1，4－萘二酚用于制备防治生殖道感染的外用杀精避孕药物用途

摘要

本发明公开了1，4－萘二酚用于制备防治生殖道感染的外用杀精避孕药物的用途，以及1，4－萘二酚制备成一种防治生殖道感染的外用杀精避孕药物，该药物具有消炎、避孕、改善性生活等三重功能。本发明首次将1，4－萘二酚开发为兼具抗生殖道感染的外用杀精子避孕药，该药具有杀精子作用强，比壬苯醇醚高25倍以上，对阴道正常的乳酸杆菌无抑制作用，对部分性传播性病菌具有防御作用，且具安全、高效、方便的特点。

说明书

                        技术领域

本发明属于医药卫生领域(计划生育避孕药品类)，特别涉及1，4-萘二酚(1，4-Naphthohydroquinone/1，4-Dihydroxynaphthalene，N)用于制备防治生殖道感染的外用杀精避孕药物的用途，及其该1，4-萘二酚制备的一种防治生殖道感染的外用杀精避孕药物——坤百康避孕霜(KBK)(制剂)。

                        背景技术

在现行的各种避孕措施中，虽然各具特点，但无论是宫内节育器、输卵管结扎和输精管结扎，还是激素类口服避孕药等，均存在着有创性或长期使用副作用大、使用不方便；既可能扰乱人体正常生理过程，又存在许多潜在的危险致病因素，特别是致畸、致癌性、STDs传播等。男性口服避孕药虽然可望成为有前景的避孕措施，但是要寻求一种有效、安全、易接受、可重复使用的男用避孕药要较女用避孕药更为困难。近年来男性避孕套(MC)与女性避孕套(FC)的使用虽然可以说得上是避孕技术的重大突破，但是由于其感官性状差，使用不方便、不舒适，或太昂贵而在普通人生活中很难得以推广。

在众多的节育方法中，阴道杀精避孕剂是最古老的一种避孕方法，近年来由于它不仅具有全身副反应小，局部副作用轻，价格低廉，应用方便，用法恰当，避孕效果也较满意等优点，而且能有效防止意外妊娠、预防STDs传播以及更适合于成年人和绝经前期妇女使用而又重新得到重视。

壬苯醇醚(NP-9)为世界卫生组织在全球唯一推广使用的一种外用杀精避孕药，虽然它的杀精子作用很强，但近年来许多研究证明它在体内存在肝-肠循环，具有体内蓄积性，对肝脏、肾脏均有毒性，且不具有防治生殖道感染的作用。2002年，Cochrane Library出版了一个所有可获得研究的荟萃分析，其结论是：NP-9可能有害，因为它使生殖道损害的发生率增加，因而可能增加STDs传播的可能性。WHO和CONRHD提出警告：含有NP-9的杀精子剂不能对HIV、淋病或衣原体的传播起到保护作用，经常使用这些产品的妇女可能增加罹患STDs的危险。单独使用NP-9对避孕只是中度有效，应该建议HIM感染的高危妇女不要用NP-9杀精剂避孕，除非不能获得其它的避孕方法。

另外，国内外虽然还有不少外用杀精子避孕药的其他报道，如中草药商陆皂甙、牛膝皂甙、猪胆汁(ZDZ)、乌梅、蛇床子、苦参碱以及西药醋酸苯汞、氯化苄乙氧胺、右旋心得安、鱼肝油酸钠、植物血细胞凝集素、酚醛、酚酮、酚酸类化合物、苯扎氯铵(BZN)、洗必泰(CH)、磺化聚苯乙烯及咪康唑等，但均处于实验研究中，且由于其毒副作用较大或杀精效力太低等原因，尚未见报道应用于临床。而且已知的阴道杀精子剂类避孕药对女性的阴道上皮细胞有一定的损坏作用，更多的还可影响阴道内的正常菌群。

