一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法

摘要

本发明公开了一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法。它是采用一系列酶处理感病昆虫的血细胞，以破坏和除去昆虫的遗传物质，并加以分离纯化制得。将获得的病原真菌菌体用来提取DNA和mRNA，经PCR和RT－PCR的验证，无昆虫遗传物质的污染，可用于构建基因文库，也为进一步揭开虫生真菌侵染机制打下坚实基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法。

背景技术

目前对于昆虫病原真菌致病基因的研究，主要是建立在不同离体条件下的诱导表达序列标签库(以下称EST库)，如通过建立金龟子绿僵菌(广谱菌株)在不同离体条件下的诱导EST库，分析大量EST序列，以期利用大量不同离体条件下的诱导EST序列分析病原真菌在侵入寄主昆虫体内后基因的表达情况等，但此方法既耗时、又费力，并且难以检测在活体条件下特异表达的病原真菌基因。

而在病原真菌侵染后的寄主昆虫血淋巴中分离纯化到无寄主DNA和RNA污染的病原真菌菌体是分离和克隆病原真菌在寄主体内表达基因的关键技术。从寄主昆虫体内直接获取病原真菌菌体，以分离和克隆昆虫病原真菌菌体侵入昆虫体内后表达的基因，研究它们在致病机理中的作用，一直是业内人士渴望解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从感病昆虫血淋巴中直接分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法，其特征在于：将感病昆虫的血细胞采用酶处理进行裂解及其DNA和RNA采用酶处理进行降解，再加以分离沉淀，纯化制得病原真菌菌体；在整个酶解过程中，采用聚合酶链式反应(以下称PCR)检测保守序列监控，最后采用PCR和逆转录-聚合酶链式反应(以下称RT-PCR)检测保守序列方法对昆虫病原真菌菌体进行鉴定。

上述感病昆虫的血细胞经超纯水处理、离心分离后，其沉淀与蛋白酶K进行裂解反应；裂解反应完成后，其离心沉淀与核酸酶进行降解反应，以降解其RNA和DNA，最终分离出的沉淀为昆虫病原真菌菌体和细胞碎片；在整个酶解过程中，采用昆虫的保守基因序列设计昆虫特异性引物来检测昆虫核酸是否存在，昆虫病原真菌保守基因序列设计昆虫病原真菌的特异性引物作为检测有无昆虫病原真菌核酸的存在，通过PCR和RT-PCR扩增检测酶解后检测昆虫的保守基因序列量的多少及有无来判断酶切进程，实现对整个酶切过程的全过程监控以及对昆虫病原菌菌体进行鉴定。

上述感病昆虫是指东亚飞蝗，上述病原真菌是指绿僵菌；上述感病东亚飞蝗的血细胞中加入超纯水洗涤，血细胞数：超纯水的体积＝3.0×10⁶个：1000-2000μl；洗涤、离心分离除去上清液的血细胞中加入细胞裂解缓冲液，血细胞数：细胞裂解缓冲液的体积＝1.0×10⁶个：100-200μl，混匀后加入10％十二烷基磺酸钠(SDS)至终浓度为1％，混匀后加入蛋白酶K后，30℃水浴1～2小时，离心分离弃去上清液，洗涤沉淀；再在沉淀中加入核酸降解缓冲液，其加入量以前面所计的感病东亚飞蝗的血细胞数加入核酸降解缓冲液，血细胞数：核酸降解缓冲液的体积＝1.0×10⁶个：100-200μl，再加入脱氧核糖核酸酶DNAase I、核糖核酸酶RNAase A，使其终浓度均为0.5mg/ml，混匀后30℃水浴30-45分钟，离心分离弃去上清液，洗涤沉淀；每次洗涤后的上清液，取10μl作模板进行PCR反应，2％琼脂糖凝胶电泳，以分析东亚飞蝗血细胞的裂解及DNA、RNA的降解的情况；从沉淀中提取DNA或mRNA，并用东亚飞蝗特异性引物和绿僵菌特异性引物做PCR和RT-PCR，以验证是否污染了东亚飞蝗的遗传物质及沉淀是否为绿僵菌菌体。

