高通量蛋白质合成系统及使该系统自动运行的合成装置

摘要

开发蛋白质和RNA等的生命高分子的高通量的试管内合成反应法的系统技术。详细而言，是无细胞系合成系统以及采用该系统的自动合成机，该系统是以模板物质为原料的合成系统，其特征在于包括以下的工序、其控制工序或者其组合：1)使模板物质、基质以及反应溶液接触，导入合成反应体系中。2)在合成速度略降低的前后或合成反应即要停止的前后或者这些状态的过程中，将反应体系置于合成反应体系外，进行溶液的稀释处理。3)稀释处理以后进行浓缩处理。4)将反应体系回复至合成反应体系中。或者1)使模板物质、基质以及反应溶液接触，导入合成反应体系中。2)在合成速度略降低的前后或合成反应即要停止的前后或者这些状态的过程中，将反应体系置于合成反应体系外，进行溶液的浓缩处理。3)浓缩处理以后进行稀释处理。4)将稀释的反应体系回复至合成反应体系中。

说明书

本申请请求为参照而在此援引的日本专利申请号2003-122930及2003-281500的优先权。

技术领域

本发明涉及由模板物质开始的无细胞合成系统。更详细而言，涉及以模板物质作原料合成物质时为达到合成反应最大效率的系统。同时，涉及为使该系统自动运行的合成装置。

背景技术

作为在生物体外合成蛋白质和RNA等生物体高分子的方法，将那些反应中所必需的基质、离子类、缓冲液、细胞提取液以及合成酶置于试管内调制而进行反应的所谓分批处理方式从古沿用至今。但是，这种分批处理反应法，由于它的反应原理而引发基质浓度随着反应的进行而下降、具有抑制合成作用的副产物浓度上升等，从而使得合成反应在短时间内停止，其结果是目的生成物产量降低，具有很大的限制。前苏联的A.Spirin等人报告通过利用超过滤膜、透析膜或者在树脂上固定翻译模板的柱层析法等，可以连续供给氨基酸和ATP、GTP等的能量源以及基质，同时可以连续地从反应系统中去除目的生成物以及副产物的连续式无细胞蛋白质合成法(非专利文献1)。但是，使用这些半透膜和超级过滤柱的连续法必须组装复杂的装置，而且处理烦杂，因而需要充分的经验。还有，这种方式同时在反应系统自动化上存在很大难点。

远藤等人发明了不采用半透膜可以连续供给基质和去除副产物的接触界面扩散法(专利文献1)作为解决这些问题的方法。按照该方法可以不使用特别的反应装置合成大量的蛋白质。但是，该方法是以分子扩散原理为基础，具有为了合成必要量的蛋白质需要较长时间的缺点，其有待解决。

进而，试管内的RNA合成法，特别是即使在无细胞蛋白质合成反应中所必需的翻译模板mRNA的高通量(バイスル一プツト)合成法中也存在蛋白质的无细胞合成法中所见到的问题，作为课题有待解决。远藤等人进行RNA合成法的研究，研制了利用透析膜的连续合成法，这一方式是大幅度提高分批法的性能从而合成产量极高的RNA的合成法(专利文献2)。但是，采用这一半透膜等的RNA连续合成法需要组装复杂的装置，而且处理烦琐需要充分的工作经验。进而，该方式在反应系统自动化方面存在很大难点。

后基因组时代的今天，作为蛋白质和RNA等生物体高分子的高通量合成法中所要求的必要条件，可考虑以下几点。1)可以在短时间内大量合成；2)在短时间内可以合成多种类的分子；以及3)以单纯的原理为基础，可以获得使反应装置自动化的技术要素等。特别是1)以及2)的必要条件，不仅从单纯的合成价格低的角度，而且为了在保持具有相对不稳定物性的蛋白质的活性状态下来制备是极为重要的。

(专利文献1)WO02/24939

(专利文献2)WO01/27260

(非专利文献1)Spirin，A.et al.(1993)Meth.in Enzymol.，217，123-142

发明内容

本发明的课题，与利用半透膜等的复杂装置的连续式合成法的原理完全不同，是提供蛋白质和RNA等生物体高分子的高通量试管内合成反应法的技术系统以及利用该系统的自动合成装置。由此，可以使以解析基因产物的RNA和蛋白质等的结构·功能为目的、简便且有效地进行全面制备和大量生产成为可能。

本发明为了解决上述课题，在以模板物质为原料的合成系统中进行以长时间维持它的高反应速度为目的的各种研究，结果通过包括以下的工序、其控制机构或者其组合的无细胞系统以及利用该系统的自动合成装置的完成，实现了课题的解决。

即，本发明如下。

1.无细胞系合成系统，其是以模板物质为原料的合成体系，其特征为含有以下的工序、其控制工序或者其组合：

1)使模板物质、基质以及反应溶液接触，导入合成反应中，

2)在合成速度略为降低的前后、合成反应即要停止的前后或者在这些状态的过程中，对反应溶液进行稀释处理，

3)在稀释处理后进行浓缩处理，

4)通过被浓缩的反应体系进行合成反应；

或者

1)使模板物质、基质以及反应溶液接触，导入合成反应中，

2)在合成速度略为降低的前后、合成反应即要停止的前后或者在这些状态的过程中，对反应溶液进行浓缩处理，

3)在浓缩处理后进行稀释处理，

4)通过被稀释的反应体系进行合成反应。

2.前项1的系统，其中，通过浓缩处理将副产物去除至反应体系外。

3.前项1或者2的系统，其中，通过稀释处理将基质、能量源和/或模板物质补充至反应体系内。

4.前项1的系统，其特征在于，多次重复1)～4)工序。

5.前述1～4项中任一项所述的系统，其中，模板物质是转录模板。

6.前述1～4项中任一项所述的系统，其中，模板物质是翻译模板。

7.前项6的系统，其中，反应溶液是包括细胞提取液。

8.无细胞系合成系统，其中，将通过前项5的系统得到的转录产物生成系统和通过前项6或者7的系统得到的翻译产物生成系统组合起来。

9.合成试剂盒，至少包括一种在利用前述1～8项中任一项所述的系统而由模板物质开始的无细胞系合成方法中所使用的试剂。

10.从模板物质开始的无细胞系合成方法，其中，利用前述1～8项中任一项所述的系统。

11.从模板物质开始的无细胞系合成装置，其中，利用前述1～8项中任一项所述的系统。

12.无细胞系合成装置，其是用于自动实施前述1～8项中的任一项所述的系统的装置，其中，为了多次实施利用蛋白质合成反应速度高的合成反应初期相的合成系统，至少装备有以下控制机构：

(1)开始合成的机构，

(2)将反应液浓缩的机构，

(3)将反应液稀释的机构，

(4)使合成反应再活化的机构，

(5)使上述(2)～(4)机构重复运作的机构；

或者

(1)开始合成的机构，

(2)将反应液稀释的机构，

(3)将反应液浓缩的机构，

(4)使合成反应再活化的机构，

(5)使上述(2)～(4)机构重复运作的机构。

13.前项12中所述的合成装置，其中，将反应液浓缩的机构是采用超过滤膜的机构，使反应液通过超过滤膜去除至反应体系外时，反应液中不能通过超过滤膜的物质被浓缩在反应系统内。

14.前项13中所述的合成装置，其中，在将反应液浓缩的机构中，反应液向反应体系外去除时，采用离心机和/或吸引泵。

15.前项12中所述的合成装置，其中，将反应液稀释的机构是向反应液中添加稀释溶液或者基质溶液。

16.前项11～15中所述的合成装置，其中，在无细胞蛋白质合成工序中，为了自动实施从转录模板直至生成在翻译模板上编码的蛋白质的工序，至少具备以下一种控制机构：

(1)可变控制反应容器内温度的机构；

(2)向反应容器内分注样品或者试剂的机构；

(3)运送反应容器的机构；

(4)沉淀以及浓缩过滤的机构。

17.用于实施前述1～8项中任一项中所述的系统的程序，其中，为了多次实施利用蛋白质合成反应速度高的合成反应初期相的合成系统，包括以下的信息处理机构：

(1)以反应容器的容积和反应液浓度的信息为基础，设定单位时间的合成量变成减少倾向过程之前的合成反应初期相范围内的合成时间的信息处理机构，

(2)达到(1)的合成反应初期相范围内的合成时间时，将稀释溶液添加至反应容器内，将反应液设定在可以进行实质性合成反应的浓度范围以外的信息处理机构，

(3)在(2)之后，浓缩反应容器中的反应液，为使因添加稀释液而增加的反应液的液量回到原来液量而设定的信息处理机构，

(4)在(3)之后，为了再开始合成反应而设定反应最适温度的信息处理机构，

(5)为了多次重复(1)～(4)的信息处理机构；

或者

(1)以反应容器的容积和反应液浓度的信息为基础，设定单位时间的合成量在变成减少倾向过程之前的合成反应初期相范围内的合成时间的信息处理机构，

(2)达到(1)的合成反应初期相范围内的合成时间时，浓缩反应容器中的反应液，将反应液设定在可以进行实质性合成反应的浓度范围以外的信息处理机构，

(3)在(2)之后，添加稀释溶液至反应容器中，为使因浓缩而减少的反应液的液量回到原来液量的信息处理机构，

(4)在(3)之后，为了再开始合成反应而设定反应最适温度的信息处理机构，

(5)为了多次重复(1)～(4)的信息处理机构。

18.编入了前项17中所述的程序的无细胞系统合成装置，其特征在于，通过该程序的数据处理与该装置进行协同工作，运行合成开始、反应液的稀释·浓缩、合成反应的再活化的机构，可以多次反复实施利用蛋白质合成反应速度高的合成反应初期相的合成系统。

19.通过前项11～16、18中所述的合成装置合成的蛋白质。

附图说明

图1：显示本发明的无细胞蛋白质合成方法与通过分批法的过去的无细胞蛋白质合成方法的实验结果的差异图。

图2：显示除了改变小麦胚芽提取液的浓度以外、与实施例1同样地进行无细胞蛋白质合成的实验结果图。

图3A：是除了小麦胚芽提取液的浓度为800D、GFPmRNA的浓度为640μg/ml、使实施稀释以及浓缩的不连续反复操作的间隔变化以外，与实施例1同样地进行无细胞蛋白质合成的实验结果图。

图3B：显示由于实施稀释以及浓缩的不连续反复操作的间隔不同而导致的合成的GFP数量差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图。

图4：显示通过具有过滤膜的浓缩器和送液泵的组合而可以除去本发明的无细胞蛋白质合成方法中生成的副产物的结构的一个模式图。

图5：使用图4所示的利用过滤膜和送液泵去除副产物的结构，经本发明的无细胞蛋白质合成方法进行蛋白质合成的实验结果图。

图6：A显示除了采用600D的小麦胚芽提取液、450g/ml的dihydrofolate reductase(DHFR)的mRNA作为翻译模板以外、使用与实施例1同样的翻译反应液，除了以1小时的间隔实施稀释和浓缩的不连续重复操作2次以外、与实施例1同样地进行无细胞蛋白质合成时的实验结果图。

B是显示采用本发明的方法合成在N末端融合了抗生蛋白链菌素的GFP融合蛋白、在体系以外单独分离GFP融合蛋白的实验结果的电泳图。

图7是显示本发明的RNA合成方法和利用分批法的过去的体外合成RNA法之间的实验结果的差异图。

图8是显示采用以乙醇沉淀纯化的mRNA和未经纯化的mRNA分别作为翻译模板，实施本发明的无细胞蛋白质合成方法的实验结果图。

图9是显示利用原样采用实验例7的转录反应后的转录反应液而制备的翻译反应液来进行本发明的无细胞蛋白质合成方法的实验结果图。

图10：自动合成装置的概略图

图11：显示装置实施例结果的SDS-PAGE图

(符号说明)

1：过滤浓缩器

2：送液泵

3：反应槽

4：装有(RNA)基质溶液的容器

5：送液切换阀

6：容器

T1：管T1

T2：管T2

T3：管T3

T4：管T4

T5：管T5

①：模板用板

②：试剂槽1(转录反应用溶液)

③：试剂槽2(翻译反应用溶液)

④：试剂槽3(稀释溶液)

