金或银纳米粒子的表面功能化及比色检测生物分子的方法

摘要

金或银纳米粒子表面功能化和标记、比色检测生物分子的方法涉及一种表面功能化的金或银纳米粒子作为标记物比色检测生物分子的方法，识别生物分子的探针分子及连接金或银纳米粒子的锚定分子首先通过双功能试剂被共价修饰于高分子的葡聚糖上，构成包裹金或银纳米粒子的修饰物，修饰物经纯化和修饰物上的分子数定量后，再通过修饰物上的锚定基团在金或银纳米粒子表面的自组装，形成葡聚糖分子包裹的金或银纳米粒子。该方法利用金属纳米粒子比色检测生物分子，避免了复杂的检测设备，方法简单且具有高的灵敏度，检测限达到fmol级。

说明书

技术领域

本发明涉及一种表面功能化的金或银纳米粒子作为标记物比色检测生物分子的方法，属于生物分子的纳米标记和检测技术领域。

背景技术

标记分析法是生物分子(核酸、蛋白质等)检测的最主要方法之一。许多生物分子由于本身可供分析的性质较弱，要获得高灵敏度的检测，常常是借助外来的标记物获得可测量的信号来分析。常用的标记物可分为发光标记物、酶标记物、电化学标记物等等。其中发光标记法是最主要的一大类方法，如各种荧光标记、化学发光标记等。发光标记检测的灵敏度很大程度上取决于发光标记物的发光强度。

纳米技术与生物技术的结合将给诊断、治疗、生物分析科学带来新的发展。纳米粒子的应用之一是作为生物分子的标记物。金、银金属纳米粒子化学性质稳定，早期就作为抗体、蛋白质的标记物在免疫分析中被使用。标记抗体、蛋白质主要是利用表面静电吸附，吸附牢固程度很大程度取决于溶液的pH值。然而，这种物理吸附的方法并不适合DNA等其它分子的标记。

DNA分子的金属纳米粒子标记目前是用金纳米粒子标记，采用巯基化的寡核苷酸在金纳米粒子表面自组装的方法(Elghanian R，Storhoff J J，Mucic R C，Letsinger R L，Mirkin C A，Science，1997，277，1078；Storhoff J J，Elghanian R.Mucic R C，Mirkin C A，J Am Chem Soc，1998，120，1959)。巯基化的寡核苷酸商业上是可获得的，但多数巯基化的其它分子商业上不能获得，因此，其它分子通过这种方法被金纳米粒子标记很难实现。用其它种类的金属纳米粒子标记DNA的方法未见报道。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种新的、能使多种生物分子被金和银纳米粒子标记，并利用金或银纳米粒子的颜色高灵敏比色检测生物分子的方法。

技术方案：本发明的金或银纳米粒子表面功能化和标记、比色检测生物分子的方法是识别生物分子的探针分子及连接金或银纳米粒子的锚定分子首先通过双功能试剂被共价修饰于高分子的葡聚糖上，构成包裹金或银纳米粒子的修饰物，修饰物经纯化和修饰物上的分子数定量后，再通过修饰物上的锚定基团在金或银纳米粒子表面的自组装，形成葡聚糖分子包裹的金或银纳米粒子。用这种功能化的金或银纳米粒子比色检测生物分子是以微米尺寸的白色高分子微球为载体，将靶分子溶液和过量的修饰有探针分子的金或银纳米粒子的溶液加入到装载有捕获分子的白色高分子微球的溶液中反应，金或银纳米粒子与白色高分子微球通过靶分子为连接分子形成三明治式的结合，生成呈现金或银纳米粒子颜色的微球，微球离心或过滤分离并洗涤后，微球颜色的深浅与结合的靶分子的量成正比，对照结合了已知量靶分子的微球的颜色，目视或扫描比色测出靶分子的含量。

上述方案中修饰了探针分子和锚定分子的每个葡聚糖分子是通过许多个锚定基团被固定于纳米粒子的表面。葡聚糖分子上含有能与双功能试剂反应的活性官能团或可生成活性官能团的基团，可以是氨基葡聚糖、或羧基葡聚糖或羧甲基葡聚糖。探针分子为能互相识别的生物分子对中的一种，其一端含有可与双功能试剂反应的活性基团，可以为寡核苷酸、或生物素、或抗体、或肽、或蛋白质。锚定分子含有与金或银纳米粒子连接的二硫基团(-S-S-)或巯基基团(SH-)以及与葡聚糖分子连接或与双功能试剂反应的活性基团。双功能试剂是能与氨基反应的琥珀酰亚胺酯、或能与羧基反应的碳二亚胺、或能与醛基反应的腙类化合物。修饰在葡聚糖分子上的探针分子和锚定分子数可以通过偶联时生成化学键的UV吸收定量。

