稳定的含组织因子通路抑制剂或组织因子通路抑制剂变体的液体组合物

摘要

含有助溶剂，抗氧化剂和缓冲剂的稳定的组织因子通路抑制剂(TFPI)或TFPI变体的水性组合物。助溶剂和抗氧化剂的联合使用显著改善了TFPI或TFPI变体组合物的储存寿命。该助溶剂或抗氧化剂基本上抵消了TFPI或TFPI变体因聚合和氧化而致的降解作用。

说明书

本申请要求2003年1月8日提交的待批临时申请：序列号NO.60/438,519，2003年8月13日提交的，序列号NO.60/494,577，2003年19月8日提交的，序列号NO.60/509,260，2003年10月20日提交的，序列号NO.60/512,090专利的优先权益，这些专利的内容纳入本文作参考。

发明领域

本发明涉及稳定的包含组织因子通路抑制剂蛋白质(TFPI)的组合物。更具体说，本发明涉及包含TFPI或TFPI变体，助溶剂和抗氧化剂的组合物。

发明背景

组织因子通路抑制剂(TFPI)蛋白长276个氨基酸，其作用是作为组织因子介导血液凝结的抑制剂。其氨基酸序列见SEQ.ID NO：1所示。TFPI的氨基末端带负电，羧基末端带正电。TFPI蛋白质含有3个Kunitz-型酶抑制功能域。TFPI含有18个半胱氨酸残基，当其正确折叠时形成9个二硫键。其一级序列含有3个N连接共有糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)。糖基化位点的天冬酰胺残基位于145，195和256位。还知道TFPI是脂蛋白相关促凝抑制剂(LACI)，组织因子抑制剂(TFI)和外源性通路抑制剂(EPI)。

已提出TFPI可用于治疗各种疾病，包括脓毒血症(U.S.6,063,764和WO93/24143)，深静脉血栓(U.S.5,563,123，U.S.5,589,359和WO 96/04378)，局部缺血(U.S.5,885,781，U.S.6,242,414，和WO 96/40224)，再狭窄(U.S.5,824,644和WO 96/01649)，和癌症(U.S.5,902,582和WO 97/09063)。TFPI变体与TFPI的差别是在氨基末端加入了一个丙氨酸残基(“ala-TFPI”)。据Carr等人报道(Circ Shock 1994 NOV；44(3)：126-37)TFPI变体在动物模型对治疗脓毒血症有效。

制备之后，可将TFPI或TFPI变体组合物以液体形式或冷冻状态包装储存。然而TFPI或TFPI变体以液体剂型保存时会形成聚合物。TFPI或TFPI变体分子之间相互作用引起的聚合可导致形成寡聚物。这些寡聚物在储存过程中可保持溶解性或形成大的，可见的聚合物从溶液中沉淀出来。TFPI或TFPI变体在液体组合物的储存过程中形成聚合物对其生物学活性可能起着不良作用，导致其作为抗促凝剂有效治疗包括脓毒血症在内的各种疾病时丧失疗效。此外，聚合物的形成可能导致其它问题，例如当含有TFPI或TFPI变体的组合物采用输液系统给药时会堵塞管道，膜或泵。为最大程度减少这些问题，该领域需要改进TFPI和TFPI变体组合物的稳定性。

发明概述

本发明依据包含助溶剂和抗氧化剂的TFPI或TFPI变体的液体组合物稳定性得到显著改善的认识为基础。所述的抗氧化剂的形式可以是氧取代气体，氧或自由基捕获剂或螯合剂。

本发明提供至少以下具体实施方式。

本发明的一个具体实施方式是一种液体组合物，它包含约0.05-15mg/ml的TFPI或TFPI变体；约50-600mM的选自以下的助溶剂(i)精氨酸或其类似物，(ii)赖氨酸或其类似物，(iii)是(i)和(ii)的混合物；和选自以下的抗氧化剂(i)氧取代气体，(ii)氧或自由基捕获剂，(iii)螯合剂，和(iv)它们的混合物；该液体组合物的(a)聚合稳定性百分率约为45％或更高；(b)氧化稳定性百分率约为45％或更高；(c)pH约4-8之间。

