快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法

摘要

本发明提供一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，它通过检测甲肝病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体来确定病毒的存在，突破了现有逆转录聚合酶链式反应不能区分感染性甲肝病毒和失活病毒的局限，同时克服了细胞培养法存在的步骤繁杂，耗时较长，常导致疫苗库存期长，缩短疫苗有效期等不足，使培养时间由一个月缩短至八天，大大缩短了检测周期，病毒培养过程中勿需替换维持液，降低了污染的机率，减少了常规方法中细胞后处理步骤如反复冻融、超声，降低工作量，有效提高工作效率，通过对聚合酶链式反应产物的测序提供病毒遗传信息。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对甲肝病毒进行检测的方法，属于医学生物技术领域。

背景技术

甲型肝炎(以下称甲肝)是一种世界范围流行的常见病毒性肠道传染病，每年至少有150万的临床病例出现。目前，我国甲肝流行状况仍然十分严峻，并且出现了新情况。一方面在大部分地区，卫生条件仍然落后，属于甲肝高发地区，群体性甲肝爆发时有报道，全国甲肝发病率在16/10万左右。据卫生部公布资料显示，2004年第一季度，甲肝位居前5位传染病之一。另一方面在经济发达地区，随着卫生条件的改善，人群感染甲肝的年龄，由儿童早期推移至青少年时期以上。未经甲肝感染，体内未形成甲肝抗体的易感人群不断积累。此外，发达地区外来人口的增加和人口流动性的增加，更增加了甲肝的传播范围和速度。总之，我国目前正从甲肝高流行地区向中度流行地区转化，但高、中流行区交错存在的形式将长期存在，其特点是甲肝感染向大年龄推移，易感人群不断累积，甲肝流行的危险性因而增大。使用甲肝疫苗进行主动免疫是控制甲肝流行的最主要手段。现阶段，我国主要使用甲肝减毒活疫苗进行免疫预防。

目前检测甲肝病毒的方法主要有两种：一、细胞培养法，该方法是先将病毒样品用敏感细胞分离培养一段时间后，再用免疫学手段检测甲肝病毒抗原，判断样品中是否含有病毒。细胞培养法的优点是可间接检测样品中感染性病毒，并可对病毒感染性滴度进行定量。但是，甲肝病毒一般不引起宿主细胞病变，生长缓慢，周期长，最佳产毒培养时间需3至4周，病毒产量不高。这一生长特性不能用如检测感染性脊髓灰质炎病毒的蚀斑法或细胞病变实验来检测甲肝病毒，而必须依赖于用标记后的特异性抗体进行免疫学检测，同时使得细胞培养法检测工作量大，周期冗长，常需要一个月时间以上。二、分子生物学方法，常见的分子生物学方法是逆转录聚合酶链式反应法，可直接检测样品中甲肝病毒正链RNA，为甲肝病毒的存在状况提供可靠和直接证据。逆转录聚合酶链式反应法灵敏度高，特异性好，操作时间短，并可通过对聚合酶链式反应产物测序提供病毒遗传信息。但是，逆转录聚合酶链式反应有一个严重缺陷，即不能区分感染性病毒和失活病毒。可以看出，这两类检测方法是通过检测甲肝病毒自身固有结构如抗原蛋白或基因组正链RNA来判断病毒的存在。

病毒感染性滴度检测是甲肝减毒活疫苗质量控制的一个重要指标。目前，主要采用细胞培养法(CCID50)进行甲肝减毒活疫苗的病毒感染性滴度检测(《中国生物制品规程》，2000版)，其过程为取疫苗样品作10倍稀释，取至少3个稀释度分别接种人二倍体细胞，在35℃培养至病毒增殖高峰，收获细胞，经反复冻融，超声后提取病毒抗原，用ELISA方法检测甲肝病毒抗原蛋白，判断病毒感染性滴度。该方法步骤繁杂，耗时较长，时间需4周以上，常导致疫苗在库内存放期延长，实际缩短了疫苗的有效期。

