含前S1、前S2和S抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒

摘要

本发明涉及一种新的含前S抗原决定簇的乙肝表面抗原颗粒，该颗粒包括羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS1)和羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS2)。该颗粒以与天然乙肝表面抗原结构类似的球形颗粒形式存在，能在酵母细胞中高效表达，并同时具有前S1、前S2和S三重抗原性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的乙肝表面抗原复合颗粒，具体地说，涉及包含有通过基因工程方法获得的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS1)和羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS2)的乙肝表面抗原复合颗粒。

本发明还涉及包含上述融合多肽编码基因的重组载体、重组菌株及制备该复合颗粒的方法。

背景技术

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，在全世界广泛流行，是一种严重危害人民健康的疾病。据统计，我国约10％的人口为乙肝表面抗原(HBsAg)携带者，其中慢性乙型肝炎患者约1000万人，年发病率约158/10万。目前对乙型肝炎还缺乏有效的治疗方法，进行乙型肝炎疫苗免疫接种是预防和控制乙型肝炎唯一有效的途径。

乙型肝炎疫苗的发展经历了三个阶段。最早的乙型肝炎疫苗是从乙肝病毒携带者血浆中分离的乙肝表面抗原颗粒制成的，由于血浆来源有限，加之成本和安全性方面的考虑，这类疫苗在我国已停止使用。目前国内外广泛使用的是重组酵母或CHO细胞产生的由乙肝病毒表面抗原主蛋白(S)构成的重组基因工程疫苗。与血源疫苗相比，基因工程疫苗成本较低，安全性更好，已取得了很好的免疫效果。但这种单S的重组疫苗也有诸多不足，如免疫程序过长，乙肝病毒突变株导致的免疫逃逸及部分人群无应答或低应答等。因此，开发免疫原性更好、价格更为低廉的新型疫苗(第三代乙肝疫苗)仍有其紧迫性。

乙肝病毒包膜蛋白含有大蛋白(L)，中蛋白(M)和主蛋白(S)三种成分，其中S蛋白由226个氨基酸组成，在S蛋白之前，有一个由119个氨基酸组成的前S1(preS1)区和由55个氨基酸组成的前S2(preS2)区，其中，PreS2和S一起构成中蛋白，preS1和M一起构成大蛋白。研究表明，preS2含有B细胞和T细胞识别位点(Met¹-Gly²⁶)，在对S抗原遗传性无应答的小鼠中诱导出针对preS2的T细胞应答即可使小鼠对S抗原产生抗体应答(Milich DR，Thornton GB，Neurath AR，et a1.Enhancedimmunogenicity of the preS region of hepatitis B surface antigen.Science，1985，228：1195-1199.)。PreS抗体可能还在阻止病毒进入细胞时起作用，因为preS1含肝细胞结合位点(aa21-47)，preS2含多聚人血白蛋白(HAS)结合位点，而HAS能与肝细胞结合从而介导病毒对肝细胞的侵入(Machida A，Kishimoto S，Ohnuma H et al.Apolypeptide containing 55 amino acid residues coded by the pre-S region of hepatitis Bvirus deoxyribonucleic acid bears the receptor for polymerized human as well aschimpanzee albumins.Gastroenterology，1984，86：910-918.)。有研究显示，preS1、preS2抗血清能够分别中和乙肝病毒的毒力，保护大猩猩免受乙肝病毒感染(Pride MW，Bailey CR，Muchmore E et al.Evaluation of B and T-cell responses in chimpanzeesimmunized with Hepagene^R，a hepatitis B vaccine containing pre-S1，pre-S2 and S geneproducts.Vaccine，1998，16：543-550.)。因此，在疫苗中加入前S成分不但使S抗原本身的免疫原性得到增强，还增加了抗体谱，从而进一步提高了保护效率。

乙肝表面抗原大蛋白虽然含有preS1、preS2和S三种抗原成分，但其内部含有多个蛋白酶敏感位点，易于降解；亦不能有效组装成颗粒样结构(Imamura T，Araki M，Miyanohara A，et al.Expression of hepatitis B virus middle and large surface antigengenes in Saccharomyces cerevisiae.Journal of Virology 1987，3543-3549.)，难以作为疫苗成分加以利用。为了有效表达乙肝表面抗原大蛋白，人们尝试了多种方法对其进行修饰，如俞贤明等采用部分缺失的前S序列与S序列相连的方法，在动物细胞和酵母中表达出了颗粒样的含前S区的乙肝表面抗原(中国专利：CN 1063343C)。李光地等将前S1序列融合于S蛋白1-223位氨基酸的羧端并同时在S蛋白N端融合了前S2序列，构建出了前S2+S+前S1的结构(中国专利：CN 1067721C)。由于前S2和S基因均含有各自的翻译起始位点，上述结构在翻译过程中会分别从前S2和S蛋白起始，产生两种翻译产物，从而降低了前S组分的比例。而且上述两种构造的表达量都比较低，在实际应用方面有一定的限制。比利时的史密丝克莱恩公司将修饰的L基因与S基因在酵母中进行混合表达(美国专利6103519；美国专利6306625)，得到了含前S成分的乙肝表面抗原颗粒，但这种方法需要进行多次转化、多次筛选才能完成，过程比较复杂，而且混合颗粒需要以单独的S蛋白作为骨架，导致前S组分的比例偏低。