⑤：300μl接口管(チツプ)⑥：20μl接口管

⑦：机械臂

⑧：分注机1

⑨：分注机2

⑩：接收转录·滤液用板

：接口管废弃口

：恒温槽1

：MTP(multi titer plate)操作台

：翻译用板

：升降台

：离心机废液口

具体实施方式

本发明的合成法，其特征在于，将以模板物质为原料的一般的分批方式或者连续扩散分批方式的、反应速度高的合成反应初期相的特性最大限度地利用。还有，本发明的合成装置的特征在于，使最大程度利用这一特性的合成法能够自动化。

它的方法是在合成速度略为降低的前后或者合成反应即要停止的前后、或者在这些状态的过程中，进行反应溶液的稀释处理或浓缩处理。通过这些稀释处理或浓缩处理，对以模板物质为原料的合成中所必需的基质、能量源、离子类、缓冲液以及模板物质等成分进行补充或浓缩。

这些稀释或者浓缩的反应溶液，其后，在被稀释的情况下进行浓缩处理、在被浓缩的情况下进行稀释处理。通过这种处理，使反应溶液回到原来的反应最适浓度。通过该浓缩处理，可以去除或者分离反应溶液中的成分，可以使反应产物和/或反应副产物得到回收和/或去除。通过这种浓缩或稀释，可以使合成反应的各种要素再次达到最适浓度。而且，这种稀释及浓缩处理，通过不连续地反复进行，可以合成大量的蛋白质。

本发明的原理是，对利用模板物质的合成反应不连续地重复进行稀释以及浓缩的合成方法。

另外，本发明的自动合成装置的原理是，使不连续地重复进行的合成方法自动化。

在本发明中，以模板物质为原料的合成体系之一是以mRNA为模板的蛋白质的翻译合成体系，特别是使用蛋白质合成用细胞提取液的无细胞蛋白质合成体系，该提取液是将细胞内的作为蛋白质翻译装置的核糖体等从细胞中取出而利用的。其另一种是指将RNA聚合酶作为酶、通过转录模板进行试管内转录反应的RNA合成体系。

(无细胞蛋白质合成体系)

在无细胞蛋白质合成体系中，与利用大肠杆菌提取物的无细胞蛋白质合成体系相比，利用小麦胚芽提取物的合成体系的核酸分解酶活性较低，而且，具有翻译活性稳定且较高的特性(Madin K.et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，559-564)，在以质粒为模板的转录·翻译体系中可以高效率地合成蛋白质(PCT/JP99/04088)。以下，在本发明中，以在小麦胚芽无细胞蛋白质合成体系以及在该合成体系中可以发挥作用的转录模板的合成法为例予以说明，但是，本发明的基本原理也可应用于采用其它的源自微生物和动物细胞的细胞提取物的无细胞蛋白质合成体系以及用于该体系的转录模板的合成体系。

(细胞提取物)

作为细胞提取物的市售品，有源自大肠杆菌的E.coli S30 extractsystem(Promega)、RTS 500 Rapid Translation System(Roche)、源自兔网状红细胞的Rabbit Reticulocyte Lysate System(Promega)、源自小麦胚芽的Proteios(^TM)(TOYOBO)等。其中，特别优选采用源自植物种子的胚芽提取物，可以例举出小麦、大麦、稻、玉米、菠菜的种子等，以采用小麦胚芽提取液的体系最为合适。

(翻译产物生产体系)

这里，所谓翻译产物生产体系是从生物体提取含有细胞内的作为蛋白质翻译装置的核糖体等成分，将翻译模板、成为基质的核酸、氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液以及其它有效因子加入到该提取液内，使之在试管内反应的方法。

(无细胞蛋白质合成体系)

这里，所谓无细胞蛋白质合成体系是从生物体提取含有作为细胞内的蛋白质翻译装置的核糖体等成分，将转录或者翻译模板、成为基质的核酸、氨基酸、能量源、各种离子、缓冲液以及其它有效因子加入到该提取液内，使其在试管内反应的方法。

(小麦胚芽提取液)

作为本发明的细胞提取物含有液优选使用其中有小麦胚芽提取液的溶液。

就小麦胚芽提取液的制备方法而言，作为分离小麦胚芽的方法，例如可采用Johnston，F.B.et al.，Nature，179，160-161(1957)中所述的方法等；而作为从分离出的胚芽中提取细胞提取物含有液的方法，例如：可采用Erickson，A.H.et al.，(1996)Meth.In Enzymol.，96，38-50等中所述的方法。此外，可例举特愿2002-23139、特愿2002-231340的方法。

在本发明可适宜利用的胚芽提取物几乎完全去除了原料小麦自身含有或者保持的抑制蛋白质合成功能的物质(麦黄酮(トリチン)、硫堇、核糖核酸酶等的作用于mRNA、tRNA、翻译蛋白质因子和核糖体等并抑制其功能的物质)。即，几乎完全去除了局部存在这些抑制物质的胚乳而得以纯化。去除胚乳的程度，可以通过检查小麦胚芽提取物中夹杂的麦黄酮活性，即核糖体脱腺嘌呤化的活性加以评价。如果核糖体没有被实质性腺嘌呤化，那么，胚芽提取物中没有夹杂源自胚乳的成分，即判定为几乎完全去除了胚乳而得到纯化。所谓核糖体没有被实质性脱腺嘌呤化的程度，是指核糖体的脱腺嘌呤化率小于7％，优选在1％或更少。

上述胚芽提取物含有源自细胞提取物含有液以及根据需要另外添加的蛋白质。其含有量无特别限制，但从冻结干燥状态下的保存稳定性、容易使用等的方面来看，在冻结干燥前的组合物中，该组合物整体优选在1～10重量％、更优选在2.5～5重量％；另外，在冻结干燥后的冻结干燥组合物中，该组合物整体优选在10～90重量％、更优选为25～70重量％。并且，这里提及的蛋白质含有量是通过测定吸光度(260、280、320nm)而算出的。

(去除微生物)

细胞提取物含有液中常混有微生物、特别是丝状菌(霉菌)等的孢子，优选预先除去这些微生物。特别是由于长期(1日或更长)的无细胞蛋白质合成反应中可常见到微生物繁殖，因此抑制它的繁殖很重要。微生物的去除装置无特定限制，但优选采用过滤灭菌滤器。滤器的孔径只要可以除去可能混入的微生物即可，并无特别限制，但通常为0.1～1μm、优选0.2～0.5μm。

进而，在细胞提取物含有液制备工序的某一阶段，通过增加去除低分子合成抑制物质的工序和/或降低还原剂浓度的工序，可以作为以进行具有特定效果的无细胞蛋白质合成为目的的细胞提取物含有液。

(从细胞提取物含有液中去除低分子合成抑制物质的方法)

细胞提取物含有液含有具有蛋白质合成抑制活性的低分子的合成抑制物质(以下，常称为“低分子合成抑制物质”)，通过去除这些物质可以取得蛋白质合成活性高的细胞提取物含有液。具体而言，从细胞提取物含有液的构成成分中，通过分子量的不同分别去除低分子合成抑制物质。低分子合成抑制物质是细胞提取物含有液中包含的蛋白质合成所必需的因子中最小的物质，可以作为具有以下分子量的分子而区分。具体而言，可以作为分子量为50,000～14,000或更低的、优选为14,000或更低的分子而区分，得到去除。

作为从细胞提取物含有液去除低分子合成抑制物质的方法，可以采用大家已知的常用方法，具体而言，可以例举出通过透析膜透析的方法、凝胶过滤法、或者超级过滤法等。其中，在对透析内液的物质供给的容易程度等上考虑，优选用透析的方法。

作为经透析去除低分子合成抑制物质的操作中使用的透析膜，可例举出具有去除分子量为50,000～12,000的透析膜，具体而言，优选使用去除分子量为12,000～14,000的再生纤维素膜(Viskase Sales，Chicago制造)和去除分子量为50,000的SPECTRA/孔径6(SPECTRUM LABOTRATORIESINC.，CA，USA制造)等。在这种透析膜中加入适当量的细胞提取物含有液等，采用通常方法进行透析。进行透析的时间，优选为30分钟～24小时左右。

(细胞提取物含有液的稳定化)

进行去除低分子合成抑制物质时，在细胞提取物含有液中生成不溶性成分时，通过抑制它的生成(以下，常称之为“细胞提取物含有液的稳定化”)，能够提高最终获得的细胞提取物含有液或者翻译反应用溶液的蛋白质合成活性。作为细胞提取物含有液或者翻译反应用溶液稳定化的具体方法可例举出，在进行去除上述低分子合成抑制物质时，将细胞提取物含有液或者翻译反应用溶液制成至少含有高能磷酸化合物、例如ATP或者GTP等(以下，常称之为“稳定化成分”)的溶液而进行的方法。优选ATP作为高能磷酸化合物使用。而且，优选在含有ATP和GTP的溶液中，更优选在含有ATP、GTP以及20种氨基酸的溶液中进行。

这些成分可以预先添加稳定化成分、温育后提供给低分子抑制物质的去除工序，在采用透析法去除低分子合成抑制物质的情况下，也可将稳定化成分添加到透析外液中进行透析来去除低分子合成抑制物质。如果预先将稳定化成分添加到透析外液内，透析中稳定化成分即使被分解，也可不断供给新的稳定化成分，因而优选。这也适用于采用凝胶过滤法和超级过滤法的情况，用含有稳定化成分的过滤用缓冲液平衡各种载体以后，提供含有稳定化成分的细胞提取物含有液或者翻译反应用溶液，进而通过一边添加上述缓冲液一边进行过滤可以获得同样的效果。

稳定化成分的添加量以及稳定化处理时间，可以根据细胞提取物含有液的种类和制备方法而适当选择。作为这些选择方法，可例举出将按试验性的量及种类分开的稳定化成分添加到细胞提取物含有液内，适当的时间之后进行低分子抑制物质的去除工序，用离心分离等方法将得到的处理后的细胞提取物含有液分离为可溶性成分和不溶性成分，选择其中的不溶性成分较少的稳定化成分的方法。进而，优选用取得的处理后细胞提取物含有液进行无细胞蛋白质合成，选择蛋白质合成活性较高的稳定化成分的方法。而且，在上述选择方法中，在使用细胞提取物含有液和透析法的情况下，可举出在透析外液中也添加适当的稳定化成分，用它们进行适当时间的透析以后，根据得到的细胞提取物含有液中的不溶性成分的量和得到的细胞提取物含有液的蛋白质合成活性等来选择的方法。

这样，作为选择的细胞提取物含有液的稳定化条件的例子，具体而言，在通过透析法进行低分子合成抑制物质的去除工序的情况下，可举出在它的小麦胚芽提取物含有液以及透析外液中添加ATP100μM～0.5mM、GTP25μM～1mM、20种氨基酸各25μM～5mM，进行30分钟～1小时或更长的透析的方法等。进行透析时的温度，只要不丧失细胞提取物含有液的蛋白质合成活性，而且是可以进行透析的温度即可。具体而言，最低温度为溶液不冻结的温度，通常为-10℃、优选-5℃；最高温度为以对透析中使用的溶液不带来坏影响为限度的温度40℃、优选38℃。

而且，如果在调制成细胞提取物含有液后进行低分子合成抑制物质的去除，就没有必要在细胞提取物含有液内进一步添加上述稳定化成分。

(mRNA的制备)

作为模板物质的mRNA，只要是编码目的蛋白质的物质，它的制备方法不受限制，可以采用众所周知的任何方法。当然，特别优选通过本发明的方法从模板物质的DNA来制备，进而在一系列的体系中连续地使用。

(翻译反应用溶液的制备)

从mRNA开始的蛋白质的合成是，在含有核糖体的蛋白质合成用细胞提取液中，以无细胞蛋白质合成方法中适宜的浓度，添加含有适宜翻译反应的成分的溶液(翻译反应溶液)，该溶液含有成为基质的氨基酸(采用20种必需氨基酸或者根据目的的相似体或变异的氨基酸)、能量源(ATP和/或GTP)、根据需要的各种离子(钙离子、镁离子、铵离子等)、缓冲液(HEPES-KOH、Tris-醋酸等)、ATP再生体系(磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸激酶的组合、磷酸肌酸和肌酸激酶的组合等)、核酸分解酶抑制剂(核糖核酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂等)、tRNA、还原剂(二硫苏糖醇等)、聚乙二醇、3’，5’-cAMP、叶酸、抗菌剂(叠氮钠、氨卞青霉素等)等，再向其中加入翻译模板mRNA，制备翻译反应用液。将此翻译反应用溶液调制为适于翻译反应的温度，进行翻译反应，合成目的蛋白质。