甲肝病毒基因组由单一正链RNA构成。在复制时，甲肝病毒基因组正链RNA首先转录出负链RNA，再以负链为模板合成新生下一代正链RNA。负链RNA在感染后两天内出现，至第8天达到高峰，第10天至14天开始回落。由此可看出，负链RNA的出现是甲肝病毒进行复制的标志，也是感染性甲肝病毒存在的直接证据。

发明内容

为克服现有细胞培养法存在的步骤繁杂，耗时较长，常导致疫苗库存期长，缩短疫苗有效期等不足，以及逆转录聚合酶链式反应法存在的不能区分感染性病毒和失活病毒等不足，本发明提供了一种快速、特异且灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法。

本发明根据甲肝病毒复制的分子机制，采用标签式逆转录聚合酶链式反应，检测甲肝病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体，并以此来判断感染性病毒的存在，通过软件分析与实验验证，确定逆转录聚合酶链式反应的引物及各反应参数，从而快速检测出感染性甲肝病毒的存在，并计算疫苗病毒感染性滴度。

本发明通过下列具体技术方案实现：一种快速、灵敏检测甲肝减毒活疫苗病毒感染性滴度的方法，其特征在于包括下列步骤：

A、病毒培养

将KMB17细胞植入小方瓶中，培养至长成新鲜单层后，将甲肝减毒活疫苗样品作10倍系列稀释，取稀释度为10^-4-10^-9的病毒液接种至该细胞单层上，吸附1～2小时后，补加维持液，于35-37℃培养5-8天；

B、提取细胞内甲肝病毒基因组正链RNA；

C、引物设计

正向引物N1：

5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’

反向引物N2：

5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’

正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’

反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’

正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’；

D、检测甲肝病毒负链RNA中间体

(1)、逆转录反应

在离心管中依次加入下列试剂：

10×逆转录缓冲液              2.5～5.0μl

dNTP混合物(2.5～10mmol/L)     1.25～10μl

正向引物N1(5～60μmol/L)      1.0～5μl

RNase抑制剂(40u/μl)          1.0～2.0μl

逆转录酶(4u/μl)              1.0～2.0μl

甲肝病毒RNA                   15.0～30.0μl

无核酸酶水补充至总反应体积    25～50μl

在37～42℃下反应90～120分钟；将所获逆转录反应产物煮沸45～75分钟；

(2)、第一轮聚合酶链式反应

在离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                 10.0～15.0μl

dNTP混合物(2.5～10mmol/L)     2.0～8.0μl

反向引物N2(5～60μmol/L)      1.0～5.0μl

正向引物M1(5～60μmol/L)      1.0～5.0μl

DNA聚合酶(5u/μl)             0.5～1.0μl

逆转录反应产物                10.0～15.0μl

无核酸酶水          补充至总反应体积100～150μl

在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

(3)、第二轮聚合酶链式反应

在离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                    5.0～7.5μl

dNTP混合物(2.5～10mmol/L)        1.0～4.0μl

引物N3(5～60μmol/L)             0.5～2.5μl

引物M2(5～60μmol/L)             0.5～2.5μl

DNA聚合酶(5u/μl)                0.25～0.5μl

第一轮PCR产物(1～10倍稀释)       1.0～2.0μl

无核酸酶水       补充至总反应体积50～75μl

在94℃预热20～30分钟，之后在94℃变性1～2分钟，在52～55℃退火1～2分钟，在72℃延伸1.5～2分钟，如此循环30～35次后；再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

E、电泳分析和滴度计算

用1.5％浓度琼脂糖凝胶对第二轮聚合酶链式反应(PCR)产物进行电泳分析，出现351bp长度的DNA特异性条带者为阳性结果，用Reed-Muench公式计算出滴度。

所述正向引物N1：

5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’中，非划线部分为甲肝病毒HM-175株基因组序列第2322位核苷酸至第2342位核苷酸，划线部分为标签结构，与甲肝病毒基因组序列既不互补也不相同。

