安祖花组培用的培养基及组培苗繁殖方法

摘要

本发明公开了一种安祖花组培用的培养基及组培苗繁殖方法，该培养基中的大量元素成分的浓度组合是现有安祖花组培用的培养基中没有的，同时该培养基中使用的脱落酸是现有安祖花快速繁殖技术中没有使用过的。安祖花组培苗繁殖方法包括：利用上述培养基诱导叶或叶柄产生愈伤组织和不定芽；将已分化出不定芽的愈伤组织，继代到改良MS培养基上培养，繁殖不定枝；将不定枝转移到生根培养基中，诱导生根，然后用常规组培苗移栽方法将生根组培苗移栽到土壤基质中。采用本发明提供的技术方案，能诱导安祖花2个种各品种营养繁殖的盆栽苗的叶和叶柄愈伤组织和再生植株，减轻了品种基因型对叶和叶柄愈伤组织诱导和植株再生的影响，加快安祖花组培苗的繁殖速度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物生物技术中组培苗(试管苗)繁殖技术，具体而言，涉及一种安祖花组培用的培养基及组培苗繁殖方法。

背景技术

安祖花(又称红掌、花烛、火鹤)为天南星科(Araceae)安祖花属(Anthurium)植物。主要的商品花栽培种有A.andreanum和A.scherzerianum，其销售量在世界花卉市场上位居第二，是仅次于热带兰的名贵花卉。安祖花苗的繁殖主要通过组培苗培养的方法繁殖。自从Pierik等(1974)诱导A.andreanum形成愈伤组织以来，Pierik(1976)、Kunisaki(1980)、Kuehnle和Sugii(1991)、Teng(1997)、Chen等(1997)、肖三元和梁国平(2000)、Joseph等(2003)、Martin等(2003)、Vargas等(2004)和郭维明等(2004)分别报道了A.andreanum盆花和切花的组培苗繁殖；Geier(1986)、刘春明和许智宏(1992)和Hamidah等(1997)分别报道了A.scherzerianum器官发生和体细胞胚胎发生再生植株。现有技术的特点表现在以下几方面。

(1)快速繁殖A.andreanum和A.scherzerianum时，使用各不相同的培养基

诱导A.scherzerianum愈伤组织和植株再生则采用Nitsch(Nitsch，1969)基本培养基或半量MS(Murashige和Skoog，1962)培养基降低NH₄NO₃含量。例如，Geier(1986)诱导A.scherzerianum愈伤组织使用Nitsch基本培养基，降低NH₄NO₃浓度，添加1mg/L6-苄氨基嘌呤和0.1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸；诱导植株再生和繁殖使用相同的基本培养基，提高NH₄NO₃浓度，添加0.5mg/L6-苄氨基嘌呤；生根培养基与再生和繁殖培养基相同，但不添加生长调节剂。

诱导A.andreanum叶和叶柄外植体愈伤组织和植株再生使用的培养基为MS基本培养基(Kunisaki，1980；Teng，1997)和MS大量元素减半(Kuehnle和Sugii，1991；Chen等，1997；Martin等，2003；Joseph等，2003)或部分大量元素减半(Kuehnle和Sugii，1991)的培养基。Martin等(2003)在A.andreanum切花品种植株再生过程中，均使用半量MS培养基，通过添加不同种类和不同浓度的生长调节剂诱导愈伤组织、不定芽和生根。Teng(1997)在MS培养基(添加2.2-4.4μM 6-苄氨基嘌呤和0.9μM 2，4-二氯苯氧乙酸)诱导愈伤组织，在含6-苄氨基嘌呤的MS培养基上诱导不定芽，在无生长调节剂的培养基上生根。

