcc    15540

cacttgtatt gtcgatcaga ctatcagcgt gagactacga ttccatcaat gcctgtcaag    15600

ggcaagtatt gacatgtcgt cgtaacctgt agaacggagt aacctcggtg tgcggttgta    15660

tgcctgctgt ggattgctgc tgtgtcctgc ttatccacaa cattttgcgc acggttatgt    15720

ggacaaaata cctggttacc caggccgtgc cggcacgtta accgggctgc atccgatgca    15780

agtgtgtcgc tgtcgacgag ctcgcgagct cggacatgag gttgccccgt attcagtgtc    15840

gctgatttgt attgtctgaa gttgttttta cgttaagttg atgcagatca attaatacga    15900

tacctgcgtc ataattgatt atttgacgtg gtttgatggc ctccacgcac gttgtgatat    15960

gtagatgata atcattatca ctttacgggt cctttccggt gatccgacag gttacggggc    16020

ggcgacctcg cgggttttcg ctatttatga aaattttccg gtttaaggcg tttccgttct    16080

tcttcgtcat aacttaatgt ttttatttaa aataccctct gaaaagaaag gaaacgacag    16140

gtgctgaaag cgagcttttt ggcctctgtc gtttcctttc tctgtttttg tccgtggaat    16200

gaacaatgga agtccgagct catcgctaat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt    16260

atattcgatg cggccgctga ggtctgcctc gtgaagaagg tgttgctgac tcataccagg    16320

gctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag tgagggagcc acggttgatg agagctttgt    16380

tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg tctgcgttgt    16440

cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt caacaaagcc    16500

acgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa aaatatatca tcatgaacaa    16560

taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt tatgagccat attcaacggg    16620

aaacgtcttg ctcgacgatg ataagctgtc aaacatgaga attgggtcgt caatatgcta    16680

aaacgcggca taccccgcgt attcccacta gttaattaac ctgcaggggg ctgttagagg    16740

tcttccctag tccaactata gcgtatggac atattgtcgt tagaacgcgg ctacaattaa    16800

tacataacct tatgtatcat acacatacga tttaggggac actatag                  16847

<210>43

<211>18563

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACsp6/JVFL/XhoI的序列

<400>43

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg     420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga     480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg     540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg     600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc     660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca     720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga     780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatctg tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

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gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

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gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

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gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc     9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca     9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg     9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg     9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa     9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc     9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta     9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatctcg agcggccgcg    10980

gaccgactag cctcttttcg gccttcgctg agagggattt gttccctagg cctaattatt    11040

atttttaatt gcccaatacg tatacgagtg ccttttctaa ttctcgtata ctatagtgag    11100

tcgtattatc tagccgcccg ggccgtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga    11160

atttctgcca ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaaccag gcgtttaagg    11220

gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg    11280

taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat    11340

cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg    11400

ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg    11460

attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc    11520

accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta    11580

ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg    11640

aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc    11700

attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt    11760

tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    11820

aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt    11880

atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcgataactc    11940

aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg    12000

ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caacagggac    12060

accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt cgcgataagc    12120

tcatggagcg gcgtaaccgt cgcacaggaa ggacagagaa agcgcggatc tgggaagtga    12180

cggacagaac ggtcaggacc tggattgggg aggcggttgc cgccgctgct gctgacggtg    12240

tgacgttctc tgttccggtc acaccacata cgttccgcca ttcctatgcg atgcacatgc    12300

tgtatgccgg tataccgctg aaagttctgc aaagcctgat gggacataag tccatcagtt    12360

caacggaagt ctacacgaag gtttttgcgc tggatgtggc tgcccggcac cgggtgcagt    12420

ttgcgatgcc ggagtctgat gcggttgcga tgctgaaaca attatcctga gaataaatgc    12480

cttggccttt atatggaaat gtggaactga gtggatatgc tgtttttgtc tgttaaacag    12540

agaagctggc tgttatccac tgagaagcga acgaaacagt cgggaaaatc tcccattatc    12600

gtagagatcc gcattattaa tctcaggagc ctgtgtagcg tttataggaa gtagtgttct    12660

gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg aacaatagaa    12720

atcttcgtgc ggtgttacgt tgaagtggag cggattatgt cagcaatgga cagaacaacc    12780

taatgaacac agaaccatga tgtggtctgt ccttttacag ccagtagtgc tcgccgcagt    12840

cgagcgacag ggcgaagccc tcgagtgagc gaggaagcac cagggaacag cacttatata    12900

ttctgcttac acacgatgcc tgaaaaaact tcccttgggg ttatccactt atccacgggg    12960

atatttttat aattattttt tttatagttt ttagatcttc ttttttagag cgccttgtag    13020

gcctttatcc atgctggttc tagagaaggt gttgtgacaa attgcccttt cagtgtgaca    13080

aatcaccctc aaatgacagt cctgtctgtg acaaattgcc cttaaccctg tgacaaattg    13140

ccctcagaag aagctgtttt ttcacaaagt tatccctgct tattgactct tttttattta    13200

gtgtgacaat ctaaaaactt gtcacacttc acatggatct gtcatggcgg aaacagcggt    13260

tatcaatcac aagaaacgta aaaatagccc gcgaatcgtc cagtcaaacg acctcactga    13320

ggcggcatat agtctctccc gggatcaaaa acgtatgctg tatctgttcg ttgaccagat    13380

cagaaaatct gatggcaccc tacaggaaca tgacggtatc tgcgagatcc atgttgctaa    13440

atatgctgaa atattcggat tgacctctgc ggaagccagt aaggatatac ggcaggcatt    13500

gaagagtttc gcggggaagg aagtggtttt ttatcgccct gaagaggatg ccggcgatga    13560

aaaaggctat gaatcttttc cttggtttat caaacgtgcg cacagtccat ccagagggct    13620

ttacagtgta catatcaacc catatctcat tcccttcttt atcgggttac agaaccggtt    13680

tacgcagttt cggcttagtg aaacaaaaga aatcaccaat ccgtatgcca tgcgtttata    13740

cgaatccctg tgtcagtatc gtaagccgga tggctcaggc atcgtctctc tgaaaatcga    13800

ctggatcata gagcgttacc agctgcctca aagttaccag cgtatgcctg acttccgccg    13860

ccgcttcctg caggtctgtg ttaatgagat caacagcaga actccaatgc gcctctcata    13920

cattgagaaa aagaaaggcc gccagacgac tcatatcgta ttttccttcc gcgatatcac    13980

ttccatgacg acaggatagt ctgagggtta tctgtcacag atttgagggt ggttcgtcac    14040

atttgttctg acctactgag ggtaatttgt cacagttttg ctgtttcctt cagcctgcat    14100

ggattttctc atactttttg aactgtaatt tttaaggaag ccaaatttga gggcagtttg    14160

tcacagttga tttccttctc tttcccttcg tcatgtgacc tgatatcggg ggttagttcg    14220

tcatcattga tgagggttga ttatcacagt ttattactct gaattggcta tccgcgtgtg    14280

tacctctacc tggagttttt cccacggtgg atatttcttc ttgcgctgag cgtaagagct    14340

atctgacaga acagttcttc tttgcttcct cgccagttcg ctcgctatgc tcggttacac    14400

ggctgcggcg agcgctagtg ataataagtg actgaggtat gtgctcttct tatctccttt    14460

tgtagtgttg ctcttatttt aaacaacttt gcggtttttt gatgactttg cgattttgtt    14520

gttgctttgc agtaaattgc aagatttaat aaaaaaacgc aaagcaatga ttaaaggatg    14580

ttcagaatga aactcatgga aacacttaac cagtgcataa acgctggtca tgaaatgacg    14640

aaggctatcg ccattgcaca gtttaatgat gacagcccgg aagcgaggaa aataacccgg    14700

cgctggagaa taggtgaagc agcggattta gttggggttt cttctcaggc tatcagagat    14760

gccgagaaag cagggcgact accgcacccg gatatggaaa ttcgaggacg ggttgagcaa    14820

cgtgttggtt atacaattga acaaattaat catatgcgtg atgtgtttgg tacgcgattg    14880

cgacgtgctg aagacgtatt tccaccggtg atcggggttg ctgcccataa aggtggcgtt    14940

tacaaaacct cagtttctgt tcatcttgct caggatctgg ctctgaaggg gctacgtgtt    15000

ttgctcgtgg aaggtaacga cccccaggga acagcctcaa tgtatcacgg atgggtacca    15060

gatcttcata ttcatgcaga agacactctc ctgcctttct atcttgggga aaaggacgat    15120

gtcacttatg caataaagcc cacttgctgg ccggggcttg acattattcc ttcctgtctg    15180

gctctgcacc gtattgaaac tgagttaatg ggcaaatttg atgaaggtaa actgcccacc    15240

gatccacacc tgatgctccg actggccatt gaaactgttg ctcatgacta tgatgtcata    15300

gttattgaca gcgcgcctaa cctgggtatc ggcacgatta atgtcgtatg tgctgctgat    15360

gtgctgattg ttcccacgcc tgctgagttg tttgactaca cctccgcact gcagtttttc    15420

gatatgcttc gtgatctgct caagaacgtt gatcttaaag ggttcgagcc tgatgtacgt    15480

attttgctta ccaaatacag caatagtaat ggctctcagt ccccgtggat ggaggagcaa    15540

attcgggatg cctggggaag catggttcta aaaaatgttg tacgtgaaac ggatgaagtt    15600

ggtaaaggtc agatccggat gagaactgtt tttgaacagg ccattgatca acgctcttca    15660

actggtgcct ggagaaatgc tctttctatt tgggaacctg tctgcaatga aattttcgat    15720

cgtctgatta aaccacgctg ggagattaga taatgaagcg tgcgcctgtt attccaaaac    15780

atacgctcaa tactcaaccg gttgaagata cttcgttatc gacaccagct gccccgatgg    15840

tggattcgtt aattgcgcgc gtaggagtaa tggctcgcgg taatgccatt actttgcctg    15900

tatgtggtcg ggatgtgaag tttactcttg aagtgctccg gggtgatagt gttgagaaga    15960

cctctcgggt atggtcaggt aatgaacgtg accaggagct gcttactgag gacgcactgg    16020

atgatctcat cccttctttt ctactgactg gtcaacagac accggcgttc ggtcgaagag    16080

tatctggtgt catagaaatt gccgatggga gtcgccgtcg taaagctgct gcacttaccg    16140

aaagtgatta tcgtgttctg gttggcgagc tggatgatga gcagatggct gcattatcca    16200

gattgggtaa cgattatcgc ccaacaagtg cttatgaacg tggtcagcgt tatgcaagcc    16260

gattgcagaa tgaatttgct ggaaatattt ctgcgctggc tgatgcggaa aatatttcac    16320

gtaagattat tacccgctgt atcaacaccg ccaaattgcc taaatcagtt gttgctcttt    16380

tttctcaccc cggtgaacta tctgcccggt caggtgatgc acttcaaaaa gcctttacag    16440

ataaagagga attacttaag cagcaggcat ctaaccttca tgagcagaaa aaagctgggg    16500

tgatatttga agctgaagaa gttatcactc ttttaacttc tgtgcttaaa acgtcatctg    16560

catcaagaac tagtttaagc tcacgacatc agtttgctcc tggagcgaca gtattgtata    16620

agggcgataa aatggtgctt aacctggaca ggtctcgtgt tccaactgag tgtatagaga    16680

aaattgaggc cattcttaag gaacttgaaa agccagcacc ctgatgcgac cacgttttag    16740

tctacgttta tctgtcttta cttaatgtcc tttgttacag gccagaaagc ataactggcc    16800

tgaatattct ctctgggccc actgttccac ttgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg    16860

accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt    16920

atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgataat    16980

cagactggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccatggt    17040

cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg    17100

tctgattatt agtctggaac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg    17160

gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg atcccactcg    17220

tgttgtcggt ctgattatcg gtctgggacc acggtcccac ttgtattgtc gatcagacta    17280

tcagcgtgag actacgattc catcaatgcc tgtcaagggc aagtattgac atgtcgtcgt    17340

aacctgtaga acggagtaac ctcggtgtgc ggttgtatgc ctgctgtgga ttgctgctgt    17400

gtcctgctta tccacaacat tttgcgcacg gttatgtgga caaaatacct ggttacccag    17460

gccgtgccgg cacgttaacc gggctgcatc cgatgcaagt gtgtcgctgt cgacgagctc    17520

gcgagctcgg acatgaggtt gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt    17580

gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt    17640

tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt    17700

tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta    17760

tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt    17820

tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc    17880

ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc gtggaatgaa caatggaagt ccgagctcat    17940

cgctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttcgatgcgg cgctgaggtc    18000

tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc    18060

agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt    18120

tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct    18180

tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccacgt gtctcaaaat ctctgatgtt    18240

acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca    18300

gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg acgatgataa    18360

gctgtcaaac atgagaattg ggtcgtcaat atgctaaaac gcggcatacc ccgcgtattc    18420

ccactagtta attaacctgc agggggctgt tagaggtctt ccctagtcca actatagcgt    18480

atggacatat tgtcgttaga acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac    18540

atacgattta ggggacacta tag                                            18563

<210>44

<211>18563

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACsp6/JVFLx/XhoI的序列

<400>44

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg     600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc     660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca     720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga     780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatctg tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

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aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

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gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tcttgagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc    9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca    9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg    9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg     9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa     9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc     9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta     9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatctcg agcggccgcg    10980

gaccgactag cctcttttcg gccttcgctg agagggattt gttccctagg cctaattatt    11040

atttttaatt gcccaatacg tatacgagtg ccttttctaa ttctcgtata ctatagtgag    11100

tcgtattatc tagccgcccg ggccgtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga    11160

atttctgcca ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaaccag gcgtttaagg    11220

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taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat    11340

cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg    11400

ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg    11460

attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc    11520

accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta    11580

ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg    11640

aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc    11700

attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt    11760

tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    11820

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aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg    12000

ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caacagggac    12060

accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt cgcgataagc    12120

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tgtatgccgg tataccgctg aaagttctgc aaagcctgat gggacataag tccatcagtt    12360

caacggaagt ctacacgaag gtttttgcgc tggatgtggc tgcccggcac cgggtgcagt    12420

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agaagctggc tgttatccac tgagaagcga acgaaacagt cgggaaaatc tcccattatc    12600

gtagagatcc gcattattaa tctcaggagc ctgtgtagcg tttataggaa gtagtgttct    12660

gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg aacaatagaa    12720

atcttcgtgc ggtgttacgt tgaagtggag cggattatgt cagcaatgga cagaacaacc    12780

taatgaacac agaaccatga tgtggtctgt ccttttacag ccagtagtgc tcgccgcagt    12840

cgagcgacag ggcgaagccc tcgagtgagc gaggaagcac cagggaacag cacttatata    12900

ttctgcttac acacgatgcc tgaaaaaact tcccttgggg ttatccactt atccacgggg    12960

atatttttat aattattttt tttatagttt ttagatcttc ttttttagag cgccttgtag    13020

gcctttatcc atgctggttc tagagaaggt gttgtgacaa attgcccttt cagtgtgaca    13080

aatcaccctc aaatgacagt cctgtctgtg acaaattgcc cttaaccctg tgacaaattg    13140

ccctcagaag aagctgtttt ttcacaaagt tatccctgct tattgactct tttttattta    13200

gtgtgacaat ctaaaaactt gtcacacttc acatggatct gtcatggcgg aaacagcggt    13260

tatcaatcac aagaaacgta aaaatagccc gcgaatcgtc cagtcaaacg acctcactga    13320

ggcggcatat agtctctccc gggatcaaaa acgtatgctg tatctgttcg ttgaccagat    13380

cagaaaatct gatggcaccc tacaggaaca tgacggtatc tgcgagatcc atgttgctaa    13440

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tcacagttga tttccttctc tttcccttcg tcatgtgacc tgatatcggg ggttagttcg    14220

tcatcattga tgagggttga ttatcacagt ttattactct gaattggcta tccgcgtgtg    14280

tacctctacc tggagttttt cccacggtgg atatttcttc ttgcgctgag cgtaagagct    14340

atctgacaga acagttcttc tttgcttcct cgccagttcg ctcgctatgc tcggttacac    14400

ggctgcggcg agcgctagtg ataataagtg actgaggtat gtgctcttct tatctccttt    14460

tgtagtgttg ctcttatttt aaacaacttt gcggtttttt gatgactttg cgattttgtt    14520

gttgctttgc agtaaattgc aagatttaat aaaaaaacgc aaagcaatga ttaaaggatg    14580

ttcagaatga aactcatgga aacacttaac cagtgcataa acgctggtca tgaaatgacg    14640

aaggctatcg ccattgcaca gtttaatgat gacagcccgg aagcgaggaa aataacccgg    14700

cgctggagaa taggtgaagc agcggattta gttggggttt cttctcaggc tatcagagat    14760

gccgagaaag cagggcgact accgcacccg gatatggaaa ttcgaggacg ggttgagcaa    14820

cgtgttggtt atacaattga acaaattaat catatgcgtg atgtgtttgg tacgcgattg    14880

cgacgtgctg aagacgtatt tccaccggtg atcggggttg ctgcccataa aggtggcgtt    14940

tacaaaacct cagtttctgt tcatcttgct caggatctgg ctctgaaggg gctacgtgtt    15000

ttgctcgtgg aaggtaacga cccccaggga acagcctcaa tgtatcacgg atgggtacca    15060

gatcttcata ttcatgcaga agacactctc ctgcctttct atcttgggga aaaggacgat    15120

gtcacttatg caataaagcc cacttgctgg ccggggcttg acattattcc ttcctgtctg    15180

gctctgcacc gtattgaaac tgagttaatg ggcaaatttg atgaaggtaa actgcccacc    15240

gatccacacc tgatgctccg actggccatt gaaactgttg ctcatgacta tgatgtcata    15300

gttattgaca gcgcgcctaa cctgggtatc ggcacgatta atgtcgtatg tgctgctgat    15360

gtgctgattg ttcccacgcc tgctgagttg tttgactaca cctccgcact gcagtttttc    15420

gatatgcttc gtgatctgct caagaacgtt gatcttaaag ggttcgagcc tgatgtacgt    15480

attttgctta ccaaatacag caatagtaat ggctctcagt ccccgtggat ggaggagcaa    15540

attcgggatg cctggggaag catggttcta aaaaatgttg tacgtgaaac ggatgaagtt    15600

ggtaaaggtc agatccggat gagaactgtt tttgaacagg ccattgatca acgctcttca    15660

actggtgcct ggagaaatgc tctttctatt tgggaacctg tctgcaatga aattttcgat    15720

cgtctgatta aaccacgctg ggagattaga taatgaagcg tgcgcctgtt attccaaaac    15780

atacgctcaa tactcaaccg gttgaagata cttcgttatc gacaccagct gccccgatgg    15840

tggattcgtt aattgcgcgc gtaggagtaa tggctcgcgg taatgccatt actttgcctg    15900

tatgtggtcg ggatgtgaag tttactcttg aagtgctccg gggtgatagt gttgagaaga    15960

cctctcgggt atggtcaggt aatgaacgtg accaggagct gcttactgag gacgcactgg    16020

atgatctcat cccttctttt ctactgactg gtcaacagac accggcgttc ggtcgaagag    16080

tatctggtgt catagaaatt gccgatggga gtcgccgtcg taaagctgct gcacttaccg    16140

aaagtgatta tcgtgttctg gttggcgagc tggatgatga gcagatggct gcattatcca    16200

gattgggtaa cgattatcgc ccaacaagtg cttatgaacg tggtcagcgt tatgcaagcc    16260

gattgcagaa tgaatttgct ggaaatattt ctgcgctggc tgatgcggaa aatatttcac    16320

gtaagattat tacccgctgt atcaacaccg ccaaattgcc taaatcagtt gttgctcttt    16380

tttctcaccc cggtgaacta tctgcccggt caggtgatgc acttcaaaaa gcctttacag    16440

ataaagagga attacttaag cagcaggcat ctaaccttca tgagcagaaa aaagctgggg    16500

tgatatttga agctgaagaa gttatcactc ttttaacttc tgtgcttaaa acgtcatctg    16560

catcaagaac tagtttaagc tcacgacatc agtttgctcc tggagcgaca gtattgtata    16620

agggcgataa aatggtgctt aacctggaca ggtctcgtgt tccaactgag tgtatagaga    16680

aaattgaggc cattcttaag gaacttgaaa agccagcacc ctgatgcgac cacgttttag    16740

tctacgttta tctgtcttta cttaatgtcc tttgttacag gccagaaagc ataactggcc    16800

tgaatattct ctctgggccc actgttccac ttgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg    16860

accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt    16920

atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgataat    16980

cagactggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccatggt    17040

cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg    17100

tctgattatt agtctggaac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg    17160

gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg atcccactcg    17220

tgttgtcggt ctgattatcg gtctgggacc acggtcccac ttgtattgtc gatcagacta    17280

tcagcgtgag actacgattc catcaatgcc tgtcaagggc aagtattgac atgtcgtcgt    17340

aacctgtaga acggagtaac ctcggtgtgc ggttgtatgc ctgctgtgga ttgctgctgt    17400

gtcctgctta tccacaacat tttgcgcacg gttatgtgga caaaatacct ggttacccag    17460

gccgtgccgg cacgttaacc gggctgcatc cgatgcaagt gtgtcgctgt cgacgagctc    17520

gcgagctcgg acatgaggtt gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt    17580

gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt    17640

tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt    17700

tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta    17760

tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt    17820

tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc    17880

ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc gtggaatgaa caatggaagt ccgagctcat    17940

cgctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttcgatgcgg cgctgaggtc    18000

tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc    18060

agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt    18120

tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct    18180

tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccacgt gtctcaaaat ctctgatgtt    18240

acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca    18300

gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg acgatgataa    18360

gctgtcaaac atgagaattg ggtcgtcaat atgctaaaac gcggcatacc ccgcgtattc    18420

ccactagtta attaacctgc agggggctgt tagaggtctt ccctagtcca actatagcgt    18480

atggacatat tgtcgttaga acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac    18540