总之，由于近年来我国未婚先孕妇女人数、人工流产率、生殖道感染率以及出生缺陷率呈急剧上升趋势。而且我国已婚育龄妇女的主要避孕方法为男性绝育(约占7.9％)和女性绝育(约占38.1％)及放置宫内节育器(约占45.6％)，而这三种避孕方法对于人们生殖健康的影响及其副作用是众所周知的。因此，能够研制出一种阴道耐受性好的新型杀精子避孕剂，或者若能将两种或两种以上该类药物联合应用制成复方配伍制剂，不仅可以增强其杀精子作用和预防STDs的作用，而且还可降低对阴道粘膜的刺激，从而对提高生殖健康水平，改善性生活质量具有十分重要的现实意义和极高的社会经济效益。

                        发明内容

本发明的一个目的是，提供1，4-萘二酚用于制备防治生殖道感染的外用杀精避孕药物的用途；

本发明的另一个目的是，将1，4-萘二酚制备成一种防治生殖道感染的外用杀精避孕药物，该药物具有消炎、避孕、改善性生活三重功能。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

申请人对1，4-萘二酚进行了临床前药物学、药代动力学、药效药理毒理学研究，根据研究结果证明，1，4-萘二酚能够用于制备防治生殖道感染的外用杀精避孕药物用途，而且杀精子作用比壬苯醇醚高25倍以上。

一种防治生殖道感染的外用杀精避孕药物，其特征在于，该药物主要原料药的有效成分为1，4-萘二酚，其结构式为：

化学分子式：C₁₀H₈O₂，分子量：M＝160。

其中C₁₀H₈O₂在药物中的标示量＞98.0％；mp：192℃-194℃；炽灼残渣＜0.1％；水份＜0.05％；在水中溶解度为0.04‰。

该药物与霜剂基质制成水包油型半粘稠流体样制剂，每支最小包装单位的体积为3ml，其中的药物含量为2mg，其余为霜剂基质。

所述的霜剂基质为硬脂酸甘油酯、硬脂酸、液状石蜡、白凡士林、羊毛脂与三乙醇胺、羧甲基纤维素钠盐(CMC-NA)、聚丙烯羧酸类高分子化合物(PA)和适量的蒸馏水构成。

本发明首次将1，4-萘二酚制备为兼具抗生殖道感染的外用杀精子避孕药，具有杀精子作用强，在药物使用浓度下对阴道正常的乳酸杆菌无抑制作用，对部分性传播性病菌具有防御作用，且具安全、高效、方便的特点。另外该药在阴道内可形成分子膜结构，不仅对粘膜起到机械屏障保护作用，可以阻滞N被粘膜吸收，而且可以限制精子运动并快速有效杀死精子。

                        附图说明

图1为本发明制备坤百康避孕霜(KBK)的制剂工艺流程图。

以下结合附图和主要药物学、药效学和药理学、毒理学试验报告对本发明作进一步的详细说明。

                      具体实施方式

申请人按照国家I类新药注册管理办法，将1，4-萘二酚制备成一种用于防治生殖道感染的外用杀精避孕药物——坤百康避孕霜(KBK)。

以下是坤百康避孕霜(KBK)的详细内容：

(一)坤百康避孕霜制剂原料药1，4-萘二酚的质量标准

1，4-萘二酚

Naierfen

1，4-Dihydroxynaphthalene

结构式：

化学反应式为：C₁₀H₈O₂分子量为：M＝160

本品为1，4-萘二酚(1，4-Dihydroxynaphthalene)，按干燥品计算，含(C₁₀H₈O₂)量不得少于98.0％。

【性状】本品为浅灰色至无色结晶，无臭或几乎无臭。遇光或在空气中色渐深，常显棕灰色，溶液显弱酸性反应。

本品易溶于甲醇、热乙醇、乙醚和醋酸，微溶于水。

折光率：折光率应为1.422(中国药典2005年版二部附录VIF)。

熔点：熔点应为192～194℃(中国药典2005年版二部附录VIC)。

【鉴别】

(1)本品在含量测定项下所得色谱图中的保留时间，应与对照品的保留时间一致。

(2)取本品，照紫外分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)试验，在280nm和320nm处有最大吸收。