(转录反应)

转录模板可以按本发明者已经报告的具有广泛应用性的模板分子构筑法(WO01/27260、02/18586)为基准制备，适宜的例示为：在例如质粒载体pEU中导入所希望的结构基因，用SP6RNA聚合酶处理来进行转录的方法等，当然mRNA的制备方法不限于此。将转录模板与含有适合于转录模板中的启动子的RNA聚合酶和RNA合成用的基质(4种三磷酸核糖核苷)等转录反应中所必需的成分的溶液(也称转录反应溶液)混合，将此混合物在约20～约60℃、优选约30～约42℃温育约30分钟～约16小时、更优选约2～5小时进行转录反应。

(合成反应)

在本发明的无细胞系合成系统中可以完成包括以下的工序、工序的控制或者它们的组合的系统。

必要的工序之一是使模板物质、基质、以及反应溶液接触并导入合成反应体系。将所述的模板物质、基质以及反应溶液(转录反应溶液或者翻译反应用溶液)调制到最适浓度以及最适温度，进行最适的合成反应。合成反应通常进行约10分钟～2小时、更优选为20分钟～1小时。该时间可根据各体系而改变，可以通过反复实验来调整最适时间。在本发明的不连续重复合成法中，特别优选这种一个循环的处理时间为较短的时间。

(稀释或者浓缩)

必要的工序之二是，作为上述反应时间，在合成速度略为降低的前后或者合成反应即要停止的前后或这些状态的过程中，对反应体系进行稀释或浓缩处理。所谓合成速度略为降低的前后是指发现mRNA或者蛋白质的单位时间合成量随时间变化而有从最大量开始减少的倾向的时机，一般可以理解为是线而不是点。另外，所谓合成反应的即要停止的前后是指合成量下降到实质上不能检出的程度的水平，这种情况一般可以理解为是线而不是点。所谓这些状态的过程中是指合成速度开始下降到合成反应停止的区间。再有，为了获得更好的合成效率，应该在合成速度略为降低的前后对反应体系实施稀释或者浓缩处理。这一时间最优选为10分钟～1小时。

对反应体系的稀释或者浓缩按以下方式进行。

稀释是向反应体系添加约1～20倍、优选约2～10倍容量的水溶液来进行。按照需要使水溶液中含有模板物质、基质、反应溶液。特别优选的是采用含有模板物质、基质、能量源等的溶液。选择各成分的添加浓度，使得在接下来的浓缩处理之后可以调制出最适宜合成的浓度。通过这一稀释，反应体系处于合成能力明显下降的状态。本发明因此状态，故称为不连续。

浓缩是将反应液去除到反应体系外时，反应液中的不能通过的物质(例如：合成蛋白质、核糖体等)可以被浓缩至反应体系内，可以利用众所周知的任何浓缩方法。优选的方法可例示为，用超过滤膜进行滤过处理、通过离心机处理、凝胶过滤处理、吸引泵、使液相或者气相中产生压力差的方法等。在这种处理时，通过调节膜的通过孔径，用离心分离操作、或者分子筛分离·去除反应产物、反应副产物。膜的分子量截留尺寸、离心速度、凝胶过滤条件，可以根据众所周知的所要处理的产物的物性调至最适。在本发明中，优选利用10,000～100,000Da的分子量分离膜。

通过这一浓缩处理，反应溶液被浓缩至原来容量的1/5～2/3，其结果是，大大偏离了各合成因子的最适合成浓度。通过这种浓缩，反应体系处于合成能力明显下降的状态。本发明因此状态，故称为不连续。

(合成反应的再活化)

必要的工序之三是合成反应的再活化。将在前阶段被稀释处理的反应液加以浓缩，对被浓缩处理的反应液实施稀释处理。

前者的情况是在稀释处理后进行浓缩处理。这里的所谓浓缩是指将通过稀释增加的反应体系的液量回复至原来的液量。浓缩方法没有特别的限制，可以利用众所周知的任何浓缩方法。优选的方法可例示为，使用超过滤膜的过滤处理、通过离心机处理、凝胶过滤处理、使液相或者气相中产生压力差的方法等。在这种处理时，通过调节膜的通过孔径，用离心分离操作、或者分子筛分离·去除反应产物、反应副产物。膜的分子量截留尺寸、离心速度、凝胶过滤条件可以根据众所周知的所要处理产物的物性调至最适。在本发明中，优选利用10,000～100,000Da的分子量分离膜。

后者的情况是在浓缩处理后进行稀释处理。这里的所谓稀释是指将通过浓缩被减少的反应体系的液量回复至原来的液量。使稀释溶液中根据需要含有模板物质、基质、反应溶液。特别优选采用含有模板物质、基质、能量源等的溶液。各成分的添加浓度，应该按照稀释后可以调制出最适合成浓度来选择。

这样，恢复至反应系统最适浓度的反应体系，温度可以再次被调至最适反应温度，反应系统可以再次活化。最适温度为15～25℃。

再者，为了反应产物和/或反应副产物的分离·回收·去除等，可以优选实施根据与处理对象物亲和性的处理。所谓根据亲和性可以例示为，先将亲和性物质固定，使它与目的物质接触并结合，其后溶解·回收目的物质的方法。所谓亲和性物质可以例示为，例如如果回收物质是蛋白质，就是蛋白质相应的抗体、受体相应的配体、转录因子相应的核酸等。另外，用适当的标记·标记物修饰目的产物(例如，抗生蛋白链菌素、组氨酸标记、GST、麦芽糖结合蛋白质等)，使用能与这些修饰物质特异性结合的物质(例如，生物素、二价金属离子、谷胱甘肽、麦芽糖等)来纯化。

在本发明中，可以不连续地多次重复稀释以及浓缩的处理，通过这种重复达到使无细胞合成体系的多次再生。通过这一再生就可以实现蛋白质的大量合成。

在本发明中，可以将稀释以及浓缩的处理作为一系列的工序与控制机构相结合来完成。为了实现这种控制，可以通过驱动源(马达、气压·油压机、其它的可以控制运作的调节器等)以及用计算机控制的控制电路、程控电路等调节运作的开·关、运作的程度、运作的速度、运作间隔。并且，根据需要可以适宜地装备信号传输用驱动装置、运作确认用感知器、运作控制用开关、定时器等。

本发明如上述说明那样，通过不连续地多次重复稀释以及浓缩来达到无细胞合成体系的再生，更具体的说明它的效果如下。

(稀释浓缩分批方式无细胞蛋白质合成法)

在本合成法，合成反应容器可以将过去使用至今的装有超过滤膜和透析膜的、可以浓缩的容器作为分批反应容器来开始合成反应。采用无细胞蛋白质合成方法在最适条件下进行蛋白质合成反应后，例如合成反应停止的前后，为了使反应系统再活化，将含有基质和作为能量源的氨基酸、ATP及GTP的其它缓冲液和离子类等蛋白质合成中必要的成分(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，559-556中所述的透析外液，以下简称为基质溶液)以及模板物质的mRNA的溶液，按反应液的1至20倍容量一次性添加、稀释(稀释处理)。其后，通过将反应容器放在例如离心机上离心，通过过滤膜，排出容器内增加的溶液，回复到原来的反应液容量(浓缩处理)。这种浓缩处理可以不依据离心力而是通过使液相或者气相中产生压力差来实现。通过这种稀释以及浓缩处理，在提供新鲜的基质溶液给反应体系的同时，可以排除合成反应生成的抑制翻译反应的副产物。这样，例如通过在合成反应的停止前后进行的用含有基质等溶液不连续地重复稀释和浓缩反应液，从而完成反应系统的再活化，可以长时间地合成蛋白质。该方法与Spirin等人研制的使用半透膜来连续进行基质、能量源的补充和代谢产物的废弃的、所谓连续法的原理不同，它的合成效果达到数十到数千倍(在本发明的方法中，可用2～3小时获得通过使用半透膜的方法约用30小时获得的产量)，本质上具有很大的差异。再有，在采用本原理的蛋白质合成方法方面，通过选择使用过滤膜的切割分子量大小，可以在排除副产物的同时选择性地从反应系统中分离出合成蛋白质。即，通过利用本原理，使蛋白质合成和合成产物纯化可以同时进行。再有，在改变进行浓缩后进行稀释的顺序的情况下也可达到同样效果。

(稀释浓缩分批试管内RNA合成法：转录产物生成系统)

采用噬菌体RNA合成酶的一般的RNA合成反应液组成、反应方法以及合成RNA的分析方法是按照WO01/27260以及WO02/18586中所述的方法。在本发明合成法中，可以将过去的装有超过滤膜和透析膜的、可以浓缩的容器作为分批反应容器开始合成反应。采用的超过滤膜的切割分子量选择RNA不能通过的大小。在合成反应停止的前后，将含有成为基质的4种三磷酸核糖核苷酸、离子类和缓冲液等的RNA合成中所必要成分的溶液(按照WO01/27260以及WO02/18586中记载方法制备的透析外液，以下简称为RNA基质溶液)，按照反应液的1至20倍容量添加稀释。将反应容器放在离心机上离心，通过过滤膜，排出容器内增加的溶液，浓缩至原来的反应液容量。这一过程的处理可以不依据离心力而是通过使液相或者气相中产生压力差来实现。经过这些处理，在将新鲜的基质溶液提供给反应体系的同时，通过从反应体系中排除在分批RNA合成反应中生成的单核苷酸和焦磷酸，使根据化学平衡原理事实上已经停止的RNA合成反应通过移动平衡而重新开始。通过将在这一反应停止前后进行的利用基质的反应液的稀释和过滤浓缩的操作反复实施，使长时间的RNA合成变为可能。这一方法与以前远藤等人发明的经透析法的RNA连续合成法(WO00/68412)的原理不同。在采用本原理的蛋白质合成方法中，通过将用水(或者希望的溶液)稀释和用过滤膜等浓缩的操作反复实施，可以将不含核苷酸类、缓冲液成分和离子类的RNA作为水(或者含有目的成分的溶液)回收。即，用这一方法，可以通过选择成为模板的DNA分子种，高速、高产量且低价格(高价的RNA合成酶的使用量仅为通常的分批法所必要的量)制备所希望的mRNA溶液。

再有，在进行浓缩后进行稀释的改变顺序的情况下，也可达到同样效果。

(自动合成装置)

本发明的自动合成装置提供使通过不连续地反复实施稀释和浓缩来至少进行依据翻译模板的合成反应(蛋白质合成)的合成法的一系列反应操作自动地进行的方法。而且，提供使从转录产物生产体系合成的转录模板开始到生成该模板编码的蛋白质为止的反应操作自动地进行的方法。这里所谓“使……操作自动地进行”意味着在一系列的工序中，实验者不需对反应系统(反应容器)直接加以手动操作。因此，实施各工序时，实验者通过手动使用本发明的自动合成装置中设定的规定的操作按钮和开关，并不有损本发明中“自动”的必要条件。

在本发明中，从转录产物生产体系合成的转录模板开始到生成该模板编码的蛋白质为止的反应操作自动化的装置，以至少具有以下的(1)～(5)的工序为特征。

以下，例举有关各工序具体的实施方式来详细说明，但本发明的方法只要具有翻译模板的纯化工序的特征，就不受其限制。

(1)转录模板的制作工序

在本发明的自动合成装置方面，本工序不一定必须自动进行，通过手动获得的转录模板也可用于以下的自动化工序中，但包括本工序在内，优选使从转录模板的制作开始到生成该模板编码的蛋白质为止的一系列工序自动进行。

在本说明书中所谓“转录模板”是指可以作为体外转录反应的模板分子而使用的DNA，在适当的启动子序列下游至少具有编码目的蛋白质的碱基序列。所谓适当的启动子序列是指可以使在转录反应中使用的RNA聚合酶识别的启动子序列，可例举出SP6启动子、T7启动子等。编码目的蛋白质的DNA可以为任何基因。