本发明所采用的蝗虫保守基因为蝗虫的组蛋白基因，并以其保守区段来设计的引物是

H1：5-’ACCAAGGCGGCGAGGAAGA-3’；

H2：5’-TCGAAGAGGCCGACGAGGTAG-3’

本发明所采用的病原真菌菌体保守基因序列为绿僵菌管蛋白基因，并以其保守区段来设计的引物是

T3：5’-AGCCGACCATGAAGAAGTGC-3’，

T4：5’-TGCCTCCAGGGTTTCCAGAT-3’

当然本发明的监控过程中，也可用其他保守序列作为监控序列，但需要注意的是，在所选的这两段序列中，不能含有相似的片段，而且根据这两段序列可设计出比较特异的引物，在供试的样本中只能扩增出单一目的带。

上述细胞裂解缓冲液是由0.606g三羟甲基氨基甲烷，0.584g氯化钠，0.102g六水氯化镁，加80ml去离子水溶解，用盐酸调节pH值至8.0，加水定容至100ml组成；上述核酸降解缓冲液是由0.606g三羟甲基氨基甲烷，0.058g氯化钠，0.584g六水氯化镁，加80ml去离子水溶解，用盐酸调节pH值至7.5，加水定容至100ml组成。

本发明将感病昆虫的血细胞采用一系列酶处理，以破坏和除去昆虫的遗传物质，并加以分离纯化制得昆虫病原真菌菌体。将获得的昆虫病原真菌用来提取DNA和mRNA，经PCR和RT-PCR的验证，无昆虫遗传物质的污染，可用于构建基因文库，也为进一步揭开虫生真菌侵染机制打下坚实基础。

总之，本发明所述方法是从寄主昆虫体内直接获取病原真菌菌体，以分离和克隆昆虫病原真菌菌体侵入蝗虫体内后表达的基因，这对研究它们在致病机理中的作用有着重要的意义。而且本发明进一步对昆虫血细胞裂解及其DNA和RNA降解的条件进行了优化，在优化条件下，不仅去除了感病昆虫血淋巴中的血细胞及DNA和RNA，而且成功地分离和纯化了昆虫病原真菌菌体，为后续研究昆虫病原菌菌体在昆虫体内表达的基因以及它们在致病机理中的作用奠定了基础。

附图说明

图1：从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原菌菌体流程示意图；

图2：所设计的蝗虫特异性引物和绿僵菌特异性引物灵敏度分析；

图3：侵染蝗虫血淋巴酶切前与酶切后镜检图；

图4：用设计的蝗虫特异性引物和绿僵菌特异性引物进行PCR和RT-PCR的结果。

其中，图2-A为蝗虫特异性引物PCR灵敏度分析结果图，1：阴性对照，2-6：蝗虫DNA模板量分别为100pg、10pg、1pg、0.1pg，M：MARKER标准碱基数。

图2-B为绿僵菌特异性引物PCR灵敏度分析结果图，1：阴性对照，2-5：蝗虫DNA模板量分别为100pg、10pg、1pg，M：MARKER标准碱基数。

图3-A为酶解前感病蝗虫血淋巴镜检图，1：蝗虫血细胞，2：绿僵菌。

图3-B为酶解后感病蝗虫血淋巴镜检图，1：绿僵菌。

图4-A为PCR检测从感病昆虫中纯化的绿僵菌DNA纯度；1：阴性对照：无DNA模板+蝗虫特异性引物，2：绿僵菌DNA+蝗虫特异性引物，3：10ng绿僵菌DNA+0.1pg蝗虫DNA+蝗虫特异性引物，4：蝗虫DNA+蝗虫特异性引物，5：阴性对照：无DNA模板+绿僵菌特异性引物，6：阳性对照：绿僵菌基因组DNA模板+绿僵菌特异性引物，7：提取的绿僵菌基因组DNA模板+绿僵菌特异性引物，8：提取的绿僵菌基因组DNA模板+蝗虫特异性引物，M：MARKER标准碱基数。