(3)本品的红外吸收图谱与对照的标准图谱一致。

【检查】酸度：取本品，加注射用水溶解成使每1ml中含1mg的溶液，依法测定(中国药典2005年版二部附录VIH)，pH应在4.0～4.5。

【含量测定】避光操作，照紫外分光光度法和/或高效液相色谱法(中国药典2005年版二部附录VD)测定。

【类别】外用避孕药

【贮藏】遮光，密封保存

(二)原料药1，4-萘二酚的合成工艺路线

[合成工艺路线流程]：

a.反应式：

1、原料：4-硝基-1-萘酚，锌粉，冰醋酸，盐酸，乙醇

2、温度：94℃-105℃

3、压力：常压

4、时间：3小时

5、还原剂：锌粉

6、操作步骤：

将锌粉，冰醋酸，盐酸加入三颈瓶中，分批加入4-硝基-1-萘酚，加热至回流，通过观察颜色变化，反应三小时，反应充分完全，加入盐酸，趁热过滤，减压蒸出部分冰醋酸至有结晶析出，冷却，析出大量结晶(褐色)。

b.反应式：

1、原料：4-氨基-1-萘酚盐酸盐，水，硫酸，K₂Cr₂O₇

2、温度：常温

3、压力：常压

4、时间：半小时

5、氧化剂：K₂Cr₂O₇

6、操作步骤：

在烧瓶中放入4-氨基-1-萘酚盐酸盐和水，30℃搅拌至完全溶解，用浓硫酸处理，加热煮沸，让沉淀出来的硫酸盐全部溶解为止，溶液略带淡红色，把热溶液从一个曾在蒸汽浴上热过的大漏斗里迅速倒入圆底烧瓶中(内有K₂Cr₂O₇水溶液)，摇动烧瓶，使其中物质充分混合，得大量黄色针状结晶，冷至室温，抽滤，水洗，干燥，得到粗产物(暗黄色，m.p.124-125℃，熔化后为深褐色液体。)

7、精制方法：

将粗品和乙醚蒸汽加热至溶解，加活性碳脱色10分钟，抽滤，回收乙醚至开始形成晶体，冷却抽滤，少量乙醚洗结晶，再在母液中加入活性碳脱色，重复上述过程多次，最终得浅黄色结晶(m.p.124℃～125℃，熔化后为黄色透明液体)。

c.反应式：

1、原料：1，4-萘二醌，冰醋酸，醋酐，无水醋酸钠，锌粉

2、温度：110℃

3、压力：常压

4、时间：一小时

5、酰化剂：醋酐

6、操作步骤：

在烧瓶中加入1，4-萘二醌，冰醋酸，醋酐，无水醋酸钠，搅拌使全部溶解，分批加入锌粉，控制温度不超过40℃，加完锌粉后，加热使温度升至110℃，维持半小时，溶液颜色由黄色转为棕红色，最后逐渐褪去成无色，之后再维持此温度10分钟，热滤，用醋酸洗涤，合并洗液，减压浓缩，回收醋酸与醋酐，残渣倒入冰水中，充分搅拌，即析出结晶，抽滤，水洗至中性，即得结晶。

7、精制方法：

粗品用5倍乙醇重结晶，加活性碳脱色，热滤，冷至10℃以下，使结晶完全，抽滤，水洗，干燥，即得精品。

d.反应式：

1、原料：二乙酰萘酚，冰醋酸，氢氧化钠，盐酸

2、温度：60℃

3、压力：常压

4、时间：2小时

5、催化剂：氢氧化钠

6、操作步骤：

将二乙酰萘酚，冰醋酸加入烧瓶中，加热搅拌至完全溶解，加入氢氧化钠调pH至9，反应完全(观察颜色由白色变为深褐色)，将反应液倒入水中，用盐酸调至pH＝4-5，析出结晶，抽滤水洗，干燥，得粗品(m.p.192-194℃)

