一种饲料级微生物添加剂及其制备与应用

摘要

本发明提供了一种饲料级微生物添加剂及其制备与应用，所述的微生物添加剂主要包括益生菌部分和营养液部分；所述的益生菌部分含有噬酸乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌；所述的营养液部分含有乙酸、丙酸、丁酸。本发明所述的饲料级微生物添加剂的有益效果主要体现在：(1)雏鸡在孵化后的24小时之内服用本发明所述的饲料级微生物添加剂后可以显著地减少抗生素类药物的使用量，显著地提高日增重，降低料肉比，经济效益明显提高；(2)制备操作简单，成本低。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种饲料级微生物添加剂及其制备方法，以及该添加剂在家禽饲养中的应用。

(二)背景技术

近二十年来，伴随着我国畜牧业生产规模的快速增长，我国已经成为世界畜禽产品生产和贸易大国。其中禽蛋生产跃居世界首位，家禽生产居世界第二位，牛肉生产居世界第三位。具国家农业部统计数字显示，2003年我国家禽总出栏量达到84亿只。但是，和畜牧大国不相称的现实是，我国饲养业整体的技术水平还很底下，细菌感染性疾病还是以抗生素类药物控制为主，其结果极易带来肉类农产品中药物残留量过高、病原菌耐药性增加等一系列问题。

由于现代孵化场经过多次消毒孵化设备异常洁净，目前的孵化过程和母鸡孵化相比，雏鸡难以及时得到过去母鸡能够给予的正常菌群的接种，在孵化出壳的最初几天内，肠内壁不能形成天然的菌群保护层。由此导致了雏鸡极易受到某些病原菌，尤其是沙门氏菌、致病大肠杆菌等的感染，最终必须使用大量抗生素来降低病原菌的感染机会。所以为了提高雏鸡的存活率，我们目前使用的养殖方法是在雏鸡出壳后的初次饮水中添加抗生素。有的生产厂家甚至在使用抗生素水的基础之上在饲料中添加额外分量的抗生素。常用的抗生素品种有青霉素、环丙沙星、蒽诺沙星等。

鉴于目前孵化过程中缺乏天然菌群保护层这一明显不足，专利号为94191480.1和94194949.4的发明专利描述了采用批量发酵或连续培养的方式生产含有29种细菌的微生态制剂。其中包括6种粪肠球菌菌株，2种大肠杆菌菌株，4种乳杆菌菌株，4种丙酸菌菌株，3种双歧杆菌菌株，以及其它肠道菌菌株。上述专利产品使用后对雏鸡沙门氏菌的感染有明显的竞争性排斥作用，可以显著地提高雏鸡的存活率。但上述专利菌种复杂，生产投资成本较高。

专利号为98807794.9的发明专利描述了采用路氏乳杆菌和约氏乳杆菌的组合物饲喂新生雏鸡，然后采用枯草芽孢杆菌饲喂成长期家禽，以达到提高生产性能和减少抗生素用量的目的。由于此专利在家禽的生长过程中需使用两种组合的微生态制剂，操作复杂。

(三)发明内容

本发明既是为了提供一种菌种简单易得，成本低，操作方便的饲料级微生物添加剂。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

一种饲料级微生物添加剂，所述的微生物添加剂主要包括益生菌部分和营养液部分；所述的益生菌部分含有噬酸乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌；所述的营养液部分含有乙酸、丙酸、丁酸；

所述的饲料级微生物添加剂按如下步骤制备得到：

(1)噬酸乳杆菌、粪肠球菌和丁酸梭菌分别培养，以PYG厌氧发酵培养基为种子培养基，在30～40℃下厌氧培养1～30小时；

(2)步骤(1)所得种子液接种至同一发酵罐，采用PYG厌氧发酵培养基，30～40℃下厌氧培养1～30小时；

该步亦可以连续发酵培养的方式培养，即将步骤(1)所得种子液接种至一连续发酵罐中，采用PYG厌氧发酵培养基，以0.2/小时到0.6/小时的稀释度连续向发酵罐中加入培养基，并保持在30～40℃温度条件下厌氧培养；