发明内容

为了增强乙肝疫苗的免疫原性，增加抗体谱和稳定性，同时使抗原能够在宿主细胞中高效表达，本发明的一个目的在于提供一种新的乙肝表面复合颗粒，其特征在于，该颗粒包含羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1和羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2。

所述的乙肝表面抗原复合颗粒由羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1亚基与羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2亚基装配而成。

所述的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1含有SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列。所述的羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS1由SEQ ID NO.1所述的基因编码。

所述的羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2含有SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列。所述的羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽SS2由SEQ ID NO.4所述的基因编码。在本发明的一个实施方案中，具有乙肝表面抗原S和前S2抗原性的多肽(蛋白)由SEQ ID NO.4编码，具有SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供含有SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.4所述核苷酸序列的重组载体，在本发明的一个具体实施方案中，构建了含有SEQ ID NO.1以及SEQ IDNO.4所述核苷酸序列的重组载体pAO815-SS1/SS2。

本发明的又一个目的是提供一种重组乙肝疫苗的制备方法，通过将所述重组载体转化宿主细胞，获得转化体，培养所述转化体获得表达的重组乙肝表面抗原融合蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗，所述的宿主细胞为酵母菌。

本发明还提供一种重组乙肝疫苗，其特征在于其含有所述的乙肝表面抗原复合颗粒；该重组乙肝疫苗也可以通过下述制备方法获得，

用权利要求7所述重组载体转化宿主细胞，获得转化体，培养所述转化体获得表达的重组乙肝表面抗原融合蛋白，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗。

根据本发明的一方面，首先，通过基因工程的方法构建了一个的新基因，根据乙肝病毒(adr亚型)的基因序列设计并合成相应的引物(SEQ ID NO.7、8、11、12)，以含乙肝病毒全长基因的质粒为模板，通过PCR扩增合成了乙肝表面抗原S和preS2(Met¹-Gly²⁶)所对应的基因序列，并将preS2(Met¹-Gly²⁶)序列融合于S序列的3’末端构建了新型乙肝表面抗原融合基因，其序列如SEQ ID NO.4所示。可以将该新的DNA与载体连接构建成重组载体，进而转(染)化宿主细胞，从而制备重组蛋白。也可以将该基因直接构建成重组DNA疫苗，用于乙型肝炎的预防或治疗。

根据本发明的另一方面，由本发明的基因编码的蛋白含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列，其为一个同时具有S和前S2抗原决定簇的新型乙肝病毒表面抗原(融合抗原)，构建的融合基因将编码前S2的核苷酸序列置于编码S的核苷酸序列的3端，从而当翻译时只有一种翻译产物产生，有效提高了前S2抗原的含量。同时，由于去除了前S2区主要的蛋白酶敏感位点，该融合抗原具有比天然蛋白更好的稳定性。此外，该融合抗原还能组装成与天然乙肝表面抗原类似的球形结构，这一特点对其免疫原性的维持具有重要作用。所产生的融合抗原经分离纯化后可以制备成重组乙肝疫苗。

本领域技术人员可以理解的是，本发明的融合多肽还包括那些与SEQ ID NO.6基本相同的氨基酸序列、或来自于它的简并的氨基酸序列、以及它们在生物学上的活性同类物，这些同类物具有在SEQ ID NO.6的基础上经过取代的、缺失的、延长的、置换的和甚至修饰的序列，这些序列所编码的蛋白质具有与SEQ ID NO.6所编码的蛋白质基本相同的生物学活性和功能。

按照类似的方法，我们也构建了羧端含前S1(20-47氨基酸残基)免疫决定簇的乙肝表面抗原融合基因(SS1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，可以将得到的融合基因直接构成重组DNA疫苗，也可以将由所述基因表达的融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，制备成疫苗。