7、精制方法：

粗品用5倍甲醇重结晶，加活性碳脱色，热滤，冷至室温，使结晶析出，抽滤，水洗，干燥，即得精品(m.p.192-194℃)。

(三)坤百康避孕霜制剂质量标准及制备工艺路线

1、坤百康避孕霜制剂质量标准：

                    坤百康避孕霜

                Kunbaikang biyun rugao

                    Kun baikang Cream

本品含1，4-萘二酚(C₁₀H₈O₂)应为标示量内90.0％～110.0％。

【性状】本品为乳剂型基质的白色或乳白色乳膏(霜剂)。

【鉴别】(1)本品在含量测定项下所得溶液的色谱图中的保留时间，应与对照品的保留时间一致。

(2)本品在含量测定项下所得溶液照分光光度法(中国药典2005年版二部附录IVA)试验，在280nm和320nm处有最大吸收。

(3)本品在含量测定项下所得溶液的红外吸收图谱与对照的标准图谱一致。

【检查】酸度：依法测定(中国药典2005年版二部附录VD)，pH应为5.5～6.0。

【含量测定】避光操作，照高效液相色谱法和/或紫外分光光度法(中国药典2005年版二部附录VD)测定。

对照品溶液的制备及测定法：避光操作，精密称取在硫酸干燥器中干燥至恒重的1，4-萘二酚标准品适量0.7mg后精密称定，甲醇溶解，定容至25.0ml，照高效液相色谱法测定。

供试品溶液的制备及测定法：避光操作，取软膏约1.0g，精密称定，用20.0ml甲醇溶解，超声处理20min，滤过，定容至25.0ml，照高效液相色谱法测定。

【类别】外用避孕药

【规格】3ml/支，10支/盒

【贮藏】遮光，密封保存

【制剂】霜剂

2、坤百康避孕霜制剂制备工艺路线：

[处方]    1，4-萘二酚        666.7mg

          霜剂基质           余量

          制成               1000g

[制法]

将油相成分(硬脂酸甘油酯35g，硬脂酸120g，液状石蜡60g，白凡士林10g，羊毛脂50g)与水相成分(三乙醇胺4ml，羧甲基纤维素钠盐和聚丙烯羧酸类高分子化合物共300g，蒸馏水适量)分别加热至80℃，不断搅拌下，将熔融的油相加入水相中，温度降至40℃左右，取1，4-萘二酚用少量乙醇溶解，搅拌下加入上述基质中，搅匀，灌装，包装，即得。

[工艺流程图]

参见图1。

[含量测定]避光操作，取软膏约1.0g，精密称定，用20.0ml甲醇溶解，超声处理20min，滤过，定容至25.0ml，照高效液相色谱法测定。

(四)原料药1，4-萘二酚和坤百康避孕霜制剂的毒性研究：

1、原料药1，4-萘二酚小鼠口服给药的急性毒性实验结果：LD₅₀为150.42mg/kg(95％的可信区间为：136.22-166.08mg/kg)。

2、原料药1，4-萘二酚家兔阴道给药的急性毒性实验结果：在临床使用剂量50倍(MTD)的浓度下(1.67mg/kg)未见任何动物死亡及毒性反应。

3、坤百康避孕霜制剂家兔阴道给药的急性毒性实验结果：在临床使用剂量50倍(MTD)的浓度下(1.67mg/kg)未见任何动物死亡及毒性反应。

4、按药品毒性与有效性剂量关系的安全性规定，本品在临床使用浓度下应为无毒性药品。

(五)坤百康避孕霜制剂的刺激实验研究结果：

1、家兔(4只)角膜刺激实验结果：给药6小时后刺激反应评分为0.5，裂隙灯下可见结膜轻度充血、角膜透明、巩膜正常；24小时以后直至7天的刺激反应评分为0，裂隙灯下可见结膜无充血、角膜透明、巩膜正常、无分泌物。与赋形剂对照组比较无差异。按规定，实验结论应为制剂无刺激性。