(3)步骤(2)所得发酵液经分离后，上清液高温灭菌即得所述微生物添加剂的营养液部分；菌泥加入质量为其2～20％的冻干保护剂，混匀后冷冻干燥所得冻干菌体即为所述的微生物添加剂的益生菌部分。

通常的，所述的益生菌部分含有：10⁴～10⁹cfu/g的噬酸乳杆菌，10⁴～10⁹cfu/g的粪肠球菌，10³～10⁹cfu/g的丁酸梭菌；所述的营养液部分含有：15～25mmol/L的乙酸，10～20mmol/L的丙酸，25～30mmol/L的丁酸。例如，所述的益生菌部分含有：2×10⁸cfu/g的噬酸乳杆菌，2×10⁹cfu/g的粪肠球菌，2×10⁷cfu/g的丁酸梭菌。

所述的粪肠球菌是从家禽肠道中分离的厌氧菌，但在好氧条件下能生长。它能够分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，无动力，不游动，无芽孢，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶反应阴性，能够在6.5％NaCl肉汤、40％的胆汁中生长，同时能够在10C、45C温度下生长的球菌。显微镜下观察菌体呈球行，单个或链状不规则排列。生化反应显示该菌能够水解精氨酸和淀粉。

所述的噬酸乳杆菌为家禽肠道中分离出来的厌氧菌，在微氧条件下能生长。它能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸。此菌无动力，不游动，无芽孢，革兰氏染色阳性，过氧化氢酶反应阴性，显微镜下观察菌体呈杆状，较细长。生化反应显示该菌能够发酵水扬苷、纤维二糖、七叶苷、麦芽糖，不能发酵甘露糖、山梨醇。

所述的丁酸梭菌为家禽肠道中分离出来的厌氧菌，只能在厌氧条件下生长。此菌无动力，不游动，末端芽孢，革兰氏染色阳性，显微镜下观察菌体呈杆状。生化反应显示该菌能够发酵淀粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖，产生二氧化碳和丁酸。

所述的营养液部分通过气相色谱仪测定其中乙酸、丙酸和丁酸含量。其中，乙酸含量≥15mM，丙酸含量≥10mM，丁酸含量≥25mM。如果发酵液上述三种挥发性脂肪酸含量小于规定值，可在其中添加化学分析纯度的乙酸、丙酸和丁酸。

所述的PYG厌氧发酵培养基中含有葡萄糖20克/升，酵母膏10克/升，大豆蛋白胨5克/升，蛋白胨水5克/升，半光氨酸0.5克/升，血红素5毫克/升，维生素K10.2毫克/升，土温8010毫升/升，PYG盐溶液40毫升/升。PYG盐溶液的配制方法如下：溶解0.2克CaCl₂和MgSO₄于800毫升纯净水中，全部溶解后再加入1.0克K₂HPO₄，1.0克KH₂PO₄，10.0克NaHO₃，2.0克NaCl和200毫升纯净水，待全部溶解后在4C下保存。

挥发性脂肪酸是肠道中微生物发酵的产物。近二十年来的研究证明，短链脂肪酸在维护肠道内生理生化平衡、提供肠壁内细胞能量方面起到不可忽视的作用。其中，乙酸和丙酸能够降低肠道内pH值，抑制沙门氏菌和致病性大肠杆菌生长，而丁酸能够减少肠道炎症反应，防止癌变，修复肠道上皮细胞。所以，提高肠道挥发性脂肪酸含量，对饲养动物，尤其是幼雏动物抵抗致病菌感染能力有一定的帮助。

制备所述的饲料剂微生物添加剂的方法，所述的方法按如下步骤进行：

(a)噬酸乳杆菌、粪肠球菌和丁酸梭菌分别培养，以PYG厌氧发酵培养基为种子培养基，在30～40℃下厌氧培养1～30小时；

(b)步骤(a)所得种子液接种至同一发酵罐，采用PYG厌氧发酵培养基，30～40℃下厌氧培养1～30小时；

该步亦可以连续发酵培养的方式培养，即将步骤(1)所得种子液接种至一连续发酵罐中，采用PYG厌氧发酵培养基，以0.2/小时到0.6/小时的稀释度连续向发酵罐中加入培养基，并保持在30～40℃温度条件下厌氧培养；

