大肠杆菌无细胞体系高通量合成蛋白质的探索性研究

摘要

与体内合成蛋白质相比，由于无细胞反应体系的开放性，无细胞体外合成蛋白质的一个潜在的重要优点是蛋白质合成的高通量性。本文从无细胞反应内在效率的提高、基于目标蛋白质线性模板的无细胞反应、DNA凝胶辅助的无细胞反应、无细胞反应器微型化及喷墨打印技术等多个角度研究了无细胞体系如何实现高通量蛋白质的合成。
　　首先选择了枯草芽孢杆菌木聚糖酶作为目标蛋白，研究如何在大肠杆菌无细胞蛋白合成体系实现功能性高效合成。通过对木聚糖酶基因N’端的信号肽序列的突变，采用过量表达了分子伴侣的大肠杆菌制备无细胞抽提物，构建了高效可溶性合成木聚糖酶的无细胞体系，并且通过在无细胞反应体系中添加表面活性剂Triton X-100制备高活性的成熟木聚糖酶。结合优化无细胞反应条件，无细胞体系中表达的木聚糖酶的活性最终提高了6.1倍。这一组合表达策略成功应用于其它四种具有代表性的重要的工业酶（包括碱性磷酸酶、葡萄糖脱氢酶、青霉素G酰基转移酶以及脂肪酶）的体外无细胞表达，与常规的无细胞蛋白表达结果相比，这四个酶的整体表达的水平均获得了从3.2倍到5.3倍不等的增加。
　　在无细胞蛋白合成体系中，以线性PCR产物为模板是实现高通量合成蛋白质的一个基本策略。然而，由于无细胞体系中核酸酶的存在，线性模板极易降解，从而导致无细胞表达效率低。本文引入了DNA凝胶技术，将线性目标基因模板交联固定在凝胶内部，从而提高以线性目标基因片段为表达模板时无细胞反应的效率。我们对DNA凝胶的制备方法进行了改进，开发了基于乳液原理的高通量制备直径为微米级DNA凝胶微粒的新技术。基于此DNA凝胶微粒的固相无细胞表达模式下，木聚糖酶表达效率与传统的直接添加DNA模板的液相反应体系相比提高了近十倍，有效提高了以线性DNA片段为表达模板时的无细胞表达效率。在此基础上，进一步考察了两种更为稳定而有效的方法，包括冲击混合与膜过滤技术，最终可得到粒度平均分布仅为3μM的DNA凝胶微粒。
　　在DNA凝胶微颗粒与无细胞蛋白合成体系的基础上，结合脂质体的制备方法，我们建立了一种高通量制备微米级微型生物反应器的方法。通过我们的方法所获得的“人工细胞”（微型生物反应器）具有磷脂双分子层的外膜结构以及固定了目标基因模板的DNA凝胶内核，中间部分则是用于蛋白合成的无细胞表达体系。该“人工细胞”反应器不仅有助于研究微体系下高效率的无细胞蛋白表达，尤其是膜蛋白的无细胞表达，而且整个系统从结构到功能上都模拟了真正的细胞，因而具有极其重要的合成生物学意义。
　　最后，研究了商业化打印机作为一种高通量反应技术在高通量分散生物样品中的基本规律和特性，并证明了将喷墨打印技术与无细胞蛋白合成体系相结合，用于无细胞高通量反应及在线制备蛋白芯片的可行性。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 无细胞蛋白合成体系