迄今，尚未见到有关一种基本培养基都适合安祖花2个种的愈伤组织诱导和植株再生的报道。

(2)现有技术能繁殖的品种或基因型有限

在A.andreanum和A.scherzerianum中已经分别培育出许多盆花和切花品种。在同一个种的研究中，Kunisaki(1980)报道了4个品种的快速繁殖，Geier(1986)从18个基因型中只诱导10个基因型再生植株，Kuehnle和Sugii(1991)应用相同培养基诱导7个品种的叶外植体愈伤组织和再生植株，刘春明和许智宏(1992)诱导了7个种子来源的基因型植株再生，Chen等(1997)诱导2个品种的根外植体再生植株，Joseph(2003)和Martin等(2003)分别诱导3和2个切花品种的叶外植体再生植株，Vargas等(2004)和郭维明等(2004)分别报道了1个品种的植株再生，其他研究没有报道品种数量。这些研究报道说明，利用现有的培养基只能诱导个别品种的愈伤组织和再生植株，尚未研发出安祖花品种或基因型不依赖的愈伤组织诱导和植株再生的培养基。

(3)营养繁殖的盆栽苗叶和叶柄外植体再生植株的繁殖技术不成熟

用于诱导愈伤组织和再生植株的外植体有种胚、营养芽、叶、叶柄、肉穗花序、佛焰苞、根和茎段。其中，叶和叶柄外植体研究多，80％的研究使用叶与叶柄作外植体。安祖花产业中诱导叶和叶柄再生植株一般采用的途径是，首先获得种子萌发的无菌苗、或通过茎芽培养产生组培苗，然后再诱导组培苗叶和叶柄产生愈伤组织并再生植株。有的研究也以种子萌发的实生苗或组培苗茎段、叶和叶柄为外植体(Kunisaki，1980；Geier，1986；刘春明和许智宏，1992；Hamidah等，1997；郭维明等，2004；Vargas等，2004)。

另一种途径是直接诱导盆栽苗叶和叶柄产生愈伤组织和再生植株(Teng，1997；肖三元和梁国平，2000；Joseph，2003；Martin等，2003)。就愈伤组织和再生植株诱导难易来说，相对容易的是实生苗和试管苗的叶和叶柄外植体，而营养繁殖的盆栽苗外植体难度大。前者能诱导较多的品种叶外植体再生植株，而后者最多有3个品种被诱导再生植株(Joseph，2003)。以营养繁殖的盆栽苗叶和叶柄作为外植体的优点是，取材数量大和取材时间长，有利于引种推广和快速繁殖新品种。因此，研发安祖花种和品种盆栽苗叶和叶柄再生植株的快速繁殖通用技术具有很大的应用价值。已有的研究仅在个别品种上获得成功，限制了研究结果的实际应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术中的不足，而提出一种安祖花组培用的培养基及组培苗繁殖方法，使用该培养基及方法繁殖安祖花组培苗，能诱导安祖花2个种A.andreanum和A.scherzerianum各品种营养繁殖的盆栽苗叶和叶柄愈伤组织和再生植株，减轻品种或基因型对叶和叶柄愈伤组织诱导和植株再生的影响，并能够加快安祖花组培苗的繁殖速度。

本发明所提供的技术方案是：

一种安祖花组培用的培养基，用于诱导叶和叶柄愈伤组织及其不定芽分化，包含下列成分：

配方1：

(1)大量元素成分

KNO₃，400～850mg/L；NH₄NO₃，150～350mg/L；CaCl₂·2H₂O，200～500mg/L；MgSO₄·7H₂O，150～400mg/L；KH₂PO₄，100～250mg/L；

(2)微量元素成分

FeSO₄·7H₂O，13.9～27.8mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65～37.3mg/L；KI，0～0.83mg/L；H₃BO₃，0～6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，11.2～25mg/L；ZnSO₄·7H₂O，4.3～10mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.04～0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

(3)有机营养成分

肌醇，500～1000mg/L；烟酸，0.5～5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5～1mg/L；盐酸硫胺素，0.1～1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

(4)生长调节剂

2，4-二氯苯氧乙酸，0.1～0.5mg/L；6-苄氨基嘌呤，0.5～1.5mg/L；脱落酸0.01～0.3mg/L；

(5)碳源：蔗糖，20～30g/L；

(6)凝固剂：琼脂，6～7g/L；

最终pH调节为5.6～5.8；

配方2：

(1)大量元素成分

KNO₃，400～850mg/L；NH₄NO₃，150～350mg/L；CaCl₂·2H₂O，200～500mg/L；MgSO₄·7H₂O，150～400mg/L；KH₂PO₄，100～250mg/L；