本发明的另一个具体实施方式是一种制造液体TFPI或TFPI变体组合物的方法，包括在含0.05-15mg/ml的TFPI或TFPI变体的液体组合物中加入约50-600mM的选自以下的助溶剂(i)精氨酸或其类似物，(ii)赖氨酸或其类似物，(iii)是(i)和(ii)的混合物；和选自以下的抗氧化剂(i)氧取代气体，(ii)氧或自由基捕获剂，(iii)螯合剂，和(iv)(i)，(ii)和(iii)的混合物；该液体组合物的(a)聚合稳定性百分率约为45％或更高；(b)氧化稳定性百分率约为45％或更高；(c)pH约为4-8。

本发明还有一个具体实施方式是一种药物组合物，其包含所述液体组合物和药学上可接受的赋形剂。所述液体组合物包含约0.05-15mg/ml的TFPI或TFPI变体；和约50-600mM的选自以下的助溶剂(i)精氨酸或其类似物，(ii)赖氨酸或其类似物，(iii)(i)和(ii)的混合物；和选自以下的抗氧化剂(i)氧取代气体，(ii)氧或自由基捕获剂，(iii)螯合剂，和(iv)(i)，(ii)和(iii)的混合物；该液体组合物的(a)聚合稳定性百分率约为45％或更高；(b)氧化稳定性百分率约为45％或更高；(c)pH约4-8。

附图简要说明

图1显示50℃时，对用离子交换高压液相层析(IEX-HPLC)分析得到的4种标准ala-TFPI组合物储存期间的半衰期(t_1/2，按天计)是精氨酸浓度的函数。所有制剂都含有0.15mg/ml的ala-TFPI，并用L-精氨酸碱和柠檬酸缓冲液或L-精氨酸盐酸盐和10mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液调节pH至5.5。该特定ala-TFPI制剂含有：(a)20-150mM的L-精氨酸盐酸盐，10mM的柠檬酸/柠檬酸钠作为缓冲液；(b)20-150mM的L-精氨酸碱，用柠檬酸滴定；(c)100-300mM的L-精氨酸盐酸盐，10mM的柠檬酸/柠檬酸钠作为缓冲液；(d)用柠檬酸滴定的100-300mML-精氨酸碱；

图2显示标准ala-TFPI组合物的稳定性是溶氧浓度的函数，溶氧浓度表示为空气完全饱和的百分数。用反相(RP)HPLC分析储存于30℃的稳定样品中的可溶性ala-TFPI百分数。该标准ala-TFPI组合物含有0.15mg/ml的ala-TFPI，20mM的柠檬酸/柠檬酸钠和300mM的L-精氨酸。pH值5.5。

图3显示标准ala-TFPI组合物储存期间半衰期(t_1/2，按周计)是溶氧浓度的函数，溶氧浓度表示为空气完全饱和的百分数。用反相(RP)HPLC分析储存于30℃的稳定样品中的可溶性ala-TFPI百分数。该标准ala-TFPI组合物含有0.15mg/ml的TFPI，20mM的柠檬酸/柠檬酸钠和300mM的L-精氨酸。pH值5.5。

图4显示含有螯合剂EDTA和DTPA的标准ala-TFPI组合物的稳定性，EDTA和DTPA的加入量是0，1或4mM。用反相(RP)HPLC分析储存于30℃的稳定样品中的可溶性ala-TFPI百分数。该标准ala-TFPI组合物含有0.15mg/ml的ala-TFPI，20mM的柠檬酸/柠檬酸钠和300mM L-精氨酸。pH值5.5。

图5显示含有加入量0，2，5或10mM的氧捕获剂甲硫氨酸的标准ala-TFPI组合物的稳定性。用反相(RP)HPLC分析储存于30℃的稳定样品中的可溶性ala-TFPI百分数。该标准ala-TFPI组合物含有0.15mg/ml的ala-TFPI，20mM的柠檬酸/柠檬酸钠和300mM L-精氨酸。pH值5.5。

