人白细胞介素15与Fc融合蛋白

摘要

公开了一种融合蛋白，该融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc片段、白细胞介素15，其中所述人免疫球蛋白Fc片段与白细胞介素15通过连接肽段连接。还公开了编码它的核酸，含有该核酸的表达载体，含有该融合蛋白的药物组合物，其抗微生物感染的制药用途以及产生这种融合蛋白的方法，包括步骤：在宿主细胞中表达上述表达载体。

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术领域，更具体地，本发明涉及基因工程人白细胞介素15(Interleukin-15，IL-15)与Fc融合蛋白，其用途及制备方法。

发明背景

白细胞介素15(IL 15)是白细胞介素类新发现的一种细胞因子，与白细胞介素2(IL-2)具有相似的生物学活性，能促进B细胞的分化增殖，诱导NK细胞增殖、细胞毒活性、细胞因子产生，它与IL 12协同可促使NK细胞产生IFN-γ，对于调节NK细胞的功能和机体免疫力有重要作用。

首先，IL-15作为机体内抗微生物感染早期免疫应答的一部分，它能在不利于炎症前期细胞因子(如IL-1等)表达的环境下持续发挥作用，并通过激活γδT细胞，填补吞噬系统和由αβT细胞特异免疫应答之间的空隙。通过激活NK细胞的杀伤活性，在机体抗病毒感染过程中起着十分重要的作用。IL-15在多种组织中表达，如胎盘、骨骼肌、肾、肺、心、单个核细胞、巨噬细胞，在受到多种刺激时可诱导表达。特别是单核细胞/巨噬细胞系统在受到刺激后可诱导表达IL-15，并在机体天然免疫与获得性免疫的承启过程中起着比较重要的作用。

HIV感染的病人外周血单个核细胞，NK细胞和ADCC活性明显降低。而在体外培养过程中加入重组IL-15，可明显提高NK细胞的杀伤活性，且这种作用不需要其它细胞因子(如IL2，IL12，IFN-γ等)的诱导。

同时IL15可以调节HIV感染病人CD8+T细胞的增殖，它可保持CD8+T细胞介导的血管外组织抗HIV免疫应答。这提示在IL2和功能性CD4+T细胞缺乏时，利用IL-15的免疫调节作用，使CTL进行体内增殖的可能性。炎症时IL15可以活化肺部巨噬细胞，HIV感染病人肺泡Mφ和T细胞表达IL15、IFNγ，IL15结合蛋白，同时上调共刺激因子B7，CD72，都与MФ抗原递呈有关，它们可引起T细胞强烈增殖。这表明IL15在HIV病人血管外组织T细胞介导的防御机制中有重要作用。Lane等最近认为，间歇性、低剂量rIL2治疗HIV1感染病人导致的循环CD4+T细胞增多，可能是机体免疫状态的一种改善；然而，这种治疗却因为rIL2注射的同时胞浆HIV1 RNA水平瞬时升高而复杂化，推测IL-2激活CD4+T细胞后，造成病毒复制加强。如果IL15能象IL2一样引起循环CD4+T细胞增多，但同时仅使最少数目的CD4+T细胞得到活化，它将有希望成为一种有效的免疫功能恢复剂。

但是由于天然IL-15分子量小，体内应用后半衰期短，因而限制了其体内生物学活性的发挥。因此，本领域迫切需要一种改善其体内半衰期，促进其生物学活性发挥的途径。

发明内容

因此，在本发明的第一个方面，提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含人免疫球蛋白Fc片段、白细胞介素15，其中所述人免疫球蛋白Fc片段与白细胞介素15通过连接肽段连接。

在该方面的一个优选实施方式中，免疫球蛋白Fc片段包含免疫球蛋白重链的CH2、CH3和CH4结构域。更优选的，该免疫球蛋白Fc片段是人免疫球蛋白IgG4的重链恒定区。还优选免疫球蛋白Fc片段是IgG4的Fc片段，包括IgG4的绞链区、CH2、CH3结构域。