当用修饰了探针分子和锚定分子的葡聚糖分子包裹金或银纳米粒子时，偶联所需的葡聚糖的量通过加入不同量的含有探针分子和锚定分子的葡聚糖到一定量的金或银纳米粒子溶液中测得。包裹不完全时由于缓冲液中盐的存在，纳米粒子发生聚集，溶液改变颜色，UV吸光度发生变化。将溶液过滤并记录溶液中金或银纳米粒子的UV吸光度值可测得完全包裹时所需加入的最少葡聚糖量。将完全包裹时所需最少量的含有探针分子和锚定分子的葡聚糖加入到金或银纳米粒子溶液中，充分混合即生成稳定的金或银纳米粒子探针。

用金或银纳米粒子探针比色检测生物分子时，使用商业上可获得的白色高分子微球(如Bangs，Dynal，Molecular Probe等公司)作载体，连接在白色高分子微球上的捕获分子能特异性地结合靶分子，其一端含有可和微球结合的活性基团，捕获分子可以是寡核苷酸、或生物素、或抗体、或肽、或蛋白质。捕获分子与高分子微球连接的方法由微球制造商提供。

有益效果：金或银纳米粒子作标记物具有制备简单、价廉，化学性质十分稳定的优点，本发明方法除具有这些优点外，还具有以下独特优点：由于探针分子通过多个含巯基的锚定分子被固定于纳米粒子表面，与通常单巯基探针分子修饰的纳米粒子相比，多巯基探针分子修饰的纳米粒子具有高度的稳定性，可在更苛刻的条件下使用(如高盐浓度下、PCR高温过程)。其次，欲连接的分子被修饰在高分子上，整个修饰表层的制备过程不受纳米粒子本身的干扰，具有高的制备产率且易于纯化与定量分析。第三，探针分子修饰到高分子上包裹纳米粒子的方法不仅适用于DNA与纳米粒子的连接，也适用于其它生物分子与纳米粒子的连接。第四，检测利用金属纳米粒子的颜色比色测定。金属粒子的颜色不随时间而变化具有长久稳定性，比色分析避免了复杂的检测设备，方法简单且具有高的灵敏度，检测限达到fmol级。

附图说明

图1.探针分子修饰的纳米粒子与靶分子及装载有捕获分子的微球三明治式结合示意图。1为捕获分子，2为白色微球，3为靶分子，4为探针分子，5为纳米粒子。

图2.(A)直径10nm的金纳米粒子检测DNA的结果，目视检测限为500fmol。从上到下分别是200pmol，50pmol，10pmol，5pmol，500fmol，0mol靶分子对应的颜色。(B)直径20nm的银纳米粒子检测DNA结果，目视检测限为500fmol。从上到下分别是200pmol，50pmol，10pmol，5pmol，500fmol，0mol靶分子对应的颜色。

图3.表面连接了金纳米粒子的白色高分子微球的TEM图。(a)(b)为加入靶分子的样品，(c)为无靶分子的对照。

具体实施方式

实施例1：金纳米粒子标记的寡核苷酸探针测定DNA

寡核苷酸与葡聚糖的偶联：0.16ml，25mg/ml 4-菸酸琥珀酰亚胺酯联氨丙酮腙(C6-succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)和25mg/ml N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP，N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)的无水DMSO溶液被加到4ml，2mg/ml氨基葡聚糖(MW 70KDa)的1×PBS溶液中室温下反应2小时。生成的葡聚糖偶联物以0.1M NaAc(pH＝4.5)为洗脱液用Sephadex G25柱纯化。生成的二硫和腙官能团的量可分别用1，4-二巯基丁二醇(Dithiothreitol)和4-硝基苯甲醛(4-nitrobenzaldehyde)定量。过量的醛基修饰的寡核苷酸加入到葡聚糖偶联物的0.1M NaAc(pH4.5)溶液中反应12h后，用30KDa分子量截止的离心过滤器(Millipore)分离除去未反应的寡核苷酸并H₂O洗两次。寡核苷酸与葡聚糖上腙官能团形成的共价键在360nm的吸收峰(ε₃₆₀＝1.8×10⁴)可对修饰上的寡核苷酸分子数定量。

金纳米粒子标记的寡核苷酸探针制备：修饰的PDP分子中的二硫键可在金纳米粒子表面上自组装而形成葡聚糖包裹的纳米粒子。在一定量的金纳米粒子溶液中加入不同量的寡核苷酸和PDP修饰的葡聚糖，溶液经0.20μm的膜过滤后记录金纳米粒子520nm的UV吸收，用测得的所需葡聚糖量与金纳米粒子溶液混合生成金纳米粒子标记的寡核苷酸探针。生成的金纳米粒子探针没有再纯化。具体步骤为：16μl探针分子修饰的葡聚糖被加到0.75ml，10nm，5.7×10¹² Au纳米粒子/ml溶液中，充分混合后加入0.375ml 1.5M NaCl 30mM磷酸盐(pH7.0)缓冲液，并加入1.2mg BSA，1.2mg葡萄糖和5.6μl Tween-20混合后备用。