然而，为了使重组乙肝疫苗具有更好的免疫原性，并且使其制备方法更加简便，本发明人在构建了新的核苷酸序列如SEQ ID NO.4的基础上，同时构建了如SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列，通过酶切后插入的方法将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4同时插入各种载体中构建成重组载体，再由重组载体转化宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，先将合成的SEQ ID NO.1序列的基因经酶切后插入pAO815，载体构建重组载体pAO815-SS1；在本发明的另一个实施方案中，将合成的SEQ ID NO.4序列的基因经酶切后插入载体pAO815，构建成重组载体pAO815-SS2；在另一实施方案中，通过酶切，分离含SEQ ID NO.4的表达盒，再插入pAO815-SS1，最后构建成重组载体pAO815-SS1/SS2。

当使用本发明构建的含有所述两种融合基因表达盒的重组载体转染宿主细胞时，获得可大规模培养并表达的转化体，培养该转化体可以同时获得具有所述两种融合多肽，并可在细胞内装配成具有前S1、前2和S三重抗原性的重组蛋白，即本发明的乙肝表面抗原复合颗粒，对该蛋白进行分离和纯化后即可用于制备重组乙肝疫苗。可以使用的宿主细胞包括但不限于酵母。

本发明中组成复合抗原颗粒的两种多肽分别是羧端含前S1抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS1)及羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合多肽(SS2)。由于前S1和前S2序列分别与S序列相融合，每一条多肽链都不长，因此可以在重组表达体系中达到很高的表达量。由于将前S序列融合到了S基因的羧基端，每一条融合基因链的转录体都只有一种翻译产物产生，这样就提高了前S成分的含量。翻译产生的两种多肽经过在细胞内的组合，产尘了同时具有前S1、前2和S三重抗原性的复合抗原。该复合抗原能组装成与天然乙肝表面抗原结构类似的球形颗粒，并且稳定性良好。

本发明的乙肝表面抗原复合颗粒能够在酵母中高效表达，并且在细胞内装配成具有前S1、前S2和S三重抗原性的复合颗粒，具有良好的抗原性，疫苗生产成本低廉。

附图说明

图1为SS1融合基因的结构示意图。

图2为重组载体pAO815-SS1的结构图。

图3为SS2融合基因的结构示意图。

图4为重组载体pAO815-SS2的结构图。

图5为重组表达载体pAO815-SS1/SS2的构建示意图。

图6为SS2融合抗原的Western blot分析结果。

A，用S抗体检测；B，用前S2抗体检测。图中左边条带为预染蛋白分子量标准(从下到上依次为20.0kd、26.0kd、33.0kd、50.0kd、85.0kd和118.0kd)，右边为印迹带。

图7为复合抗原颗粒的Western blot分析结果。

A，用S抗体检测；B，用前S1抗体检测；C，用前S2抗体检测。图中左边条带为预染蛋白分子量标准(从下到上依次为20.0kd、26.0kd、33.0kd、50.0kd、85.0kd和118.0kd)，右边为印迹带。

图8为纯化复合抗原的SDS-PAGE电泳图。图中左边条带为蛋白分子量标准，(从下到上依次为18.4kd、25.0kd、35.0kd、45.0kd、66.2kd和116.0kd)，右边为抗原染色带。

图9为复合抗原颗粒的电镜照片。

具体实施方式

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述说明，但不限制本发明。

【实施例1】羧端含前S1(aa20-47)抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因(SS1)的合成和表达载体的构建

1.主要材料和试剂

毕赤酵母菌株GS115(His^-，Mut⁺)，大肠杆菌Top10F’及毕赤酵母表达质粒pAO815购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α和克隆载体pBluescript II SK(+)为通用的菌株和质粒。限制性内切酶和Taq DNA聚合酶购自NEB公司，小牛肠碱性磷酸酶(CIP)，T4DNA连接酶购自MBI公司，DNA片断回收试剂盒购自Boehringer Mannheim公司

2.PCR引物合成及SS1融合基因片段的扩增

根据文献(琦祖和，阎君，熊伟军，等.乙型肝炎病毒adr NC-1DNA的全序列测定.中国科学(B辑)，1988，12：1300-1304.)报道的乙肝病毒(adr亚型)基因序列，合成下列四条引物：

P1：5’-AAAGAATTCACCATGGAGAACACAGCATCA-3’；

P2：5’-AATGTATACCCAAAGAC-3’；

P3：5’-TGGGTATACATTAATCCTCTGGGATTC-3’；

P4：5’-AAAGAATTCTCAGGGGTTGAAGTCCCAATC-3’；

其中P3引物5’端有12个碱基与P2引物互补，P1和P4引物编码区以外各含一个EcoR I位点。以含乙肝表面抗原全长基因片段的质粒(琦祖和，阎君，熊伟军，等.乙型肝炎病毒adr NC-1 DNA的全序列测定.中国科学(B辑)，1988，12：1300-1304.)pHBV为底物，以P1和P2为引物合成S片段，以P3和P4为引物合成前S1片段，然后以上述反应的产物为底物，以P1和P4为引物合成SS1融合基因片段。具体反应条件如下：