atacgattta ggggacacta tag                                            18563

<210>45

<211>18565

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACsp6/JVFLx/XbaI的序列

<400>45

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgact aaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg    600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc    660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca    720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga     780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatctg tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca    7800

gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tcttgagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc    9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca    9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg    9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg    9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa    9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc    9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta     9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatctct agagcggccg    10980

cggaccgact agcctctttt cggccttcgc tgagagggat ttgttcccta ggcctaatta    11040

ttatttttaa ttgcccaata cgtatacgag tgccttttct aattctcgta tactatagtg    11100

agtcgtatta tctagccgcc cgggccgtcg accaattctc atgtttgaca gcttatcatc    11160

gaatttctgc cattcatccg cttattatca cttattcagg cgtagcaacc aggcgtttaa    11220

gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt    11280

tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga    11340

atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg    11400

ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag    11460

ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt    11520

tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg    11580

tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg    11640

tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga    11700

gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc    11760

tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga    11820

gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg    11880

gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac    11940

tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg    12000

tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg    12060

acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcgcgataa    12120

gctcatggag cggcgtaacc gtcgcacagg aaggacagag aaagcgcgga tctgggaagt    12180

gacggacaga acggtcagga cctggattgg ggaggcggtt gccgccgctg ctgctgacgg    12240

tgtgacgttc tctgttccgg tcacaccaca tacgttccgc cattcctatg cgatgcacat    12300

gctgtatgcc ggtataccgc tgaaagttct gcaaagcctg atgggacata agtccatcag    12360

ttcaacggaa gtctacacga aggtttttgc gctggatgtg gctgcccggc accgggtgca    12420

gtttgcgatg ccggagtctg atgcggttgc gatgctgaaa caattatcct gagaataaat    12480

gccttggcct ttatatggaa atgtggaact gagtggatat gctgtttttg tctgttaaac    12540

agagaagctg gctgttatcc actgagaagc gaacgaaaca gtcgggaaaa tctcccatta    12600

tcgtagagat ccgcattatt aatctcagga gcctgtgtag cgtttatagg aagtagtgtt    12660

ctgtcatgat gcctgcaagc ggtaacgaaa acgatttgaa tatgccttca ggaacaatag    12720

aaatcttcgt gcggtgttac gttgaagtgg agcggattat gtcagcaatg gacagaacaa    12780

cctaatgaac acagaaccat gatgtggtct gtccttttac agccagtagt gctcgccgca    12840

gtcgagcgac agggcgaagc cctcgagtga gcgaggaagc accagggaac agcacttata    12900

tattctgctt acacacgatg cctgaaaaaa cttcccttgg ggttatccac ttatccacgg    12960

ggatattttt ataattattt tttttatagt ttttagatct tcttttttag agcgccttgt    13020

aggcctttat ccatgctggt tctagagaag gtgttgtgac aaattgccct ttcagtgtga    13080

caaatcaccc tcaaatgaca gtcctgtctg tgacaaattg cccttaaccc tgtgacaaat    13140

tgccctcaga agaagctgtt ttttcacaaa gttatccctg cttattgact cttttttatt    13200

tagtgtgaca atctaaaaac ttgtcacact tcacatggat ctgtcatggc ggaaacagcg    13260

gttatcaatc acaagaaacg taaaaatagc ccgcgaatcg tccagtcaaa cgacctcact    13320

gaggcggcat atagtctctc ccgggatcaa aaacgtatgc tgtatctgtt cgttgaccag    13380

atcagaaaat ctgatggcac cctacaggaa catgacggta tctgcgagat ccatgttgct    13440

aaatatgctg aaatattcgg attgacctct gcggaagcca gtaaggatat acggcaggca    13500

ttgaagagtt tcgcggggaa ggaagtggtt ttttatcgcc ctgaagagga tgccggcgat    13560

gaaaaaggct atgaatcttt tccttggttt atcaaacgtg cgcacagtcc atccagaggg    13620

ctttacagtg tacatatcaa cccatatctc attcccttct ttatcgggtt acagaaccgg    13680

tttacgcagt ttcggcttag tgaaacaaaa gaaatcacca atccgtatgc catgcgttta    13740

tacgaatccc tgtgtcagta tcgtaagccg gatggctcag gcatcgtctc tctgaaaatc    13800

gactggatca tagagcgtta ccagctgcct caaagttacc agcgtatgcc tgacttccgc    13860

cgccgcttcc tgcaggtctg tgttaatgag atcaacagca gaactccaat gcgcctctca    13920

tacattgaga aaaagaaagg ccgccagacg actcatatcg tattttcctt ccgcgatatc    13980

acttccatga cgacaggata gtctgagggt tatctgtcac agatttgagg gtggttcgtc    14040

acatttgttc tgacctactg agggtaattt gtcacagttt tgctgtttcc ttcagcctgc    14100

atggattttc tcatactttt tgaactgtaa tttttaagga agccaaattt gagggcagtt    14160

tgtcacagtt gatttccttc tctttccctt cgtcatgtga cctgatatcg ggggttagtt    14220

cgtcatcatt gatgagggtt gattatcaca gtttattact ctgaattggc tatccgcgtg    14280

tgtacctcta cctggagttt ttcccacggt ggatatttct tcttgcgctg agcgtaagag    14340

ctatctgaca gaacagttct tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac    14400

acggctgcgg cgagcgctag tgataataag tgactgaggt atgtgctctt cttatctcct    14460

tttgtagtgt tgctcttatt ttaaacaact ttgcggtttt ttgatgactt tgcgattttg    14520

ttgttgcttt gcagtaaatt gcaagattta ataaaaaaac gcaaagcaat gattaaagga    14580

tgttcagaat gaaactcatg gaaacactta accagtgcat aaacgctggt catgaaatga    14640

cgaaggctat cgccattgca cagtttaatg atgacagccc ggaagcgagg aaaataaccc    14700

ggcgctggag aataggtgaa gcagcggatt tagttggggt ttcttctcag gctatcagag    14760

atgccgagaa agcagggcga ctaccgcacc cggatatgga aattcgagga cgggttgagc    14820

aacgtgttgg ttatacaatt gaacaaatta atcatatgcg tgatgtgttt ggtacgcgat    14880

tgcgacgtgc tgaagacgta tttccaccgg tgatcggggt tgctgcccat aaaggtggcg    14940

tttacaaaac ctcagtttct gttcatcttg ctcaggatct ggctctgaag gggctacgtg    15000

ttttgctcgt ggaaggtaac gacccccagg gaacagcctc aatgtatcac ggatgggtac    15060

cagatcttca tattcatgca gaagacactc tcctgccttt ctatcttggg gaaaaggacg    15120

atgtcactta tgcaataaag cccacttgct ggccggggct tgacattatt ccttcctgtc    15180

tggctctgca ccgtattgaa actgagttaa tgggcaaatt tgatgaaggt aaactgccca    15240

ccgatccaca cctgatgctc cgactggcca ttgaaactgt tgctcatgac tatgatgtca    15300

tagttattga cagcgcgcct aacctgggta tcggcacgat taatgtcgta tgtgctgctg    15360

atgtgctgat tgttcccacg cctgctgagt tgtttgacta cacctccgca ctgcagtttt    15420

tcgatatgct tcgtgatctg ctcaagaacg ttgatcttaa agggttcgag cctgatgtac    15480

gtattttgct taccaaatac agcaatagta atggctctca gtccccgtgg atggaggagc    15540

aaattcggga tgcctgggga agcatggttc taaaaaatgt tgtacgtgaa acggatgaag    15600

ttggtaaagg tcagatccgg atgagaactg tttttgaaca ggccattgat caacgctctt    15660

caactggtgc ctggagaaat gctctttcta tttgggaacc tgtctgcaat gaaattttcg    15720

atcgtctgat taaaccacgc tgggagatta gataatgaag cgtgcgcctg ttattccaaa    15780

acatacgctc aatactcaac cggttgaaga tacttcgtta tcgacaccag ctgccccgat    15840

ggtggattcg ttaattgcgc gcgtaggagt aatggctcgc ggtaatgcca ttactttgcc    15900

tgtatgtggt cgggatgtga agtttactct tgaagtgctc cggggtgata gtgttgagaa    15960

gacctctcgg gtatggtcag gtaatgaacg tgaccaggag ctgcttactg aggacgcact    16020

ggatgatctc atcccttctt ttctactgac tggtcaacag acaccggcgt tcggtcgaag    16080

agtatctggt gtcatagaaa ttgccgatgg gagtcgccgt cgtaaagctg ctgcacttac    16140

cgaaagtgat tatcgtgttc tggttggcga gctggatgat gagcagatgg ctgcattatc    16200

cagattgggt aacgattatc gcccaacaag tgcttatgaa cgtggtcagc gttatgcaag    16260

ccgattgcag aatgaatttg ctggaaatat ttctgcgctg gctgatgcgg aaaatatttc    16320

acgtaagatt attacccgct gtatcaacac cgccaaattg cctaaatcag ttgttgctct    16380

tttttctcac cccggtgaac tatctgcccg gtcaggtgat gcacttcaaa aagcctttac    16440

agataaagag gaattactta agcagcaggc atctaacctt catgagcaga aaaaagctgg    16500

ggtgatattt gaagctgaag aagttatcac tcttttaact tctgtgctta aaacgtcatc    16560

tgcatcaaga actagtttaa gctcacgaca tcagtttgct cctggagcga cagtattgta    16620

taagggcgat aaaatggtgc ttaacctgga caggtctcgt gttccaactg agtgtataga    16680

gaaaattgag gccattctta aggaacttga aaagccagca ccctgatgcg accacgtttt    16740

agtctacgtt tatctgtctt tacttaatgt cctttgttac aggccagaaa gcataactgg    16800

cctgaatatt ctctctgggc ccactgttcc acttgtatcg tcggtctgat aatcagactg    16860

ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc    16920

gtatcgtcgg tctgattatt agtctgggac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgata    16980

atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccatg    17040

gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc    17100

ggtctgatta ttagtctgga accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct    17160

gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cgatcccact    17220

cgtgttgtcg gtctgattat cggtctggga ccacggtccc acttgtattg tcgatcagac    17280

tatcagcgtg agactacgat tccatcaatg cctgtcaagg gcaagtattg acatgtcgtc    17340

gtaacctgta gaacggagta acctcggtgt gcggttgtat gcctgctgtg gattgctgct    17400

gtgtcctgct tatccacaac attttgcgca cggttatgtg gacaaaatac ctggttaccc    17460

aggccgtgcc ggcacgttaa ccgggctgca tccgatgcaa gtgtgtcgct gtcgacgagc    17520

tcgcgagctc ggacatgagg ttgccccgta ttcagtgtcg ctgatttgta ttgtctgaag    17580

ttgtttttac gttaagttga tgcagatcaa ttaatacgat acctgcgtca taattgatta    17640

tttgacgtgg tttgatggcc tccacgcacg ttgtgatatg tagatgataa tcattatcac    17700

tttacgggtc ctttccggtg atccgacagg ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc    17760

tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt    17820

tttatttaaa ataccctctg aaaagaaagg aaacgacagg tgctgaaagc gagctttttg    17880

gcctctgtcg tttcctttct ctgtttttgt ccgtggaatg aacaatggaa gtccgagctc    17940

atcgctaata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tattcgatgc ggcgctgagg    18000

tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag    18060

ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg taggtggacc agttggtgat    18120

tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg ggaagatgcg tgatctgatc    18180

cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccac gtgtctcaaa atctctgatg    18240

ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa    18300

cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgacgatgat    18360

aagctgtcaa acatgagaat tgggtcgtca atatgctaaa acgcggcata ccccgcgtat    18420

tcccactagt taattaacct gcagggggct gttagaggtc ttccctagtc caactatagc    18480

gtatggacat attgtcgtta gaacgcggct acaattaata cataacctta tgtatcatac    18540

acatacgatt taggggacac tatag                                          18565

<210>46

<211>19038

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACt7/JVFL/XhoI的序列

<400>46

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg    600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc    660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca    720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga    780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca    840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg    900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

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atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacat cgctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

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gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

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ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

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gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

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tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

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aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tctagagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc    9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca    9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg    9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg    9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa    9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc    9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta    9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca    9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg    9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

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gaccgactag cctcttttcg gccttcgctg agagggattt gttccctagg cctaattatt    11040

atttttaatt gcccaatacg tatacgagtg ccttttctaa ttctcgtata ctatagtgag    11100

tcgtattatc tagccgcccg ggccgtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga    11160

atttctgcca ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaaccag gcgtttaagg    11220

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taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat    11340

cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg    11400

ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg    11460

attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc    11520

accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta    11580

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attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt    11760

tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    11820

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ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caacagggac    12060

accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt cgcgataagc    12120

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tgacgttctc tgttccggtc acaccacata cgttccgcca ttcctatgcg atgcacatgc    12300

tgtatgccgg tataccgctg aaagttctgc aaagcctgat gggacataag tccatcagtt    12360

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gtagagatcc gcattattaa tctcaggagc ctgtgtagcg tttataggaa gtagtgttct    12660

gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg aacaatagaa    12720

atcttcgtgc ggtgttacgt tgaagtggag cggattatgt cagcaatgga cagaacaacc    12780

taatgaacac agaaccatga tgtggtctgt ccttttacag ccagtagtgc tcgccgcagt    12840

cgagcgacag ggcgaagccc tcgagtgagc gaggaagcac cagggaacag cacttatata    12900

ttctgcttac acacgatgcc tgaaaaaact tcccttgggg ttatccactt atccacgggg    12960

atatttttat aattattttt tttatagttt ttagatcttc ttttttagag cgccttgtag    13020

gcctttatcc atgctggttc tagagaaggt gttgtgacaa attgcccttt cagtgtgaca    13080

aatcaccctc aaatgacagt cctgtctgtg acaaattgcc cttaaccctg tgacaaattg    13140

ccctcagaag aagctgtttt ttcacaaagt tatccctgct tattgactct tttttattta    13200

gtgtgacaat ctaaaaactt gtcacacttc acatggatct gtcatggcgg aaacagcggt    13260

tatcaatcac aagaaacgta aaaatagccc gcgaatcgtc cagtcaaacg acctcactga    13320

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cagaaaatct gatggcaccc tacaggaaca tgacggtatc tgcgagatcc atgttgctaa    13440

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ttacagtgta catatcaacc catatctcat tcccttcttt atcgggttac agaaccggtt    13680

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ttccatgacg acaggatagt ctgagggtta tctgtcacag atttgagggt ggttcgtcac    14040

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tcacagttga tttccttctc tttcccttcg tcatgtgacc tgatatcggg ggttagttcg    14220

tcatcattga tgagggttga ttatcacagt ttattactct gaattggcta tccgcgtgtg    14280

tacctctacc tggagttttt cccacggtgg atatttcttc ttgcgctgag cgtaagagct    14340

atctgacaga acagttcttc tttgcttcct cgccagttcg ctcgctatgc tcggttacac    14400

ggctgcggcg agcgctagtg ataataagtg actgaggtat gtgctcttct tatctccttt    14460

tgtagtgttg ctcttatttt aaacaacttt gcggtttttt gatgactttg cgattttgtt    14520

gttgctttgc agtaaattgc aagatttaat aaaaaaacgc aaagcaatga ttaaaggatg    14580

ttcagaatga aactcatgga aacacttaac cagtgcataa acgctggtca tgaaatgacg    14640

aaggctatcg ccattgcaca gtttaatgat gacagcccgg aagcgaggaa aataacccgg    14700

cgctggagaa taggtgaagc agcggattta gttggggttt cttctcaggc tatcagagat    14760

gccgagaaag cagggcgact accgcacccg gatatggaaa ttcgaggacg ggttgagcaa    14820

cgtgttggtt atacaattga acaaattaat catatgcgtg atgtgtttgg tacgcgattg    14880

cgacgtgctg aagacgtatt tccaccggtg atcggggttg ctgcccataa aggtggcgtt    14940

tacaaaacct cagtttctgt tcatcttgct caggatctgg ctctgaaggg gctacgtgtt    15000

ttgctcgtgg aaggtaacga cccccaggga acagcctcaa tgtatcacgg atgggtacca    15060

gatcttcata ttcatgcaga agacactctc ctgcctttct atcttgggga aaaggacgat    15120

gtcacttatg caataaagcc cacttgctgg ccggggcttg acattattcc ttcctgtctg    15180

gctctgcacc gtattgaaac tgagttaatg ggcaaatttg atgaaggtaa actgcccacc    15240

gatccacacc tgatgctccg actggccatt gaaactgttg ctcatgacta tgatgtcata    15300

gttattgaca gcgcgcctaa cctgggtatc ggcacgatta atgtcgtatg tgctgctgat    15360

gtgctgattg ttcccacgcc tgctgagttg tttgactaca cctccgcact gcagtttttc    15420

gatatgcttc gtgatctgct caagaacgtt gatcttaaag ggttcgagcc tgatgtacgt    15480

attttgctta ccaaatacag caatagtaat ggctctcagt ccccgtggat ggaggagcaa    15540

attcgggatg cctggggaag catggttcta aaaaatgttg tacgtgaaac ggatgaagtt    15600

ggtaaaggtc agatccggat gagaactgtt tttgaacagg ccattgatca acgctcttca    15660

actggtgcct ggagaaatgc tctttctatt tgggaacctg tctgcaatga aattttcgat    15720

cgtctgatta aaccacgctg ggagattaga taatgaagcg tgcgcctgtt attccaaaac    15780

atacgctcaa tactcaaccg gttgaagata cttcgttatc gacaccagct gccccgatgg    15840

tggattcgtt aattgcgcgc gtaggagtaa tggctcgcgg taatgccatt actttgcctg    15900

tatgtggtcg ggatgtgaag tttactcttg aagtgctccg gggtgatagt gttgagaaga    15960

cctctcgggt atggtcaggt aatgaacgtg accaggagct gcttactgag gacgcactgg    16020

atgatctcat cccttctttt ctactgactg gtcaacagac accggcgttc ggtcgaagag    16080

tatctggtgt catagaaatt gccgatggga gtcgccgtcg taaagctgct gcacttaccg    16140

aaagtgatta tcgtgttctg gttggcgagc tggatgatga gcagatggct gcattatcca    16200

gattgggtaa cgattatcgc ccaacaagtg cttatgaacg tggtcagcgt tatgcaagcc    16260

gattgcagaa tgaatttgct ggaaatattt ctgcgctggc tgatgcggaa aatatttcac    16320

gtaagattat tacccgctgt atcaacaccg ccaaattgcc taaatcagtt gttgctcttt    16380

tttctcaccc cggtgaacta tctgcccggt caggtgatgc acttcaaaaa gcctttacag    16440

ataaagagga attacttaag cagcaggcat ctaaccttca tgagcagaaa aaagctgggg    16500

tgatatttga agctgaagaa gttatcactc ttttaacttc tgtgcttaaa acgtcatctg    16560

catcaagaac tagtttaagc tcacgacatc agtttgctcc tggagcgaca gtattgtata    16620

agggcgataa aatggtgctt aacctggaca ggtctcgtgt tccaactgag tgtatagaga    16680

aaattgaggc cattcttaag gaacttgaaa agccagcacc ctgatgcgac cacgttttag    16740

tctacgttta tctgtcttta cttaatgtcc tttgttacag gccagaaagc ataactggcc    16800

tgaatattct ctctgggccc actgttccac ttgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg    16860

accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt    16920

atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgataat    16980

cagactggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccatggt    17040

cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg    17100

tctgattatt agtctggaac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg    17160

gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg atcccactcg    17220

tgttgtcggt ctgattatcg gtctgggacc acggtcccac ttgtattgtc gatcagacta    17280

tcagcgtgag actacgattc catcaatgcc tgtcaagggc aagtattgac atgtcgtcgt    17340

aacctgtaga acggagtaac ctcggtgtgc ggttgtatgc ctgctgtgga ttgctgctgt    17400

gtcctgctta tccacaacat tttgcgcacg gttatgtgga caaaatacct ggttacccag    17460

gccgtgccgg cacgttaacc gggctgcatc cgatgcaagt gtgtcgctgt cgacgagctc    17520

gcgagctcgg acatgaggtt gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt    17580

gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt    17640

tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt    17700

tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta    17760

tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt    17820

tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc    17880

ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc gtggaatgaa caatggaagt ccgagctcat    17940

cgctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttcgatgcgg cgctgaggtc    18000

tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc    18060

agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt    18120

tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct    18180

tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccacgt gtctcaaaat ctctgatgtt    18240

acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca    18300

gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg acgatgataa    18360

gctgtcaaac atgagaattg ggtcgtcaat atgctaaaac gcggcatacc ccgcgtattc    18420

ccactagtta atcgtacgaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg    18480

atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct    18540

ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt    18600

gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct    18660

cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact    18720

tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc    18780

cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta    18840

atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt    18900

attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg cctgaataag tgataataag cggatgaatg    18960

gcagaaattc gatgataagc tgtcaaacat gagaattggt cgacggcccg ggcggctaga    19020

taatacgact cactatag                                                  19038

<210>47

<211>19038

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACt7/JVFLx/XhoI的序列

<400>47

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg    360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg    420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga    480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg    540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg    600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc     660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca     720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga     780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatctg tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca    7800

gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tcttgagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc    9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc    9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca    9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg    9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg    9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa     9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc     9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta     9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatctcg agcggccgcg    10980

gaccgactag cctcttttcg gccttcgctg agagggattt gttccctagg cctaattatt    11040

atttttaatt gcccaatacg tatacgagtg ccttttctaa ttctcgtata ctatagtgag    11100

tcgtattatc tagccgcccg ggccgtcgac caattctcat gtttgacagc ttatcatcga    11160

atttctgcca ttcatccgct tattatcact tattcaggcg tagcaaccag gcgtttaagg    11220

gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc agtactgttg    11280

taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa acggcatgat gaacctgaat    11340

cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat ttgcccatgg tgaaaacggg    11400

ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa ctggtgaaac tcacccaggg    11460

attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta gggaaatagg ccaggttttc    11520

accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac tgccggaaat cgtcgtggta    11580

ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt aacaagggtg    11640

aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc atacggaatt ccggatgagc    11700

attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa aacttgtgct tatttttctt    11760

tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc tggttatagg tacattgagc    11820

aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat tgggatatat caacggtggt    11880

atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct cctgaaaatc tcgataactc    11940

aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga aagttggaac ctcttacgtg    12000

ccgatcaacg tctcattttc gccaaaagtt ggcccagggc ttcccggtat caacagggac    12060

accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca ggtatttatt cgcgataagc    12120

tcatggagcg gcgtaaccgt cgcacaggaa ggacagagaa agcgcggatc tgggaagtga    12180

cggacagaac ggtcaggacc tggattgggg aggcggttgc cgccgctgct gctgacggtg    12240

tgacgttctc tgttccggtc acaccacata cgttccgcca ttcctatgcg atgcacatgc    12300

tgtatgccgg tataccgctg aaagttctgc aaagcctgat gggacataag tccatcagtt    12360

caacggaagt ctacacgaag gtttttgcgc tggatgtggc tgcccggcac cgggtgcagt    12420

ttgcgatgcc ggagtctgat gcggttgcga tgctgaaaca attatcctga gaataaatgc    12480

cttggccttt atatggaaat gtggaactga gtggatatgc tgtttttgtc tgttaaacag    12540

agaagctggc tgttatccac tgagaagcga acgaaacagt cgggaaaatc tcccattatc    12600

gtagagatcc gcattattaa tctcaggagc ctgtgtagcg tttataggaa gtagtgttct    12660

gtcatgatgc ctgcaagcgg taacgaaaac gatttgaata tgccttcagg aacaatagaa    12720

atcttcgtgc ggtgttacgt tgaagtggag cggattatgt cagcaatgga cagaacaacc    12780

taatgaacac agaaccatga tgtggtctgt ccttttacag ccagtagtgc tcgccgcagt    12840

cgagcgacag ggcgaagccc tcgagtgagc gaggaagcac cagggaacag cacttatata    12900

ttctgcttac acacgatgcc tgaaaaaact tcccttgggg ttatccactt atccacgggg    12960

atatttttat aattattttt tttatagttt ttagatcttc ttttttagag cgccttgtag    13020

gcctttatcc atgctggttc tagagaaggt gttgtgacaa attgcccttt cagtgtgaca    13080

aatcaccctc aaatgacagt cctgtctgtg acaaattgcc cttaaccctg tgacaaattg    13140

ccctcagaag aagctgtttt ttcacaaagt tatccctgct tattgactct tttttattta    13200

gtgtgacaat ctaaaaactt gtcacacttc acatggatct gtcatggcgg aaacagcggt    13260

tatcaatcac aagaaacgta aaaatagccc gcgaatcgtc cagtcaaacg acctcactga    13320

ggcggcatat agtctctccc gggatcaaaa acgtatgctg tatctgttcg ttgaccagat    13380

cagaaaatct gatggcaccc tacaggaaca tgacggtatc tgcgagatcc atgttgctaa    13440

atatgctgaa atattcggat tgacctctgc ggaagccagt aaggatatac ggcaggcatt    13500

gaagagtttc gcggggaagg aagtggtttt ttatcgccct gaagaggatg ccggcgatga    13560

aaaaggctat gaatcttttc cttggtttat caaacgtgcg cacagtccat ccagagggct    13620

ttacagtgta catatcaacc catatctcat tcccttcttt atcgggttac agaaccggtt    13680

tacgcagttt cggcttagtg aaacaaaaga aatcaccaat ccgtatgcca tgcgtttata    13740

cgaatccctg tgtcagtatc gtaagccgga tggctcaggc atcgtctctc tgaaaatcga    13800

ctggatcata gagcgttacc agctgcctca aagttaccag cgtatgcctg acttccgccg    13860

ccgcttcctg caggtctgtg ttaatgagat caacagcaga actccaatgc gcctctcata    13920

cattgagaaa aagaaaggcc gccagacgac tcatatcgta ttttccttcc gcgatatcac    13980

ttccatgacg acaggatagt ctgagggtta tctgtcacag atttgagggt ggttcgtcac    14040

atttgttctg acctactgag ggtaatttgt cacagttttg ctgtttcctt cagcctgcat    14100

ggattttctc atactttttg aactgtaatt tttaaggaag ccaaatttga gggcagtttg    14160

tcacagttga tttccttctc tttcccttcg tcatgtgacc tgatatcggg ggttagttcg    14220

tcatcattga tgagggttga ttatcacagt ttattactct gaattggcta tccgcgtgtg    14280

tacctctacc tggagttttt cccacggtgg atatttcttc ttgcgctgag cgtaagagct    14340

atctgacaga acagttcttc tttgcttcct cgccagttcg ctcgctatgc tcggttacac    14400

ggctgcggcg agcgctagtg ataataagtg actgaggtat gtgctcttct tatctccttt    14460

tgtagtgttg ctcttatttt aaacaacttt gcggtttttt gatgactttg cgattttgtt    14520

gttgctttgc agtaaattgc aagatttaat aaaaaaacgc aaagcaatga ttaaaggatg    14580

ttcagaatga aactcatgga aacacttaac cagtgcataa acgctggtca tgaaatgacg    14640

aaggctatcg ccattgcaca gtttaatgat gacagcccgg aagcgaggaa aataacccgg    14700

cgctggagaa taggtgaagc agcggattta gttggggttt cttctcaggc tatcagagat    14760

gccgagaaag cagggcgact accgcacccg gatatggaaa ttcgaggacg ggttgagcaa    14820

cgtgttggtt atacaattga acaaattaat catatgcgtg atgtgtttgg tacgcgattg    14880

cgacgtgctg aagacgtatt tccaccggtg atcggggttg ctgcccataa aggtggcgtt    14940

tacaaaacct cagtttctgt tcatcttgct caggatctgg ctctgaaggg gctacgtgtt    15000

ttgctcgtgg aaggtaacga cccccaggga acagcctcaa tgtatcacgg atgggtacca    15060

gatcttcata ttcatgcaga agacactctc ctgcctttct atcttgggga aaaggacgat    15120

gtcacttatg caataaagcc cacttgctgg ccggggcttg acattattcc ttcctgtctg    15180

gctctgcacc gtattgaaac tgagttaatg ggcaaatttg atgaaggtaa actgcccacc    15240

gatccacacc tgatgctccg actggccatt gaaactgttg ctcatgacta tgatgtcata    15300

gttattgaca gcgcgcctaa cctgggtatc ggcacgatta atgtcgtatg tgctgctgat    15360

gtgctgattg ttcccacgcc tgctgagttg tttgactaca cctccgcact gcagtttttc    15420

gatatgcttc gtgatctgct caagaacgtt gatcttaaag ggttcgagcc tgatgtacgt    15480

attttgctta ccaaatacag caatagtaat ggctctcagt ccccgtggat ggaggagcaa    15540

attcgggatg cctggggaag catggttcta aaaaatgttg tacgtgaaac ggatgaagtt    15600

ggtaaaggtc agatccggat gagaactgtt tttgaacagg ccattgatca acgctcttca    15660

actggtgcct ggagaaatgc tctttctatt tgggaacctg tctgcaatga aattttcgat    15720

cgtctgatta aaccacgctg ggagattaga taatgaagcg tgcgcctgtt attccaaaac    15780

atacgctcaa tactcaaccg gttgaagata cttcgttatc gacaccagct gccccgatgg    15840

tggattcgtt aattgcgcgc gtaggagtaa tggctcgcgg taatgccatt actttgcctg    15900

tatgtggtcg ggatgtgaag tttactcttg aagtgctccg gggtgatagt gttgagaaga    15960

cctctcgggt atggtcaggt aatgaacgtg accaggagct gcttactgag gacgcactgg    16020

atgatctcat cccttctttt ctactgactg gtcaacagac accggcgttc ggtcgaagag    16080

tatctggtgt catagaaatt gccgatggga gtcgccgtcg taaagctgct gcacttaccg    16140

aaagtgatta tcgtgttctg gttggcgagc tggatgatga gcagatggct gcattatcca    16200

gattgggtaa cgattatcgc ccaacaagtg cttatgaacg tggtcagcgt tatgcaagcc    16260

gattgcagaa tgaatttgct ggaaatattt ctgcgctggc tgatgcggaa aatatttcac    16320

gtaagattat tacccgctgt atcaacaccg ccaaattgcc taaatcagtt gttgctcttt    16380

tttctcaccc cggtgaacta tctgcccggt caggtgatgc acttcaaaaa gcctttacag    16440

ataaagagga attacttaag cagcaggcat ctaaccttca tgagcagaaa aaagctgggg    16500

tgatatttga agctgaagaa gttatcactc ttttaacttc tgtgcttaaa acgtcatctg    16560

catcaagaac tagtttaagc tcacgacatc agtttgctcc tggagcgaca gtattgtata    16620

agggcgataa aatggtgctt aacctggaca ggtctcgtgt tccaactgag tgtatagaga    16680

aaattgaggc cattcttaag gaacttgaaa agccagcacc ctgatgcgac cacgttttag    16740

tctacgttta tctgtcttta cttaatgtcc tttgttacag gccagaaagc ataactggcc    16800

tgaatattct ctctgggccc actgttccac ttgtatcgtc ggtctgataa tcagactggg    16860

accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct gggaccacgg tcccactcgt    16920

atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cggtcccact cgtatcgtcg gtctgataat    16980

cagactggga ccacggtccc actcgtatcg tcggtctgat tattagtctg ggaccatggt    17040

cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc gtatcgtcgg    17100

tctgattatt agtctggaac cacggtccca ctcgtatcgt cggtctgatt attagtctgg    17160

gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccacg atcccactcg    17220

tgttgtcggt ctgattatcg gtctgggacc acggtcccac ttgtattgtc gatcagacta    17280

tcagcgtgag actacgattc catcaatgcc tgtcaagggc aagtattgac atgtcgtcgt    17340

aacctgtaga acggagtaac ctcggtgtgc ggttgtatgc ctgctgtgga ttgctgctgt    17400

gtcctgctta tccacaacat tttgcgcacg gttatgtgga caaaatacct ggttacccag    17460

gccgtgccgg cacgttaacc gggctgcatc cgatgcaagt gtgtcgctgt cgacgagctc    17520

gcgagctcgg acatgaggtt gccccgtatt cagtgtcgct gatttgtatt gtctgaagtt    17580

gtttttacgt taagttgatg cagatcaatt aatacgatac ctgcgtcata attgattatt    17640

tgacgtggtt tgatggcctc cacgcacgtt gtgatatgta gatgataatc attatcactt    17700

tacgggtcct ttccggtgat ccgacaggtt acggggcggc gacctcgcgg gttttcgcta    17760

tttatgaaaa ttttccggtt taaggcgttt ccgttcttct tcgtcataac ttaatgtttt    17820

tatttaaaat accctctgaa aagaaaggaa acgacaggtg ctgaaagcga gctttttggc    17880

ctctgtcgtt tcctttctct gtttttgtcc gtggaatgaa caatggaagt ccgagctcat    17940

cgctaataac ttcgtatagc atacattata cgaagttata ttcgatgcgg cgctgaggtc    18000

tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca tcatccagcc    18060

agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag ttggtgattt    18120

tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg atctgatcct    18180

tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccacgt gtctcaaaat ctctgatgtt    18240