在该方面的另一个优选实施方式中，该融合蛋白具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

在该方面的另一个具体实施方式中，白细胞介素15是人白细胞介素15。

在该方面的另一个优选实施方式中，连接肽序列是ESKYGPPCPSCP。

在该方面的还有一个优选实施方式中，该融合蛋白通过分子间二硫键形成二聚体。

在本发明的第二个方面，提供了编码上述融合蛋白的核酸。优选该核酸具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

在本发明的第三个方面，提供了含有上述核酸的表达载体。

在本发明的第四个方面，提供了含有上述表达载体的宿主细胞。优选所述宿主细胞是真核细胞，更优选的，所述真核细胞是酵母细胞。

在本发明的第五个方面，提供了一种药物组合物，该药物组合物含有上述融合蛋白及其药物学上可接受的载体。

在本发明的第六个方面，提供了上述药物组合物用于制备抗微生物感染的药物的用途。

在本发明的第七个方面，提供了一种生产上述融合蛋白的方法，包括步骤：

在宿主细胞中表达上述表达载体。

在该方法的一个优选实施方式中，该方法包括步骤：(a)在发酵罐中对上述真核宿主细胞，优选酵母细胞进行高密度培养；(b)收集培养上清后经超滤浓缩、亲和层析及阴离子交换方法纯化得到上述融合蛋白。

附图说明

图1是融合蛋白的氨基酸(SEQ ID NO：1)及cDNA序列(SEQ ID NO：2)。

其中在SEQ ID NO：1的氨基酸序列中，1-116位氨基酸残基为IL-15的氨基酸序列，117-128位氨基酸残基为连接肽，129-345位氨基酸残基为Fc的氨基酸序列。

在SEQ ID NO：2的cDNA序列中：1-348碱基为IL-15编码序列；349-384碱基为连接肽编码序列；385-1035为Fc编码序列。

图2是连接肽的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)和氨基酸序列。

图3是PCR扩增α信号肽片断、IL-15和Fc的电泳检测图。

图4显示了最终融合质粒的酶切筛选图。

图5显示了表达IL15-Fc融合蛋白的酵母工程菌株的筛选。

图6是实施例3中用PCR的方法扩增所筛选的表达菌株的基因组DNA电泳图谱。

图7是纯化后基因工程人IL15/Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定照片。

图8是CTLL-2细胞增殖法检测融合蛋白生物学活性结果。

具体实施方式

本发明首先通过分子生物学方法从人外周血单个核细胞中及外周血白细胞中分离出总mRNA，采用RT-PCR方法扩增出IL-15及IgG4 Fc编码cDNA序列，然后通过双重PCR方法体外将IL-15cDNA序列与人免疫球蛋白Fc区的编码序列相连。

此处所用的术语“免疫球蛋白Fc区”指免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，例如免疫球蛋白Fc区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合，在一个优选的实施例中，所用的免疫球蛋白的Fc区包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，优选缺少CH1结构域。

已知人免疫球蛋白有多种类别，如IgA、IgD、IgE、IgM及IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四个亚类)，从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区是在本领域技术人员所掌握的范围之内的，在一个优选的实例中，免疫球蛋白Fc区可选择包含有人免疫球蛋白IgG4亚类Fc区的编码序列，其中缺失一个免疫球蛋白重链1结构域(CH1)，但包括了铰链区以及CH2、CH3、CH4三个结构域的编码序列。

连接白细胞介索15与人免疫球蛋白间的连接肽是指将两个蛋白连接在一起的多肽序列，连接肽可选择多种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)或其它氨基酸的组合，例如可选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为10-15个氨基酸残基，参见US Patent NO 00/13827。也可选择人免疫球蛋白的铰链区多肽序列直接将白细胞介素15与人免疫球蛋白Fc区相连。最佳的连接肽长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。在本发明的一个优选实施例中，连接肽采用人免疫球蛋白IgG的铰链区序列，采用该连接肽可降低融合蛋白的免疫原性，提供融合蛋白在体内应用后的生物学活性。