图4-B为用蝗虫专一引物进行RT-PCR检测提取的绿僵菌菌体DNA中是否存在蝗虫mRNA；1：阴性对照：无DNA模板，2：阳性对照：0.1pg蝗虫mRNA，3：10ng提取的绿僵菌基因组DNA模板+0.1pg蝗虫mRNA，4：10ng提取的绿僵菌基因组DNA，M：MARKER标准碱基数。

具体实施方式

一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法，其特征在于：将感病昆虫的血细胞采用酶处理进行裂解及其DNA和RNA采用酶处理进行降解，再加以分离沉淀，纯化制得病原真菌菌体；在整个酶解过程中，采用PCR检测保守序列监控，最后采用PCR和RT-PCR检测保守序列方法对昆虫病原真菌菌体进行鉴定。

总之，本发明的理论依据是利用动物细胞与真菌细胞结构上的不同而设计的，由于动物细胞最外层是由细胞膜包裹，而细胞膜又是由双层磷脂和膜蛋白构成。所以利用蛋白酶K专门降解蛋白质的特性降解膜蛋白达到破坏动物细胞的目的，而真菌细胞外被细胞壁，其主要成分是多糖，所以蛋白酶K不会破坏真菌细胞，从而达到分离的目的。因此，只要是涉及从动物血淋巴中获取病原真菌，均可采用本发明所述的方法。此外，本发明在酶解过程中，酶解温度采用的是30℃，与其寄生条件(26-30℃)接近，而并未采用蛋白酶K的最适温度37℃，目的是基于为以后更好的了解真菌的侵染机制做准备。避免由于温度的原因造成真菌产生应答机制而出现一些与侵染无关的基因表达。

下面具体地以感病东亚飞蝗血淋巴中分离纯化绿僵菌菌体为例，结合附图对本发明作进一步详述，也正如上段所描述的，本发明不仅限于此。

金龟子绿僵菌菌株CQMa102孢子的活化：本例的金龟子绿僵菌菌株CQMa102(Metarhizium anisopliae var.acridum CQMa102)是从罹病竹蝗僵虫体内分离培养纯化得到，由重庆大学基因工程中心分离纯化，中国微生物所菌种保存中心保存的菌株，保藏编号CGMCC No.0877，其分生孢子存储于30％甘油溶液中，于-80℃超低温冰箱中长期保存。将-80℃保存的金龟子绿僵菌菌株CQMa102接种于1/4SDA平板培养基上进行活化，所用培养基由10～11g/l葡萄糖，2.3～2.7g/l蛋白胨，4.8～5.2g/l酵母浸膏，19～21g/l琼脂组成，并将其pH值调至6.0，菌株在26～28℃黑暗条件下生长7～14d，直至产孢，然后于4℃冰箱中保存备用。

用接种铲轻刮孢子层，将刮下的孢子粉悬浮在灭菌的0.05％吐温80中，用微型旋涡震荡器充分混匀，四层擦镜纸过滤，用血球计数板进行计数，配制10⁸个/ml的孢子悬液。蝗虫在处理前先饥饿2h，再在4℃冷冻30min。每只蝗虫在前胸背板用微量进样器接种含5.0×10⁴～1.0×10⁵个绿僵菌孢子的棉籽油5μl。东亚飞蝗于26±2℃，采用12h光照：12h黑暗的光照方式进行饲养。

收集侵染4天后蝗虫血淋巴，取血部位为蝗虫后腿内侧关节膜。先用70％酒精消毒取血部位，待酒精干后，用无菌针头刺一下后腿内侧关节膜，然后用微量进样枪快速吸取流出的蝗虫血液于盛有300～500μl抗凝血缓冲液(3.8％柠檬酸钠)的1.5ml离心管中(离心管放置于冰上)。被稀释的蝗虫血淋巴，4℃，6000rpm离心5min。弃去上清(血浆)，收集血细胞。