1．2．1 无细胞体外合成蛋白质的研究历史

1．2．2 无细胞体外合成蛋白质的基本原理及其优势

1．2．3 影响无细胞体系蛋白质合成效率的关键因素

1．2．4 无细胞蛋白合成体系的高通量潜力

1．3 无细胞蛋白合成体系中的高通量反应技术

1．3．1 基于单分子PCR反应的体外高通量表达与筛选

1．3．2 孔板与载波片上的无细胞蛋白合成

1．3．3 微型反应器中的无细胞蛋白合成

1．3．4 微囊体系中的无细胞蛋白合成

1．4 DNA凝肢的研究进展及其应用

1．4．1 DNA凝胶简介

1．4．2 DNA凝胶的类型以及物理／化学特性

1．4．3 DNA凝胶的应用

1．5 喷墨打印技术的研究进展及其应用

1．5．1 喷墨打印技术简介

1．5．2 喷墨打印技术在生物工程／技术领域的应用

1．6 本工作的基本研究思路及拟研究内容

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 质粒

2．1．2 实验菌株

2．1．3 重要试剂、工具酶及试剂盒

2．1．4 培养基

2．2 仪器

2．3 实验及分析方法

2．3．1 分子克隆实验

2．3．2 DNA分子摩尔浓度测定

2．3．3 SDS-PAGE电泳

2．3．4 Western-blot分析

2．3．5 EGFP荧光强度测定

2．3．6 油水乳液粒度大小分布测定

2．3．7 木糖测定

2．3．8 S12细胞抽提物的制备

2．3．9 标准无细胞反应液的配制

2．3．10 商业化无细胞反应液的配制

2．3．11 无细胞补充液的配制

2．3．12 pIVEX2．4c-gfp重组质粒的构建

2．3．13 pET21a-DsRed2重组质粒的构建

第三章 体外高效合成目标蛋白的无细胞体系构建及优化

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．2．1 菌株和载体

3．2．2 培养基和培养条件

3．2．3 工具酶及主要试剂

3．2．4 基本的分子生物学操作

3．2．5 菌株的活化与分子伴侣质粒的转化

3．2．6 菌体浓度的测定

3．2．7 重组分子伴侣菌株的表达

3．2．8 富含分子伴侣的S12大肠杆菌抽提物的制备

3．2．9 富含分子伴侣的大肠杆菌无细胞反应体系的构建

3．2．10 含不同信号肽序列的木聚糖酶基因重组质粒模板的构建

3．2．11 其它重组质粒模板的构建

3．2．12 木聚糖酶以及其它几种酶的活性测定

3．2．13 SDS-PAGE分析

3．2．14 Western-blot分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 信号肽序列对木聚糖酶在无细胞表达中的影响

3．3．2 含有分子伴侣质粒的重组菌的表达

3．3．3 富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统对木聚糖酶可溶表达的影响

3．3．4 表面活性剂Triton X-100对无细胞表达的木聚糖酶活性的促进

3．3．5 组合表达策略对其它酶的体外活性表达的促进

3．4 小结

第四章 DNA凝胶固定线性模板高效合成木聚糖酶的研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 X-DNA的台成

4．2．3 目标质粒的构建

4．2．4 线性目标基因模板的准备

4．2．5 能够自身环化的PCR模板的准备

4．2．6 富含GroEL／S系列分子伴侣的无细胞反应液的配制

4．2．7 商业化无细胞反应液的配制

4．2．8 Eppendorf管中DNA凝胶的合成

4．2．9 凝胶体系中X-DNA与gfp及xylA目标模板浓度的优化

4．2．10 目标蛋白活性检测

4．2．11 滤纸片中DNA凝胶的制备

4．2．12 基于磁力搅拌方式的DNA凝胶微颗粒的高通量制备

4．2．13 DNA凝胶微粒的收集与纯化

4．2．14 DNA凝胶的染色及检测

4．2．15 采用不同xylA模板对无细胞反应效率的影响

4．3 结果与讨论

4．3．1 X-DNA的合成

4．3．2 不同的X-DNA粘性末端对合成DNA凝胶的影响

4．3．3 DNA凝胶中X-DNA与目标基因模板浓度优化

4．3．4 滤纸片中DNA凝胶的制备

4．3．5 基于磁力搅拌方式制备的DNA凝胶微粒的大小分布

4．3．6 不同方法制备的DNA凝肢对无细胞合成木聚糖酶效率的促进

4．4 小结

第五章 基于DNA凝胶的无细胞反应器微型化及高通量反应研究

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料

5．2．2 X-DNA的合成以及目标基因模板gfp的准备

5．2．3 商业化无细胞反应液以及无细胞补充液的配制

5．2．4 DNA凝胶反应混合液的配制

5．2．5 基于冲击混合与膜过滤方式高通量制备DNA凝胶微粒

5．2．6 不同方式合成DNA凝胶对GFP体外表达效率的影响

5．2．7 不同体积DNA凝胶结合核酸染料标准曲线绘制

5．2．8 含有卵磷脂分子以及含有表面活性剂成分的矿物油的准备

5．2．9 油相基质中微型生物反应器的高通量制备

5．2．10 标准与微型反应模式下GFP表达效率的比较

5．2．11 水相基质中微型生物反应器的高通量制备

5．3 结果与讨论

5．3．1 基于冲击混合与膜过滤方式高通量制备DNA凝胶微粒

5．3．2 不同方式合成的DNA凝胶对GFP表达效率的影响

5．3．3 不同的物理混合方式对合成DNA凝胶微粒效率的影响

5．3．4 基于油相体系的无细胞微型生物反应器

5．3．5 基于水相体系的人工细胞模型的构建

5．4 小结

第六章 基于喷墨打印技术的体外高通量合成蛋白质的研究

6．1 引言

6．2 材料和方法

6．2．1 喷墨打印机的改装

6．2．2 打印样品的准备

6．2．3 打印基质的准备

6．2．4 抗生素实验菌悬液的制备

6．2．5 琼脂玻璃双碟的准备

6．2．6 特定菌落图案的打印

6．2．7 高密度细胞阵列的打印

6．2．8 基于喷墨打印技术的抗生素效价测定

6．2．9 基于喷墨打印技术的抗生素最低押菌浓度(MIC)值测定

6．2．10 无细胞蛋白合成体系的打印

6．3 结果和讨论

6．3．1 热喷墨打印后大肠杆菌存活率分析

6．3．2 大肠杆菌细胞菌落形态

6．3．3 高密度细胞阵列

6．3．4 抗生素效价测定

6．3．5 基于喷墨打印技术的梯度抑菌模型

6．3．6 无细胞反应液打印条件优化

6．3．7 无细胞蛋白合成体系的打印

6．4 小结

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

作者简历