图6是ala-TFPI样品的RP-HPLC图谱。峰A-F见实施例1中所述。

图7是Kaplan-Neier存活图。X-轴是存活数；Y-轴是时间(小时)。

发明详述

本发明的液体组合物依据以下发现：在液体TFPI或TFPI变体组合物中加入i)氨基酸助溶剂(例如，精氨酸，赖氨酸或其类似物)和ii)抗氧化剂(其中液体组合物的pH约4-8)。与制备过程中未联合加入这两种添加成份的含TFPI或TFPI变体的组合物相比较，导致含TFPI或TFPI变体组合物的储存期间稳定性得到实质性的提高。该组合物稳定性的这种全面提高是通过助溶剂联合抗氧化剂的作用而得到的，使得组合物不仅在储存过程中能抵抗聚合，而且能抵抗有害的氧化作用，尤其是对TFPI的甲硫氨酸残基的氧化作用。本发明的液体组合物还能抵抗其它有害的作用(例如，未折叠，再折叠和变性)，这些有害作用可导致其丧失生物学活性或其它不需要的特性。

因为助溶剂和抗氧化剂主要影响到TFPI或TFPI变体降解的各自独立机制(分别是聚合和甲硫氨酸氧化)，所以联合使用助溶剂和抗氧化剂，与不联合使用、即使使用两种成份之一得到了更稳定的TFPI或TFPI变体组合物。例如，即使当TFPI或TFPI变体有生物学活性时，TFPI或TFPI变体甲硫氨酸的氧化也是不希望的。

液体组合物的稳定性

对于一种或多种降解作用(例如，聚合和甲硫氨酸氧化)，与制备过程中未联用本文所述的助溶剂和抗氧化剂的组合物相比，本发明含TFPI或TFPI变体的液体组合物在储存过程的稳定性普遍增加。这是因为本发明含TFPI或TFPI变体的组合物的聚合稳定性百分率和氧化稳定性百分率都增加了，所以未聚合、未氧化TFPI或TFPI变体的半衰期也增长了。TFPI或TFPI变体样品的聚合稳定性百分率和氧化稳定性百分率可独立变化。更好的是，本发明中液体组合物的TFPI或TFPI变体是有生物学活性的，这种生物学活性可用下述的凝血酶原时间试验测定。

本发明的液体组合物有至少45％的聚合稳定性。“聚合稳定性百分率”是指一个TFPI或TFPI变体样品在40℃加速稳定性试验中测到的可溶性部分的比值。在40℃加速稳定性试验中，将TFPI或TFPI变体样品于40℃孵育8星期。孵育后，将TFPI或TFPI变体样品用0.2μm过滤器过滤，进行离子交换高效液相层析(IEX-HPLC)试验测定溶液中可溶性TFPI或TFPI变体的量。下面描述45％以下的IEX-HPLC试验。因此，例如具有60％聚合稳定性的TFPI或TFPI变体组合物指该组合物在40℃加速稳定性试验中测试到有60％可溶性TFPI或TFPI变体。具有80％聚合稳定性的TFPI或TFPI变体组合物指该组合物在40℃加速稳定性试验中测试到有80％可溶性TFPI或TFPI变体。本发明TFPI或TFPI变体组合物的聚合稳定性百分率在40℃加速稳定性试验中测定优选大约45、50、60、70、或75％或更高，更优选约80、82、84、85、90、92、94、95、96、97、98、或99％或更高，范围可以从例如约45％或更高到大约99％或更高，从大约45％或更高到大约70％或更高，从大约60％或更高到大约80％或更高，从大约70％或更高到大约90％或更高，从大约80％或更高到大约90％或更高，从大约45％或更高到大约70％或更高。