acattgcaca agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca    18300

gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctcg acgatgataa    18360

gctgtcaaac atgagaattg ggtcgtcaat atgctaaaac gcggcatacc ccgcgtattc    18420

ccactagtta atcgtacgaa ttccgtatgg caatgaaaga cggtgagctg gtgatatggg    18480

atagtgttca cccttgttac accgttttcc atgagcaaac tgaaacgttt tcatcgctct    18540

ggagtgaata ccacgacgat ttccggcagt ttctacacat atattcgcaa gatgtggcgt    18600

gttacggtga aaacctggcc tatttcccta aagggtttat tgagaatatg tttttcgtct    18660

cagccaatcc ctgggtgagt ttcaccagtt ttgatttaaa cgtggccaat atggacaact    18720

tcttcgcccc cgttttcacc atgggcaaat attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc    18780

cgctggcgat tcaggttcat catgccgttt gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta    18840

atgaattaca acagtactgc gatgagtggc agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt    18900

attggtgccc ttaaacgcct ggttgctacg cctgaataag tgataataag cggatgaatg    18960

gcagaaattc gatgataagc tgtcaaacat gagaattggt cgacggcccg ggcggctaga    19020

taatacgact cactatag                                                  19038

<210>48

<211>19040

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pBACt7/JVFLx/XbaI的序列

<400>48

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt     60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg    120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg    180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgg acggcagagg accagtacgt ttcgtgctgg    240