所述反向引物N2：

5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’中非划线部分与甲肝病毒HM-175株基因组序列第2948位核苷酸至第2970位核苷酸互补，划线部分为另一个标签结构。

所述正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’与引物N1中的标签结构序列一致。

所述反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’与引物N2中的标签结构序列一致。

所述正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’为甲肝病毒HM-175株基因组序列第2641位核苷酸至第2662位核苷酸。

在逆转录时，使用引物N1；在第一轮聚合酶链式反应中，使用引物N2与M1，预期产物长度为677bp；在第二轮聚合酶链式反应中，使用引物N2与M3，预期产物长度为351bp。

本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

1、在本发明中，感染性甲肝病毒的存在，是通过链特异性逆转录聚合酶链式反应法，检测甲肝病毒复制时出现的标志物负链RNA中间体来确定的。它突破了现有逆转录聚合酶链式反应不能区分感染性甲肝病毒和失活病毒的局限，同时克服了细胞培养法存在的步骤繁杂，耗时较长，常导致疫苗库存期长，缩短疫苗有效期等不足，直接检测出甲肝病毒的标志物，为感染性甲肝病毒的存在提供可靠的直接证据。

2、在测定甲肝活疫苗的感染性滴度时，与常规细胞培养法《中国生物制品规程》(2000版)相比，细胞培养/链特异性逆转录聚合酶链式反应法有如下优点：a、可将病毒在细胞中培养时间由一个月左右缩短至八天左右，大大缩短了检测周期。b、在病毒培养过程中勿需替换维持液，降低了污染的机率，减少了常规方法中细胞后处理步骤如反复冻融、超声，降低工作量，有效提高工作效率，勿需用免疫学方法检测抗原，避免抗甲肝抗体与二抗的使用。c、可通过对聚合酶链式反应产物的测序提供病毒遗传信息。

表1给出用本发明检测甲肝减毒活疫苗样品Ref的病毒感染性滴度

表1.

  稀释度  本发明检测结果  A  B  C  D  10^-5  10^-6  10^-7  10^-8  +  +  -  -  +  +  +  -  +  +  +  -  +  +  +  -

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

表2给出用常规细胞培养法检测疫苗样品Ref的病毒感染性滴度

具体按《中国生物制品规程》(2000版)进行。将代次为第20代的KMB17细胞以1∶3的比例分种于18个小方瓶(25cm²)中，两天后长成新鲜单层。将甲型肝炎减毒活疫苗样品Ref作10倍系列稀释，取10^-5，10^-6，10^-7和10^-8稀释度接种至KMB17细胞上，每个稀释度接种4瓶细胞(A、B、C和D)，每瓶细胞接种病毒液1.0ml，吸附2小时后补加维持液，于35□培养，每周换液一次。另外两瓶细胞加1mlPBS，设为阴性对照。28天后收获细胞，经反复冻融，超声后提取病毒抗原，用ELISA方法检测甲肝病毒抗原蛋白，结果见表2。用Reed-Muench公式计算滴度为10^7.50CCID₅₀/ml。

表2.

  稀释度  常规细胞培养法检测结果  A  B  C  D  10^-5  10^-6  10^-7  10^-8  +  +  +  -  +  +  +  -  +  +  +  -  +  +  +  -

注：“+”为阳性，“-”为阴性。

由表中可知：用本发明检测甲肝Ref样品，感染性滴度为7.33CCID₅₀/ml。用常规细胞培养法检测甲肝Ref样品，感染性滴度为7.50CCID₅₀/ml。两种方法检测的结果非常接近。

附图说明

图1为用发明检测出的甲肝病毒负链RNA中间体；

图2为用发明检测出的甲肝病毒负链RNA中间体。

图1中，M：DNA Marker DL2000；C；阴性对照；道1至道4：10^-5稀释度的样品A，B，C和D；道5至道8：10^-6稀释度的样品A，B，C和D。