S和前S1片段的合成条件为：94℃3min(分)；94℃45s(秒)，40℃60s，72°C 70s，25个循环；72℃5min。分别回收S和S1片段，各取1ul作底物进行SS1融合片段的扩增。PCR反应条件如下：94℃3min；94℃45s，60℃60s，72℃70s，25个循环；72℃5min。

图1为SS1融合基因片段的结构示意图。

3.克隆载体的构建和基因序列测定

将PCR产物用EcoR I消化，与经EcoR I线性化并用去磷酸化酶(CIP)处理的pBluescript II SK(+)载体连接获得重组载体(pBlue-SS1)，转化大肠杆菌DH5α，进行质粒制备后分析EcoR I酶切图谱，挑选插入单一片段的重组子，委托上海基康生物技术有限公司进行序列测定。构建的SS1融合基因片段序列如下：

SEQ ID NO.1

  1 ATGGAGAACA CAGCATCAGG ATTCCTAGGA CCCCTGCTCG TGTTACAGGC

 51 GGGGTTTTTC TTGTTGACAA GAATCCTCAC AATACCACAG AGTCTAGACT

101 CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT TTTCTAGGGG GAGTACCCAC GTGTCCTGGC

151 CAAAATTCGC AGTCCCCAAC CTCCAATCAC TCACCAACCT CTTGTCCTCC

201 AATTTGTCCT GGCTATCGCT GGATGTGTCT GCGGCGTTTT ATCATATTCC-

251 TCTTCATCCT GCTGCTATGC CTCATCTTCT TGTTGGTTCT TCTGGACTAT

301 CACGGTATGT TGCCCGTTTG TCCTCTACTT CCAGGAACAT CAACTACCAG

351 CACGGGACCA TGCAAGACCT GCACGATTCC TGCTCAAGGA ACCTCTATGT

401 TTCCCTCTTG TTGCTGTACA AAACCTTCGG ACGGAAACTG CACTTGTATT

451 CCCATCCCAT CATCCTGGGC TTTCGCAAGA TTCCTATGGG AGTGGGCCTC

501 AGTCCGTTTC TCCTGGCTCA GTTTACTAGT GCCATTTGTT CAGTGGTTCG

551 TAGGGCTTTC CCCCACTGTT TGGCTTTCAG TTATATGGAT GATGTGGTAT

601 TGGGGGCCAA GTCTGTACAA CATCTTGAGT CCCTTTTTAC CTCTATTACC

651 AATTTTCTTT TGTCTTTGGG TATACATTAA TCCTCTGGGA TTCTTTCCCG

701 ATCACCAGTT GGACCCTGCG TTCGGAGCCA ACTCAAACAA TCCAGATTGG

751 GACTTCAACC CC

4.表达载体的构建

本实验所用的质粒pAO815为一商品化的载体，具有如下结构：含青霉素抗性基因以利于载体复制和筛选；含毕赤酵母酒精氧化酶基因1(AOX1)的启动子以起始外源基因的转录，其后是单一的EcoR I克隆位点，3’端是AOX1的末端终止序列；含毕赤酵母组氨醇脱氢酶基因(HIS4)以补偿宿主菌组氨酸的代谢缺陷；该载体还含有一段AOX1基因3’端的同源序列以利外源基因向宿主染色体的整合。用EcoR I消化插入SS1片段的pBluescript II SK(+)载体，分离插入片段，与经EcoR I线性化并用CIP碱性磷酸酶处理的pAO815载体连接，转化大肠杆菌Top10 F’，挑取单菌落制备质粒，用Avr II和BamH I双酶切，分析酶切图谱，挑选单一正向插入的重组子，构建成功含SS1融合基因的表达载体pAO815-SS1，该载体的结构如图2。

【实施例2】羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面抗原融合基因的合成和表达载体的构建

1.主要材料和试剂

同实施例1

2.PCR引物合成及SS2融合基因片段的扩增

根据文献(琦祖和，阎君，熊伟军，等.乙型肝炎病毒adr NC-1DNA的全序列测定.中国科学(B辑)，1988，12：1300-1304.)报道的乙肝病毒(adr亚型)基因序列，