本发明中所述的表达载体可以是原核表达载体及真核表达载体。载体的选择及构建是本领域技术人员通常所掌握的。由于原核表达体系所表达的产物常以不溶性的包涵体形式存在，表达的目的蛋白需经过复杂的变性及复性过程后，才能获得具有天然生物学活性的目的蛋白。由于Fc融合蛋白分子较大，分子中含有较多的二硫键，结构及功能也较复杂，一般均采用真核表达系统表达，以便通过糖基化修饰和自然折叠，产生具有天然蛋白或多肽生物学活性功能的糖基化重组融合蛋白。由于在真核表达体系中，酵母表达体系具有构建快速、目的蛋白表达量高，生产目的蛋白成本较低等优点，因此本发明优选了酵母真核表达载体。在优选的一个方案中，本发明人构建了酵母分泌型表达载体pPIC9-IL15-Fc，该载体的简单描述。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是酵母细胞，更佳地，该宿主细胞是毕赤酵母细胞，最佳地是巴斯德毕赤酵母细胞。在一个优选的实施例中，本发明的发明人通过将所述的酵母分泌型载体转染酵母菌后，得到分泌IL-15/Fc融合蛋白的表达工程菌。

在本发明中，术语“IL-15/Fc融合蛋白”，是指由白细胞介素-15与人IgG4Fc段两种蛋白融合后所形成的多肽。所述的白细胞介素-15和抗体IgG4Fc均来自于人，也可以衍生自其它非人的哺乳动物，但较佳地是衍生于人的白细胞介素-15和人的抗体IgG4。

本发明提供的人白细胞介素-15/Fc融合蛋白优选是一种二聚体分子。这里所用的术语“二聚体”是指二个融合蛋白多肽链通过共价键或非共价键相互作用而稳定地连接在一起。特别是通过免疫球蛋白Fc区二硫键形成的共价键，形成稳定的二聚体结构。

本发明的发明人发现，通过将编码hIL-15的核苷酸与人IgG4Fc区编码序列整合，插入酵母表达载体pPIC9，可十分高效地表达人IL-15/Fc融合蛋白。通过优化酵母工程菌的培养及制备工艺，获得高纯度的人IL-15/Fc融合蛋白，完成了本发明。

在一个较佳例子中，通过优选的方案，从人外周血单核细胞中通过PCR方法直接克隆人IL-15 cDNA序列，然后将PCR产物直接克隆至pMD18T(Takara公司)载体，得到pMD18T-IL15，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)。然后从正常人外周血白细胞中提取mRNA，反转录获得cDNA第一链，以其为模板进行PCR，扩增IgG4的Fc片段基因，PCR产物直接克隆到pMD18T载体上，得到pMD18T-Fc。

以pMD18T-IL15和pMD18T-Fc为模板，设计引物扩增出IL15和Fc片断，然后IL15与pPICK载体上经过改造的α信号肽相连，而Fc片断则连接到IL15的下游区，构成编码IL15-Fc融和蛋白的载体，命名为pPIC9K-IL15-Fc。

表达工程菌通过将表达载体在体外转染宿主细胞后完成。表达载体的转化可采用常规的方法，如氯化钙法、电穿孔法等。在本发明中，发明人采用一种通常适用于酵母菌的高效转化方法。可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞或真核细胞，更佳地为酵母菌，最佳地为酵母菌巴斯德毕赤酵母菌株。具体地，本发明的工程酵母菌是通过如下方法获得的。将巴斯德酵母(pichia pastoria)GS115菌接种于YPD培养基中，30℃摇床培养过夜制备感受态酵母菌。将80μl感受态酵母和内切酶SacI酶切的表达载体混合在一起，然后置于电穿孔仪以7000伏特/cm 5-10毫秒进行电击。电击后的酵母涂于MD选择性培养上，放28℃进行培养。3-5天后挑选克隆，将单个克隆生长于MD培养中，于28℃培养36小时，所选的克隆再进行DNA测序，再次确认融合蛋白基因是正确的。

本发明人还通过优化酵母工程菌的表达条件，提高了IL15-Fc融合蛋白的表达水平。并通过优选的方法，从培养上清中分离纯化出IL15-Fc高纯度的IL15-Fc融合蛋白。

在本发明中，可用多种常规方法使携带表达载体的酵母菌株表达IL-15。在下面的实施例给出了一个优选方案。采用优选的发酵培养基，培养时间一般为72-144小时，收获时的OD600光吸收应100-300，一般为200-250。