本发明的液体组合物也具有45％或更高的氧化稳定性。“氧化稳定性百分率”指TFPI或TFPI变体样品在30℃加速稳定性试验中测到的不含被氧化甲硫氨酸部分的比值。在30℃加速稳定性试验中，将TFPI或TFPI变体样品于30℃孵育8星期。孵育后，TFPI或TFPI变体样品用反相高效液相层析(RP-HPLC)试验测定溶液中甲硫氨酸被氧化的TFPI或TFPI变体的量。下面描述RP-HPLC试验。因此，例如具有60％氧化稳定性的TFPI或TFPI变体组合物指该组合物在30℃加速稳定性试验中测到60％的TFPI或TFPI变体不含有氧化的甲硫氨酸。具有80％氧化稳定性的TFPI或TFPI变体组合物指该组合物在30℃加速稳定性试验中测到80％的TFPI或TFPI变体不含有氧化的甲硫氨酸。本发明TFPI或TFPI变体组合物的氧化稳定性百分率在30℃加速稳定性试验中测定优选大约45、50、60、70、或75％或更高，更优选约80、82、84、85、89、90、91、92、94、95、96、97、98、或99％或更高，范围可以从例如约45％或更高到约99％或更高，从大约45％或更高到大约70％或更高，从大约60％或更高到大约80％或更高，从大约70％或更高到大约90％或更高，从大约80％或更高到大约90％或更高。

本发明液体组合物中TFPI或TFPI变体储存半衰期范围一般是从大约1个月到大约36个月(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35或36个月)，这取决于储存温度。考虑到聚合和/或氧化稳定性，在15℃时，本发明含有TFPI或TFPI变体、助溶剂和抗氧化剂的液体组合物储存半衰期一般大于8个星期。这些液体组合物pH值约4-8。例如，在温度大约15℃或30℃时，TFPI或TFPI变体储存半衰期从大约1个月到大约24个月(例如，大约1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、或24个月)。

储存温度

本发明的液体组合物无论以液体储存备用或是冷冻储存在使用前解冻，其储存稳定性都得到提高。储存温度的范围可从大约-70℃到大约25℃(例如，大约-70、-60、-50、-40、-30、-20、-10、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24或25℃)。优选本发明的液体组合物以增加了储存稳定性的液体形式储存，无需重新配制就可方便地给药，并能以预先填充、立即可使用的针筒中的制剂或者如果该制剂与制菌剂相容，可作为多剂量制品提供。液体制剂优选的储存温度是大约2℃-8℃(例如，大约2、3、4、5、6、7或8℃)。

TFPI和TFPI变体

TFPI是一种多肽，其氨基酸序列见SEQ ID NO：1。优选TFPI是由微生物宿主产生的重组人蛋白质。WO 01/24814进一步特征鉴定和描述了TFPI的生物学活性。

TFPI变体包括TFPI的类似物和衍生物，以及TFPI、TFPI类似物和TFPI衍生物的片段。TFPI变体可以通过人或其它哺乳动物来源、合成或重组技术获得。其类似物是TFPI分子中具有一个或多个氨基酸取代、插入、去除和/或添加。优选保守性取代，即一个氨基酸被另一个性质相似的所取代。保守性取代的例子包括但不限于：GlyAla，ValIleLeu，LysArg，AsnGln和PheTrpTyr。它们一般在1到5个氨基酸范围内(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)。添加的氨基酸可以加在该分子的任何位置，尤其是在氨基端或羧基端。例如，N-L-丙氨酰-TFPI，是一种TFPI类似物，在其氨基端添加了一个丙氨酸。添加的氨基酸可以是1、2、5、10、25、100个或更多。融合蛋白质包括在此定义中。

片段指TFPI，TFPI类似物或TFPI衍生物的一部分。片段的例子包括Kunitz结构域1、2或3，Kunitz功能域的1和2或2和3，或N-末端或C-末端缺失，或者二者均缺失。制造变体的实用性指南见U.S.5,106,833。TFPI的片段含有SEQID NO：1所示的至少20个保守氨基酸。例如，片段可长20、25、30、50、100、150、200、250或275个保守性氨基酸。无生物学活性的TFPI片段见U.S.5,106,833中的描述。本发明也采用了这些片段。