合成下列四条引物：

P1、P2同实施例1；

P5：5’-TGGGTATACATTATGCAGTGGAACTCC-3’；

P6：5’-AAAGAATTCTCAGCCACCAGCAGG-3’；

其中P5引物5’端有12个碱基与P2引物互补，P1和P6引物编码区以外各含一个EcoR I位点。S片段的合成方法同实施例1。以质粒pHBV为底物，以P5和P6为引物合成前S2片段，然后以上述反应的产物为底物，以P1和P6为引物合成SS2融合基因片段。具体反应条件如下：

前S2片段的合成条件为：94℃3min(分)；94℃30s(秒)，45℃45s，72℃75s，25个循环；72℃5min。分别回收S和S2片段，各取1ul作底物进行SS2融合片段的扩增。PCR反应条件如下：94℃3min；94℃30s，55℃45s，72℃70s，25个循环；72℃5min。

图3为SS2融合基因片段的结构示意图。

3.克隆载体的构建和基因序列测定

将PCR产物用EcoR I消化，与经EcoR I线性化并用去磷酸化酶(CIP)处理的pBluescript II SK(+)载体连接获得重组载体(pBlue-SS2)，转化大肠杆菌DH5α，进行质粒制备后分析EcoR I酶切图谱，挑选插入单一片段的重组子，委托上海基康生物技术有限公司进行序列测定。构建的SS2融合基因片段序列如下：

SEQ ID NO.3

  1 ATGGAGAACA CAGCATCAGG ATTCCTAGGA CCCCTGCTCG TGTTACAGGC

 51 GGGGTTTTTC TTGTTGACAA GAATCCTCAC AATACCACAG AGTCTAGACT

101 CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT TTTCTAGGGG GAGCACCCAC GTGTCCTGGC

151 CAAAATTCGC AGTCCCCAAC CTCCAATCAC TCACCAACCT CTTGTCCTCC

201 AATTTGTCCT GGCTATCGCT GGATGTGTCT GCGGCGTTTT ATCATATTCC

251 TCTTCATCCT GCTGCTATGC CTCATCTTCT TGTTGGTTCT TCTGGACTAT

301 CACGGTATGT TGCCCGTTTG TCCTCTACTT CCAGGAACAT CAACTACCAG

351 CACGGGACCA TGCAAGACCT GCACGATTCC TGCTCAAGGA ACCTCTATGT

401 TTCCCTCTTG TTGCTGTACA AAACCTTCGG ACGGAAACTG CACTTGTATT

451 CCCATCCCAT CATCCTGGGC TTTCGCAAGA TTCCTATGGG AGTGGGCCTC

501 AGTCCGTTTC TCCTGGCTCA GTTTACTAGT GCCATTTGTT CAGTGGTTCG

551 TAGGGCTTTC CCCCACTGTT TGGCTTTCAG TTATATGGAT GATGTGGTAT

601 TGGGGGCCAA GTCTGTACAA CATCTTGAGT CCCTTTTTAC CTCTATTACC

651 AATTTTCTTT TGTCTTTGGG TATACATTAT GCAGTGGAAC TCCACAACAT

701 TCCACCAAGC TCTGCTAGAT CCCAGAGTGA GGGGTCTATA TTTTCCTGCT

751 GGTGGC

4.表达载体的构建

用EcoR I消化插入SS2片段的pBluescript II SK(+)载体，分离插入片段，与经EcoRI线性化并用CIP碱性磷酸酶处理的pAO815载体连接，转化大肠杆菌Top10F”，挑取单菌落制备质粒，用Avr II和BamH I双酶切，分析酶切图谱，挑选单一正向插入的重组子，构建成功含SS2融合基因的表达载体pAO815-SS2，该载体的结构如图4。

【实施例3】含SS1和SS2双表达盒(expression cassette)重组载体的构建

用BamH I和BglII双酶切pAO815-SS2质粒，分离含AOX1启动子区、SS2融合基因和AOX1转录中止序列的表达盒。将分离的BamH I-Bgl II表达盒与经BamH I线性化的pAO815-SS1质粒连接，转化大肠杆菌Top10F’，制备质粒，用BamH 1和BglII双酶切分析重组质粒并筛选正向插入SS2表达盒的重组子。该重组质粒含有两个表达盒：表达盒1，AOX1启动子区+SS1融合蛋白编码序列+AOX1转录中止序列；表达盒2，AOX1启动子区+SS2融合蛋白编码序列+AOX1转录中止序列。将该重组质粒转化到宿主菌以后，两个表达盒上的调控序列能够分别起始SS1和SS2融合基因的转录并进一步翻译成为相应的蛋白质。将该重载体命名为pAO815-SS1/SS2。其构建过程如图5所示。