2、家兔(5只)阴道刺激实验结果：阴道粘膜无充血，水肿等病理现象。按规定，实验结论应为制剂无刺激性。

3、家兔(3只)皮肤刺激实验结果：1、24、48、72小时刺激反应评分为0.33。与赋形剂对照组比较无差异。按规定，实验结论应为制剂无刺激性。

(六)原料药1，4-萘二酚及其制剂坤百康避孕霜主要药效学的实验结果：

1、新合成的原料药1，4-萘二酚的体外杀精子最低浓度(20秒内)反复实验结果一致为0.005mg/ml-0.008mg/ml。制剂坤百康避孕霜的体外杀精子最低浓度(20秒内)反复实验结果一致为0.003mg/ml-0.006mg/ml。

2、新合成的原料药与制剂的抗病原生物谱和效果同原1，4-萘二酚(N)的杀菌实验结果报告一致。如下表1所示：

        表1  N对标准菌株的体外MIC和MBC表

 菌株  MIC(mg/ml)  MBC(mg/ml) 大肠埃希菌ATCC25922株  0.2500  0.2500 大肠杆菌44825株  0.2500  0.5000 金黄色葡萄球菌ATCC25925株  0.0625  0.0625 金黄色葡萄球菌26113株  0.0625  0.0625 绿脓杆菌ATCC27853株  ＞2000.0  ＞2000.0 绿脓杆菌10103株  ＞2000.0  ＞2000.0 变形杆菌49010株  0.5000  0.5000 变形杆菌49080株  0.3125  0.3125

 白色念珠菌85021株  0.0078  0.0156 淋球菌29016株  0.0018  0.0036 淋球菌29017株  0.0018  0.0036 粪链球菌ATCC10541株  0.5000  0.5000 乳酸杆菌1.555株  ＞2000.0  ＞2000.0

(七)坤百康避孕霜的体外杀精子实验研究

7.1提要

应用坤百康避孕霜(KBK)(制剂)及其主要组份-1，4-萘二酚(1，4-naphthohydroquinone/1，4-Dihydroxynaphthalene，N)作体外杀精子实验，结果表明，N具有较强的杀精效应，它使精子20秒内瞬间失活的最低有效浓度为0.005mg/ml-0.008mg/ml；KBK使精子20秒内瞬间失活的最低有效浓度为0.003mg/ml-0.006mg/ml。并且应用公认的壬苯醇醚作比较，证明N和KBK的杀精效力比壬苯醇醚高25倍以上。

7.2材料和方法

7.2.1药物及其配制

7.2.1.1药物

N和KBK均由西安交通大学医学院药学系药化制剂室制备提供；壬苯醇醚-9(nonoxyno1-9，购自Orthopharmaceutical Company)。

7.2.1.2配制

N药物粉末用精确称量一定量，加0.9％生理盐水稀释配制成1.000mg/ml、0.100mg/ml、0.050mg/ml、0.010mg/ml、0.005mg/ml和0.001mg/ml六种不同浓度溶液，KBK按处方体积比用0.9％氯化钠溶液配成1.000mg/ml、0.100mg/ml、0.050mg/ml、0.010mg/ml、0.005mg/ml和0.001mg/ml六个不同浓度的含药溶液。阳性对照使用的壬苯醇醚亦是用生理盐水配成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml和0.6mg/ml六个不同的浓度。

7.2.2仪器

高倍光学显微镜；恒温箱；分析天平；秒表；微量移液管等。

7.2.3标本

本试验所用的精液均采自健康育龄男性，禁欲5-6天后用摩擦法采得的新鲜精液，并作常规检查符合要求，于恒温箱35℃保温备用。精子计数≥60×10⁶/ml，活动率≥60％，前向运动精子百分率≥75％，畸形精子百分率≤20％，液化时间≤30min。