纯化工艺可采用本领域中常规使用的纯化工艺，也可采用本发明人专门设计的纯化工艺。本发明给出的一个优选的融合蛋白后的分离纯化步骤，包括以下步骤：(a)收集培养上清，(b)超滤浓缩，(c)Protein A亲和层析，(d)Sourcel5Q离子交换柱层析。用本发明人选择的工艺进行纯化，最终可获得纯度大于95％基因人白细胞介素15/Fc融合蛋白制品。

免疫球蛋白Fc段融合蛋白是应用基因工程技术产生的由某种具有生物学活性的蛋白或多肽片段与免疫球蛋白(多为IgG)的重链恒定区Fc片段组成而成的融合蛋白，由于融合蛋白具有类似于免疫球蛋白的双体样分子结构，既保留了所融合的目的蛋白的生物学活性，又具有不容易被蛋白酶降解，在体内外应用过程中具有较好的稳定性等优点。特别是由于与未融合的多肽活性因子相比，融合蛋白分子量大，在血清中半衰期长，克服了在重组细胞因子免疫治疗过程中存在的药物在体内生物半衰期短(数十分钟到数小时)的缺点，提高了细胞因子的治疗效果。而且融合蛋白通过结合Fc受体后，与含有Fc受体的免疫细胞相结合，从而给预所制备药物具有特定的靶向性，定位于NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等免疫活性细胞，使IL-15发挥其免疫调节效应，而抑制其与其它靶细胞作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，这引起实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：人IL-15功能基因和人IgG4的Fc片段基因的克隆

1、IL-15功能基因的克隆：

从正常人的外周血中分离粘附的单核细胞，加入LPS刺激4h后，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成cDNA第一链，以其为模板分别进行PCR扩增野生型人成熟IL-15cDNA序列，所用的引物为：

上游引物：P15’AACTGGGTGAATGTAATAAG 3’

下游引物：P25’AGAAGTGTTGATGAACA TTTG3’

人IL-15的PCR产物的预计大小为790bp，PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃30秒、51℃45秒、72℃50秒，30个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。野生型人IL-15的PCR产物的预计大小为790bp，电泳得到预计大小的片断。PCR产物直接克隆至pMD18T(Takara)载体，得到pMD18T-IL15，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，结果表明克隆到的人野生型人IL-15的cDNA与报道一致，包括完整的编码序列。

2、IgG4的Fc片段基因的克隆：从正常人外周血白细胞中提取mRNA，反转录获得cDNA第一链，以其为模板进行PCR，扩增IgG4的Fc片段基因，所用的引物为：

上游引物：P35’ACATGCCCACCGTGCCCAG 3’

下游引物：P45’TTATTTACCCGGAGACAGGGAG 3’

PCR反应的循环参数为94℃30秒、56℃40秒、72℃45秒，进行30个循环。得到约670bp的Fc基因片段。PCR产物直接克隆到pMD18T载体上，得到pMD18T-Fc，测序结果与报道一致。

实施例2：编码IL15-Fc融合蛋白的酵母分泌型载体的构建

分别以pMD18T-IL15和pMD18T-Fc为模板，设计引物扩增出IL15和Fc片断，然后IL15与pPICK载体上经过改造的α信号肽相连，而Fc片断则连接到IL15的下游区，构成编码IL15-Fc融和蛋白的载体，命名为pPIC9K-IL15-Fc。

(a)IL-15片断的扩增

对于IL15片断，用于扩增的引物序列为：

上游引物IL15-F：-CGAGAAAAGAAACTGGGTTAACGTTATCTC-

下游引物IL15-RE：-CGGAATTCGGAAGTGTTGATGAACAT-

以pMD18T-IL15为模板，按常规PCR方法扩增出IL15片断。扩增条件为97℃，2min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，45s，共25个循环；再72℃，10min；最后4℃保存。结果得到一条360bp的目的片断，与预期的相符。对反应产物用试剂盒回收。

(b)对pPIC9K的α信号肽进行改造

如果按照常规操作，选择限制性内切酶EcoRI将外源的目的蛋白插入表达载体pPIC9K，则会在最终蛋白产物的N端多加至少4个多余的氨基酸。为消除此N端多余的氨基酸，我们对α信号肽序列进行了改造，使目的融合蛋白的读码框直接紧接在信号肽之后。