根据血细胞数加入超纯水洗涤三次(血细胞数：洗涤水的体积＝3.0×10⁶个：1000μl)，离心尽量弃尽上清液，根据血细胞数加入细胞裂解缓冲液(0.606g三羟甲基氨基甲烷，0.584g氯化钠，0.102g六水氯化镁，加80ml去离子水溶解，用盐酸调节pH值至8.0，加水定容至100ml)(血细胞数：缓冲液的体积＝1.0×10⁶个：100μl)，混匀后加入10％二烷基磺酸钠(SDS)至终浓度为1％，旋涡混匀，加入蛋白酶K后，30℃水浴1～2小时，离心弃去上清液，沉淀用生理盐水重复洗涤三次，离心弃去上清，沉淀仍然按前面所计的蝗虫血细胞数加入核酸降解缓冲液(0.606g三羟甲基氨基甲烷，0.058g氯化钠，0.584g六水氯化镁，加80ml去离子水溶解，用盐酸调节pH值至7.5，加水定容至100ml)，加入脱氧核糖核酸酶(DNAase I)、核糖核酸酶(RNAase A)，使其终浓度均为0.5mg/ml，混匀后30℃水浴30-45分钟，离心弃去上清液，沉淀用生理盐水重复洗涤三次。每次洗涤后的上清液，取10μl作模板进行PCR反应，2％琼脂糖凝胶电泳，以分析蝗虫血细胞的裂解及DNA降解的情况。沉淀提取DNA或mRNA，并用设计好的蝗虫特异性引物：

根据蝗虫的组蛋白基因保守区段设计引物

H1：5-’ACCAAGGCGGCGAGGAAGA-3’；

H2：5’-TCGAAGAGGCCGACGAGGTAG-3’

绿僵菌特异性引物：根据绿僵菌管蛋白基因序列设计引物

T3：5’-AGCCGACCATGAAGAAGTGC-3’，

T4：5’-TGCCTCCAGGGTTTCCAGAT-3’。

做PCR和RT-PCR，以验证是否污染了蝗虫的遗传物质及沉淀是否为绿僵菌。

本发明将蝗虫的组蛋白基因作为保守序列来检测蝗虫核酸是否存在，在所有酶解完成后，用PCR检测第3次生理盐水清洗上清液，根据PCR扩增带的亮度、有无判断酶解完成情况；PCR扩增检测酶解完成后检上清液中的蝗虫组蛋白基因，无目标扩增产物时，酶解结束；所述绿僵菌菌体的鉴定是指用镜检观察，提取DNA或mRNA后，通过PCR和RT-PCR，用绿僵菌菌体管蛋白基因序列设计引物H1和H2检测是否污染了蝗虫的核酸，T3和T4有无绿僵菌菌体核酸的存在。PCR和RT-PCR扩增检测，无蝗虫组蛋白基因目标扩增产物，绿僵菌菌体管蛋白基因有目标扩增产物时，证明所得沉淀为绿僵菌菌体。

结果表明，将提取的DNA，用蝗虫特异性引物进行PCR反应，PCR产物电泳结果表明(图4-A)：绿僵菌特异性引物能够扩增出PCR产物(见图4-A，Lane7)，说明有绿僵菌DNA的存在，即分离到了绿僵菌细胞。取10ng提取的绿僵菌DNA，用蝗虫特异性引物没有扩增出PCR产物(见图4-A，Lane2、8)，再加入0.1pg蝗虫基因组DNA，能够扩增出PCR产物(见图4-A，Lane3)，证明提取的绿僵菌基因组DNA中没有蝗虫的DNA污染。提取的沉淀DNA用蝗虫特异性引物1、2进行RT-PCR反应，产物电泳结果：取10ng提取的绿僵菌基因组DNA，用蝗虫特异性引物1、2没有扩增出RT-PCR产物(见图4-B，Lane4)，再加入1pg蝗虫mRNA能够扩增出RT-PCR产物(见图4-B，Lane3)，证明所提绿僵菌DNA中没有蝗虫RNA的污染。