【实施例4】羧端含前S2抗原决定簇的乙肝表面融合抗原SS2在毕赤酵母(PichiaPastoris)中的表达

1.主要材料和试剂

乙肝表面抗原反相血凝(RPHA)试剂盒和表面抗原(S)酶标试剂盒购自上海科华生物技术有限公司，乙肝表面抗原S和前S2抗体分别为Oxford BiotechnologyLimited公司和Orbigen Inc.公司产品。

2.重组质粒向酵母细胞的转化和阳性克隆的初步筛选

用Bgl II线性化pAO815-SS2载体，经酚/氯仿抽提，酒精沉淀后用电穿孔法转化GS115细胞。用MD[1.34％YNB(无氨基酸)，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖]琼脂平板筛选阳性克隆。由于GS115菌株本身不能合成组氨酸，只有整合了含HIS4基因的pAO815-SS2载体序列的菌株才能在无组氨酸的培养基上生长。

3.抗原的诱导表达及初提液的制备

挑取His⁺的单菌落，接种于100ml MGY培养基(1.34％YNB，1％甘油，4×10^-5％生物素)30℃震荡培养过夜，收获菌体，悬浮于20ml MM培养基(1.34％YNB，4×10^-3％生物素，0.5％甲醇)继续培养。每24hr补加100μl甲醇并取样，离心收集菌体，共诱导72hr。

在菌体中加入适量破壁缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.4，1mM PMSF，1mMEDTA，5％甘油)和等体积玻璃珠(直径0.5mm)，在振荡器上剧烈振荡30s后，冰浴30s，重复8次，离心抽取上清，即为抗原初提液。

4.表达产物的抗原性检测

用反相血凝法(RPHA)对8株His⁺(组氨酸合成阳性)菌株的抗原初提液进行测定，其中有一株阳性，进一步用ELISA法对该产物进行前S2抗原性检测，结果也为阳性。测定结果如表1。将该重组菌株定名为GS115-SS2。

              表1 融合抗原SS2的抗原性检测

  RPHA  ELISA  S  PreS2  1∶1024  2.92(1/100稀释)  2.03(1/10稀释)

5.表达产物的Western blot鉴定

将抗原初提液经SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上，分别以S和前S2抗体为一抗，以碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，以NBT/BCIP为显色底物，进行印迹分析。从图6可以看出，表达产物既能与S抗体结合，也能与前S2抗体结合。S前S2抗体印记带处于同一位置，这说明，前S2区域并没有发生降解，否则S抗体印记会出现较前S2抗体印记较小的条带。SS2融合抗原可以形成二聚体和多聚体，在图中也有相应的显色带。

【实施例5】具有前S1、前S2和S三重抗原性的乙肝表面抗原复合颗粒在毕赤酵母(Pichia Pastoris)中的表达

1.主要材料和试剂

乙肝表面抗原反相血凝(RPHA)试剂盒和表面抗原(S)酶标试剂盒购自上海科华生物技术有限公司，前S1酶标试剂盒购自上海阿尔法生物技术有限公司，前S2单克隆抗体和酶标试剂盒购自北京肝炎试剂研制中心，乙肝病毒变性S抗原的抗体参考宗芳等(变性乙型肝炎病毒表面s抗原抗体的制备和应用.中华实验和临床病毒学杂志，2001，15：387-388)的方法自制，前S1抗体也是自制的多克隆抗体，方法如下：用纯化的SS1融合蛋白免疫家兔，制备抗血清，用纯化的乙肝表面抗原(S)吸收家兔血清中的S抗体成分进而得到前S1抗体。

2.重组质粒向酵母细胞的转化和阳性克隆的初步筛选

用Bgl II线性化pAO815-SS1/SS2载体，经酚/氯仿抽提，酒精沉淀后用电穿孔法转化GS115细胞。用MD[1.34％YNB(无氨基酸)，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖]琼脂平板筛选阳性克隆。由于GS115菌株本身不能合成组氨酸，只有整合了含HIS4基因的pAO815-SS1/SS2载体序列的菌株才能在无组氨酸的培养基上生长。

3.抗原的诱导表达及初提液的制备

挑取His⁺的单菌落，接种于100ml MGY培养基(1.34％YNB，1％甘油，4×10^-5％生物素)30℃震荡培养过夜，收获菌体，悬浮于20ml MM培养基(1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)继续培养。每24hr补加100μl甲醇并取样，离心收集菌体，共诱导72hr。

在菌体中加入适量破壁缓冲液(50mM磷酸缓冲液pH7.4，1mM PMSF，1mMEDTA，5％甘油)和等体积玻璃珠(直径0.5mm)，在振荡器上剧烈振荡30s后，冰浴30s，重复8次，离心抽取上清，即为抗原初提液。