衍生物定义为具有添加部分的TFPI，TFPI类似物或TFPI片段。这些添加部分的例子包括糖基化，磷酸化，酰基化或酰胺化。

TFPI变体和SEQ ID NO：1之间的同源性百分数可采用Blast2排列对比程序测定(Blosum62，Expect10，标准遗传密码，open gap 11，extension gap 1，gapx_dropoff 50，低复杂性滤除)。TFPI变体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的相同性一般为70％或更高，优选约80％或更高，更优选约90％到95％(例如，90、91、92、93、94或95％)或更高，最优选98％或99％的相同性。

制备TFPI的氨基酸序列变体可通过改变编码TFPI的DNA序列进行。改变核苷酸序列的方法是本领域广为知晓的。例如，可见Walker和Gaastra编辑(1983)分子生物学技术(MacMillan出版社，New York)，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492，Kunkel等人著(1987)酶学方法(MethodsEnzymol).154：367-382，Sambrook等人著(1989)分子克隆：实验室手册(ColdSpring Harbor，New York)，U.S.4,873,192，和本文引用的参考文献。

TFPI变体宜具有一定量的生物学活性，例如用下述凝血酶原(PT)试验测定的10％、30％、50％、60％、80％、90％或更高的TFPI生物学活性。显然，编码TFPI变体DNA中的任何改变一定不能将其序列放到读码框以外并且最好不要产生能形成二级mRNA结构的互补区域。可利用该领域公知的计算机程序寻找确定哪些氨基酸残基可被取代，插入或缺失不会使TFPI或TFPI变体失去生物学或免疫学活性的技术指南：例如DNASTAR软件，或Dayhoff等人所著(1978)的Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found，Washington，D.C)。也考虑采用稳定的无生物学活性的TFPI变体。

TFPI或TFPI变体可以用重组方法生产，见U.S.4,966,852。例如，可以将所需蛋白质的cDNA掺入到质粒中，在原核生物或真核生物中表达。本领域技术人员知道很多参考文献可提供为用微生物表达蛋白质的细节。见U.S.4,847,201和Maniatas等人所著，1982，分子克隆：实验室手册(ColdSpring Harbor，New York)。

转化微生物和利用转化的微生物表达TFPI或TFPI变体已有各种可用的技术。以下仅是一些可能方法的例子。可将TFPI或TFPI变体的DNA序列以与适当的控制序列相连接。可将TFPI或TFPI变体的DNA序列掺入到pUC13或pBR322这样的质粒中，这些质粒可购自Boehringer-Mannhein等公司。一旦将TFPI或TFPI变体的DNA序列插入到载体中，可将该载体克隆进适当的宿主中。用如U.S.4,683,202和U.S.4,683,195所述的技术扩增该DNA。通过诱导细胞(例如HepG2和SKHep hepatoma细胞)得到cDNA来制造mRNA，然后鉴定并分离该mRNA，逆转录得到cDNA。表达载体转化入宿主细胞(例如，大肠杆菌)之后，培养该细菌表达蛋白质。优选原核微生物，大肠杆菌尤其优选。本发明所用的优选微生物是大肠杆菌K-12，即按照布达佩斯条约的条款，于1984年9月14日保存在美国典型培养物保藏所的菌株MM294。现在该所座落于大学路10801号，Manassas，弗吉尼亚(登录号39607)。

可用细菌或酵母菌生产TFPI或TFPI变体，然后纯化。所使用的流程大致如U.S.5,212,091，U.S.6,063,764和U.S.6,103,500或WO96/40784中所述。可按WO96/40784和Gustafson等人(Prot.Express.Pur.5：233)所述，纯化，溶解和再折叠TFPI或TFPI变体。例如，当按照WO96/40784中的实施例9所述制备ala-TFPI时，所得到的ala-TFPI制剂含有的生物学活性ala-TFPI占总蛋白质重量的85％到90％。