(c)步骤(b)所得发酵液经分离后，上清液高温灭菌即得所述微生物添加剂的营养液部分；菌泥加入质量为其2～20％的冻干保护剂，混匀后冷冻干燥所得冻干菌体即为所述的微生物添加剂的益生菌部分。

具体的，所述的方法按如下步骤进行：

1)噬酸乳杆菌、粪肠球菌和丁酸梭菌分别培养，以PYG厌氧发酵培养基为种子培养基，在37～39℃下厌氧培养18～24小时；

2)步骤(1)所得种子液接种至同一发酵罐，采用PYG厌氧发酵培养基，37～39℃下厌氧培养18～24小时；

3)步骤(2)所得发酵液经离心后，上清液高温灭菌即得所述微生物添加剂的营养液部分；菌泥加入质量为其10％的冻干保护剂，混匀后冷冻干燥所得冻干菌体即为所述的微生物添加剂的益生菌部分。

所述的饲料级微生物添加剂可应用于家禽饲养，尤其适用于雏鸡的饲养。

应用于雏鸡时，可将饲料级微生物添加剂添加至雏鸡孵化后的第一次饮水中，所述添加剂中益生菌各菌株服用量为每羽雏鸡1×10⁵～1×10⁸cfu。具体是先用营养液溶解冻干菌体，然后将溶解物与营养液充分混匀倒入雏鸡的第一次饮水中。

也可将所述的添加剂通过喷雾器在雏鸡孵化后喷雾。具体是先用营养液溶解冻干菌体，然后将溶解物与营养液充分混匀加入喷雾器中。

本发明所述的饲料级微生物添加剂的有益效果主要体现在：(1)雏鸡在孵化后的24小时之内服用本发明所述的饲料级微生物添加剂后可以显著地减少抗生素类药物的使用量，显著地提高日增重，降低料肉比，经济效益明显提高；(2)制备操作简单，成本低。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述：

实例1：饲料级微生物添加剂的制备---批量发酵法

溶解0.2克CaCl₂和MgSO₄于800毫升纯净水中，全部溶解后再加入1.0克K₂HPO₄，1.0克KH₂PO₄，10.0克NaHO₃，2.0克NaCl和200毫升纯净水，待全部溶解后在4C下保存。

分别取配制好的PYG厌氧培养基300毫升在密封的三角瓶中。分别接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌(10％接种量)。接种后，三角瓶上部冲满CO₂气体，然后在37℃下静止培养24小时，作为一级种子。

再按照上述方法分别配制PYG厌氧培养基3升，分别接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌的一级种子。接种后，容器上部冲满CO₂气体，然后在37℃下静止培养24小时，作为二级种子。

0.5吨发酵罐中配制PYG厌氧培养基400升，接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌的二级种子进入同一发酵罐中。接种后，发酵罐上部不断填充CO₂气体，温度控制在39C，搅拌速度200转/分钟，发酵24小时。当OD值达到2.0时，放罐。发酵液进入管式离心机分离后，上清液分装到玻璃瓶中高温灭菌后(121℃，15分钟)做成营养液部分，菌泥加入10％的脱脂奶粉混均后分装。冷冻干燥后制成益生菌部分产品。

此产品益生菌部分含有噬酸乳杆菌2×10⁸cfu/克，粪肠球菌2×10⁹cfu/克，丁酸梭菌2×10⁷cfu/克；营养液部分含有乙酸22mmol/L，丙酸25mmol/L，丁酸28mmol/L。

实例2：饲料级微生物添加剂的制备---连续发酵法

溶解0.2克CaCl₂和MgSO₄于800毫升纯净水中，全部溶解后再加入1.0克K₂HPO₄，1.0克KH₂PO₄，10.0克NaHO₃，2.0克NaCl和200毫升纯净水，待全部溶解后在4C下保存。

分别取配制好的PYG厌氧培养基300毫升在密封的三角瓶中。分别接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌(10％接种量)。接种后，三角瓶上部冲满CO₂气体，然后在37℃下静止培养24小时，作为一级种子。