4.表达产物的抗原性检测

用反相血凝法(RPHA)对4株His⁺(组氨酸合成阳性)菌株的抗原初提液进行测定，其中有一株阳性，进一步用ELISA法对该产物进行前S1、前S2和S抗原性检测，三者均为阳性。测定结果如表2。将该重组菌株定名为GS115-SS1S2。

              表2 表达产物的ELISA检测结果

  PreS1  PreS2  S  1.1(1/8稀释)  2.0(1/8稀释)  2.8(1/100稀释)

5.表达产物的Western blot鉴定

将抗原初提液经SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上，分别以变性S抗体、前S1抗体和前S2抗体为一抗，以碱性磷酸酶(AP)标记的兔抗鼠(S和前S2抗体)或羊抗兔(前S1抗体)IgG为酶标二抗，以NBT/BCIP为显色底物，进行印迹分析。从图7可以看出，表达产物既能与S抗体结合，也能与前S1和前S2抗体结合。由于SS1和SS2融合蛋白的理论分子量相近，都在27kd左右，S、前S1和前S2抗体印记带几乎在同一位置。这同时也说明，前S区域并没有发生降解，否则S抗体印记会出现较前S抗体印记较小的条带。乙肝表面抗原可以形成二聚体和多聚体，在图中也有相应的显色带。

【实施例6】工程菌的发酵和复合抗原的纯化

1.主要材料和试剂

MGY培养基：1.34％酵母含氮碱性培养基，1％甘油，4*10^-5％生物素；

基础盐溶液：

磷酸85％                        26.7ml

硫酸钙                          0.93g

硫酸钾                          18.2g

硫酸镁7水                       14.9g

氢氧化钾                        4.13g

甘油                            40.0g

蒸馏水                          补至1L；

微量盐溶液：

硫酸铜5水                       6.0g

碘化钠                          0.08g

硫酸锰1水                       3.0g

钼酸钠2水                       0.2g

硼酸                            0.02g

氯化钴                          0.5g

氯化锌                          20.0g

硫酸亚铁7水                     65.0g

生物素                          0.2g

硫酸                            5.0ml

蒸馏水                          补至1L；

2.工程菌发酵

挑取GS115-SS1S2单菌落，接种到MGY培养基，30℃振荡培养至OD600＝2-6，转移到发酵罐继续培养。发酵用培养基为含微量盐的基础盐溶液。待基础盐中的甘油消耗完全以后，补加甘油，继续培养4-8小时，加甲醇诱导约72小时。此时培养物浓度大致达到每ml 150-180个OD600单位。抽样并按【实施例4】所述方法制备抗原初提液，用反相血凝法测定样品滴度。经测定，抗原表达量达到300-600mg/L。离心收集菌体，储存于-20℃备用。

3.抗原的纯化和检测

取适量菌体，经细胞破碎、酸沉淀、硅胶吸附、疏水层析和凝胶过滤后，进行SDS-PAGE电泳分析。从图8可以看出，纯化的抗原带型完整，没有明显的降解条带。由于SS1和SS2的分子量相近，在电泳照片上的位置重合，均为27kd。电泳图上也有二聚体和三聚体带，这些结果均与Western blot分析相吻合。进一步用ELISA法对纯化抗原进行检测，其前S1、前S2和S抗原均呈阳性。

4.复合抗原的电镜观察

将纯化的融合抗原经2％磷钨酸负染后进行透射电镜观察，可以看到，纯化抗原能够组装成直径20-35nm的球形颗粒，如图9所示。

上述结果说明，用本发明提供的方法，能够制备出结构稳定并且具有前S1、前S2和S三重抗原性的复合抗原颗粒。本发明得到的复合颗粒同时具有前S1、前S2和S抗原性，在毕赤酵母系统中能达到很高的表达量，并且以与天然乙肝表面抗原结构类似的球形颗粒形式存在，这些特性为开发廉价、高效的新一代乙肝疫苗提供了很好的条件。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

                                          乙肝复合颗粒.ST25.txt

                        SEQUENCE LISTING

<110>成都生物制品所

<120>含前S1、前S2和S抗原决定簇的乙肝表面抗原复合颗粒

<130>2748

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>762

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(762)

<400>1

atggagaaca cagcatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc     60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat    120

tttctagggg gagtacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac    180

tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt    240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat    300

cacggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacat caactaccag cacgggacca    360

tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca    420

aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga    480

ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt    540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat    600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt    660

tgtctttggg tatacattaa tcctctggga ttctttcccg atcaccagtt ggaccctgcg    720

ttcggagcca actcaaacaa tccagattgg gacttcaacc cc                       762

<210>2

<211>762

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(762)