用于α信号肽扩增的上下游引物为：

上游引物α-factor-FB：-CGGGATCCAAACGATGAGATTTCCTT-

下游引物α-factor-R：-TAACCCAGTTTCTTTTCTCGAGAGATACCC-

以pPIC9K为模板，按常规PCR方法扩增出α信号肽片断。反应条件与(a)中的相同，结果得到一条280bp的片断。对反应产物用试剂盒回收。

(c)将IL15片断与改造过的α信号肽连接

通过两个PCR完成。第一个PCR反应以上两步得到的PCR产物为模板和引物。反应条件为：97℃，2min；94℃，45s，56℃，45s，72℃，60s，共13个循环：再72℃，10min；最后4℃保存。该反应结束后，将反应混合液离心冰浴，补加入引物α-factor-FB和IL15-RE以及补充反应所需的其他成分。反应条件为：

97℃，2min；94℃，45s，55℃，45s，72℃，60s，共25个循环；再72℃，10min；最后4℃保存。电泳检测发现得到一条略大于500bp的片断，与预期结果相符合。对反应产物用试剂盒回收。

(d)扩增Fc片断，改变其酶切位点

上游引物为Fc-FE：-CGGAATTCGAGTCCAAGTACGGTCC-

下游引物为Fc-RN：-TTGCGGCCGCTTACTTACCCAAGGAC-

反应条件为：97℃，2min；94℃，45s，53℃，45s，72℃，60s，共30个循环；再72℃，10min；最后4℃保存。电泳发现有一条750bp的单一片断。符合预期。

图3显示了(a)、(b)和(d)项结果的电泳检测图谱。其中两图中M都表示DL2000DNA电泳标记，A为IL-15片断，B为α信号肽片断，C为Fc扩增片断。可见三者的大小与预期的360bp、280bp、700bp相符。

(e)两个中间载体的构建和鉴定

分别用BamHI和EcoRI酶切(c)中得到的产物和载体pPIC9K，胶回收目的外源片断和载体片断。用T4连接酶连接两个片断。转化入大肠杆菌DH5α。

分别用EcoRI和NotI酶切(d)中得到的产物和载体pPIC9K，胶回收目的外源片断和载体片断。用T4连接酶连接两个片断。转化入大肠杆菌DH5α。

分别抽提上两个转化得到的克隆的质粒，命名为pPIC9K-I115和pPIC9K-Fc，分别用酶切鉴定和测序以确定无误。

(f)融合载体的构建

确定两个中间载体序列无误后，分别用EcoRI和NotI双酶切，回收pPIC9K-IL15酶切后的载体片断和pPIC9K-Fc的Fc片断。然后连接pPIC9K-IL15和Fc，得到终产物融合载体pPIC9K-IL15-Fc，分别用酶切鉴定和测序以确定无误。

图4显示了最终融合质粒的酶切筛选图，1-6为转化后得到的克隆经过抽提质粒后用BamHI和EcoRI双酶切后1.2％琼脂糖电泳图谱。可以看到1、2、4、6四个质粒酶切后切出了一个片断介于500bp到750bp之间，与预期的相符。

实施例3：表达IL15-Fc融合蛋白的酵母工程菌株的建立及其鉴定

重组质粒pPIC9K-IL15-Fc和对照质粒pPIC9K大抽质粒，各取5-10μg经Sac I酶切线性化后，用电击法转化酵母菌株GS115，转化后用MD(葡萄糖最低限度培养基)平板筛选发生同源重组的His⁺克隆。用水将转化得到的克隆全部混匀起来，取105个酵母菌分别涂布到G418梯度抗性的YPD平板上(G418浓度分别为0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0、3.0和4.0mg/ml)。30℃培养2-5天。挑取若干个各梯度抗性板上的重组菌落接种于20ml的BMGY中培养基中，30℃摇瓶培养，生长至菌体浓度A600nm＝2～6，离心收菌，换以5-10倍体积的(100ml)BMMY(含0.5％甲醇)重悬细胞，30℃继续培养48h，每24hr补加甲醇至终浓度为0.5％。诱导72hr后，取上清以鼠抗人Fc抗体做斑点印迹，按显色的深浅半定量确定表达量高的菌株。