转录模板优选在启动子序列和编码目的蛋白质碱基序列之间具有控制翻译效率活性的碱基序列，例如：可以采用源自烟草花叶病毒的Ω序列等源自RNA病毒的5’非翻译区域、和/或柯萨克序列(Kozak’s sequence)等。而且，转录模板优选包括在编码目的蛋白质碱基序列的下游中含有转录终止区域的3’非翻译区域。所谓3’非翻译区域优选在终止密码子下游约1.0～约3.0千碱基左右。这些3’非翻译区域不必是编码目的蛋白质的基因原来有的序列。

转录模板的制作可以通过众所周知的手法实施。可以例举培养含有插入DNA的质粒的大肠杆菌等的宿主细胞，该DNA含有与所希望的转录模板相同的碱基序列，采用公知的纯化方法大量制备该质粒后，用适当的限制酶从该质粒中切出转录模板DNA，通过苯酚处理以及氯仿处理去除限制酶，进一步通过乙醇或异丙醇的醇沉淀(根据需要，添加适当量的醋酸铵、醋酸钠、氯化钠等的盐)等纯化转录模板的方法。获得的DNA的沉淀溶解在超纯净水或下述的转录反应用溶液中，可供以下的转录反应使用。

为了这样一系列操作自动或半自动(指部分工序中实验者直接手动操作反应体系的状态)实施的装置是已知的，通过将这些装置组装到本发明的自动合成装置中，就可以自动进行从转录模板的制作到蛋白质的生成。但是，如果考虑到以提供为了高通量分析而在本发明所涉及的高通量合成系统为目的，以及装置的简单化，缩短所要时间等，优选利用通过以下的多聚酶链反应(PCR)来制作转录模板的方法。

在本发明的合成装置的优选实施方式方面，采用将编码目的蛋白质的DNA克隆化的宿主(例如：具有含有该DNA的质粒的大肠杆菌等)用直接PCR扩增转录模板的方法。例如：通过众所周知的手法采用DNA自动合成机器合成含有适当的启动子序列、具有控制翻译效率活性的5’非翻译序列以及编码目的蛋白质的DNA的5’端部分区域的寡核苷酸，将此作为有义引物，而将含有3’非翻译序列的3’端区域序列的寡核苷酸作为反义引物，将编码目的蛋白质的DNA以及它的下游中含有该3’非翻译序列质粒的大肠菌等的宿主作为模板加入直接PCR反应液内，在通常的条件下使之进行扩增反应可以获得所希望的转录模板。另外，为了防止产生通过非特异扩增生成的短链DNA(结果出现目的产物的回收量低以及低分子翻译产物干扰)，也可使用国际公开第02/18586号小册子中所述的启动子分断型引物。

扩增反应也可采用市售PCR用热循环仪在市售PCR用96孔板中进行，也可将同样的温度可变控制装置与本发明的合成装置联动，或者将用于进行本发明的合成装置的转录·翻译反应的各种方法直接适用于PCR中。

如上述获得的转录模板DNA通过氯仿提取和醇沉淀纯化后也可用于转录反应，但为了装置的简单化、缩短所要时间，优选将PCR反应液直接地作为转录模板溶液来使用。在转录模板的制作中，与一次大量制备质粒、用限制酶处理质粒获得转录模板的方法相比较，通过采用上述从宿主的直接PCR可以格外地节省工序，可以用较少的工序数、在短时间大量合成转录模板。即，因为不需要培养含有重组目的基因质粒的大肠杆菌来大量制备质粒的工序，可以缩短为培养和纯化质粒的超速离心所需要的时间。而且，由于可以省略从质粒中切出转录模板的限制酶处理、以及用于除去限制酶等的苯酚处理、氯仿处理、用于纯化转录模板的醇沉淀、用于溶解转录模板DNA的沉淀的工序，因此，没有由苯酚/氯仿的残留引起的转录反应的抑制和由多工序纯化操作引起的转录模板的丢失。此外，由于可以减少反应中需要的步骤次数，进一步具有使用少量的接口管等即可的优点。

(2)转录反应工序

本发明的合成装置，包括从采用众所周知的方法制备的编码目的蛋白质的转录模板DNA，通过体外转录反应产生翻译模板mRNA的工序。将向反应体系(例如：96孔滴定板等市售的反应容器)中提供的含有转录模板的溶液、优选上述PCR反应液与含有适合于转录模板中启动子的RNA聚合酶(例如：SP6RNA聚合酶等)和RNA合成用的基质(4种三磷酸核苷)等的转录反应中必需成分的溶液(也称为『转录反应用溶液』)混合后，在约20℃～约60℃、优选为约30℃～约42℃，温育30分钟～16小时、优选温育约2小时～约5小时，如此地进行该转录反应工序。转录模板溶液、转录反应用液向反应容器内的分注、混合等的操作可以使用下述的自动合成装置的分注装置(例如：移液器(作为反应容器使用市售96孔滴定板时，优选使用具有适合于孔间距的8联或12联分注接口管的装置)等)。而为了转录反应的温育，可以通过下述的合成装置的温度控制机构一边控制一定温度一边进行。

(3)翻译模板的纯化工序

如上述那样，生成的转录产物(即“翻译模板”)是RNA分子，其包含按照所需而插入转录模板中的、具有控制翻译效率活性的5’非翻译序列和/或3’非翻译序列，具有编码目的蛋白质的碱基序列。转录反应后的反应液中混有除翻译模板RNA外的未反应的三磷酸核苷和反应副产物焦磷酸、其它转录反应用溶液中含有的盐等，因为已知这些物质抑制后来的翻译反应，所以，通过交换反应溶液去除这些物质。作为这样的溶液交换方法，可以例举出将反应溶液加入到装有滤器的容器中通过离心去除含有抑制翻译反应的物质的溶液、添加新的适当的缓冲液等溶液、重复这一操作的方法，但不限于此。如果将新添加的溶液作为翻译反应用溶液，可以不经过纯化模板进行下一步的翻译反应。而且，作为去除这些物质的方法可以举出选择性地沉淀翻译模板分离去除未反应基质等的方法。作为这样的沉淀方法，可例举出盐析等，优选例如醇沉淀法，但不局限于此。采用醇沉淀法的情况下，使用的醇只要是选择性地使RNA沉淀的物质，就没有特别的限制，例如优选乙醇、异丙醇等，更优选乙醇。乙醇的情况下，优选使用转录反应液的约2倍量～约3倍量；异丙醇的情况下，优选使用转录反应液的约0.6倍量～约1倍量。而且，通过与适当的盐共存，可以增大沉淀产量。作为这种盐可以举出醋酸铵、醋酸钠、氯化钠、氯化锂等。例如采用醋酸铵的情况下，优选使终浓度达到约0.5M～约3M来添加。此外，醇沉淀可在室温下进行。

(4)翻译反应工序

如上述那样，通过将含有获得的翻译模板的翻译反应用溶液以适当的温度、适当的时间进行温育，可以进行翻译反应。翻译反应通常进行约10分钟～2小时，更优选20分钟～1小时。这个时间可根据各反应体系而改变，通过反复实验可以调至最适时间。在本发明的不连续重复合成法中，这一个循环的处理时间特别优选较短的时间。

如前所述在上述的反应中，在合成速度略为降低的前后或者合成反应即要停止的前后，或这些状态的过程中时，进行对反应体系的稀释或浓缩。所谓合成速度略为降低的前后意味着可见蛋白质的单位时间合成量随时间变化而具有从最大量开始出现减少倾向的时机，一般可以理解为是线而不是点。并且，所谓合成反应的即要停止的前后是指合成量降至实质上不能检出程度的水平，这种情况一般也可以理解为是线而不是点。所谓这些状态的过程中是指合成速度开始下降到合成反应停止的期间。在此，为了获得更好的合成效率，在合成速度略为降低的前后对反应体系进行稀释或者浓缩处理。这一时间最适为10分钟～1小时。

对反应体系稀释或者浓缩按以下方式进行。

稀释为向反应体系添加约1～20倍、优选添加约2～10倍容量的水溶液来进行。使水溶液内按照所希望地含有模板物质、基质、反应溶液。特别优选采用含有模板物质、基质、能量源等的溶液。各成分的添加浓度，应该按照使得在以下的处理得浓缩后可调制出合成最适浓度的标准来选择。通过这一稀释，反应体系处于合成能力显著下降的状态。因此状态，本发明称为不连续。

浓缩可以利用在将反应液去除到反应体系外时能将反应液中的不能通过的物质(例如：合成蛋白质、核糖体等)浓缩在反应体系内的、众所周知的所有浓缩方法。优选为，例示如使用超过滤膜的过滤处理、通过离心机的处理、凝胶过滤处理、吸引泵、使液相或者气相内产生压力差的方法等。在这种处理时，通过调节膜的通过孔径、离心分离操作、或者经分子筛分离·除去反应产物、反应副产物。膜的分子量截留尺寸、离心速度、凝胶过滤条件，可以按照众所周知的处理目的产物的物性调至最适。在本发明中，优选利用10,000～100,000Da的截留分子量的分离膜。

通过这一浓缩处理，反应溶液被浓缩至原来容量的1/5～2/3，其结果，各合成因子成为大大偏离最适合成浓度的状态。通过这种浓缩，反应系统变为合成能力显著下降的状态。因此状态，本发明称为不连续。

接着进行合成反应的再活化。将在前阶段被稀释处理的反应液加以浓缩，被浓缩处理的反应液进行稀释处理。

前者的情况是在稀释处理后进行浓缩处理。这里的所谓浓缩意味着将通过稀释被增加的反应体系的液量回复至原来的液量。浓缩方法没有特别的限制，可以利用众所周知的所有浓缩方法。优选为，例示如使用超过滤膜的过滤处理、通过离心机的处理、凝胶过滤处理、使液相或者气相内产生压力差的方法等。在这种处理时，通过调节膜的通过孔径、离心分离操作、或者经分子筛分离·去除反应产物、反应副产物。膜的分子量截留尺寸、离心速度、凝胶过滤条件，可以根据众所周知的处理目的产物的物性调至最适。在本发明中，优选利用10,000～100,000Da的截留分子量分离膜。

后者的情况是在浓缩处理后进行稀释处理。这里的所谓稀释意味着将通过浓缩被减少的反应体系的液量回复至原来的液量。使稀释溶液内按照所希望的含有模板物质、基质、反应溶液。特别优选采用含有模板物质、基质、能量源等的溶液。各成分的添加浓度，应该按照稀释后可调制达到合成最适浓度来选择。

这样，恢复至反应体系最适浓度的反应体系，可以再次将温度调至最适反应温度、反应体系可以再次活化。最适温度为15～25℃。

在本发明中，可以不连续地多次重复稀释以及浓缩的处理，通过这种重复达到使无细胞合成体系的多次再生。重复次数从2次到20次，优选从5次到10次。通过这种再生，就可以完成蛋白质的大量合成。

有关其它的工序，可以按照能够适用于自动化的众所周知的任意顺序和条件来进行，没有特别的限制。

在本发明中，为进行上述操作的装置至少具有以下的(a)～(e)的机构为其特征。

(a)对反应容器内的温度实施可变控制的机构

(b)向反应容器内分注样品或试剂的机构

(c)运送反应容器的机构

(d)沉淀及浓缩过滤的装置

以及(e)控制上述(a)～(d)的机构使其按照上述本发明的方法运作的控制机构。

通过采用这种至少装有(a)～(e)结构的装置，可以使从上述本发明的转录产物生产系统合成的转录模板到生成该模板编码的蛋白质为止的反应操作自动实施。以下具体详述有关各结构。