(2)微量元素成分

FeSO₄·7H₂O，13.9～27.8mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65～37.3mg/L；KI，0～0.83mg/L；H₃BO₃，0～6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，11.2～25mg/L；ZnSO₄·7H₂O，4.3～10mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.01～0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

(3)有机营养成分

肌醇，500～1000mg/L；烟酸，0.5～5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5～1mg/L；盐酸硫胺素，0.1～1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

(4)生长调节剂

α-萘乙酸0.1～0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5～1.5mg/L；

(5)碳源：蔗糖，20～30g/L；

(6)凝固剂：琼脂，6～7g/L；

最终pH调节为5.6～5.8。

一种安祖花组培苗繁殖方法，包括如下步骤：

(1)诱导叶或叶柄产生愈伤组织和不定芽

利用权利要求1或2所述的培养基诱导产生愈伤组织和不定芽：将营养繁殖的盆栽苗叶或叶柄接种在采用配方1配制的培养基上，培养3～8周后，诱导产生愈伤组织，或接着诱导产生不定芽，或虽产生愈伤组织，没有产生不定芽时，则将大于3～5mm³的愈伤组织转移到采用配方2配制的培养基上，再经过6～8周培养后，愈伤组织被诱导再生不定芽；

(2)不定枝繁殖

将上述具有分化能力的愈伤组织即已分化出不定芽的愈伤组织，继代到改良MS培养基上培养，增殖愈伤组织和快速繁殖组培苗；愈伤组织在改良MS培养基上培养6～7周后，按1∶4比例继代增殖培养；用于组培苗快速繁殖时，愈伤组织继代按1∶2比例继代，并且在愈伤组织上保留小于0.5cm长度的不定枝；

(3)组培苗生根诱导和移栽

将长度为2～3cm以上的不定枝转移到生根培养基中，经过2～4周培养后，不定枝产生新根，新根生长到0.5～1cm长时，采用常规组培苗移栽方法将生根组培苗移栽到土壤基质中。

优选地，所述诱导培养基的大量元素成分为KNO₃，600mg/L；NH₄NO₃，200mg/L；CaCl₂·2H₂O，220mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L。

进一步，所述的安祖花组培繁殖方法，其中第2步所用的改良MS培养基，该培养基中的生长调节剂成分为：α-萘乙酸，0.1～0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤，0.4～2.0mg/L；碳源：蔗糖，20～30g/L；凝固剂：琼脂，4～6g/L；大量元素成分、微量元素成分、有机营养成分与MS基本培养基中的相应成分相同；最终pH调节为5.6～5.8。

进一步地，所述的安祖花组培繁殖方法，其中第3步所用的生根培养基，该培养基中含有大量元素含量减半的MS基本培养基成分；萘乙酸，0.05～0.2mg/L；蔗糖，10g/L；琼脂，7g/L；最终pH值调节为5.6～5.8。

本发明有如下优点：(1)建立了新的安祖花盆栽苗叶和叶柄愈伤组织诱导培养基，该培养基中的大量元素成分的浓度组合是现有培养基中没有的，同时该培养基中使用的脱落酸是现有安祖花快速繁殖技术中没有使用过的，大量元素成分组合和脱落酸是诱导叶和叶柄愈伤组织成功的关键因子，在其他条件适宜的情况下，缺少上述两种处理中任何一种处理，则使愈伤组织诱导受到抑制。将培养基中的肌醇浓度提高到500～1000mg/L，有利于愈伤组织的诱导。(2)建立了安祖花组培苗的快速繁殖的体系。这个体系由建立的诱导培养基与改良诱导培养基、改良MS培养基和1/2MS(大量元素浓度减半)生根培养基组成。诱导培养基是这个快速繁殖体系的基础，只有将在诱导培养基或改良诱导培养基上具有分化能力的愈伤组织继代培养在改良MS培养基上，才能促进愈伤组织增殖和提高不定芽分化的频率，促进安祖花组培苗的繁殖速度。(3)建立了安祖花2个种A.andreanum和A.scherzerianum通用的组培苗快速繁殖技术，能诱导安祖花2个种A.andreanum和A.scherzerianum营养繁殖的盆栽苗的叶和叶柄愈伤组织，及其再生植株，减轻了品种或基因型对叶和叶柄愈伤组织诱导和植株再生的影响。利用本发明技术方案能诱导安祖花各品种盆栽苗叶和叶柄产生愈伤组织和再生植株。