图5显示了是用斑点印迹法表达筛选IL15-Fc融合蛋白的酵母工程菌株HRP标记的鼠抗人Fc片断的显色图。从图中可以看出，左上角两个阴性对照不显色。而最上排第三列表达液显色最亮。我们确定以该菌株为表达菌株。编号为KIF6。

挑取该菌株的克隆于含25单位酵母酶(lyticase)的5μl水中，30℃保温10min，-80℃ 10min，室温离心，取上清2μl为模板。根据同源重组原理设计引物：5’端引物采用与酵母5’AOX1启动子同源的序列，3’端引物为IL-15基因的下游引物，进行PCR扩增进一步筛选阳性克隆，以无基因插入的空载体转化克隆为阴性对照。来确定该克隆是否含有目的片断。

图6为用PCR的方法扩增所筛选的表达菌株的基因组DNA电泳图谱。所用的扩增引物为实施例2中的IL15-FE和Fc-RN。样品1为图5中菌株KIF6，2和3为图5中另外两个高亮菌株。4为GS115用空质粒pPIC9K电转菌株。PCR结果显示，1-3都有＞1000bp的片段，其大小与IL15-Fc融合片断的相符。提示目的片断整合入了酵母的基因组DNA中。

实施例4.重组酵母菌的发酵

(a)种子培养

将实施例3获得的酵母菌菌种KIF6，0.1ml接种入100ml种子培养基，在摇床中30℃、250rpm培养16-18小时，在OD₆₀₀光吸收为10时停止摇菌。

种子培养基配方：YNB 13.4g/L，甘油20g/L，Biotin 0.4mg/L，磷酸钾盐缓冲液0.1mol/L，pH6.0。用各组分的无菌母液配制。

(b)发酵罐培养基的配制

发酵培养基主要组成成分是一些无机盐，其配方如下：磷酸(80％)26.7ml/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40g/L，加去离子水到1L。

高压灭菌后，每L培养中添加0.1g消泡剂，4.35ml微量元素(PTM1)。

微量元素(PTM1)配方：

五水硫酸铜-6.0g/L

NaI-0.08g/L

MnSO₄·H₂O-3.Og/L

Na₂MoO₄2H₂O 0.2g/L

硼酸-0.02g/L

CoCl₂-0.5g/L

ZnCl₂-20g/L

FeSO₄·7H₂O-65.0g/L

浓硫酸-5.0ml/L

生物素-0.2g/L

加水到1L，0.22um过滤除菌后备用。

(c)接菌培养

工作体积为5L的发酵罐，灭菌2L培养基。接种入100ml培养好的种子培养液，开始发酵。发酵参数设置如下：

搅拌速率：                    200-600rpm

通气量(压缩空气)：            2.0L/分钟

罐压：                        5.0PSI

溶解氧：                      30％

pH值：                        6.0

温度：                        28.0℃

发酵中用NH₄OH和磷酸自动控制pH值；产生过量泡沫时，用Antifoam204(Sigma)0.2ml消泡；溶氧控制为与搅拌速率级联，溶氧低于30％时自动加快搅拌速度，以满足氧的供应。

(d)补料培养

发酵过程中测定OD₆₀₀光密度值，监测酵母菌的生长情况。培养26-28小时后，当OD600值达到180时，可以看到溶氧从刚接菌开始经历了持续下降和维持低水平后突然上升，说明培养基中的甘油已经消耗完毕，开始补充甘油。甘油为50％的灭菌，加入12ml/L PTM1混匀。补加速度为15ml/hr/L发酵液。补料过程为4hr。

(e)诱导培养

甘油补充4hr后，停止补加，可以看到发酵液的溶氧上升，说明酵母生长减慢。再经过约两小时，让发酵液中的甘油消耗完毕后，开始补加甲醇，诱导蛋白表达。补加的甲醇中加入12.5ml/L PTM1液。补加速度为4g/hr/L发酵液。诱导表达96小时，此时OD₆₀₀值为200以上。4℃离心收集收集培养上清，经ELISA检测，融合蛋白的表达量可达到5～10mg/L。