加入本发明液体组合物的TFPI或TFPI变体的量通常大约0.05mg/ml到15mg/ml(例如，0.05、0.15、0.5、1、2.5、5、7.5、10、12.5或15mg/ml)。

氨基酸助溶剂

加入本发明含TFPI或TFPI变体组合物中的氨基酸助溶剂主要作用是保护TFPI或TFPI变体防止聚合，从而提高了其在储存期间的稳定性。聚合物形成的减少与氨基酸助溶剂的加入呈浓度依赖方式。提高氨基酸助溶剂的浓度增加会导致TFPI或TFPI变体组合物稳定性的提高。因为储存期间聚合物的形成相应减少了。

优选的氨基酸助溶剂是精氨酸，赖氨酸或精氨酸、赖氨酸的类似物。精氨酸或赖氨酸可以是以游离碱形式或盐形式存在，例如以盐酸盐的形式。精氨酸或赖氨酸的类似物也可以以游离碱形式或盐形式存在。精氨酸类似物包括氨基胍基精氨酸乙酯，精氨酸异羟肟酸酯和精氨酸p-硝基酰苯胺。赖氨酸类似物包括赖氨酰胺，赖氨酸乙酯，赖氨酸异羟肟酸酯和赖氨酸p-硝基酰苯胺。助溶剂优选以游离碱或盐酸盐形式存在的精氨酸。也优选天然精氨酸或赖氨酸L-立体异构体作为助溶剂，然而本发明的稳定组合物中可加入D-立体异构体或L-和D-立体异构体的混合物。

将精氨酸或赖氨酸助溶剂或它们的类似物加入本发明液体组合物中的量应对储存期间TFPI或TFPI变体起到所需的稳定作用，因此与未加入助溶剂的类似组合物相比，该制剂显示对降解的抵抗作用提高。组合物中助溶剂的总量优选约50-600mM(例如50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600mMO)，更优选约100mM-400mM，最优选约300mM。

测定某特定氨基酸碱加入含TFPI或TFPI变体液体组合物中以降低聚合物形成、提高多肽的稳定性和组合物的储存稳定性的量，不难采用该领域技术人员公知的方法测定，例如见以下实施例6所述。例如，测定液体组合物中精氨酸或赖氨酸助溶剂对TFPI或TFPI变体储存稳定性的作用，可方便地检测该组合物的一种或多种可能性质的变化，例如可溶性多肽浓度随时间的变化来测定。溶液中可溶性多肽的量可用离子排它(IEC)-HPLC定量测定。如果TFPI或TFPI变体降解的主要通路是聚合，加入TFPI或TFPI变体组合物中以获得稳定性提高的助溶剂的有效量，是可以减少此时间内聚合物形成，从而使溶液中保留更多非聚合(例如，单节的)分子形式的可溶性多肽的量。

抗氧化剂

本发明的液体TFPI或TFPI变体组合物也包含抗氧化剂。“抗氧化剂”是一种可减少TFPI或TFPI变体氧化的成分，尤其是对分子中甲硫氨酸残基的氧化。TFPI或TFPI变体分子中甲硫氨酸残基被氧化是TFPI或TFPI变体组合物存储期间主要的降解途径之一。氧化作用与组合物中存在的污染物有关，这些污染物或可直接与甲硫氨酸残基反应或可催化氧化反应。因此，添加某些抗氧化剂来对抗这些污染物的作用可以极大地提高TFPI或TFPI变体组合物的稳定性，即使该组合物中已添加了本发明的助溶剂。优选的抗氧化剂、是药学上可接受的，其浓度约为0.01-50mM(例如，0.01、0.1、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mM)。术语“药学上可接受的”指当给予病人该制剂时没有明显的生物学副作用。术语“病人”包括人和兽类。