图2中，M：DNA Marker DL2000；C：阴性对照；道1至道4：10^-8稀释度的样品A，B，C和D；道5至道8：10^-7稀释度的样品A，B，C和D。

由图可知：10^-5、10^-6稀释度的样品A，B，C和D全为阳性，10^-7稀释度的样品A为阴性，B，C和D为阳性，10^-8稀释度的样品A，B，C和D全为阴性。

具体实施方式

实施例1

1、病毒培养

将KMB17细胞分种于小方瓶中，培养两天后长成新鲜单层；将甲肝减毒活疫苗样品Ref作10倍系列稀释，取10^-5，10^-6，10^-7和10^-8稀释度接种至KMB17细胞上，每个稀释度接种4瓶细胞，每瓶细胞接种病毒液1.0ml，吸附2小时后补加维持液，于35℃培养。另外两瓶细胞加1ml磷酸盐缓冲液，设为阴性对照。

2、细胞内甲肝病毒RNA的提取

培养8天后，将培养瓶中维持液吸干，每瓶加入2.5mlTRIzol试剂进行裂解，将均匀裂解液分装到2支1.5ml管中，一管立刻用于后续实验，一管保存于-70℃备用，随后按试剂操作手册进行操作，每瓶细胞可获50μlRNA样品。

3、提取细胞内甲肝病毒基因组正链RNA；

4、引物设计

正向引物N1：

5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-GGATGTTTCAGGAGTACAAGC-3’

反向引物N2：

5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-CTCTGATTGTTCTGTGACAGAC-3’

正向引物M1：5’-TTGGGATTAGCGAGTATG-3’

反向引物M2：5’-GACCTGGATAGGCTGTGTGAT-3’

正向引物N3：5’-ATTACAGGAGCAACTGATGTAG-3’；

5、检测甲肝病毒负链RNA中间体

(1)、逆转录反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×逆转录缓冲液          2.5μl

dNTP混合物(5mmol/L)       2μl

正向引物N1(5～60μmol/L)             1μl

RNase抑制剂(40u/μl)                 1μl

逆转录酶(4u/μl)                     2μl

甲肝病毒RNA                          15μl

无核酸酶水   补充至总反应体积        25μl

在37℃下反应90分钟；将所获逆转录反应产物煮沸45分钟；

(2)、第一轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                        10μl

dNTP混合物(10mmol/L)                 2μl

反向引物N2(5～60μmol/L)             1μl

正向引物M1(5～60μmol/L)             1μl

DNA聚合酶(5u/μl)                    0.5μl

逆转录反应产物                       15μl

无核酸酶水   补充至总反应体积        100μl

在94℃预热20分钟，之后在94℃变性1分钟，在52℃退火1分钟，在72℃延伸1.5分钟，如此循环30次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

(3)、第二轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                        5μl

dNTP混合物(10mmol/L)                 1μl

引物N3(5～60μmol/L)                 0.5μl

引物M2(5～60μmol/L)                 0.5μl

DNA聚合酶(5u/μl)                    0.5μl

第一轮PCR产物(1～10倍稀释)           2.0μl

无核酸酶水补充至总反应体积           50μl

在94℃预热20分钟，之后在94℃变性1分钟，在52℃退火1分钟，在72℃延伸1.5分钟，如此循环30次后；再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

E、电泳分析和滴度计算

取8μl第二轮聚合酶链式反应产物进行电泳分析(用1.5％浓度琼脂糖凝胶)，电泳条件为100V，30分钟，于紫外灯下观察并照相，电泳结果见图1与图2。出现351bp长度DNA特异性条带者为阳性结果，统计结果见表1。用Reed-Muench公式计算滴度为10^7.33CCID₅₀/ml。该结果十分接近于用常规细胞培养法测定值10^7.50CCID₅₀/ml。

