灭活生物制品中病毒和去除细菌内毒素的方法

摘要

本发明涉及一种灭活生物制品中病毒和去除细菌内毒素的方法，将生物制品或中间品用NaOH溶液调pH达12.0±0.2，在25±1℃下静置孵放至少1小时，然后以HCl溶液复调至制品所需pH值。本法对所有的脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有很好的灭活效果，而且在灭活病毒的同时，还可一并去除细菌内毒素，操作简单，稳定性好，不会引入对人体有害的物质，确保制品的安全性，保持制品的生物活性。本方法以分别甲肝病毒(HAV)、鸭乙肝病毒(DHBV)、肾综合症出血热病毒(HFRsV、及狂犬病毒(PRV)、乙型脑炎病毒、脑心肌炎病毒及爱滋病毒等多种病毒为指示病毒进行了大量试验，均取得了较好的灭活效果，并用鳖试剂法(TAL)和家兔检测热原均合格。

说明书

技术领域

本发明涉及一种灭活生物制品中病毒并可同时去除细菌内毒素的方法。属生物制品病毒灭活领域。

背景技术

以生物体、生物脏器及血液的提取物为原料制成的药品、食品、保健品等产品被称为生物制品。生物体、生物脏器特别是血液中含有各种类传染性病毒及细菌内毒素，病毒主要有DNA和RNA两大类，从病毒结构有脂包膜病毒及非脂包膜病毒，具体病毒有HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV和细小病毒B19等等，种类繁多。为了确保生物制品使用的安全性，需要在生物制品生产过程中，对中间品或制成品进行去除/灭活病毒和除细菌内毒素的处理。

目前去除/灭活病毒主要有以下几种方法：

1.巴斯德消毒法(巴氏消毒法)和干热法(80℃加热72小时)，灭活效果较为肯定，但有时由于对一些细胞因子的生物活性影响较大而不能使用。

2.有机溶剂/去污剂(S/D)处理法，灭活病毒全过程要求严格，而且对非包膜病毒无效。

3.纳米膜过滤法，只有膜孔径比病毒有效直径小才可使用，有很大的局限性，灭活病毒的效果易受多种因素影响，且必须与其它方法联合使用。

4.低pH孵放法，此法可灭活几种脂包膜病毒，但灭活效果难以控制。

以上的病毒灭活方法均不能同时适用于脂包膜病毒和非脂包膜病毒，效果不完全，因此难以一次灭活所有病毒，一般需几种方法联合使用。以上方法实施效果受许多因素的影响，稳定性差，且不能同时去除热原，无法兼顾内毒素的去除。细菌内毒素需另采用超滤法或层析法等方法除去，前者主要适用于小分子量的输液药品，如注射用水等；后者应用范围较广，但设备昂贵，成本高，且每批处理量有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、经济的灭活生物制品中病毒和去除细菌内毒素的方法，本方法对生物制品灭活病毒及去除内毒素均有效，在灭活脂包膜病毒和非脂包膜病毒的同时，可一并去除细菌内毒素，确保制品的安全性，保持制品的生物活性。

本发明方法按下步骤：

生物制品或中间品用NaOH溶液调pH达12.0±0.2，在25±1℃下至少静置孵放1小时，然后以HCl溶液复调至制品所需pH值。

所说的静置孵放时间最好是1.5～2小时。

所说的NaOH溶液浓度最好是3～5mol/L。

所说的HCl溶液最好是2～4mol/L。

如上所述，本发明采用了碱处理加静置孵放的灭活生物制品中病毒的方法，本法对所有的脂包膜病毒和非脂包膜病毒均有很好的灭活效果，而且本法在灭活病毒的同时，还可将细菌内毒素一并去除，不但灭活了生物制品中的病毒，同时也去除细菌内毒素，二者无需分步处理，是一个经济、有效的方法。操作简单，稳定性好，不会引入对人体有害的物质，确保制品的安全性，保持制品的生物活性。本方法以分别甲肝病毒、鸭乙肝病毒、肾综合症出血热病毒、及狂犬病毒、乙型脑炎病毒、脑心肌炎病毒及爱滋病毒等多种病毒为指示病毒进行了大量试验，均取得了较好的灭活效果，并用鳖试法(TAL)和家兔检测热原均合格。

具体实施方式

下面通过实施例进一步说明本发明方法灭活病毒的效果，各例试验用样品人神经生长因子注射液中间品均由南京军区军事医学研究所提供。

用于试验的三批样品质量参数如下表：：

  样品批号  20030126  20030214  20030222  蛋白质含量(mg/ml)  pH值  18.064  10.979  16.820  10.970  15.576  10.928

实施例1人神经生长因子注射液中间品伪狂犬病毒的灭活试验

指示病毒：伪狂犬病毒，加入滴度为8.00LgTCID₅₀/ml

培养用细胞：PK-15细胞。

一.病毒灭活按下步骤：

三批样品各取45ml，分别加入5ml伪狂犬病毒，同时加入内毒素，浓度为4EU/ml，混匀，用4mol/L NaOH调至pH值12±0.1，等量分装至5个离心管，8ml/管，密封，置孵箱25℃±1℃下孵育，分别于15、30、60、90、120分钟取样，立即加入3mol/L HCl将pH值调至中性。