实施例5.基因工程人IL15/Fc融合蛋白的纯化

发酵培养物经高速离心后收集培养上清，培养上清经离子截留分子量为10KDPellicon(Millipore公司)超滤浓缩20倍，并用50mM Tris，150mM NaCl，pH7.5转移缓冲液。经离心去除沉淀后，上样至用50mM Iris，150mM NaCl，pH7.5缓冲液平衡好的Protein A亲和柱，上样完后再用平衡缓冲液液将紫外吸收洗到极限，然后采用50mM柠檬酸缓冲液，PH＝3.4直接洗脱，收集洗脱组分后，用5倍体积的50mM Tris，pH8.0稀释。将该组分上样到经50mM Tris/HCl，pH＝8.0缓冲液平衡的Source15Q层析柱上，采用含100mM NaCl的50mM Tris/HCl，pH＝8.0缓冲液洗脱杂质，然后采用含200mM NaCl的50mM Tris/HCl，pH＝8.0缓冲液洗脱含融合蛋白的组分。经过上述纯化过程，目的蛋白的纯度可以达到95％以上。

实施例6  基因工程人IL15/Fc融合蛋白鉴定和活性测定

用常规方法进行SDS-PAGE电泳测定：纯化后的IL15/Fc融合蛋白进行常规SDS-PAGE电泳，染色后扫描测得IL15/Fc融合蛋白为单一条带。图7是纯化后基因工程人IL15/Fc融合蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定照片。

用CTLL-2增殖的生物学活性测定试验：即采用CTLL-2依赖株、MTT法测定纯化(单位为国际标准单位/毫克)。结果表明，采用实施例5方法纯化的IL-15-Fc终产品比活性为2×10⁷国际标准单位/毫克。图8显示了结果。采用CTLL-2细胞增殖法检测融合蛋白生物学活性结果，从实验结果分析可见，融合蛋白促进CTLL-2增殖的ED₅₀＜0.5ng/ml，其比活性应＞2×10⁷U/mg。经过体内给药初步试验，IL-15-Fc融合蛋白与原来的IL-15相比，促进NK细胞增殖活性明显增强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                              序列表

<110>杭州浙大康泰生物技术有限公司

<120>人白细胞介素15与Fc融合蛋白

<130>047333

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>345

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

1               5                   10                  15

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

            20                  25                  30

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

        35                  40                  45

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

    50                  55                  60

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

65                  70                  75                  80

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

            100                 105                 110

Thr Ser Glu Phe Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

        115                 120                 125

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

    130                 135                 140

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

145                 150                 155                 160

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

                165                 170                 175

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

            180                 185                 190

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

        195                 200                 205

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

    210                 215                 220

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

225                 230                 235                 240

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

                245                 250                 255

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

            260                 265                 270

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

        275                 280                 285

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

    290                 295                 300

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

305                 310                 315                 320

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

                325                 330                 335

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

            340                 345

<210>2

<211>1046

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aactgggtga atgtaataag tgatttgaaa aaaattgaag atcttattca atctatgcat     60

attgatgcta ctttatatac ggaaagtgat gttcacccca gttgcaaagt aacagcaatg    120

aagtgctttc tcttggagtt acaagttatt tcacttgagt ccggagatgc aagtattcat    180

gatacagtag aaaatctgat catcctagca aacaacagtt tgtcttctaa tgggaatgta    240

acagaatctg gatgcaaaga atgtgaggaa ctggaggaaa aaaatattaa agaatttttg    300

cagagttttg tacatattgt ccaaatgttc atcaacactt ctggatccga gtccaaatat    360

ggtcccccat gcccatcatg cccagcacct gagttcctgg ggggaccatc agtcttcctg    420

ttccccccaa aacccaagga cactctcatg atctcccgga cccctgaggt cacgtgcgtg    480

gtggtggacg tgagccagga agaccccgag gtccagttca actggtacgt ggatggcgtg    540

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt tcaacagcac gtaccgtgtg    600

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag    660

gtctccaaca aaggcctccc gtcctccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag    720

ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac caagaaccag    780

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag    840

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc    900

tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga ggggaatgtc    960

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc   1020

ctgtctctgg gtaaataagc ggccgc                                        1046

<210>3

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gagtccaagt acggtccacc atgtccatcc tgtcca                               36

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1               5                   10