(a)对反应容器内的温度实施可变控制的机构

所谓对反应容器内的温度实施可变控制的机构是指在转录反应、翻译反应的温育以及翻译反应的停止、翻译模板的沉淀、或者采用本发明的自动合成装置通过PCR法自动实施转录模板的制作工序时在PCR法的扩增反应等中，为调整反应容器内液体温度到达适当温度条件的机构。可控制改变的温度范围没有特别的限制，只要是在包括转录模板制作的无细胞蛋白质合成的一系列反应操作中通常所必要的温度范围(例如：约4℃～约100℃，优选约15℃～约60℃)内能够控制改变反应容器内温度的机构，就可作为实现这点的装置而没有特别的限制。可以例举出众所周知的タカラPCR热循环仪MP(タカラ生物股份有限公司制造)、(Gene Amp PCR System 9700(AppliedBiosystems Inc.，制造)等。具体而言，与进行移液操作等的场所及置放反应容器的操作台不同，是在装置内设计多个置放反应容器的操作台，通过控制改变操作台上整个空间的温度，从而实现控制改变反应容器内的温度。

(b)向反应容器内分注样品或试剂的装置

所谓向反应容器内分注样品或试剂的机构是指为了在反应容器内进行转录反应、翻译反应、PCR等的一系列的无细胞蛋白质合成反应，而向反应容器内分注样品或试剂的机构。这里“样品”是指转录模板、翻译模板、PCR用模板质粒(或者含有该质粒的宿主(如大肠杆菌))等；“试剂”是指转录反应用溶液、翻译反应用溶液、翻译反应溶液、稀释溶液、醇、盐溶液、PCR反应用溶液等。作为这样的分注机构，只要是根据工序能调整分注样品、试剂的分量来进行分注的机构，就可以无特别限制地使用众所周知的适当的可以自动分注的移液臂(分注机)等来实现。而且，移液臂可以具备将使用完的接口管丢弃在合成机的接口管废弃口的功能以及将吸完的滤液吐出到废液口中的功能。

另外，该分注机构更优选具备上述功能加上用于2种或更多种溶液均一化及溶解沉淀的混合功能(如：移液、搅拌等)。

再有，经移液臂，通过向反应容器的各单元中添加基质溶液或者稀释溶液可以实行反应液的稀释处理。

(c)运送反应容器的机构

所谓运送反应容器的机构是指使反应容器向各操作台、离心机、升降台、恒温槽移动的机构。这样的运送反应容器的机构只要能够将反应容器运送至目的地，可以没有特别限制地采用众所周知的适宜机构来完成。例如可以采用过去的合成装置中使用的机械臂来完成。

(d)沉淀以及浓缩过滤的机构

所谓沉淀及浓缩过滤机构是指使转录反应中产生的白色悬浊物沉淀的操作或者重复浓缩过滤翻译反应时的反应液的机构。这样的机构是可以使反应中生成的白色悬浊物沉淀并分离固体的，而且，只要可以重复浓缩翻译反应时的反应液，就没有特别限制，可以用众所周知的适宜机构来完成。例如可采用众所周知的离心机、还有在过滤和冻结干燥中以往就使用的适宜装置来完成该机构。

(e)控制机构

控制机构中包括对为了使上述(a)～(d)的机构运作而在各机构中使用的驱动源(发动机、空气压缩·油压缩机、其它的可以控制运作的传动装置等)的运作的开始与停止、运作的程度以及状态等进行控制的控制装置。它的控制结构是为了可以完成使上述(a)～(d)的机构的运作和从转录产物生产体系中合成的转录模板到生成该模板编码的蛋白质为止的反应操作自动进行。

前述控制装置，例如可以是组合含有具有控制程序的计算机的控制电路、程控电路等、控制上述各机构的运作时所必要的控制机器而构成，为使上述的各机构按照目的顺序运作，做成可以向各机构提供信号、以及根据需要提供电力、空压、油压等的控制结构。另外，也可适当添加用于给上述各机构的驱动源输送直接驱动信号的必要的驱动器、用于检测出上述各机构的驱动源的运作状态的必要的感知器、开关等。

另外，对可以适用于本发明的合成装置的反应容器没有特别的限制，可使用无细胞蛋白质合成反应中使用至今的众所周知的各种反应容器，可例举出96孔PCR用板、96孔滴定板、8联试管及试管(1.5ml、15ml、50ml等)，但例如将翻译反应系统采用分批法和重层法时，可以在96孔板等的小的反应系统中进行翻译反应，而且，由于用本发明的合成装置，转录反应也可以在小的反应系统中进行，包括转录反应·翻译模板的纯化、翻译反应、根据希望用于制作进一步提供给转录反应的转录模板的PCR在内的一系列无细胞蛋白质合成法的反应操作，可以在多种反应体系中对多种蛋白质同时进行，可以在短时间内合成多种的蛋白质。

进而，提供用于将通过翻译模板的合成反应利用不连续重复地进行稀释以及浓缩的合成法实施的装置。本发明的装置以至少具有以下的(1)～(5)机构为其特征。

(1)开始合成的机构，

(2)浓缩反应液的机构，

(3)稀释反应液的机构，

(4)合成反应的再活化的机构，

(5)使上述的(2)～(4)的机构重复运作的机构；

或者

(1)开始合成的机构，

(2)稀释反应液的机构，

(3)浓缩反应液的机构，

(4)合成反应的再活化的机构，

(5)使上述的(2)～(4)的机构重复运作的机构。

通过使用至少具有这样的(1)～(5)结构的装置可以使上述本发明的高通量合成系统自动进行。以下具体详述各机构。

(1)开始合成的机构

①将分注机移至加入翻译反应液的试剂槽内，吸引翻译反应液。

②将分注机移至翻译用板(单元的底部为滤器)的上方，将翻译反应液吐出至加入转录产物的翻译用板的各单元内。

③接着②，分注机进行各个单元的移液操作。

④机械臂将盖上翻译用板的盖子，并把该板运送至恒温槽以及安装在恒温槽内。

⑤翻译板保温，开始合成。

⑥在设定的合成时间结束后，机械臂将翻译用板运送至MTP操作台。

(2)稀释反应液的机构

①将分注机移至加入稀释溶液的试剂槽内，吸引稀释溶液。

②将分注机移至翻译用板上方，将稀释溶液吐出至加入翻译产物的翻译用板的各个单元内。

(3)浓缩反应液的机构

①机械臂将翻译用板重叠在接受转录·滤液用板上。

②机械臂将重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板运送至升降台内。

③将装载重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板的升降台下降至与离心机的高度相吻合。

④机械臂将重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板安装在离心机内。此时，翻译用板以及接受转录·滤液用板为一组的情况下，在对角线上安装隔板。另外，在二组的情况下，将相互的板安装在对角线上。

⑤通过离心机开始离心。此时由于翻译用板的底为滤器，因此可以将滤液去除至接受转录·滤液用板的单元中，翻译用板中各个单元被浓缩。

⑥机械臂将重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板从离心机运送至升降台内。

⑦使装载重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板的升降台上升。

⑧机械臂将重叠的翻译用板以及接受转录·滤液用板运送至MTP操作台，将翻译用板和接受转录·滤液用板分开安装。

(4)使合成反应再活化的机构

前面阶段先做稀释处理的情况下继续进行浓缩处理，先做浓缩处理的情况下继续进行稀释处理。

①机械臂将浓缩处理后的翻译用板或者稀释后的翻译用板运送至恒温槽内并安装在恒温槽内。

②翻译板保温，开始合成。

(5)使上述的(2)～(4)机构重复运作的机构

①设定时间结束后，使恒温槽的温度降低，使实质性合成停止。

②机械臂将翻译用板运送至MTP操作台。

③多次重复(2)～(4)中所述的机构重复运作。

另外，上述合成装置的机构是使高通量合成系统自动运行的一个例子，可以进一步包含通过浓缩处理进行废液处理的机构、将分注机的接口管作废弃处理的机构等。

此外，为多次实施利用用于实施高通量合成系统的蛋白质合成反应速度高的合成反应初期相的合成体系，包括以下的信息处理机构的程序也是本发明的对象。

(1)以反应容器的容积和反应液浓度的信息为基础，设定单位时间的合成量在出现减少倾向途中之前的合成反应初期相范围内的合成时间的信息处理机构；

(2)达到(1)的合成反应初期相范围内的合成时间时，向反应容器内添加稀释溶液，将反应液设定在能够进行实质性合成反应可能的浓度范围以外的信息处理机构；

(3)在(2)之后，浓缩反应容器内的反应液，进行设定而使得因添加稀释溶液而增加的反应液的液量回复到原来的液量的信息处理机构；

(4)在(3)之后，为使合成反应再次开始而设定反应最适温度的信息处理机构；

(5)用于多次重复(1)～(4)的信息处理机构。

或者

(1)以反应容器的容积和反应液浓度的信息为基础，设定单位时间的合成量在出现减少倾向途中之前的合成反应初期相范围内的合成时间的信息处理机构；

(2)达到(1)的合成反应初期相范围内的合成时间时，浓缩反应容器内的反应液，将反应液设定在能够进行实质性合成反应的浓度范围以外的信息处理机构；

(3)在(2)之后，向反应容器内添加稀释溶液，进行设定而使得因浓缩而减少的反应液液量回复到原来液量的信息处理机构；

(4)在(3)之后，为使合成反应再次开始而设定反应最适温度的信息处理机构；

(5)用于多次重复(1)～(4)的信息处理机构。

进而，在编入上述程序的众所周知的合成用装置方面，通过该程序的信息处理与该合成装置共同作用，进行开始合成、反应液的稀释·浓缩、合成反应的再活化工序，可以多次重复进行利用蛋白质合成反应速度高的合成反应初期相的合成体系，以此为特征的合成装置也是本发明的对象。

另外，使其进行转录反应、翻译反应之际，优选反应容器在密闭中进行，由此观点优选采用带有盖子的反应容器，进而装置优选具有进行该反应容器盖子的开闭的机构。上述盖子，如作为反应容器使用96孔板时，可例示为将一个一个的孔分别能够密封的橡胶制的盖子。关闭状态下优选盖子可以盖紧反应容器，由此可以考虑采用具有一定程度的重量(例如500G左右)的盖子，或者用夹子样的东西将盖子和反应容器夹住闭上盖子。并且，使反应容器的盖子进行开闭的机构，例如可以采用众所周知的卡盘结构·吸引结构与机械臂组合的结构等来实现。

本发明的合成装置除上述各机构以外，按照需要可以具有储备反应试剂的机构。

如同上述，本发明的高通量系统以及自动进行该系统的装置，可以同时简便自动地合成多种蛋白质。例如：备齐多个编码各种变异体的蛋白质的转录模板、翻译模板，同时多量地合成多种的变异体蛋白质，不需要对变异体进行详细设计即可提供用于分析等，很有用。

并且本发明的高通量系统以及自动运行该系统的装置可以很好地用于各种蛋白质的高通量功能分析的用途。例如，同源性检索的结果，以编码包含保存下来的共同功能区(例如蛋白激酶功能区等)的蛋白质的基因群为模板，采用本发明的装置通过本发明的方法同时合成该蛋白质，另外同样合成可能成为磷酸化的靶蛋白质群(例如转录因子等)，将两者以各种组合方式混合，例如，以摄取³²P标记的ATP为指标，可以同时鉴定何种蛋白质激酶使何种蛋白质磷酸化。

或者，以编码转录因子中含有特有的模体(Zn指状结构、亮氨酸拉链等)的蛋白质的基因群为模板，采用本发明的装置通过本发明的方法同时合成该蛋白质，通过检测与已知的顺式成分序列的结合、与其它转录控制因子形成杂合二聚体的能力、进而与特定基因启动子的转录控制区域的结合能力等，可以获得用于阐明转录因子交织的相互影响的信息。

实施例

以下例举实施例具体说明本发明，但本发明并不受下面记载的实施例的限制。

(无细胞蛋白质合成法)

1)从DNA到mRNA的反应(转录反应)

制备转录反应溶液[最终浓度为80mM HEPES-KOH pH 7.8、16mM醋酸镁、10mM二硫苏糖醇、2mM精脒、2.5mM 4NTPs(4种三磷酸核苷酸)、0.8U/μlRNase抑制剂、0.1μg/μl DNA[质粒GFP(GreenFluorescent Protein)]、1.6U/μl SP6 RNA聚合酶]，37℃下反应3小时。反应后在4℃以12000rmp离心1小时、离心后收集上清，添加乙醇至终浓度约70％、醋酸铵至终浓度约0.27M，在4℃的冰上静置10分钟后以3000rmp离心30分钟(乙醇沉淀)。该乙醇沉淀进行3次后，用适量的透析缓冲液(最终浓度为35mM HEPES-KOH pH7.8、3.1mM醋酸镁、103mM醋酸钾、16mM肌酸、1.2mM ATP、0.26mM GTP、2.5mM DTT、0.43mM精脒、0.3mM的各种氨基酸)将RNA浓度调至约5～10mg/ml。