具体实施方式

首先配制繁殖安祖花组培苗所需的培养基，培养基的制作采用常规的培养基配制方法。愈伤组织诱导和不定芽分化培养基采用诱导培养基，该诱导培养基的配方为：

配方1：

大量元素成分：KNO₃，600mg/L；NH₄NO₃，200mg/L；CaCl₂·2H₂O，220mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，13.9mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，1000mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

生长调节剂：2，4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L；6-苄氨基嘌呤，1.0mg/L；脱落酸，0.1mg/L；

碳源：蔗糖，20g/L；

凝固剂：琼脂，6g/L；

最终pH调节为5.6。

本发明中将该培养基称为Xiao培养基。

配方2：

大量元素成分：KNO₃，600mg/L；NH₄NO₃，200mg/L；CaCl₂·2H₂O，220mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，13.9mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，18.65mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，1000mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.1mg/L，6-苄氨基嘌呤，1.0mg/L，

碳源：蔗糖，20g/L；

凝固剂：琼脂，6g/L；

最终pH调节为5.6。

本发明中将该培养基称为改良Xiao培养基。

不定枝繁殖的培养基采用改良MS培养基，其组成为：

大量元素成分：KNO₃，1900mg/L；NH₄NO₃，1650mg/L；CaCl₂·2H₂O，440mg/L；MgSO₄·7H₂O，370mg/L；KH₂PO₄，170mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，37.3mg/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，100mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.1mg/L，6-苄氨基嘌呤，1.0mg/L；

碳源：蔗糖，20g/L；

凝固剂：琼脂，5g/L；

最终pH调节为5.7；

生根培养基的组成为：MS基本培养基(大量元素含量减半)+0.1mg/Lα-萘乙酸+10g/L蔗糖+0.7％琼脂，pH 5.8，即：

大量元素成分：KNO₃，950mg/L；NH₄NO₃，825mg/L；CaCl₂·2H₂O，220mg/L；MgSO₄·7H₂O，185mg/L；KH₂PO₄，85mg/L；

微量元素成分：FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；Na₂EDTA·2H₂O，37.3mg/LKI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；

有机营养成分：肌醇，100mg/L；烟酸，0.5mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；甘氨酸，2.0mg/L；

生长调节剂：α-萘乙酸，0.1mg/L；

碳源：蔗糖，10g/L；

凝固剂：琼脂，7g/L；

最终pH调节为5.8。

将培养基中的大量元素成分、铁成分、其他微量元素成分和有机营养成分分别按10倍、200倍、1000倍和100倍浓度配制成贮备液，同时将所需的生长调节剂配制成1mg/ml的母液，保存在4℃冰箱中。然后按需要量配制各培养基并用1N NaOH调节pH，煮沸后分装到培养瓶中，在121℃灭菌15分钟，冷却后备用。

剪取叶柄长约5cm、未展开叶片，流水冲洗30分钟后用洁净滤纸吸干水分，将外植体剪成适当大小置于无菌烧杯中，在超净工作台内进行下述表面消毒。70％乙醇浸泡30秒，再用0.1％HgCl₂处理6-8分钟，消毒过程中间歇摇动烧杯。表面消毒后，用无菌去离子水清洗外植体5次，每次停留时间为3-5分钟，并摇动烧杯充分洗除外植体上的消毒液。

将消毒清洗后的叶片沿主脉剪成约1cm²大小，将叶柄剪成1cm左右长，接种到Xiao培养基上，每瓶(50ml)接种3-4个外植体。将接种的外植体放在黑暗或弱光(300～500lx)条件下培养，培养温度为25±1℃。

