同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法

摘要

本发明提供一种同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法，属植物保护领域。根据烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒核苷酸序列分别设计两对特异性引物TB2F/TB2R(检测烟草丛顶病毒)及TVCPF/TVCPR(检测烟草扭脉病毒)。提取植株组织的总RNA后，采用双重RT－PCR的方法，同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。该发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术以及总核酸提取法和传统RT－PCR方法的缺点，只用相当于一次普通RT－PCR的时间和试剂，就可以方便、特异、灵敏的同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速、灵敏、特异对烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒进行检测的方法，属植物保护领域。

背景技术：

烟草丛顶病是近年来在世界范围内一些主要种烟区频繁爆发的一种毁灭性烟草病害，病害由烟草丛顶病毒(TBTV)和烟草扭脉病毒(TVDV)复合侵染引起。烟草丛顶病的症状表现为叶片出现淡褐色坏死斑，随后的新生叶片逐渐变小变圆并褪绿或黄化，植株矮缩。烟草丛顶病毒单独侵染烟草后引起的症状与烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒复合侵染引起的症状基本一致，而烟草扭脉病毒单独侵染烟株后一般无明显症状。因此，通过症状观察很难区分发病烟株是由烟草丛顶病毒单独侵染引起还是由烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒复合侵染引起。

通常检测病毒的方法有指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和分子生物学技术等。但目前还没有烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的指示植物报道，无法用此方法进行病毒检测。烟草丛顶病毒不形成普通的病毒粒体，在电镜下无法看到病毒粒体，而烟草扭脉病毒为球形粒体，且在植株体内含量很少，很难在电镜下观察到。烟草丛顶病毒不编码外壳蛋白，无法制备血清，虽然烟草扭脉病毒可编码外壳蛋白，但目前还没有关于烟草扭脉病毒血清制备的报道，所以不能利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测这两个病。目前应用最为广泛的检测烟草丛顶病的方法是，利用总核酸提取检测与烟草丛顶病相关的小分子RNA。该方法只能间接检测植株体内是否存在烟草丛顶病毒，而不能检测烟草扭脉病毒。RT-PCR的方法被广泛应用于病毒检测，具有操作简单、特异性和灵敏度较高的特点。但是普通RT-PCR的方法每次只能检测一个病毒，对于两个病毒复合侵染的情况则要针对各个病毒单独检测，既浪费时间，又加大了检测成本。

发明内容：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种同步、快速、灵敏、特异地检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的方法。

本发明的具体步骤是：

1、引物设计：

(1)根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，引物序列如下：

TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′

TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′

(2)根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(基因登录号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的特异性引物对TVCPF/TVCPR，引物序列如下：

TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′

TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′

(3)引物对扩增目的核酸带的大小如下：

  引物名称  引物序列  检测病毒名称  目的片段大小  TB2R   TB2F  TVCPF   TVCPR  5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′   5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′  5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′   5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′   烟草丛顶病毒    烟草扭脉病毒   550bp    620bp

2、总RNA提取：

(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；

(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；

(3)12,000rpm离心10min；

(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；

(5)12,000rpm离心10min；

(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；

(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；

3、RT-PCR扩增

(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H₂O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；

(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl₂3μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H₂O 33μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、53-60℃退火1min、72℃延伸2min，共30-40次循环，最后72℃延伸10min；

4、电泳检测：

取5μL PCR产物经1％-3％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，在仅感染烟草扭脉病毒的烟株中可以扩增到一条620bp的核酸带，而复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株中可以同时扩增到550bp和620bp的核酸带。

其中：所述的退火温度53-60℃，也可以是53-54℃或57-59℃；所述的循环数30-40次，也可以是31-34次；所述的琼脂糖凝胶浓度1％-3％，也可以是1.6％-1.9％。

本发明的有益效果是根据烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒核苷酸序列设计的特异性引物TB2F/TB2R(检测烟草丛顶病毒)、TVCPF/TVCPR(检测烟草扭脉病毒)，因此可以方便、特异、灵敏的同步检测烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。克服了烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒不能用指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术进行检测以及总核酸提取法和传统RT-PCR方法一次只能检测一种病毒等缺点，只用相当于一次普通RT-PCR的时间和试剂，就可以同步检测出烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒。

说明书附图：

图1是烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的电泳检测图。

具体实施方式：

实例一：

以已知的复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株和分别感染烟草丛顶病毒、烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。

1、引物设计：

(1)根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，引物序列如下：

TB2R 5′-GACACATGCTGGTCAAA-3′

TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′

(2)根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(基因登录号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的特异性引物对TVCPF/TVCPR，引物序列如下：

TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′

TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′

(3)引物对扩增目的核酸带的大小如下：

  引物名称  引物序列  检测病毒名称  目的片段大小  TB2R   TB2F  TVCPF   TVCPR  5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′   5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′  5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′   5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′   烟草丛顶病毒    烟草扭脉病毒   550bp    620bp