另外根据本发明，通过稀释以及浓缩的不连续的重复操作来合成mRNA是遵照实验例7来进行。

2)翻译反应用溶液的制备

使用翻译反应溶液[最终浓度为35mM HEPES-KOH pH7.8、103mM醋酸钾(KOAc)、3.1mM醋酸镁(Mg(OAc)2)、16mM磷酸肌酸、1.2mM ATP、0.26mMGTP、2.5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.43mM精脒、0.3mM AAs(20种的L型氨基酸的混合物)、1.03mg/ml肌酸激酶]，调制胚芽提取液，使翻译反应时的胚芽提取液的浓度(O.D.260nm)为40至120来使用。

3)翻译反应

在含有上述的胚芽提取液的翻译反应溶液内根据胚芽提取液的翻译反应时的浓度，加入上述制备的mRNA溶液进行反应。即，将胚芽提取液的翻译反应时的O.D.260nm为100时添加的mRNA量作为0.8mg/ml，制备根据比例计算加入的mRNA的量。

将上述制备的反应溶液在20℃下反应。从反应开始经过一定时间后(10分钟～3小时)用2～3倍容量的上述翻译反应液稀释反应溶液，随后用切割分子量为30,000Da的超过滤膜浓缩，回复反应溶液至与稀释前等量状态。多次重复这一操作。或者，事先浓缩至约1/2～1/3容量，其后用上述翻译反应液稀释至原来的容量。

在用分批法操作将mRNA追加添入翻译反应溶液的情况下，根据上述小麦胚芽液的浓度加入在1)中制备的转录反应液(乙醇沉淀前的溶液)，或者经过乙醇沉淀操作而制备的mRNA溶液进行。

4)蛋白质合成效果的确定

合成蛋白质质量的测定根据Madin K et al.等的报告(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)中所述的方法进行。

5)小麦胚芽提取液的形态

另外，本研究采用的小麦胚芽提取液、无细胞蛋白质合成反应液组成、mRNA的制备法、分批无细胞蛋白质合成法是按照Madin K et al.等的报告(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)、专利第3255784号、特开平2000-236896号、WO00/68412号、Sawasaki T.etal.等的报告(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)，99，14652-14657)中所述的方法制备。

(装置例)

图4显示出本发明的稀释以及浓缩操作可以多次进行不连续地进行合成反应的体系的模式图。在通过具有过滤膜和送液泵样的结构完成稀释以及浓缩操作的情况下，可例示利用如图4中所模式地显示的结构。通过利用具有过滤膜的过滤浓缩器1和送液泵2组合的结构，在反应槽3内翻译反应的终止前后用(RNA)基质溶液稀释(转录或者)翻译反应液后，通过过滤浓缩器1过滤副产物，排出至容器6内。另一方面，使被浓缩的(转录或者)翻译反应液再次回到反应槽3中，可以使反应再次开始。

在图4所示体系中，接受(RNA)基质溶液的容器4和反应槽3通过管T1、送液切换阀5以及管T2连接，这一送液切换阀5通过管T3、送液泵2、管T4、过滤浓缩器1、管T5与反应槽3连接。这样，送液切换阀5是可以适当切换下述各种状态的结构：(a)未向反应槽3内送液的状态(阀关闭状态)；(b)通过送液泵2的运作从装有(RNA)基质溶液的容器4吸取(RNA)基质溶液，可以直接向反应槽3内送液的状态；(c)通过送液泵2的运作，吸取反应槽3内的(转录或者)翻译反应液，使之通过过滤浓缩器1后回到反应容器3，如此可使(转录或者)翻译反应液循环的状态；(d)通过送液泵2的运作从装有基质溶液的容器4吸取(RNA)基质溶液，使之通过过滤浓缩器1、可以向反应槽3内送液的状态。

采用这样的结构按以下的顺序进行操作。

1.在反应槽3内，用分批反应进行(转录或者)翻译反应。这期间，关闭送液切换阀5[上述(a)的状态]，送液泵3也停止，使向反应槽3内送液处于停止状态。

2.在(转录或者)翻译反应停止前后的任何时刻，切换送液切换阀5[上述(b)的状态]，使送液泵2运作，将(RNA)基质溶液供给反应槽3内混合。

3.变换送液切换阀5[上述(c)的状态]，使送液泵2运作，吸取反应槽3内的(转录或者)翻译反应液，使之通过过滤浓缩器1，将副产物排至容器6，并且使浓缩的反应液循环回到反应槽3内。

4.切换送液切换阀5[上述(d)的状态]，使送液泵2运作吸取容器4内的(RNA)基质溶液，使之通过过滤浓缩器1送液至反应槽3内，将过滤浓缩器1内残留的部分(转录或者)翻译反应液洗出流至反应槽3内。

5.切换送液切换阀5[上述(b)的状态]，使送液泵2运作，吸取容器4内的(RNA)基质溶液，送液至反应槽3内，将反应槽3内的(转录或者)翻译反应液量调至原来的容量后，切换送液切换阀5[上述(a)的状态]停止送液。

6.回到1，重复上述的操作。

实现利用这样体系的装置时，作为使用的送液泵可以使用众所周知的适宜的送液泵，没有特别的限制，可例示如蠕动泵[例如LKB-Pump-P1(Phamacia公司制)等]等。而且，作为过滤浓缩器也可使用众所周知的，而没有特别的限制。具体而言，可以例示为交叉流动过滤装置、VF05C2型(切割分子量为3万、Sartorius公司制)等。

通过具有过滤膜和送液泵的结构实现上述的稀释以及浓缩机构的系统，与利用离心机的情况相比，蛋白质的合成产量提高(参照实验例4)，而且，可以构建能大规模容量进行无细胞蛋白质合成的装置。进而，通过将小型的反应容器与过滤浓缩器组合，可以构建小容量型的装置，作为去除上述的副产物的机构，与具有过滤膜和离心机样的结构不同，不必装置成为大规模的。而且，在具有这样的过滤膜和送液泵样的结构上，稀释·浓缩过程的精密控制是容易的，可以期待对适合各种目的的一般的无细胞蛋白质合成技术的自动化而言成为极为重要的骨干技术。

实验例1

作为不连续地重复本发明的稀释以及浓缩处理的分批式无细胞蛋白质合成法的一个例子(实验例1)，图1显示了使用小麦胚芽提取液的实验结果。比较例是通过分批法的过去的无细胞蛋白质合成法得到的结果。纵轴是合成蛋白质的量(mg/ml)，横轴显示反应时间(小时)。在图1中，连结黑圆的线(●-●)为本发明的方法，连结白圆的线(○-○)为过去分批法的结果。在合成反应中，40A260nm/ml(小麦胚芽提取液在260nm波长的吸光度)的浓度的小麦胚芽提取液与320μg/ml的编码Green FluorescentProtein(GFP)的mRNA(翻译模板)混合，在20℃进行无细胞蛋白质合成。

比较实验的合成反应是采用带有切割分子量为3万的超过滤膜的浓缩容器(分离分子量30,000KDa)来进行。以荧光活性为指针的蛋白质生成量的时间变化在过去的分批法反应方式中显示为典型的双曲线型。即，经过反应开始初期的最大速度相反应速度降低，在反应接近停止3小时以后，即使经过长时间保温合成蛋白质的量未见增加(○-○)。该结果与迄今为止的报告颇为一致(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-556)。这一反应停止的原因并没有完全阐明，主要考虑为作为能量源的ATP和GTP浓度下降(能量枯竭)和不能再生的副产物AMP和GMP的蓄积通过某种机制抑制蛋白质合成所致。

本发明的合成反应在装有超过滤膜的容器内进行，在反应速度较高、反应停止前相当于反应开始2小时后，添加反应液量3倍容量的蛋白质合成基质溶液(含基质以及能量源)并搅拌(稀释处理)。接着通过离心机离心，浓缩用这种基质溶液所稀释的溶液至稀释前的反应溶液容量(箭头所示的时刻)(浓缩处理)。通过不连续地多次重复这种稀释以及浓缩的一系列处理，含有副产物的低分子物质经超过滤膜被排除、其浓度降低，另一方面使合成反应所消耗的ATP、GTP、氨基酸分别回复至接近反应开始时的各自浓度。通过这种浓缩处理，同时使源自小麦胚芽的核糖体、tRNA和其它所有的翻译因子被浓缩至反应开始时的原来浓度。可以确认通过这种处理，一旦低下的蛋白质合成反应再次开始，维持至原来较高的初期速度后，其后反应再次降低(●-●)。通过这种不连续地重复稀释以及浓缩处理，可以利用初期反应速度较高的时间区域的特性，完成高效率的无细胞蛋白质合成。如图1所示，通过4次的重复稀释浓缩处理，可以使在GFP分批方式中1ml反应容量合成的0.072mg的合成量，上升至0.41mg。在此，合成蛋白质的量是按照GFP的荧光强度测定技术(荧光最大波长508nm)，1μg/ml的GFP以荧光强度为2.0来计算。

通过本处理达到充分的合成效率，但伴随稀释以及浓缩处理的重复，可见体系的蛋白质合成速度渐渐降低的现象。其原因推测为源自胚芽的翻译因子(群)漏出至滤液中或者吸附在超过滤膜上等引起反应体系内部的损失、mRNA的分解、或吸附在超过滤膜上所致的浓度降低等。

实验例2

图2为显示除了改变小麦胚芽提取液的浓度以外，与实施例1同样地进行无细胞蛋白质合成的实验结果图。纵轴是合成的蛋白质的量(mg/ml)，横轴显示反应时间(小时)。在图2中，连结小黑圆的线(·-·)显示小麦胚芽提取液浓度为60A260nm/ml、GFPmRNA浓度为480μg/ml时(实施例2)的实验结果。大黑圆的线(●-●)显示小麦胚芽提取液浓度为80A260nm/ml、GFPmRNA浓度为640μg/ml时(实施例3)的实验结果。并且在图2中，箭头显示进行上述的操作的时刻。

如图2所示，在实施例2中通过4次的稀释以及浓缩的不连续重复操作，无细胞系合成的蛋白质为每1ml反应液合成0.62mg，在实施例3中通过4次的稀释以及浓缩的不连续重复操作无细胞系统合成的蛋白质为每1ml反应液合成1.13mg。这样，反应系统的翻译因子浓度越高则用本发明的无细胞蛋白质合成方法得到的蛋白质合成量越多，与图1显示的过去分批法的实验结果相比，显著增高。

实验例3

通常的分批法中合成速度降低的时间依赖于反应溶液中基质浓度的减少以及副产物的蓄积浓度，由此得出与体系的翻译因子浓度成反比例关系。即，体系的翻译因子浓度(小麦胚芽提取液浓度)越高到达反应停止的时间越短(Madin K.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，556-559)。因此，认为在使用高浓度翻译因子的情况下，通过缩短进行稀释以及浓缩的不连续重复操作时间的间隔可以维持较高的合成速度，并由此可以期待使蛋白质单位时间内的生成效率上升。

图3A为显示小麦胚芽提取液的浓度为80A260nm/ml、GFPmRNA浓度为640μg/ml时，除改变进行稀释以及浓缩的不连续重复操作的间隔以外，与实施例1同样地进行无细胞蛋白质合成的实验结果图；图3B为显示由于进行稀释以及浓缩的不连续重复操作的间隔的不同所致合成的GFP量的差异的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。

在图3A的图上，纵轴是合成蛋白质的量(mg/ml)，横轴为反应时间(小时)。箭头显示进行稀释以及浓缩的不连续重复操作的时刻。而且在图3A中，连结黑圆的线(●-●)显示从反应开始以0.5小时间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作时(实施例4)的实验结果，连结白圆的线(○-○)显示从反应开始以1小时间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作时(实施例5)的实验结果。在图3A中，箭头显示进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的时刻。