三种通用类型的抗氧化剂在本发明TFPI或TFPI变体组合物中是有效的：即氧取代气体、氧或自由基捕获剂和螯合剂。

氧取代气体

液体TFPI或TFPI变体组合物中溶解的氧气最终会导致甲硫氨酸氧化，导致TFPI的疗效丧失或将氧化的氨基酸(例如，甲硫氨酸硫氧化物)掺入到TFPI或TFPI变体多肽中，可能具有未知的或不希望的生理学作用。氧取代气体是能有效地清除或取代溶氧的气体。与周围空气平衡的组合物的溶氧浓度相比，氧取代气体能显著降低溶氧浓度。与不含氧取代气体的TFPI或TFPI变体液体组合物的溶氧浓度相比，优选的氧取代气体可将溶氧浓度降低到约10％以下。这极大地提高了稳定性。

优选的氧取代气体对TFPI或TFPI变体组合物而言基本上是惰性的，即当TFPI组合物暴露在该氧取代气体中不会发生明显的化学反应，从而保留了TFPI的生物学活性。合适的氧取代气体包括氮气、富含氮气的空气、富含氮气的氧气、稀有气体(例如，氦气或氩气)、甲烷、乙烷、丙烷、二氧化碳或这些气体的混合物。“富含氮气的空气”和“富含氮气的氧气”各是氮气和空气或氧气的混合物。它们所含氮气的浓度比大气中的高(例如，大于79体积-％)。氮气是优选的氧取代气体。

所述组合物中氧取代气体可以是任何浓度直至包括其溶解极限。可将TFPI或TFPI变体组合物保存在加压环境中以增加其中溶解的氧取代气体，例比如在一封闭容器内使取代气体在该组合物液面以上。或者，在液面上空维持低于大气压的压力以减少氧取代气体的溶解。

可用任何常规方法将氧取代气体导入TFPI或TFPI变体组合物中。例如，将取代气体吹入含TFPI或TFPI变体组合物的小瓶或其他容器的液面上方空间，将取代气体喷射过或鼓泡吹过TFPI或TFPI变体组合物，将取代气体循环加压/减压，将取代气体再次加压后抽真空等。

在上述的氧取代作用发生后，因为空气被氧取代气体所隔离从而阻止了氧重新溶解于TFPI或TFPI变体组合物中。

氧或自由基捕获剂

本发明中另一类有用的抗氧化剂是氧捕获剂或自由基捕获剂。总体上说，这类捕获剂更易与氧和/或自由基发生反应，而不与TFPI或TFPI变体反应。它们作为“牺牲品”分子而与可利用的氧反应，从而阻止了有害的氧-TFPI或氧-TFPI变体的相互作用，特别是甲硫氨酸残基的氧化。在较好的具体实施方式中，氧或自由基捕获剂的浓度约为0.1-10mM。

合适的氧或自由基捕获剂在本发明的TFPI或TFPI变体组合物中是稳定的。药学上可接受的、优选的氧或自由基捕获剂包括：甲硫氨酸，抗坏血酸或抗坏血酸钠，L-、DL-或D-α生育酚和L-、DL-或D-α乙酸生育酚，β-胡萝卜素，硒，吡硫醇，没食子酸丙酯，丁基化羟基苯甲醚(BHA)和丁基化羟基甲苯。氧或自由基捕获剂的合适形式自然取决于它和TFPI或TFPI变体组合物的相容性。一般来说，像抗坏血酸或α生育酚乙酸盐(例如，α乙酸生育酚)之类亲水性抗氧化剂可能合适地加入本发明的组合物中。

可采用甲硫氨酸任何立体异构体(L-、D-或DL-)或这些异构体的混合物。特别优选的抗氧化剂是甲硫氨酸，尤其是L-甲硫氨酸。一般来说，当甲硫氨酸的加入量以摩尔为基础至少等价于TFPI或TFPI变体中的甲硫氨酸，则可以得到较好的结果。天然TFPI中每个蛋白质分子含有5个甲硫氨酸残基。将作为TFPI或TFPI变体蛋白质一部分的甲硫氨酸称为“TFPI或TFPI变体甲硫氨酸”，以便与作为抗氧化剂加入组合物中的而不是TFPI或TFPI变体蛋白质一部分的甲硫氨酸相区别，。当然，多肽中不是TFPI或TFPI变体甲硫氨酸的甲硫氨酸也可作为本发明的氧捕获剂。例如，一种含有聚甲硫氨酸的多肽可以降低TFPI或TFPI变体甲硫氨酸的氧化速率，这与将游离甲硫氨酸加入该组合物的情况类似。因此，区分上文所定义的“TFPI或TFPI变体甲硫氨酸”和“非TFPI或TFPI变体”的甲硫氨酸很重要，后者包括任何加入该组合物中以游离形式或结合在多肽中而非TFPI或TFPI变体中的甲硫氨酸。