2、总RNA提取：

(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；

(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；

(3)12,000rpm离心10min；

(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；

(5)12,000rpm离心10min；

(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；

(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；

3、RT-PCR扩增

(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H₂O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；

(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl₂3μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H₂O 33μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、53℃退火1min、72℃延伸2min，共30次循环，最后72℃延伸10min；

4、电泳检测：

取5μLPCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；

5、结果分析：

在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，在仅感染烟草扭脉病毒的烟株中可以扩增到一条620bp的核酸带，而复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株中可以同时扩增到550bp和620bp的核酸带；而健康植株扩增不到任何核酸条带。

实例二：

以已知的复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株和分别感染烟草丛顶病毒、烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。

1、引物设计：

(1)根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，引物序列如下：

TB2R 5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′

TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′

(2)根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(基因登录号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的特异性引物对TVCPF/TVCPR，引物序列如下：

TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′

TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCA ATTGC-3′

(3)引物对扩增目的核酸带的大小如下：

  引物名称  引物序列  检测病毒名称  目的片段大小  TB2R   TB2F  TVCPF   TVCPR  5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′   5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′  5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′   5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′   烟草丛顶病毒    烟草扭脉病毒   550bp    620bp

2、总RNA提取：

(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；

(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；

(3)12,000rpm离心10min；

(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；

(5)12,000rpm离心10min；

(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；

(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；

3、RT-PCR扩增

(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H₂O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transeriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；

(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl₂3μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H₂O 33μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、60℃退火1min、72℃延伸2min，共40次循环，最后72℃延伸10min；

4、电泳检测：

取5μLPCR产物经3％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；

5、结果分析：

在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，在仅感染烟草扭脉病毒的烟株中可以扩增到一条620bp的核酸带，而复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株中可以同时扩增到550bp和620bp的核酸带；而健康植株扩增不到任何核酸条带。

实例三：

以已知的复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株和分别感染烟草丛顶病毒、烟草扭脉病毒的烟株为检测对象，并以健康材料为阴性对照。

1、引物设计：

(1)根据已报道的烟草丛顶病毒的核苷酸序列(基因登录号为AF402620)设计扩增烟草丛顶病毒部分复制酶基因的特异性引物对TB2R/TB2F，引物序列如下：

TB2R 5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′

TB2F 5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′

(2)根据已报道的烟草扭脉病毒的核苷酸序列(基因登录号为AJ575129)设计了扩增烟草扭脉病毒外壳蛋白基因的特异性引物对TVCPF/TVCPR，引物序列如下：

TVCPF 5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′

TVCPR 5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′

(3)引物对扩增目的核酸带的大小如下：

  引物名称  引物序列  检测病毒名称  目的片段大小  TB2R   TB2F  TVCPF   TVCPR  5′-GACACATGCTGGTCA AA-3′   5′-TGGAGTCCACAACAACTC-3′  5′-ATGAATACGGGCGGAGCTAG-3′   5′-CTATTTGGGGTTGTGCAATTGC-3′   烟草丛顶病毒    烟草扭脉病毒   550bp    620bp

2、总RNA提取：

(1)称取烟草叶片50mg，放入研钵中，加入1mL Trizol试剂(购自上海生工生物工程有限公司)研磨；研磨液倒入1.5mL离心管中；

(2)在装有研磨液的离心管中加入400μL氯仿，混匀后静置5min；

(3)12,000rpm离心10min；

(4)上清液移至一新1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；

(5)12,000rpm离心10min；

(6)弃上清，沉淀用1mL 70％乙醇洗涤，干燥10min；

(7)沉淀用40μL DEPC处理水悬浮，-20℃保存备用；

3、RT-PCR扩增

(1)反转录合成cDNA：取提取的总RNA模板3μL，加入引物TB2R和TVCPR各1μL，7.5μL RNAase-free H₂O，充分混匀后70℃温浴10min，迅速冰浴5min；加入5×AMV BUFFER 4μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，RNase Inhibitor(40u/μL)0.5μL，AMV Reverse Transcriptase(5u/μL)1μL，轻弹管壁混匀，稍离心后室温10min，42℃保温60min；

(2)PCR扩增：取10×PCR Buffer 5μL，dNTPs(10mM/dNTP)2μL，25mM MgCl₂3μL，引物TB2R、TB2F、TVCPF、TVCPR各1μL，cDNA产物2μL，Tag DNApolymerase(5u/μL)1μL，dd H₂O 33μL；轻弹管壁混匀稍离心后94℃预变性4min，94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min，共35次循环，最后72℃延伸10min；

4、电泳检测：

取5μLPCR产物经2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和120V的电压下电泳1小时后，在0.5μg/mL的溴化乙锭染色液中染色15min，用紫外透射仪观察；

5、结果分析：

在仅感染烟草丛顶病毒的烟株中可以扩增到一条550bp的核酸带，在仅感染烟草扭脉病毒的烟株中可以扩增到一条620bp的核酸带，而复合感染烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒的烟株中可以同时扩增到550bp和620bp的核酸带；而健康植株扩增不到任何核酸条带。