7.2.4实验方法

药物使精子瞬间失活的最低有效浓度是比较不同药物之间杀精子效力的重要指标之一。对杀精子效力的检测按照国际计划生育基金会(IPPF)认可的杀精实验方法Sander-Cramer法加以改进，即取合格的精液15μl和药液15μl滴在同一载玻片上迅速混合均匀，计时，立即在有恒温载玻台的显微镜100倍和400倍视野下观察，在20秒内，至少五个视野内无精子运动，即全部精子失活为终点，以此作为该药物的最低杀精有效浓度。再将玻片上的药液立即用0.9％生理盐水洗掉，镜下观察未见活动精子。同时将玻片自然干燥，用伊红Y染色，发现未被破坏的少许精子全部着色，表明精子全部碎解或死亡。

此实验用0.9％生理盐水作为空白对照组，并用目前国内外使用最广泛、并作为阴道避孕剂的主要成分的杀精子剂--壬苯醇醚-9的不同浓度的生理盐水溶液作阳性对照组，然后得出药物的最低杀精有效浓度。每个药物至少用5份不同正常男子精液标本反复测定，每份标本分为数份备用，至少反复试验3次。

7.2.5统计学处理

药物最低有效浓度数据以x±s表示，差异的显著性采用成对或不成对资料进行t检验分析，P值以0.05作为显著性界限。

7.3结果

实验组：经反复试验，最后将所测得结果用统计学方法处理。在把每组样本看作符合正态分布的情况下，得出各药物的最低杀精有效浓度(x±s)，及当α＝0.05，即95％置信区间。结果见表2。

对照组：0.9％生理盐水对精子活力没有影响。

表2：各药物对人精液体外杀精效能的比较(n＝10，x±s，α＝0.05)

  药物         最低杀精有效浓度(mg/ml)  均数(x±s)  95％置信区  N  0.006±0.003  0.005，0.008  KBK  0.004±0.003  0.003，0.006  NP-9  0.280±0.060  0.240，0.320

7.4讨论：

对药物的体外杀精子效果的评价，国际计划生育基金会(IPPF)推荐的方法是改良的Sander-Cramer法，即适量药液与精液先于试管内混合均匀，保温振荡1小时，再于显微镜下观察。但由于此方法需要药量多，需要标本量极大，且消耗时间长，一份标本无法同时对几个药物进行平行测定，对于某些含有两个酚羟基的易氧化变色的药物尤其不适合。所以实验中，将此方法进行改进，采用直接玻片法。经过试验，所测得对照品NP-9的最低杀精有效浓度为0.28±0.06mg/ml，与文献报道的0.25mg/ml无显著性差异。所以，可见此试验方法是可靠的。

7.5结论：

新合成的原料药1，4-萘二酚的体外杀精子最低浓度(20秒内)为0.005mg/m1-0.008mg/ml。制剂坤百康避孕霜KBK的体外杀精子最低浓度(20秒内)为0.003mg/ml-0.006mg/ml。杀精子强度超过壬苯醇醚25倍以上。

(八)1，4-萘二酚的杀菌试验报告：

8.1摘要：

本试验测定了1，4-萘二酚对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、表皮葡萄球菌、粪链球菌、淋病奈瑟氏菌、变形杆菌、乳酸杆菌、白色假丝酵母菌的标准株和临床分离株的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。结果表明1，4-萘二酚能够有效地抑制、杀灭常见泌尿道感染细菌，但对乳酸杆菌在试验浓度内无明显抑制和杀伤作用。

8.2材料和方法

8.2.1试验药品：1，4-萘二酚。由本课题组自行合成，西安交通大学医学院药学系提供。用无菌生理盐水配制成2mg/ml。

8.2.2试验菌株：

8.2.2.1标准菌株  共11株：

            大肠埃希氏菌  ATCC25922株

            金黄色葡萄球菌ATCC25923株

            绿脓假单孢菌  ATCC27853株

            表皮葡萄球菌  ATCC26069株

            表皮葡萄球菌  49080株

            粪链球菌      ATCC10541株

            淋病奈瑟氏菌  20106株

            淋病奈瑟氏菌  20107株

            变形杆菌      49010株

            白色假丝酵母菌85021株

            乳酸杆菌      1.555株

乳酸杆菌冻干菌种购自中国农科院乳酸菌研究室；其他菌株冻干菌种购自中国医学科学院北京药品生物制品鉴定所。菌种于2004年10月复苏，本室于甘油肉汤中4℃保存。试验前传代备用。