接种3周后，外植体切口处逐渐生长出愈伤组织时，将培养物转移到光照条件下培养。从这以后的培养条件均为：光照强度4000lx，光周期为照光16小时和黑暗8小时，温度25±1℃。愈伤组织在Xiao培养基或在同一培养基上继代后继续生长并逐渐分化出不定芽。例如，阿贝申(Ambition)叶柄接种后3周产生愈伤组织，接种6～7周后分化不定芽。如果愈伤组织生长到3～5mm³大小没有不定芽分化，需要将愈伤组织转移到改良Xiao培养基上培养6～8周，诱导不定芽分化，培养条件同上。例如，接种于Xiao培养基上的亚历桑娜(Arizona)叶片被诱导产生愈伤组织后，需要将愈伤组织继代到改良Xiao培养基上才能被诱导再生不定芽。叶片愈伤组织诱导率低于叶柄。对亚美哥(Amigo)，瓦仑天奴(Valentino)，红切，橙冠军(Orange Champion，大)，橙冠军(小)，亚历桑娜(Arizona)和甜心(Sweetheart Red)7个品种叶片和叶柄愈伤组织诱导率平均分别为63.2％和85.8％。

愈伤组织分化不定芽后，将这种具有分化能力的愈伤组织转移继代到改良MS培养基上培养。改良MS培养基起着促进愈伤组织增殖和不定枝繁殖的功能。一般首先促进愈伤组织增殖，处理方法是提高改良MS培养基中的6-苄氨基嘌呤水平，使愈伤组织生长快，不定芽分化相对较少。当愈伤组织量达到一定程度时，需要减少愈伤组织生长量，促进不定芽分化和生长，处理方法是降低MS改良培养基中6-苄氨基嘌呤浓度。无论哪一种培养目的，愈伤组织每6～7周继代1次。其中，愈伤组织增殖过程中按1∶4比例继代培养，而不定枝繁殖过程中按1∶2比例继代培养。继代时若将愈伤组织上的不定芽完全切除后，重新诱导愈伤组织分化不定芽并生长到2-3cm长，需要培养10周左右的时间。因此，快速繁殖过程中继代愈伤组织需保留不定芽和小于3～5mm长度的不定枝，这些不定芽和不定枝再经过6～7周培养后，就能生长到2～3cm以上的长度，保证每次继代都能切离适宜高度的不定枝，用于生根诱导。在1大培养瓶(φ＝8.8cm)中每次继代能获得30～40株无根组培苗用于生根诱导。

将2～3cm长的不定枝从愈伤组织上切离，接种到生根培养基上，经过3周左右培养，在茎基部产生白色幼嫩新根，每株组培苗能被诱导3～5条新根。当新根生长到5～10mm长度时，将生根组培苗移栽到土壤基质中。土壤基质由椰子壳纤维、蛭石和珍珠岩组成，各占比例为1/3。移栽的组培苗置于温室中培养，移栽初期用塑料薄膜遮盖，保持空气相对湿度为90％左右，温度20～25℃，光照强度3000～5000lx。2～3周后组培苗恢复生长时，逐渐揭开塑料薄膜，温室中空气相对湿度保持在70％左右，提高光照为8000lx左右。组培苗移栽成活率达90％以上。移栽后4个月左右，组培苗生长到8～10cm高，将组培苗作为生产用苗进入下一阶段的栽培管理。

使用Xiao培养基，或与改良Xiao培养基配合对现引进的所有安祖花品种盆栽苗均成功诱导叶和叶柄产生愈伤组织和再生植株，这些品种名称列举如下。

A.andreanum种中有27个栽培品种，即亚美哥(Amigo)，瓦仑天奴(Valentino)，亚特兰大(Atlanta)，红切，卡西罗(Casino)，橙冠军(OrangeChampion)，橙冠军(小)，红烤拉(Carre)，亚历桑娜(Arizona)，鲁滨逊(Robino)，甜心(Sweetheart Red)，阿贝申(Ambition)，粉冠军(PinkChampion)，北京成功(Beijing success)，维他(Vitara)，托卡(Tucano)，阿拉巴玛(Alabama)，密西西比(Mississippi)，祝福(Impreza)，瑞马(Rima)，道科塔(Dakota)，寂静(Silence)，沙沃得(Sharade)，明尼苏达(Minnesota)，拉丁美洲(Latino)，克罗拉多(Colorado)，密苏里(Missouri)。

A.scherzerianum种中有3个栽培品种，即阿土司(Artus)，索拉里(Solara)，克拉福地(Graffity)。