<400>2

atg gag aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag       48

Met Glu Asn Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta       96

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gta ccc acg tgt      144

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Val Pro Thr Cys

        35                  40                  45

cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tct      192

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

                                           乙肝复合颗粒.ST25.txt

    50                  55                  60

tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt      240

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt      288

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

ctt ctg gac tat cac ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga      336

Leu Leu Asp Tyr His Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

            100                 105                 110

aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct      384

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

        115                 120                 125

caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac      432

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga      480

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145                 150                 155                 160

ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tta cta      528

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt      576

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc      624

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

        195                 200                 205

ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta      672

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

tac att aat cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg gac cct gcg      720

Tyr Ile Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

225                 230                 235                 240

ttc gga gcc aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc              762

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro

                245                 250

<210>3

<211>254

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<400>3

Met Glu Asn Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Val Pro Thr Cys

        35                  40                  45

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

    50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

                                          乙肝复合颗粒.ST25.txt

65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr His Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145                 150                 155                 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

        195                 200                 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

225                 230                 235                 240

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro

                245                 250

<210>4

<211>756

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(756)

<400>4

atggagaaca cagcatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc     60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccacag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat    120

tttctagggg gagcacccac gtgtcctggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac    180

tcaccaacct cttgtcctcc aatttgtcct ggctatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt    240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct tctggactat    300

cacggtatgt tgcccgtttg tcctctactt ccaggaacat caactaccag cacgggacca    360

tgcaagacct gcacgattcc tgctcaagga acctctatgt ttccctcttg ttgctgtaca    420

aaaccttcgg acggaaactg cacttgtatt cccatcccat catcctgggc tttcgcaaga    480

ttcctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcctggctca gtttactagt gccatttgtt    540

                                            乙肝复合颗粒.ST25.txt

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ttatatggat gatgtggtat    600

tgggggccaa gtctgtacaa catcttgagt ccctttttac ctctattacc aattttcttt    660

tgtctttggg tatacattat gcagtggaac tccacaacat tccaccaagc tctgctagat    720

cccagagtga ggggtctata ttttcctgct ggtggc                              756

<210>5

<211>756

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(756)

<400>5

atg gag aac aca gca tca gga ttc cta gga ccc ctg ctc gtg tta cag       48

Met Glu Asn Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata cca cag agt cta       96

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga gca ccc acg tgt      144

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys

        35                  40                  45

cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac tca cca acc tct      192

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

    50                  55                  60

tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt ctg cgg cgt ttt      240

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc ttc ttg ttg gtt      288

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

ctt ctg gac tat cac ggt atg ttg ccc gtt tgt cct cta ctt cca gga      336

Leu Leu Asp Tyr His Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

            100                 105                 110

aca tca act acc agc acg gga cca tgc aag acc tgc acg att cct gct      384

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

        115                 120                 125

caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca aaa cct tcg gac      432

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg gct ttc gca aga      480

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145                 150                 155                 160

ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg ctc agt tta cta      528

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc act gtt tgg ctt      576

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt ctg tac aac atc      624

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

        195                 200                 205

ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt tgt ctt tgg gta      672

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

                                          乙肝复合颗粒.ST25.txt

    210                 215                 220

tac att atg cag tgg aac tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta gat      720

Tyr Ile Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp

225                 230                 235                 240

ccc aga gtg agg ggt cta tat ttt cct gct ggt ggc                      756

Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

                245                 250

<210>6

<211>252

<212>PRT

<213>Artificial(人工序列)

<400>6

Met Glu Asn Thr Ala Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                   15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys

        35                  40                  45

Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

    50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr His Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly

            100                 105                 110

Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg

145                 150                 155                 160

Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile

        195                 200                 205

Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp

                                          乙肝复合颗粒.ST25.txt

225                 230                 235                 240

Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

                245                 250

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<400>7

aaagaattca ccatggagaa cacagcatca                                     30

<210>8

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<223>引物

<400>8

aatgtatacc caaagac                                                   17

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(27)

<223>引物

<400>9

tgggtataca ttaatcctct gggattc                                        27

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(30)

<223>引物

<400>10

aaagaattct caggggttga agtcccaatc                                     30

<210>11

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

                                          乙肝复合颗粒.ST25.txt

<222>(1)..(27)

<223>引物

<400>11

tgggtataca ttatgcagtg gaactcc                                        27

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial(人工序列)

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(24)

<223>引物

<400>12

aaagaattct cagccaccag cagg                                           24