实施例2

1、2、3及4步骤同实施例1；

5、检测甲肝病毒负链RNA中间体

(1)、逆转录反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×逆转录缓冲液                 5μl

dNTP混合物(3mmol/L)              4μl

正向引物N1(5～60μmol/L)         2μl

RNase抑制剂(40u/l)               2μl

逆转录酶(4u/μl)                 2μl

甲肝病毒RNA                      30μl

无核酸酶水  补充至总反应体积     50μl

在42℃下反应120分钟；将所获逆转录反应产物煮沸75分钟；

(2)、第一轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                    15μl

dNTP混合物(3mmol/L)              4μl

反向引物N2(5～60μmol/L)         2μl

正向引物M1(5～60μmol/L)         2μl

DNA聚合酶(5u/μl)                1μl

逆转录反应产物                   12μl

无核酸酶水  补充至总反应体积     150μl

在94℃预热30分钟，之后在94℃变性2分钟，在55℃退火2分钟，在72℃延伸2分钟，如此循环35次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

(3)、第二轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                    7μl

dNTP混合物(3mmol/L)              2μl

引物N3(5～60μmol/L)             1μl

引物M2(5～60μmol/L)             1μl

DNA聚合酶(5u/μl)                 0.5μl

第一轮PCR产物(1～10倍稀释)        2μl

无核酸酶水  补充至总反应体积      70μl

在94℃预热30分钟，之后在94℃变性2分钟，在55℃退火2分钟，在72℃延伸1.5分钟，如此循环35次后，再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

6、用1.5％浓度琼脂糖凝胶对第二轮聚合酶链式反应(PCR)产物进行电泳分析，出现351bp长度的DNA特异性条带者为阳性结果，用Reed-Muench公式计算出滴度为7.33CCID₅₀/ml。该结果十分接近于用常规细胞培养法测定值10^7.50CCID₅₀/ml。

实施例3

1、2、3及4步骤同实施例1；

5、检测甲肝病毒负链RNA中间体

(1)、逆转录反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×逆转录缓冲液                  3.5μl

dNTP混合物(8mmol/L)               2μl

正向引物N1(5～60μmol/L)          1μl

RNase抑制剂(40u/μl)              1μl

逆转录酶(4u/μl)                  2μl

甲肝病毒RNA                       15μl

无核酸酶水  补充至总反应体积      35μl

在40℃下反应100分钟；将所获逆转录反应产物煮沸55分钟；

(2)、第一轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                     12μl

dNTP混合物(6mmol/L)               4μl

反向引物N2(5～60μmol/L)          3μl

正向引物M1(5～60μmol/L)          3μl

DNA聚合酶(5u/μl)                 0.8μl

逆转录反应产物                    12μl

无核酸酶水  补充至总反应体积      120μl

在94℃预热15分钟，之后在94℃变性1分钟，在54℃退火1分钟，在72℃延伸2分钟，如此循环36次后，再在72℃延伸20分钟，得第一轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

(3)、第二轮聚合酶链式反应

在无核酸酶的0.5ml离心管中依次加入下列试剂：

10×PCR缓冲液                    6μl

dNTP混合物(7mmol/L)              3μl

引物N3(5～60μmol/L)             1.5μl

引物M2(5～60μmol/L)             1.5l

DNA聚合酶(5u/μl)                0.4μl

第一轮PCR产物(1～10倍稀释)       2.0μl

无核酸酶水  补充至总反应体积     60μl

在94℃预热25分钟，之后在94℃变性1分钟，在54℃退火1分钟，在72℃延伸1.5分钟，如此循环37次后；再在72℃延伸20分钟，得第二轮聚合酶链式(PCR)反应产物；

6、用1.5％浓度琼脂糖凝胶对第二轮聚合酶链式反应(PCR)产物进行电泳分析，出现351bp长度的DNA特异性条带者为阳性结果，用Reed-Muench公式计算出滴度为7.50CCID₅₀/ml。该结果与用常规细胞培养法测定值10^7.50CCID₅₀/ml相同。