ctcttatcac gttcttcaag tttacagcat tagccccgac caaggcgctt ttaggccgat    300

ggaaagcagt ggaaaagagt gtggcaatga aacatcttac tagtttcaaa cgagaacttg     360

gaacactcat tgacgccgtg aacaagcggg gcagaaagca aaacaaaaga ggaggaaatg     420

aaggctcaat catgtggctc gcgagtttgg cagttgtcat agcttgtgta ggagccatga     480

agttgtcaaa tttccaaggg aagcttttga tgaccattaa caacacggac attgcagacg     540

tcatcgtgat tcctacctca aaaggagaga acagatgctg ggtccgggca atcgatgtcg     600

gctacatgtg tgaggacact atcacgtacg aatgtcctaa gcttaccatg ggcaatgatc     660

cagaggatgt ggattgctgg tgtgacaacc aagaagtcta cgtccaatat ggacggtgca     720

cgcggaccag gcattccaag cgaagcagga ggtccgtgtc ggtccaaaca catggggaga     780

gttcactagt gaataaaaaa gaggcttggc tggattcaac gaaagccaca cgatatctca     840

tgaaaactga gaactggatc ataaggaatc ctggctatgc tttcctggcg gcggtacttg     900

gctggatgct tggcagtaac aatggtcaac gcgtggtgtt taccatcctc ctgctgttgg     960

tcgctccggc ttacagtttt aattgtctgg gaatgggcaa ccgtgacttc atagaaggag    1020

ccagtggagc cacttgggtg gacttagtgc tagaaggaga tagctgcttg acaatcatgg    1080

caaacgacaa accaacattg gacgtccgca tgattaacat cgaagccagc caacttgctg    1140

aggtcagaag ctactgctat catgcttcag tcactgacat ctcgacggtg gctcggtgcc    1200

ccacgactgg agaagcccac aacgagaagc gagctgatag tagctatgtg tgcaaacaag    1260

gtttcactga tcgtgggtgg ggcaacggat gtggactttt cgggaaggga agcattgaca    1320

catgtgcaaa attctcctgc accagtaagg cgattgggag aacaatccag ccagaaaaca    1380

tcaaatacga agttggcatt tttgtgcatg gaaccaccac ctcggaaaac catgggaatt    1440

attcagcgca agtaggggcg tcccaggcgg caaagtttac agtaacaccc aatgctcctt    1500

cgataaccct caaacttggt gactacggag aagtcacact ggactgtgaa ccaaggagtg    1560

gactgaacac tgaagcgttt tacgtcatga ccgtggggtc aaagtcattt ctggtccata    1620

gggaatggtt tcatgacctc gctctcccct ggacgtcccc ttcgagcaca gcgtggagaa    1680

acagagaact cctcatggaa tttgaagagg cgcacgccac aaaacagtcc gttgttgctc    1740

ttgggtcaca ggaaggaggc ctccatcagg cgctggcagg agccatcgtg gtggagtact    1800

caagctcagt gaagttaaca tcaggccacc tgaaatgtag gctgaaaatg gacaaactgg    1860

ctctgaaagg cacaacctat ggcatgtgta cagaaaaatt ctcgttcgcg aaaaatccgg    1920

cggacactgg ccacggaaca gttgtcattg aactctccta ttctgggagt gatggcccct    1980

gcaaaattcc gattgtctcc gttgcgagcc tcaatgacat gacccccgtt gggcggctgg    2040

tgacagtgaa ccccttcgtc gcgacttcca gtgccaactc aaaggtgctg gtcgagatgg    2100

aacccccctt cggagactcc tacatcgtag ttggaagggg agacaagcag atcaaccacc    2160

attggcataa agctggaagc acgctgggca aggctttttc aacaactttg aagggagctc    2220

aaagactggc agcgttgggc gacacagcct gggactttgg ctctattgga ggggtcttca    2280

actccatagg aaaggccgtt caccaagtgt ttggtggcgc tttcagaaca ctctttgggg    2340

gaatgtcttg gatcacacaa gggttaatgg gtgccctact actctggatg ggcatcaacg    2400

cacgagatcg atcaattgct ttggccttct tggccacagg aggtgtgctc gtgttcttag    2460

cgaccaatgt gcatgctgac actggatgtg ccattgacat cgcaagaaaa gagatgagat    2520

gcggaagtgg catcttcgtg cacaacgacg tggaagcctg ggtggatagg tataaatatt    2580

tgccagaaac gcccagatcc ctagcgaaga tcgtccacaa agcgcacaag gaaggcgtgt    2640

gcggagtcag atctgtcact agactggagc accaaatgtg ggaagccgtg cgggacgaat    2700

tgaacgtcct gctcaaagag aatgcagtgg acctcagtgt ggttgtgaac aagcccgtgg    2760

ggagatatcg ctcagcccca aaacgcctgt ccatgacgca agagaagttt gaaatgggct    2820

ggaaagcatg gggaaaaagc attctctttg ccccggaatt ggctaactcc acatttgttg    2880

tagatggacc tgagacaaag gaatgtcctg atgagcacag agcctggaac agcatgcaaa    2940

tcgaagactt cggctttggt atcacatcaa cccgtgtgtg gctgaagatt agagaggaaa    3000

gcactgacga gtgtgatgga gcgatcatag gcacagctgt caaaggacat gtggcagttc    3060

atagtgactt gtcgtactgg attgagagtc gctacaacga cacatggaaa cttgagaggg    3120

cagtctttgg agaggtcaaa tcttgcactt ggccagagac acacactctt tggggagatg    3180

gtgttgagga aagtgaactc atcatcccgc ataccatagc cggaccaaaa agcaagcaca    3240

atcggaggga agggtacaaa acacaaaacc agggaccttg ggacgaaaac ggcatagtct    3300

tggactttga ttattgccca gggacaaaag tcaccatcac agaggattgt ggcaagagag    3360

gcccttcggt cagaaccact actgacagtg gaaagttgat tactgactgg tgctgtcgca    3420

gttgctccct tccgccccta cgattccgga cagaaaatgg ctgctggtac ggaatggaaa    3480

tcagacctgt taggcatgat gaaacaacac tcgtcagatc acaggttgat gctttcaatg    3540

gtgaaatggt tgaccctttt cagctgggcc ttctggtgat gtttctggcc acccaggagg    3600

tccttcgcaa gaggtggacg gccagattga ccattcctgc ggttttgggg gccctgcttg    3660

tgctgatgct tgggggcatc acttacactg atttggcgag gtatgtggtg ctagtcgctg    3720

ctgctttcgc agaggccaat aatggaggag acgtcctgca ccttgctttg attgccgttt    3780

ttaagatcca accagctttt ctagtgatga acatgcttag cacgagatgg acgaaccaag    3840

aaaacgtggt cctggtccta ggggctgcct tctttcaatt ggcctcagta gatctgcaaa    3900

tcggagtcca cggaatcctg aatgccgccg ctatagcatg gatgattgtt cgagcgatca    3960

ccttccccac aacctcctcc gtcaccatgc cagtcttagc gcttctaact ccgggaatga    4020

gggctctata cctagacact tacagaatca tccttctcgt catagggatt tgctccctgc    4080

tgcaagagag gaaaaagacc atggcaaaaa agaaaggagc tgtactcttg ggcttagcgc    4140

tcacatccac tggatggttc tcgcccacca ccatagctgc tggactaatg gtctgcaacc    4200

caaacaagaa gagagggtgg ccagctactg agtttctgtc ggcagtcgga ttgatgtttg    4260

ccatcgtagg tggtttggcc gagttggata ttgaatccat gtcaataccc ttcatgctgg    4320

caggtcttat ggcagtgtcc tacgtagtgt caggaaaagc aacagatatg tggctcgaac    4380

gggccgccga catcagctgg gagatggatg ctgcaatcac aggaagcagt cggaggctgg    4440

atgtgaaact ggatgatgac ggagattttc acttgattga tgatcccggc gttccatgga    4500

aagtttgggt cttgcgcatg tcttgcattg gcttagccgc cctcacgcct tgggccattg    4560

ttcccgccgc tttcggttac tggctcactt taaaaacaac aaaaagaggg ggcgtgtttt    4620

gggacacgcc atccccgaaa ccttgcttaa aaggagacac cactacagga gtctaccgaa    4680

tcatggctag agggattctt ggcacctacc aggctggcgt cggagtcatg tacgagaatg    4740

ttttccacac actatggcac acaactagag gggcagccat tatgagtgga gaaggaaaat    4800

tgacgccata ctggggtagc gtgaaagaag accgcatagc ttacggaggc ccatggagat    4860

ttgatcgaaa atggaatgga acagatgacg tgcaagtgat cgtggtagaa ccggggaagg    4920

ctgcggtaaa catccagaca aaaccaggag tgtttcggac ccccttcggg gaggttgggg    4980

ctgttagcct ggattacccg cgaggaacat ccggctcacc cattctggat tccaatggag    5040

acatcatagg cctatacggc aatggagttg agcttggcga tggctcatac gtcagcgcca    5100

tcgtgcaggg tgaccgtcag gaggaaccag tcccagaagc ttacactcca aacatgttaa    5160

gaaagagaca gatgactgtg ttagatttgc accctggttc agggaaaacc aggaaaattc    5220

tgccacaaat aattaaggat gcaatccagc agcgcctaag aacagctgtg ttggcaccga    5280

cgcgggtggt agcagcagaa atggcagaag ctttgagagg gctcccagta cgataccaaa    5340

cttcagcagt gcagagagag caccaaggga atgaaatagt ggatgtgatg tgccacgcca    5400

ctctgaccca cagattgatg tcaccgaaca gagtgcccaa ctacaatctg tttgtcatgg    5460

atgaagctca tttcaccgac ccagccagca tagccgcacg aggatacatc gctaccaagg    5520

tggaattagg agaggcagca gccatcttta tgacagcgac cccgcctgga accacggatc    5580

cttttcccga ctcaaatgcc ccaatccatg atttacaaga tgagatacca gacagggcat    5640

ggagcagtgg atacgaatgg atcacagaat atgcgggtaa aaccgtgtgg tttgtggcga    5700

gcgtaaaaat ggggaatgag attgcaatgt gcctccaaag agcgggaaaa aaggtcatcc    5760

aactcaaccg caagtcctat gacacagaat acccaaaatg taagaatgga gactgggatt    5820

ttgtcattac caccgacatc tctgaaatgg gggctaactt cggtgcgagc agggtcatcg    5880

actgcagaaa gagcgtgaaa cccaccatct tagaagaggg agaaggcaga gtcatcctcg    5940

gaaacccatc tcccataacc agtgctagcg cagctcaacg gaggggcaga gtaggcagaa    6000

accccaacca agttggagat gaataccatt atggaggggc taccagtgaa gatgacagta    6060

acctagccca ttggacagag gcaaagatca tgttagacaa catacacatg cccaatgggc    6120

tggtggccca gctctatgga ccagagaggg aaaaggcttt cacaatggat ggcgaatacc    6180

gtctcagggg tgaagaaaag aaaaacttct tagagctgct taggacggct gaccttccgg    6240

tgtggctggc ctataaggtg gcgtccaatg gcattcagta caccgacaga aagtggtgtt    6300

ttgatgggcc gcgcacgaat gccatactgg aggacaacac cgaggtagag atagtcaccc    6360

ggatgggtga gagaaagatc ctcaagccga gatggcttga tgcaagagta tacgcagatc    6420

accaagccct caagtggttc aaagactttg cagcaggaaa gagatcggcc gttagcttca    6480

tagaggtgct cggtcgcatg cctgagcatt tcatgggaaa gacgcgggaa gctttagaca    6540

ccatgtactt ggtcgcaacg gctgagaaag gtgggaaggc acaccgaatg gctctcgaag    6600

agttgccgga tgcactggaa accatcacac ttattgttgc catcactgta atgacaggag    6660

gattcttcct actaatgatg cagcgaaagg gtatagggaa gatgggtctt ggagctctag    6720

tgctcacgct agctaccttc ttcctgtggg cggcagaggt tcctggaacc aaaatagcag    6780

ggaccctgct gatcgccctg ctgctgatgg tggttctcat cccagaaccg gaaaaacaga    6840

ggtcacagac agacaaccaa ctagcggtgt ttctcatctg cgtcttgacc gtggttggag    6900

tggtggcagc aaacgagtac gggatgctag aaaaaaccaa agcagatctc aagagcatgt    6960

ttggcggaaa gacacaggca tcaggactga ctggattgcc aagcatggca ctggacctgc    7020

gtccagccac agcctgggca ctgtatgggg ggagcacagt tgtgctaacc cctcttctga    7080

agcacctgat cacgtcggaa tatgtcacca catcgctagc ctcaattaac tcacaagctg    7140

gctcattatt cgtcttgcca cgaggcgtgc ctttcaccga tctagacctg accgttggcc    7200

tcgtcttcct tggctgctgg ggtcaaatca ccctcacaac gtttttgaca gccatggttc    7260

tggcgacact tcactatggg tacatgctcc ctggatggca agcagaagca ctcagggctg    7320

cccagagaag gacggcggct ggaataatga agaatgccgt tgttgacgga atggtcgcca    7380

ctgatgtgcc tgaactggaa aggactactc ctctgatgca aaagaaagtc ggacaggtgc    7440

tcctcatagg ggtgagcgtg gcagcgtttc tcgtcaaccc taatgtcacc actgtgagag    7500

aagcaggggt gttggtgacg gcggctacgc tcaccttgtg ggataatgga gccagtgccg    7560

tttggaattc caccacagcc acgggactct gccatgtcat gcgaggtagc tacctggctg    7620

gaggctctat tgcttggact cttatcaaga acgctgacaa gccctccttg aaaaggggaa    7680

ggcctggggg caggacgcta ggggagcagt ggaaggaaaa actaaatgcc atgagcagag    7740

aagagttttt taaataccgg agagaggcca taatcgaggt ggaccgcact gaagcacgca    7800

gggctagacg tgaaaataac atagtgggag gacatccggt ttcgcgaggc tcagcaaaac    7860

tccgttggct cgtggagaaa ggattcgtct cgccaatagg aaaagtcatt gatctagggt    7920

gtgggcgtgg aggatggagc tactacgcag caaccctgaa gaaggtccag gaagtcagag    7980

gatacacgaa aggtggggcg ggacatgaag agccgatgct catgcagagc tacggctgga    8040

acctggtctc cttgaagagt ggagtggatg tgttctacaa accttcagag cctagtgaca    8100

ccctgttctg tgacataggg gaatcctccc caagtccaga agtggaagaa caacgcacac    8160

tacgcgtcct agagatgaca tccgattggt tgcatcgagg acccagagag ttctgcataa    8220

aagttctctg cccttacatg cccaaggtca tagaaaaaat ggaagttctg cagcgccgct    8280

tcggaggtgg gctagtacgt ctccccctgt cccgaaactc caatcacgag atgtattggg    8340

ttagtggagc cgctggcaat gtggtgcacg ctgtgaacat gaccagccag gtactactgg    8400

ggcgaatgga tcgcacagtg tggagagggc caaagtatga ggaagatgtc aacctaggta    8460

gcggaacaag agccgtggga aagggagaag ttcatagcaa tcaggagaaa atcaagaaga    8520

gaatccagaa gcttaaagaa gaattcgcca caacgtggca caaagaccct gaacacccat    8580

accgcacttg gacataccac ggaagctatg aggtgaaggc tactggctca gccagctctc    8640

tcgtcaacgg agtggtgaag ctcatgagta aaccttggga cgccattgcc aacgtcacca    8700

ccatggccat gactgacacc accccttttg gacagcaaag agttttcaag gagaaagttg    8760

acacgaaagc tcctgagcca ccagctggag tcaaggaagt gctcaacgag accaccaact    8820

ggctgtgggc ccacttgtca cgggaaaaaa gaccccgctt gtgcaccaag gaagaattta    8880

taaagaaagt caatagcaac gcggctcttg gagcagtgtt tgctgaacag aatcaatgga    8940

gcacggcgcg tgaggctgtg gacgacccgc ggttttggga gatggtcaat gaagagaggg    9000

aaaaccatct gcgaggagag tgtcacacat gtatctacaa catgatggga aaaagagaga    9060

agaagcctgg agagtttgga aaagctaaag ggagcagggc catttggttc atgtggcttg    9120

gagcacggta tcttgagttt gaagctttgg ggttcctgaa tgaagaccac tggctgagcc     9180

gagagaattc aggaggtgga gtagaaggct caggcgtcca aaagttggga tacatcctcc     9240

gtgacatagc aggaaagcaa ggagggaaaa tgtacgctga tgacaccgcc gggtgggaca     9300

ctagaattac tagaactgat ttagaaaatg aagctaaggt gctggagctc ctagatggtg     9360

aacaccgcat gctcgcccgg gccataattg aactgactta caggcacaaa gtggtcaagg     9420

tcatgagacc tgcagcagaa ggaaagaccg tgatggacgt gatatcaaga gaagaccaaa     9480

gggggagtgg acaggtggtc acttatgctc tcaacacttt cacgaacatc gctgtccagc     9540

tcgttaggct gatggaggct gagggggtca ttgggccaca acacttggaa cagctgccta     9600

ggaaaaacaa gatagctgtc aggacttggc tctttgagaa tggagaggag agagtgacca     9660

ggatggcgat cagcggagac gactgtgtcg tcaagccgct ggacgacaga ttcgccacgg     9720

ccctccattt cctcaacgca atgtcaaagg ttagaaaaga catccaggaa tggaagcctt     9780

cgcacggctg gcacgattgg cagcaagttc ccttctgctc taaccacttt caggagattg     9840

tgatgaaaga cggaaggagt atagttgtcc cgtgcagagg acaggatgag ctgataggca     9900

gggctcgcat ctctccagga gctggatgga atgtgaagga cacagcttgc ctggcaaaag     9960

catatgcaca gatgtggcta ctcctatact tccatcgtag ggacctgcgt ctcatggcaa    10020

atgcgatttg ctcagcagtg ccagtggatt gggtgcccac aggcaggaca tcctggtcaa    10080

tacactcgaa aggagagtgg atgaccacgg aagacatgct gcaggtctgg aacagagtct    10140

ggattgaaga aaatgaatgg atgatggata agactcccgt cacaagctgg acagacgttc    10200

cgtatgtggg aaagcgtgag gacatctggt gtggcagcct catcggaacg cgttccagag    10260

caacctgggc tgagaacatc tatgcggcga taaaccaggt tagagctgtc attgggaaag    10320

aaaattatgt tgactacatg acctcactca ggagatacga agacgtcttg atccaggaag    10380

acagggtcat ctagtgtgac ttaaggtaga aatgtaaata atgtgaatga gaaaatgcat    10440

gtatatggag tcaggccagc aaaagctgcc accggatact gggtagacgg tgctgcctgc    10500

gtctcagtcc caggaggact gggttaacaa atctgacaac agaaagtgag aaagccctca    10560

gaaccgtctc ggaagtaggt ccctgctcac tggaagttga aagaccaacg tcaggccacg    10620

aatttgtgcc actccgctgg ggagtgcggc ctgcgcagcc ccaggaggac tgggttacca    10680

aagccgttga ggcccccacg gcccaagcct cgtctaggat gcaatagacg aggtgtaagg    10740

actagaggtt agaggagacc ccgtggaaac aacaacatgc ggcccaagcc ccctcgaagc    10800

tgtagaggag gtggaaggac tagaggttag aggagacccc gcatttgcat caaacagcat    10860

attgacacct gggaatagac tgggagatct tctgctctat ctcaacatca gctactaggc    10920

acagagcgcc gaagtatgta gctggtggtg aggaagaaca caggatctct agagcggccg    10980

cggaccgact agcctctttt cggccttcgc tgagagggat ttgttcccta ggcctaatta    11040

ttatttttaa ttgcccaata cgtatacgag tgccttttct aattctcgta tactatagtg    11100

agtcgtatta tctagccgcc cgggccgtcg accaattctc atgtttgaca gcttatcatc    11160

gaatttctgc cattcatccg cttattatca cttattcagg cgtagcaacc aggcgtttaa    11220

gggcaccaat aactgcctta aaaaaattac gccccgccct gccactcatc gcagtactgt    11280

tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac aaacggcatg atgaacctga    11340

atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat ggtgaaaacg    11400

ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa actcacccag    11460

ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata ggccaggttt    11520

tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa atcgtcgtgg    11580

tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt gtaacaaggg    11640

tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa ttccggatga    11700

gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg cttatttttc    11760

tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata ggtacattga    11820

gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat atcaacggtg    11880

gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa tctcgataac    11940

tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga acctcttacg    12000

tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt atcaacaggg    12060

acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta ttcgcgataa    12120

gctcatggag cggcgtaacc gtcgcacagg aaggacagag aaagcgcgga tctgggaagt    12180

gacggacaga acggtcagga cctggattgg ggaggcggtt gccgccgctg ctgctgacgg    12240

tgtgacgttc tctgttccgg tcacaccaca tacgttccgc cattcctatg cgatgcacat    12300

gctgtatgcc ggtataccgc tgaaagttct gcaaagcctg atgggacata agtccatcag    12360

ttcaacggaa gtctacacga aggtttttgc gctggatgtg gctgcccggc accgggtgca    12420

gtttgcgatg ccggagtctg atgcggttgc gatgctgaaa caattatcct gagaataaat    12480

gccttggcct ttatatggaa atgtggaact gagtggatat gctgtttttg tctgttaaac    12540

agagaagctg gctgttatcc actgagaagc gaacgaaaca gtcgggaaaa tctcccatta    12600

tcgtagagat ccgcattatt aatctcagga gcctgtgtag cgtttatagg aagtagtgtt    12660

ctgtcatgat gcctgcaagc ggtaacgaaa acgatttgaa tatgccttca ggaacaatag    12720

aaatcttcgt gcggtgttac gttgaagtgg agcggattat gtcagcaatg gacagaacaa    12780

cctaatgaac acagaaccat gatgtggtct gtccttttac agccagtagt gctcgccgca    12840

gtcgagcgac agggcgaagc cctcgagtga gcgaggaagc accagggaac agcacttata    12900

tattctgctt acacacgatg cctgaaaaaa cttcccttgg ggttatccac ttatccacgg    12960

ggatattttt ataattattt tttttatagt ttttagatct tcttttttag agcgccttgt    13020

aggcctttat ccatgctggt tctagagaag gtgttgtgac aaattgccct ttcagtgtga    13080

caaatcaccc tcaaatgaca gtcctgtctg tgacaaattg cccttaaccc tgtgacaaat    13140

tgccctcaga agaagctgtt ttttcacaaa gttatccctg cttattgact cttttttatt    13200

tagtgtgaca atctaaaaac ttgtcacact tcacatggat ctgtcatggc ggaaacagcg    13260

gttatcaatc acaagaaacg taaaaatagc ccgcgaatcg tccagtcaaa cgacctcact    13320

gaggcggcat atagtctctc ccgggatcaa aaacgtatgc tgtatctgtt cgttgaccag    13380

atcagaaaat ctgatggcac cctacaggaa catgacggta tctgcgagat ccatgttgct    13440

aaatatgctg aaatattcgg attgacctct gcggaagcca gtaaggatat acggcaggca    13500

ttgaagagtt tcgcggggaa ggaagtggtt ttttatcgcc ctgaagagga tgccggcgat    13560

gaaaaaggct atgaatcttt tccttggttt atcaaacgtg cgcacagtcc atccagaggg    13620

ctttacagtg tacatatcaa cccatatctc attcccttct ttatcgggtt acagaaccgg    13680

tttacgcagt ttcggcttag tgaaacaaaa gaaatcacca atccgtatgc catgcgttta    13740

tacgaatccc tgtgtcagta tcgtaagccg gatggctcag gcatcgtctc tctgaaaatc    13800

gactggatca tagagcgtta ccagctgcct caaagttacc agcgtatgcc tgacttccgc    13860

cgccgcttcc tgcaggtctg tgttaatgag atcaacagca gaactccaat gcgcctctca    13920

tacattgaga aaaagaaagg ccgccagacg actcatatcg tattttcctt ccgcgatatc    13980

acttccatga cgacaggata gtctgagggt tatctgtcac agatttgagg gtggttcgtc    14040

acatttgttc tgacctactg agggtaattt gtcacagttt tgctgtttcc ttcagcctgc    14100

atggattttc tcatactttt tgaactgtaa tttttaagga agccaaattt gagggcagtt    14160

tgtcacagtt gatttccttc tctttccctt cgtcatgtga cctgatatcg ggggttagtt    14220

cgtcatcatt gatgagggtt gattatcaca gtttattact ctgaattggc tatccgcgtg    14280

tgtacctcta cctggagttt ttcccacggt ggatatttct tcttgcgctg agcgtaagag    14340

ctatctgaca gaacagttct tctttgcttc ctcgccagtt cgctcgctat gctcggttac    144O0

acggctgcgg cgagcgctag tgataataag tgactgaggt atgtgctctt cttatctcct    14460

tttgtagtgt tgctcttatt ttaaacaact ttgcggtttt ttgatgactt tgcgattttg    14520

ttgttgcttt gcagtaaatt gcaagattta ataaaaaaac gcaaagcaat gattaaagga    14580

tgttcagaat gaaactcatg gaaacactta accagtgcat aaacgctggt catgaaatga    14640

cgaaggctat cgccattgca cagtttaatg atgacagccc ggaagcgagg aaaataaccc    14700

ggcgctggag aataggtgaa gcagcggatt tagttggggt ttcttctcag gctatcagag    14760

atgccgagaa agcagggcga ctaccgcacc cggatatgga aattcgagga cgggttgagc    14820

aacgtgttgg ttatacaatt gaacaaatta atcatatgcg tgatgtgttt ggtacgcgat    14880

tgcgacgtgc tgaagacgta tttccaccgg tgatcggggt tgctgcccat aaaggtggcg    14940

tttacaaaac ctcagtttct gttcatcttg ctcaggatct ggctctgaag gggctacgtg    15000

ttttgctcgt ggaaggtaac gacccccagg gaacagcctc aatgtatcac ggatgggtac    15060

cagatcttca tattcatgca gaagacactc tcctgccttt ctatcttggg gaaaaggacg    15120

atgtcactta tgcaataaag cccacttgct ggccggggct tgacattatt ccttcctgtc    15180

tggctctgca ccgtattgaa actgagttaa tgggcaaatt tgatgaaggt aaactgccca    15240

ccgatccaca cctgatgctc cgactggcca ttgaaactgt tgctcatgac tatgatgtca    15300

tagttattga cagcgcgcct aacctgggta tcggcacgat taatgtcgta tgtgctgctg    15360

atgtgctgat tgttcccacg cctgctgagt tgtttgacta cacctccgca ctgcagtttt    15420

tcgatatgct tcgtgatctg ctcaagaacg ttgatcttaa agggttcgag cctgatgtac    15480

gtattttgct taccaaatac agcaatagta atggctctca gtccccgtgg atggaggagc    15540

aaattcggga tgcctgggga agcatggttc taaaaaatgt tgtacgtgaa acggatgaag    15600

ttggtaaagg tcagatccgg atgagaactg tttttgaaca ggccattgat caacgctctt    15660

caactggtgc ctggagaaat gctctttcta tttgggaacc tgtctgcaat gaaattttcg    15720

atcgtctgat taaaccacgc tgggagatta gataatgaag cgtgcgcctg ttattccaaa    15780

acatacgctc aatactcaac cggttgaaga tacttcgtta tcgacaccag ctgccccgat    15840

ggtggattcg ttaattgcgc gcgtaggagt aatggctcgc ggtaatgcca ttactttgcc    15900

tgtatgtggt cgggatgtga agtttactct tgaagtgctc cggggtgata gtgttgagaa    15960

gacctctcgg gtatggtcag gtaatgaacg tgaccaggag ctgcttactg aggacgcact    16020

ggatgatctc atcccttctt ttctactgac tggtcaacag acaccggcgt tcggtcgaag    16080

agtatctggt gtcatagaaa ttgccgatgg gagtcgccgt cgtaaagctg ctgcacttac    16140

cgaaagtgat tatcgtgttc tggttggcga gctggatgat gagcagatgg ctgcattatc    16200

cagattgggt aacgattatc gcccaacaag tgcttatgaa cgtggtcagc gttatgcaag    16260

ccgattgcag aatgaatttg ctggaaatat ttctgcgctg gctgatgcgg aaaatatttc    16320

acgtaagatt attacccgct gtatcaacac cgccaaattg cctaaatcag ttgttgctct    16380

tttttctcac cccggtgaac tatctgcccg gtcaggtgat gcacttcaaa aagcctttac    16440

agataaagag gaattactta agcagcaggc atctaacctt catgagcaga aaaaagctgg    16500

ggtgatattt gaagctgaag aagttatcac tcttttaact tctgtgctta aaacgtcatc    16560

tgcatcaaga actagtttaa gctcacgaca tcagtttgct cctggagcga cagtattgta    16620

taagggcgat aaaatggtgc ttaacctgga caggtctcgt gttccaactg agtgtataga    16680

gaaaattgag gccattctta aggaacttga aaagccagca ccctgatgcg accacgtttt    16740

agtctacgtt tatctgtctt tacttaatgt cctttgttac aggccagaaa gcataactgg    16800

cctgaatatt ctctctgggc ccactgttcc acttgtatcg tcggtctgat aatcagactg    16860

ggaccacggt cccactcgta tcgtcggtct gattattagt ctgggaccac ggtcccactc    16920

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atcagactgg gaccacggtc ccactcgtat cgtcggtctg attattagtc tgggaccatg    17040

gtcccactcg tatcgtcggt ctgattatta gtctgggacc acggtcccac tcgtatcgtc    17100

ggtctgatta ttagtctgga accacggtcc cactcgtatc gtcggtctga ttattagtct    17160

gggaccacgg tcccactcgt atcgtcggtc tgattattag tctgggacca cgatcccact    17220

cgtgttgtcg gtctgattat cggtctggga ccacggtccc acttgtattg tcgatcagac    17280

tatcagcgtg agactacgat tccatcaatg cctgtcaagg gcaagtattg acatgtcgtc    17340

gtaacctgta gaacggagta acctcggtgt gcggttgtat gcctgctgtg gattgctgct    17400

gtgtcctgct tatccacaac attttgcgca cggttatgtg gacaaaatac ctggttaccc    17460

aggccgtgcc ggcacgttaa ccgggctgca tccgatgcaa gtgtgtcgct gtcgacgagc    17520

tcgcgagctc ggacatgagg ttgccccgta ttcagtgtcg ctgatttgta ttgtctgaag    17580

ttgtttttac gttaagttga tgcagatcaa ttaatacgat acctgcgtca taattgatta    17640

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tttacgggtc ctttccggtg atccgacagg ttacggggcg gcgacctcgc gggttttcgc    17760

tatttatgaa aattttccgg tttaaggcgt ttccgttctt cttcgtcata acttaatgtt    17820

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ttacattgca caagataaaa atatatcatc atgaacaata aaactgtctg cttacataaa    18300

cagtaataca aggggtgtta tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct cgacgatgat    18360

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tcccactagt taatcgtacg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg    18480

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ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc    18600

gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt    18660

ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa    18720

cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat    18780

gccgctggcg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct    18840

taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag    18900

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<210>49

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<210>50

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<400>50

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<210>51

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<210>52

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<210>53

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DelF

<400>53

gatttaatta acctgcaggg ggctgtt                                          27

<210>54

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C1R

<400>54

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<210>55

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C2F

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<210>56

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物DelR

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<210>57

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物E2F

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<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物NS1F

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<210>64

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物RR

<400>64

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<210>65

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物JEVCF

<400>65

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<210>66

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物JEVER

<400>66

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<210>67

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物JEVNS1R

<400>67

gatgtttaaa ctattaagca tcaacctgtg a                                     31