再按照上述方法分别配制PYG厌氧培养基3升，分别接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌的一级种子。接种后，容器上部冲满CO₂气体，然后在37℃下静止培养24小时，作为二级种子。

50升发酵罐中配制PYG厌氧培养基40升，接种噬酸乳杆菌，粪肠球菌和丁酸梭菌的二级种子进入同一发酵罐中。接种后，发酵罐上部不断填充CO₂气体，温度控制在39℃，搅拌速度200转/分钟，发酵18小时，以0.6/小时的流速流加已消毒灭菌的PYG厌氧培养基，同时收集流出的发酵液。发酵液进入管式离心机分离后，上清液分装到玻璃瓶中高温灭菌(121℃，15分钟)后做成营养液部分，菌泥加入10％的脱脂奶粉混均后分装。冷冻干燥后制成益生菌部分产品。

实例3：对沙门氏菌在雏鸡肠道内定植作用的影响

50羽1日龄“之江黄”随机分为两组，试验组每羽灌服0.3ml实施例1所得微生物添加剂(溶解0.25g益生菌部分到25毫升营养液中，每羽雏鸡再取0.3毫升灌服)，对照组每羽灌服0.3ml灭菌水。24小时后每羽灌服0.3ml沙门氏菌增菌液(含10⁷个Salmonella typhimurium)。分别在10日龄、17日龄，从对照组和试验组随机各取出13、30羽，对肝脏、脾脏划线测定细菌总数，并从盲肠内容物取样作沙门氏菌定性、定量检测。

表一：盲肠内容物样品耐30ppm卡那霉素和5ppm氨苄西林的沙门氏菌定量检测结果

时间周期           对照组           试验组  羽数沙门氏菌阳性率  羽数  沙门氏菌阳性率10天  1346.15％  30  017天  1320％  30  0

结果表明试验组的抗沙门氏菌的能力明显增强。试验组在10日龄时的检出率为零，而对照组为46.15％；试验组在17日龄时的检出率为零，而对照组为46.15％。

实例4：对肉鸡生产性能的影响

800羽从肉鸡分为两组，每组400羽。试验组在初次饮水中添加实施例1所得微生物添加剂(溶解0.25g益生菌部分到25毫升营养液中，再按每羽雏鸡0.5毫升用量加入到初次饮水中)不添加抗生素，对照组饮水添加青霉素(25000IU/只)连喂三日，三日后两组按常规饲养方式进行。试验期间记录耗料、死淘、用药及鸡群健康情况。

表二：各组各时期称重(20％随机抽样称重)

        试验组        对照组只数重量(克/只)  只数重量(克/只)  7天40 128.75  40 123.75  14天  40  310  40  316.25  28天  40  1137.5  40  1118.75  42天  20  1955  20  1912.5

表三：AA肉鸡生产性能

  组别  苗数  天数  死淘  出栏  存活率  料肉比  对照组  400  47  20  380  95％  2.23  试验组  400  47  22  378  94.5％  2.15

此实例可以看出使用本专利发明所述的微生物添加剂后存活率上和使用抗生素相似，料肉比明显降低。42天末重显著提高。

实例4：大规模饲养实验

22000羽AA肉鸡分为两组，试验组8800羽，分别养在两个大棚中。对照组1320羽，分别养在三个大棚中。试验组在初次饮水中添加实施例1所得微生物添加剂(溶解0.25g益生菌部分到25毫升营养液中，再按每羽雏鸡0.5毫升用量加入到初次饮水中)不添加抗生素，对照组饮水添加蒽诺沙星原粉(0.03％)连喂五日。采用地面平养方式。全程记录耗料、死淘、用药及鸡群健康情况。结果见下表：

  羽数  存活率  42天体重  料肉比 平均药费^*  实验组  8976  96.79％  1.85kg  1.86 0.23元  对照组  13464  96.87％  1.84kg  2.01 0.47元

^*平均药费不包含疫苗费.

此实例可以看出使用本发明所述的微生物添加剂后存活率上和使用抗生素极为相似，料肉比明显降低。抗生素用量显著减少，经济效益显著。