图3B显示将以0.5小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的实施例4，与除了以2小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作以外与实施例4同样进行时(实施例6)进行比较。这里，图3B的箭头显示GFP的染色带。聚丙烯酰胺凝胶电泳在各反应时间(在实施例4中，从反应开始经过0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5小时的时刻；在实施例6中，从反应开始经过0、2、4、6、8、10、12、14小时的时刻)的反应液1μl用聚丙烯酰胺未改性凝胶电泳分离后，用考马斯亮蓝将蛋白质染色。

如图3A、B所示，以0.5小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的实施例4，与以1小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的实施例5、以2小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的实施例6相比单位时间的产量高。在实施例4中，2.5小时的反应每1ml可获得1.12mg的合成量，但这比同一浓度的反应液以2小时的间隔进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作、使之反应10小时所获得的产量要高。该结果直接显示了当反应系统的翻译因子浓度(小麦胚芽提取液浓度)越高在短时间内伴随能量源等的消耗浓度变低，同时副产物的蓄积浓度变高、反应速度的降低和到达反应停止的时间缩短。因而，在设定稀释以及浓缩的不连续重复操作的时间上，通过选择依赖于反应系统中所含的小麦胚芽提取液浓度的最适时机，可以获得最大的合成产量。

蛋白质作为它的一般物性可举出不稳定性(高反应性)。因此，为了获得高品质的蛋白质，构建在短时间提高合成产量的技术成为必要条件之一，可以说图3证明的本发明的原理是极为有效的。

实验例4

图5为采用图4显示的使用过滤膜和送液泵来去除副产物的结构，从而用本发明的无细胞蛋白质合成方法来进行蛋白质合成(实施例7)的实验结果的图。纵轴是合成的蛋白质的量(mg/ml)，横轴显示反应时间(小时)。在图5中，连结黑圆的线(●-●)显示实施例7的实验结果，连结白圆的线(○-○)为通过过去分批法方法的实验结果。在图5中，箭头显示进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的时刻。

在实施例7中，作为过滤浓缩器，采用交叉流动过滤装置(VF05C2型、Sartorius公司制、切割分子量为3万)；作为送液泵采用LKB-Pump-P1(Pharmacia公司)。除了含有80A260nm/ml浓度的小麦胚芽提取液、640μg/ml浓度的GFPmRNA以外，使用与实施例1相同的翻译反应液，以0.5小时的间隔进行稀释以及浓缩的不连续重复操作。作为反应容器采用带有刻度的塑料管(Falcon管)，反应容量为15ml，在稀释以及浓缩的不连续重复操作过程中的稀释采用45ml容量的翻译反应用溶液来进行。

如图5所示，作为去除副产物的机构采用具有过滤膜和送液泵结构时，确认与利用实验例1～3的超过滤膜和离心机的装置同样地，可以在本发明的无细胞蛋白质合成方法中很好地利用。在实施例7中，通过4小时的反应每1ml的反应容量可合成2.1mg，可以比上述的采用利用离心机和超过滤膜的装置时合成高2倍左右产量的蛋白质。

实验例5

图6A为显示除了采用60A260nm/ml的小麦胚芽提取液、450μg/ml的dihydrofolate reductase(DHFR)的mRNA作为翻译模板以外，使用与实施例1同样的翻译反应液；除以1小时间隔进行2次稀释以及浓缩的不连续重复操作以外、进行与实施例1同样的无细胞蛋白质合成时(实施例8)的实验结果示意图。作为比较实验，除了是过去的分批法(未进行稀释以及浓缩的不连续重复操作)以外在同样的条件下进行无细胞蛋白质合成。实施例8中，在分子量约20,000KDa的DHFR的无细胞体系的合成时，采用了装有切割分子量30,000Da(ミリポア公司制)的超过滤膜的反应容器。

在图6A中，泳道1、2、3分别为实施例8的由0、1、2次稀释以及浓缩的不连续重复操作反应后的排出溶液(滤液)，在与上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作相同时刻采用过去分批法的反应液各1μl进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，示出考马斯亮蓝染色的结果(图中的箭头显示合成产物的DHFR)。从图6A中的箭头显示的DHFR条带的染色强度来判断，在过去分批法的实验结果(各泳道左侧的“反应液”)中，仅可确认反应1小时后微量的DHFR的合成，而实施例8的实验结果(在各泳道右侧的“滤液”)中，通过1次、2次稀释以及浓缩的不连续重复操作，可以确认反应系统生成的DHFR在滤液中高效地表现出来。

实施例6

图6B为显示采用本发明的无细胞蛋白质合成方法合成N端融合抗生蛋白链菌素的GFP融合蛋白(实施例9)、将GFP融合蛋白分离至体系外的实验结果的电泳图。

本实验的无细胞蛋白质合成自身，以编码GFP融合蛋白质的mRNA作为翻译模板使用，除以1小时的间隔进行4次稀释以及浓缩的不连续重复操作以外，与实施例1同样地进行。将GFP融合蛋白分离到系统外的操作为，按照1将固定了生物素的磁珠添加到反应溶液中，利用生物素与抗生蛋白链菌素间的亲和性将生成的融合体产物选择性地捕集至磁珠上；2通过磁石将结合了融合蛋白质的磁珠选择性地取出至反应容器外的顺序进行。此外，电泳及染色与实验例5同样地进行。

如图6B所示，分离操作前的反应液中能够检出的产物经过本操作从反应液中消失(分离后的反应液的泳道的箭头)，可知通过磁珠可以有效地分离到体系外(分离产物泳道中显示合成产物)。

实验例7

图7为显示本发明的RNA合成方法(实施例10)与分批法的过去在体外合成RNA方法的实验结果的差异图。在图7中，图7左为显示分批法的过去方法的结果，图7右为显示本发明的RNA合成方法的结果，箭头显示编码GFP的mRNA产物。

分别将海蜇的GFP基因各自插入小麦胚芽无细胞体系专用质粒载体pEU中作为转录模板，制备转录反应液[最终浓度为80mM HEPES-KOH pH7.8、16mM醋酸镁、10mM二硫苏糖醇、2mM精脒、2.5mM 4NTPs(4种三磷酸核苷酸)、0.8U/μl RNase抑制剂、0.1μg/μlDNA[质粒GFP(GreenFluorescent Protein)]、1.6U/μl SP6RNA聚合酶]，在37℃反应3小时。

实施例10的RNA合成反应在反应开始3小时后，将3倍量的上述的转录反应用溶液添加至转录反应液内稀释后，通过采用离心机经滤膜将低分子排除到反应液系统外，浓缩转录反应液至原来的浓度。其后，以3小时的间隔进行稀释以及浓缩的不连续重复操作，使合成反应进行下去。在各稀释以及浓缩的不连续重复操作时，分别吸取转录反应液，经溴乙啶染色使通过琼脂糖凝胶电泳分离的转录产物(mRNA)可视化。

如图7所示，在过去的分批法的体外合成RNA方法中，RNA合成反应在3小时左右停止，但在合成速度较高的3小时反应以后进行上述的稀释以及浓缩的不连续重复操作的实施例10中，可合成过去方法的2.4倍的产量的mRNA。

实验例8

图8为显示分别采用乙醇沉淀纯化的mRNA、未纯化的mRNA作为翻译模板进行本发明的无细胞蛋白质合成方法的实验结果图，纵轴是合成的蛋白质的量(mg/ml)，横轴显示反应时间(小时)。纯化的mRNA，按照实施例(无细胞蛋白质合成方法)1)从DNA至mRNA的反应(转录反应)中所述的方法制备。未纯化的mRNA用实施例10中所述的方法制备后用12,000rpm离心1小时后，回收上清制备。在图8中，连结黑圆的线(●-●)为显示含有在实施例10中合成的mRNA的转录反应液以1∶2的比例加入到翻译反应液内，混合后，加入与混合液同量的透析缓冲液[35mM HEPES-KOH pH7.8、103mM醋酸钾(KOAc)、3.1mM醋酸镁(Mg(0Ac)2)、16mM磷酸肌酸、1.2mMATP、0.26mM GTP、2.5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.43mM精脒、0.3mM AAs(20种的L型氨基酸的混合物)]稀释，然后浓缩至原来的混合液的容量，再次加入同量的透析缓冲液，再次重复同样的操作，在浓缩后加入肌酸激酶使之终浓度为约1mg/ml来进行蛋白质合成时(实施例11)的实验结果。连结白圆的线(○-○)为显示采用由在实验例7中合成的mRNA经乙醇沉淀、纯化而得到的物质制备的翻译反应液来进行蛋白质合成反应时(实施例12)的实验结果。在实施例11、12中，除了上述的mRNA分别采用480μg/ml的浓度、及使用60A260nm/ml浓度的小麦胚芽提取液以外，与实施例4同样地进行。

如图8所示，在比较实施例11、12的蛋白质合成速度时，未见有意义的差异。从该结果可知，通过本发明的无细胞蛋白质合成方法，使用未纯化mRNA的转录后的转录反应液来制备翻译反应液进行反应，可实现简便的无细胞蛋白质合成方法。

实验例9

图9为显示使用实验例7的转录反应后的转录反应液来制备翻译反应液来进行本发明的无细胞蛋白质合成方法的实验结果的示意图，纵轴是合成的蛋白质的量(mg/ml)，横轴显示反应时间(小时)。在图9中，向上的箭头显示进行稀释以及浓缩的不连续重复操作的时刻。向下的箭头显示添加转录反应后的转录反应液(含mRNA)的时刻。

翻译反应液是将80A260nm/ml的小麦胚芽提取液、转录反应后的转录反应液(含GFPmRNA9.6mg)添加至与实施例1同样的翻译反应用溶液15ml内(GFPmRNA的最终浓度640μg/ml)，将该溶液浓缩至8ml液量后，通过上述的翻译反应用溶液稀释和随之进行的浓缩操作来制备翻译反应液，开始翻译反应。作为去除副产物的机构，与图4所示相同地使用具有过滤膜和送液泵的构造，从反应开始每经过4小时添加GFPmRNA(翻译模板)，然后按30分钟间隔通过含基质以及能量源的溶液进行不连续的稀释·浓缩重复操作。

如实验结果所示，通过追加mRNA，可以确认几乎处于停止状态的翻译反应再次开始。进而可知，通过将这一稀释·浓缩法和mRNA的追加组合，能使蛋白质合成持续很长时间。

装置的实施例

以下说明有关本发明的自动合成装置的实施例。但是，有关本发明的自动合成装置只要能使高通量合成系统自动实施，就不受下述实施例装置的限制。

为了实施本发明的自动合成装置，分别将以下的东西组装在自动合成装置内，采用该自动合成装置进行GFP蛋白质合成。

转录模板

采用组入GFP的pEU质粒载体、有义引物和反义引物，在30μl体系进行PCR，获得的DNA作为转录模板。该DNA装在96孔PCR板(模板用板①)内。

转录反应用溶液

制作含有终浓度80mM HEPES-KOH、16mM醋酸镁、2mM精脒、10mMDTT、3mMNTPs、1U/μlSP6RNA聚合酶、1U/μlRNasin的溶液4.95ml，装入装置内的试剂槽1(②)内。

翻译反应用溶液

分别制作含有终浓度30mM HEPES-KOH(pH7.8)、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM磷酸肌酸、2mM二硫苏糖醇、0.3mM精脒、0.3mM 20种氨基酸、2.7mM醋酸镁、100mM醋酸钾、0.005％叠氮化钠、40ng/μl肌酸激酶、在260nm光密度(OD)为80或者40单位(unit)的小麦胚芽提取液的溶液5.5ml，装入装置内的试剂槽2(③)内。此外，分别采用含有80单位或者40单位的小麦胚芽提取液的翻译反应用溶液进行蛋白质合成。

稀释溶液

分别制作含有终浓度为30mM HEPES-KOH(pH7.8)、1.2mM ATP、0.25mMGTP、16mM磷酸肌酸、2mM二硫苏糖醇、0.3mM精脒、0.3mM 20种氨基酸、2.7mM醋酸镁、100mM醋酸钾、0.005％叠氮化钠的溶液100ml，装入装置内的试剂槽3(④)内。