金纳米粒子标记的探针测定DNA：200μg链亲合素包裹的白色微球(560nm，Bangs Laboratories，Fishers IN)与过量的生物素修饰的捕获寡核苷酸在1×PBS溶液中室温下反应0.5h，离心分离后用0.5％ Tween-20 1×PBS溶液洗涤三次。加入过量的金纳米粒子标记的寡核苷酸探针及靶DNA在杂交液(1M NaCl20mM柠檬酸钠)室温下杂交1h，反应完成后用0.5％ Tween-20 1×PBS溶液洗涤三次。沉淀重新悬浮于20μl H₂O中并将悬浮液注入微孔板中比色测得靶DNA浓度。

实施例2：银纳米粒子标记的寡核苷酸探针测定DNA

寡核苷酸与葡聚糖的偶联：0.16ml，25mg/ml 4-菸酸琥珀酰亚胺酯联氨丙酮腙(C6-succinimidyl 4-hydrazinonicotinate acetone hydrazone)和25mg/ml N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP，N-succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate)的无水DMSO溶液被加到4ml，2mg/ml氨基葡聚糖(MW 70KDa)的1×PBS溶液中室温下反应2小时。生成的葡聚糖偶联物以0.1MNaAc(pH＝4.5)为洗脱液用Sephadex G25柱纯化。生成的二硫和腙官能团的量可分别用1，4-二巯基丁二醇(Dithiothreitol)和4-硝基苯甲醛(4-nitrobenzaldehyde)定量。过量的CHO-修饰的寡核苷酸探针加入到葡聚糖偶联物的0.1M NaAc(pH4.5)溶液中反应12h后，用30KDa分子量截止的离心过滤器(Millipore)分离除去未反应的寡核苷酸并H₂O洗两次。

银纳米粒子标记的寡核苷酸探针制备：在一定量的银纳米粒子溶液中加入不同量的寡核苷酸和PDP修饰的葡聚糖，溶液经0.20μm的膜过滤后记录银纳米粒子408nm的UV吸收，用测得的所需葡聚糖量与银纳米粒子溶液混合生成银纳米粒子标记的寡核苷酸探针。生成的银纳米粒子探针没有再纯化。具体步骤为：12μl探针分子修饰的葡聚糖被加到0.75ml，20nm，7×10¹⁰ Ag纳米粒子/ml溶液中，充分混合后加入0.375ml 1.5M NaCl 30mM磷酸盐(pH 7.0)缓冲液，并加入1.2mg BSA，1.2mg葡萄糖和5.6μl Tween-20混合后备用。

银纳米粒子标记的探针测定DNA：200μg链亲合素包裹的白色微球(560nm，Bangs Laboratories，Fishers IN)与过量的生物素修饰的捕获寡核苷酸在1×PBS溶液中室温下反应0.5h，离心分离后用0.5％ Tween-20 1×PBS溶液洗涤三次，加入过量银纳米粒子标记的寡核苷酸探针及靶DNA在杂交液(1M NaCl 20mM柠檬酸钠)室温下杂交1h，反应完成后用0.5％ Tween-20 1×PBS溶液洗涤三次，沉淀重新悬浮于20μl H₂O中并将悬浮液注入微孔板中比色测得靶DNA浓度。

实施例3：金纳米粒子标记生物素分子

生物素与葡聚糖的偶联：5mg N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯(SPDP)溶解于100μl，50mg/ml生物素氨己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Biotinamidohexanic acid N-hydroxysuccinimide ester)的无水DMSO溶液，这一溶液在搅拌下被逐滴加到2.5ml，2mg/ml氨基葡聚糖(MW 70KDa)的NaHCO₃(50mM)溶液中室温下反应2小时。生成的葡聚糖偶联物在水溶液中渗析纯化后备用。葡聚糖偶联物上生物素的量可用HABA(4’-hydroxyazobenzene-2-carboxylicacid)定量。

金纳米粒子标记的生物素-葡聚糖偶联物探针制备：在一定量的金纳米粒子溶液中加入不同量的生物素-葡聚糖偶联物，溶液经0.20μm的膜过滤后记录金纳米粒子520nm的UV吸收，用测得的所需葡聚糖量与金纳米粒子溶液混合生成金纳米粒子标记的生物素探针。具体步骤为16μl探针分子修饰的葡聚糖被加到0.75ml，10nm，5.7×10¹² Au纳米粒子/ml溶液中，充分混合后加入0.375ml 1.5M NaCl 30mM磷酸盐(pH7.0)缓冲液，并加入1.2mg BSA，1.2mg葡萄糖和5.6μl Tween-20混合后备用。