8.2.2.2临床分离株  共387株：

      金黄色葡萄球菌    150株，编号金葡001-金葡100；

      表皮葡萄球菌      150株，编号表葡001-表葡050；

      粪链球菌           30株，编号粪链001-粪链030；

      淋病奈瑟氏菌       25株  编号淋病001-淋病025；

      白色念珠菌         32株  编号白念001-白念032；

以上临床分离株由西安交通大学医学院第一附属医院、第二附属医院，陕西省人民医院检验科提供。所有临床分离菌株均经Taket32全自动数字细菌鉴定仪鉴定。由本室冰冻保存。实验前复苏，传代备用。

8.2.3试验菌培养条件：

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、变形杆菌、粪链球菌接种于MH培养基，置普通培养箱37℃、24小时培养。

淋病奈瑟氏菌接种于哥伦比亚(巧克力色)培养基，5％CO2培养箱37℃、48小时培养。

白色念珠菌接种于沙保弱氏(Sabouraud，SB)培养基，置普通培养箱37℃、48小时培养。

乳酸杆菌接种于改良MRS培养基，37℃厌氧培养48小时。

所有培养基按《现代微生物培养基和试剂手册》制备。

8.2.4试验仪器：CO2培养箱，普通培养箱，厌氧培养箱、菌落记数仪等。

8.2.5试验方法：参照《卫生部药政局新药临床前研究指导原则》中“抗菌药体外抗菌试验原则”和《微生物学检验技术》，采用微量二倍稀释法测定MIC，平板转染法测定MBC。

8.2.6实验内容：

8.2.6.1最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

将1，4-萘二酚用培养液由2.0mg/ml为起点进行连续二倍梯度稀释，各梯度稀释液依次加到96孔细胞培养板，0.2ml/孔。加入浓度为106CFU/ml的试验菌液0.01ml。同时设立细菌以及培养基对照。4℃作用12小时，置培养箱37℃、48小时培养，观察结果。无细菌生长孔最小药物浓度为最小抑菌浓度(MIC)。再依次将未见细菌生长各孔的培养物分别吸取0.1ml点种于琼脂平板培养基，37℃、48小时培养。无细菌生长接种区域所对应的最小药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。

8.2.6.2培养条件对MIC的影响

选取表皮葡萄球菌ATCC26069株、淋病奈瑟氏菌29106株，改变培养条件，分别测定受试药物对受试菌的MIC。

8.2.6.3pH值影响试验：

参照试验一中MIC测定方法，将培养液的pH分别调整到5.7、7.2、8.5，分别测定出各自的MIC。

8.2.6.4细菌接种量影响试验：

参照试验一中MIC测定方法，将试验菌液浓度依次改变为106、108、1010  CFU/ml，每孔接种0.01ml，进行MIC测定。

8.2.6.5药物杀菌曲线测定

将淋淋病奈瑟氏菌29106株以终浓度为105CFU/ml接种于含二倍MBC浓度药物的哥伦比亚肉汤中，于37℃作用；分别于作用5’、10’、20’、40’、1h、2h、4h、8h吸取0.1ml，用无菌生理盐水进行十倍连续梯度稀释，吸取各梯度稀释液10ul点种于哥伦比亚平板，置5％CO2、37℃培养48小时，观察培养结果，统计各时间点细菌存活数。以药物与细菌作用时间为横坐标，细菌存活数的对数为纵坐标，绘制杀菌曲线。