合成容器

模板用板(带盖PCR96孔(纵8×横12)板(装入模板DNA的板)：①)、接受转录·滤液用板(带盖96孔(纵8×横12)滴定板：⑩)、翻译用板(带盖PCR96孔(纵8×横12)板(孔的底是滤器)：、隔板(离心时平衡用)接口管300μl接口管(转录反应用溶液用、翻译反应用溶液用、稀释溶液用：⑤)(280支)、20μl接口管(模板产物用：⑥)(96支)

分注机1：吸液管8支(接装300μl接口管用：⑧)

分注机2：吸液管8支(接装20μl接口管用：⑨)

GFP蛋白质合成，在以下的工序采用本发明有关的合成装置来进行。

<工序1：转录>

(1)机械臂(⑦)打开接受转录·滤液用板(⑩)的盖子。

(2)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)、移动至装有转录反应液的试剂槽1(②)。

(3)分注机1(⑧)从试剂槽1(②)吸取转录反应液95μl(45μl×2次+5μl)。

(4)分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板的位置(⑩)，向该板的纵向各孔(8个)内吐出2次、每次45μl转录反应液。

(5)将(2)-(4)的工序进一步在尚未加入转录反应液的纵向7列的各孔中进行。

(6)分注机1(⑧)移动至接口管废弃口()的位置，废弃接口管。

(7)机械臂(⑦)打开模板用板(①)的盖子。

(8)分注机2(⑨)装上20μl接口管(⑥)。

(9)分注机2(⑨)的各接口管吸引5μl空气(为提高吸引效率而实施的)。

(10)将分注机2(⑨)移动至模板用板(①)的位置，从模板用板(①)的纵向各孔(8个)中吸出5μl模板样品。

(11)将分注机2(⑨)移至接受转录·滤液用板的位置(⑩)，向该板的纵向各孔(8个)内全量吐出模板样品。

(12)通过分注机2(⑨)的各个接口管、用移液器混合接受转录·滤液用板(⑩)的纵向各孔(8个)。

(13)将分注机2(⑨)移动至接口管废弃口()的位置，废弃接口管。

(14)将(8)-(13)的工序进一步在尚未加入模板样品的纵向7列的各孔中进行。

(15)机械臂(⑦)盖上模板用板(①)以及接受转录·滤液用板(⑩)的盖子。

(16)机械臂(⑦)将接受转录·滤液用板(⑩)运送至预先设定为37℃的恒温槽1()中安装。

(17)在恒温槽1()中，进行37℃4小时的转录反应。

<工序2：转录后去除沉淀>

(1)机械臂(⑦)将接受转录·滤液用板(⑩)从恒温槽1()运送至MTP操作台()。

(2)机械臂(⑦)打开接受转录·滤液用板(⑩)的盖子。

(3)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(4)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(5)将分注机1(⑧)移动至加入稀释溶液的试剂槽3(④)，吸引稀释溶液(浓缩离心后的液量因板上的列而发生变化，因此，吸引量每列在80μl～120μl之间作微调整。)。

(6)将分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板(⑩)的位置，向该板的纵向各孔(8个)内吐出全量稀释溶液。

(7)进一步将(4)-(6)的工序在尚未加入稀释溶液的纵向7列的各孔中进行。

(8)分注机1(⑧)移动至接口管废弃口()位置，废弃接口管。

(9)机械臂(⑦)盖上翻译用板()的盖子，重叠在运送接受转录·滤液用板(⑩)上(离心时为与隔板取得平衡)。

(10)机械臂(⑦)将重叠的翻译用板()以及接受转录·滤液用板(⑩)运送至升降台()上。

(11)将载置有重叠的翻译用板()以及接受转录·滤液用板(⑩)的升降台下降至与离心机()的高度吻合。

(12)机械臂(⑦)打开离心机()的门。

(13)离心机()，为使板可以安装，调整离心机的板设置部位的位置。

(14)机械臂(⑦)将重叠的翻译用板()以及接受转录·滤液用板(⑩)运送至离心机上安放。

(15)与(13)同样地进行位置调整，为取得平衡，将隔板安装在离心机上。

(16)在离心机()上，进行3100g、15分钟的离心。

<工序3：第1次交换转录液的缓冲液>

(1)离心机()停止后，机械臂打开离心机)的门，接着离心机进行对位(机械臂与离心机的板设置部位的位置相吻合)。

(2)机械臂(⑦)将重叠的翻译用板()以及接受转录·滤液用板(⑩)从离心机()运送至升降台上。

(3)与(1)同样进行对位，机械臂(⑦)将隔板运送至升降台上。

(4)机械臂(⑦)将重叠的翻译用板()以及接受转录·滤液用板(⑩)运送至MTP操作台()，分开安装翻译用板()和接受转录·滤液用板(⑩)。

(5)机械臂(⑦)打开翻译用板()的盖子。

(6)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(7)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(8)分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板(⑩)的位置，从接受转录·滤液用板(⑩)的纵向各孔(8个)内吸出全部溶液。

(9)将分注机1(⑧)移动至翻译板()的位置，向翻译板()的纵向各孔(8个)内吐出全部溶液。

(10)将(6)-(9)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(11)分注机1(⑧)盖上翻译用板()的盖子。

(12)分注机1(⑧)将翻译用板()重叠在运送接受转录·滤液用板(⑩)上(上：翻译用板；下：接受转录·滤液用板)。

(13)与工序(10)～(16)同样地进行离心。

<工序4：第2次交换转录液缓冲液>

与工序3(1)～(5)相同，从离心机取出接受转录·滤液用板、翻译用板，安装在MTP操作台上，打开翻译用板的盖子。

(2)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(3)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(4)将分注机1(⑧)移动至装有稀释溶液的试剂槽3(④)。

(5)分注机1(⑧)的各个孔吸引稀释溶液(吸引量每列在80μl～120μl之间作微调整。)。

(6)分注机1(⑧)移动至翻译板()的位置，向翻译板()的纵向各孔(8个)内吐出全部溶液。

(7)将(3)-(6)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(8)分注机1(⑧)移动至接口管废弃口()的位置，废弃接口管。

(9)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(10)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(11)分注机1(⑧)移动至翻译用板()的位置。

(12)通过分注机1(⑧)的各个接口管、用移液器混合翻译板()的纵向各孔(8个)。

(13)将(8)-(12)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行(有时在各孔交换接口管)。

(14)分注机1(⑧)移动至接口管废弃口()的位置，废弃接口管。

(15)机械臂(⑦)盖上翻译用板()的盖子。

(16)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(17)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(18)分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板的位置(⑩)。

(19)分注机1(⑧)从接受转录·滤液用板(⑩)的纵向各孔(8个)内吸出全部溶液。

(20)分注机1(⑧)移动至废液口()位置。

(21)分注机1(⑧)向废液口()吐出全量。

(22)将(17)-(21)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(23)分注机1(⑨)移动至接口管废弃口()位置，废弃接口管。

(24)与工序2(9)～(16)同样进行翻译用板()的离心。

<工序5：分注翻译反应用溶液>

(1)与工序3(1)～(5)相同，从离心机取出接受转录·滤液用板、翻译用板，安装在MTP操作台上，打开翻译用板()的盖子。

(2)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空气。

(3)分注机1(⑧)移动至装有翻译反应用溶液的试剂槽2(③)。

(4)分注机1(⑧)从试剂槽2(③)中吸引50μl翻译反应液。

(5)分注机1(⑧)移动至翻译用板()的位置，向翻译用板()的纵向各孔(8个)中吐出全部溶液。

(6)通过分注机1(⑧)的各个接口管用移液器混合翻译用板()的纵向各孔(8个)。

(7)将(2)-(6)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(8)分注机1(⑨)移动至接口管废弃口()位置，废弃接口管。

(9)机械臂(⑦)盖上翻译用板()的盖子。

(10)机械臂(⑦)将翻译用板()运送至恒温槽1()。

(11)将翻译用板()在26℃保温1小时。

(12)在(11)的保温工序期间(以后为废弃滤液工序)，分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空气。

(13)分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板的位置(⑩)。

(14)分注机1(⑧)从接受转录·滤液用板(⑩)的纵向各孔(8个)内吸出全部溶液。

(15)分注机1(⑧)移动至废液口()的位置，吐出全量。

(16)将(12)～(15)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(17)分注机1(⑨)移动至接口管废弃口()位置，废弃接口管。

<工序6：重复翻译>

重复以下工序6次.

(1)机械臂(⑦)将翻译用板()从恒温槽1()运送至MTP操作台()。

(2)机械臂(⑦)打开翻译用板()的盖子。

(3)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)。

(4)分注机1(⑧)的各接口管吸引5μl空气。

(5)将分注机1(⑧)移动至加入稀释溶液的试剂槽3(④)，吸引稀释溶液(离心后的液量因板上的列发生变化，因此，吸引量每列在80μl～120μl之间作微调整。)。

(6)分注机1(⑧)移动至翻译用板()的位置，向该板的纵向各孔(8个)中吐出全部稀释溶液。

(7)将(4)-(6)的工序进一步在尚未加入稀释溶液的纵向7列的各孔中进行。

(8)与工序2(9)～(16)同样地进行离心(离心时间为18分钟)。

(9)与工序3(1)～(5)相同，从离心机取出接受转录·滤液用板、翻译用板，安装在MTP操作台上，打开翻译用板的盖子。

(10)分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)，各接口管吸引5μl空气。

(11)分注机1(⑧)移动至翻译用板()的位置。

(12)通过分注机1(⑧)的各个接口管、用移液器混合翻译用板()的纵向各孔(8个)。

(13)分注机1(⑨)移动至接口管废弃口()的位置，废弃接口管(也有替换接口管的情况)。

(14)(10)-(13)的工序进一步在其它的纵向7列的各孔中进行。

(15)机械臂(⑦)盖上翻译用板()的盖子。

(16)机械臂(⑦)将翻译用板()运送至恒温槽1()。

(17)翻译用板()在26℃保温1小时。

(18)在(17)的保温工序期间(以后为废弃滤液工序)，分注机1(⑧)装上300μl接口管(⑤)，吸引5μl空气。

(19)分注机1(⑧)移动至接受转录·滤液用板(⑩)的位置。

(20)分注机1(⑧)吸出接受转录·滤液用板(⑩)的纵向各孔(8个)内的全部溶液。

(21)分注机1(⑧)移动至废液口()的位置。

(22)分注机1(⑧)吐出全部溶液。

(23)将(18)～(22)的工序，进一步在其它纵向7列的各孔中进行。

<工序7：结束(重复工序6六次后)>

(1)工序6(18)的保温结束后，将恒温槽的温度设定为4℃。

(2)将翻译用板从合成机取出。

对于通过以上的工序合成的GFP，按照Madin K.et al.等人的报告(Madin K.et al.，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，559-564)中所述的方法进行合成蛋白质的量的测定，用SDS-PAGE分析(图11)。

在图11中，在40单位的1-8泳道以及80单位的1-4泳道中，在GFP的条带的位置上都合成有蛋白质。而且，BSA(125、250、500ng)的条带浓度和在各泳道的GFP条带的浓度比较时，可以推测所有的泳道至少合成了250ng的GFP。

通过以上的说明可以明确，选择反应速度较高的反应初期时间，由重复稀释以及浓缩的不连续操作而成的本发明的高通量合成系统以及使该系统自动进行的装置，可以在短时间内高效地合成高品质的蛋白质，而且，可以极为有效地分离目的蛋白质。另外，可以明确该原理对在体外进行的RNA的有效合成也有用。

进而，应用该原理的蛋白质和RNA合成法，显示可以解决Spirin等人的连续法中可见的种种缺点，即，装置的复杂性、膜的低强度性、运转时膜的堵塞、操作的烦杂性等引起的反应装置出现的问题。加上连续法需要特别长的合成反应时间的缺点，不仅浪费时间，而且从确保生产的蛋白质的品质方面也留下了必须解决的重大问题，而该缺点在重叠法中也未得到解决。

工业上利用的可能性

这里发明的技术，可以为面向后基因组时代的蛋白质研究提供基本的骨干技术。特别是为分析RNA和蛋白质等的结构·功能，作为可以简便且高效地全面制备和大量生产的骨干技术，可以说是不可或缺的。