经以上处理后的样品于4℃下离心(4000rpm)30分钟，取上清过滤装至小离心管，1.2ml/管，4管/取样点，-70℃下冻存备检测。

二.中性对照

每批样品用3mol/L HCl调pH至中性，每批取18ml，加入2ml伪狂犬病毒，混匀后加入40μl培养液，等量分装至2个离心管，8ml/管；其中一管样品密封，置孵箱25℃下孵育120分钟后立即加入80μl培养液，4℃下离心(4000rpm)30分钟，取上清分装，-70℃下冻存备检测。另一管样品不经孵育(即孵育时间为零)即加入80μl培养液，同样在4℃下离心(4000rpm)30分钟，取上清分装，-70℃下冻存备检测。

三.采用96孔细胞病变法进行病毒滴定，按Karber法计算。验证结果如下；

三批人神经生长因子注射液中间品经本发明方法灭活后，残余伪狂犬病毒滴度均低于本试验最低检测限(0.50LgTCID₅₀/0.1ml)，见表1。

表1本实施例经碱性灭活病毒处理后的样品与中性对照样品的残余伪狂犬病毒滴度值。

  样品  25℃孵育  时间(分钟)  残余伪狂犬病毒滴度(LgTCID₅₀/0.1ml)  20030126批  20030214  20030222  碱  性  灭  活  15  30  60  90  120  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  ≤0.50  中对  性照  0  120  5.75  5.12  5.88  4.88  5.88  5.00

注：本试验样品中病毒最低检测限为≤0.50LgTCID₅₀/0.1ml。

三批样品可灭活所加入指示病毒PRV分别为：

20030126批≥5.25LgTCID₅₀/0.1ml，

20030214批≥5.38LgTCID₅₀/0.1ml，

20030222批≥5.38LgTCID₅₀/0.1ml。

用鳖试剂法测样品内毒素为阴性，说明本方法灭活病毒的同时能一并除去内毒素。样品各项指标检测均符合要求，说明本灭活病毒的方法不会对生物制品的质量产生不良影响。

实施2人神经生长因子注射液中间品Sindbis病毒的灭活试验

指示病毒：Sindbis，滴度为7.34LgTCID₅₀/ml。

培养用细胞：BHK-21，滴定方法：6孔盘蚀斑法。

病毒灭活按下步骤：

三批样品各取20ml，用3mol/L HCl调至中性。

三批样品各取45ml，加入Sindbis病毒5ml，用4mol/L NaOH调至pH值12±0.1，每批以8ml/管分装为5个离心管，25℃±1℃下孵育，分别于15、30、60、90、120分钟后取样，立即加入80μl 3mol/LHCl将pH值调至中性。

以上灭活病毒后的样品离心(4000rpm)30分钟，0.22μm膜过滤，上清分装至小离心管中，每批4管，-70℃下冻存备检测。

采用BHK-21细胞蚀斑法，结晶紫染色，记录蚀斑数，计算病毒残余滴度及下降滴度见表2。

表2人神经生长因子不同孵育时间的Sindbis病毒灭活效果

  25℃孵育  时间(分钟)  15  30  60  90  120  20030126批  20030214  20030222  残余滴度  下降滴度  残余滴度  下降滴度  残余滴度  下降滴度  0.60  0.30  0.30  无  无  4.17  4.47  4.47  ＞4.47  ＞4.47  1.08  0.48  0.00  无  无  3.64  4.24  4.42  ＞4.72  ＞4.72  0.95  0.30  0.30  无  无  3.86  4.51  4.51  ＞4.81  ＞4.81

注：滴度单位为Lg PFU/ml

从表2可见，25℃孵育时间为90分钟及120分钟的样品，病毒被完全灭活。

实施例3人神经生长因子注射液中间品EMCV病毒的灭活试验

指示病毒：EMCV，滴度：7.50LgTCID₅₀/0.1ml。

培养用细胞：Vero，滴定方法：96孔微量病变法。

病毒灭活：同实施例2(除加入的病毒Sindbis改为EMCV外，其余均与实施例2相同)。

病毒检测方法：采用Vero细胞96孔微量病变法。

病毒滴定结果表明：三批人神经生长因子加入指示病毒EMCV，经本发明方法灭活后病毒检测结果如表3。

表3

 孵放时间 (分钟)  20030126批  20030214批  20030222批  残余滴度  下降滴度 残余滴度  下降滴度    残余滴度下降滴度 15 30 60 90 120  1.75  1.25  ≤0.5  ≤0.5  ≤0.5  3.00  3.50  ≥4.25  ≥4.25  ≥4.25 1.88 1.00 ≤0.5 ≤0.5 ≤0.5  3.64  3.88  ≥4.38  ≥4.38  ≥4.38    1.75    1.25    ≤0.5    ≤0.5    ≤0.5 3.86 3.75 ≥4.75 ≥4.75 ≥4.75

注：滴度单位为LgTCID₅₀/0.1ml。

由表3可见，本方法可灭活该病毒滴度为：

20030126批＞4.250LgTCID₅₀/0.1ml；

20030214批＞4.380LgTCID₅₀/0.1ml；

20030222批＞4.750LgTCID₅₀/0.1ml。