8.3试验结果：

8.3.1  1，4-萘二酚对标准菌株的MIC、MBC见表3。

表3  1，4-萘二酚对所试菌标准菌株的MIC和MBC

 菌株  MIC(μg/ml)  MBC(μg/ml) 大肠埃希氏菌ATCC25922株 金黄色葡萄球菌ATCC25925株 绿脓假单胞菌ATCC27853株 表皮葡萄球菌ATCC26069株 表皮葡萄球菌49080株 粪链球菌ATCC10541株 淋病奈瑟氏菌20106株 淋病奈瑟氏菌20107株 变形杆菌49010株 乳酸杆菌1.555株 白色假丝酵母菌85021株  250.0  62.5  ＞2000.0  31.25  31.25  62.5  1.8  3.6  500  ＞2000.0  62.5  500.0  125.0  ＞2000.0  31.25  62.5  125.0  7.8  7.8  1000.0  ＞2000.0  125.0

8.3.2  1，4-萘二酚对临床分离菌株的MIC、MIC50、MIC90及MBC见表4。

表4  1，4-萘二酚对临床分离菌株的MIC、MIC50、MIC90及MBC

                                                        单位：μg/ml

  菌株  株数  MIC范围  MIC50  MIC90  MBC范围  金黄葡菌  表皮葡菌  粪链球菌  淋病球菌  白念球菌  1510  50  30  25  32  31.25-125.0  15.125-60.5  62.5-250.0  3.6-15.125  31.25-125.0  150.9  139.6  179.4  5.03  187.1  193.4  164.3  221.3  13.24  223.2  62.5-250.0  31.25-125.0  62.5-500.0  6.2-31.25  62.5-500.0

8.3.3培养条件对1，4-萘二酚对表皮葡萄球菌ATCC26069株、淋病奈瑟氏菌29106株的MIC的影响结果见表5，6。

                表5.pH对MIC影响试验结果

  菌株           MIC(μg/ml)  pH5.7  pH7.2  pH8.5  表皮葡萄球菌ATCC26069株  淋病奈瑟氏菌29106株  31.25  -  31.25  1.8  31.25  -

            表6.细菌接种量对MIC影响试验结果

 菌株         MIC(μg/ml)  106  108  1010 表皮葡萄球菌ATCC26069株 淋病奈瑟氏菌29106株  31.25  1.8  31.25  1.8  31.25  1.8

从表5，6中可见，当培养液的酸碱度在pH5.7和pH8.5时，淋病奈瑟氏菌不生长。但不影响表皮葡萄球菌ATCC26069株的MIC；改变细菌接种量，不影响1，4-萘二酚对表皮葡萄球菌ATCC26069株、淋病奈瑟氏菌29106株的MIC。

8.3.4  1，4-萘二酚对淋病奈瑟氏菌29016的杀菌曲线见表7。

            表7  1，4-萘二酚对淋球菌的杀菌曲线数据表

  作用时间  5’  10’  20’  40’  1h  2h  4h  lg(CFU/ml)  5.010  5.001  5.001  4.478  4.025  0.327  0.000

                    1，4-萘二酚浓度：15.6μg/ml

                淋病奈瑟氏菌29016株细菌数：105CFU/ml

从表7中可见，1，4-萘二酚在二倍MBC(15.6μg/ml)浓度条件下，对淋球菌的杀菌作用主要在作用40分钟至2小时之间，此间活菌数量急剧下降，作用4小时后细菌完全被杀灭。

结论：

本试验选用了临床泌尿生殖系统感染常见的细菌和真菌作为试验菌株，采用二倍稀释法测定了1，4-萘二酚对11标准菌株和387株临床分离株的MIC和MBC。试验结果表明，1，4-萘二酚对试验所选用的泌尿生殖系统感染常见的细菌除绿脓杆菌外均有明显的抑制和灭活作用，尤其对淋病奈瑟氏菌的抑菌和杀菌作用尤为突出，MIC达到微克级。但对乳酸杆菌在试验浓度范围内的抑制和灭活作用不明显。本结果提示1，4-萘二酚在对病原性细菌(真菌)抑制和杀伤的同时，对阴道的正常菌群菌如阴道乳酸杆菌等无明显杀伤作用。

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