按照非-TFPI或非-TFPI变体甲硫氨酸与TFPI或TFPI变体甲硫氨酸的摩尔比，优选甲硫氨酸的加入量约1∶1-10,000∶1，更优选约1∶1-5,000∶1，更优选约100∶1-1,000∶1，还要优选约300∶1-1,000∶1，再要优选约500∶1-1,000∶1。就甲硫氨酸的绝对浓度而言，它在该组合物中优选的浓度约1-10mM(例如，大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM)。不过甲硫氨酸的浓度可以不同，这取决于本发明组合物中TFPI或TFPI变体的浓度。甲硫氨酸或其它氧捕获剂的重要作用是防止形成TFPI或TFPI变体甲硫氨酸硫氧化物残基，这些硫氧化物残基在生理条件下、即使TFPI或TFPI变体具有生物学活性也会导致不希望的或未知的作用。因此，抗氧化剂的加入量应足以抑制甲硫氨酸残基的氧化。使加入的甲硫氧酸受氧化产生的甲硫氨酸硫氧化物的量是管理当局能接受的。一般来说，这意味着该组合物中以甲硫氨酸硫氧化物形式存在的甲硫氨酸残基不超过约10％-30％。

螯合剂

本发明中所用的另一种抗氧化剂是螯合剂，也称为多价螯合剂，它能有效地结合过渡金属离子(例如，Fe³⁺)。过渡金属离子可存在于该组合物中，并能催化有害的氧化反应，导致蛋白质降解和聚合。所选用的螯合剂应与该组合物中的其它成份很少或不发生化学反应，同时应与维持该组合物所需生理特性基通常相容(例如，pH值和等渗性)。因此，如果该组合物中的过渡金属阳离子不是有意加入用于维持pH值或等重量克分子渗透浓度的话，优选在组合物中使用螯合剂。

优选药学上可接受的螯合剂。优选的、药学上可接受的螯合剂包括各种氨基羧酸盐化合物，它们能与溶液中一个或多个过渡金属离子形成金属配基络合物。这些氨基羧酸盐包括乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙基三胺五乙酸(DTPA)、1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)、乙二醇双(2-氨基乙基)-N，N，N’，N’-四乙酸乙酯(EGTA)和其它含有一个或多个羧酸盐基团的氨基羧酸盐化合物。也可采用这些氨基羧酸盐螯合剂的衍生盐形式(例如，二钠盐形式)，只要具有螯合剂能络合TFPI或TFPI变体组合物中游离过渡金属离子的某些能力。这些螯合剂除盐形式以外的其它形式也是有效的，包括这些化合物的各种酯、酐和卤化形式。

缓冲液

TFPI或TFPI变体组合物的pH值影响蛋白质的溶解性，从而也影响其稳定性。见Chen等(1999)J.Pham.Science 88：881-888。本发明组合物优选的pH范围约4-8(例如，4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8)，更优选约5-6.5。因为pH值是TFPI溶解性的主要因素，所以使用缓冲液来维持合适的pH值可能额外提高这种制剂的稳定性。因而本发明的液体组合物还可包含缓冲剂来维持溶液的pH值。缓冲剂优选基本上没有该缓冲剂盐形式的酸、盐形式的酸或酸和其盐形式的组合物。

宜用碱形式的精氨酸或赖氨酸助溶剂和基本上非盐形式的酸来维持本发明组合物的pH值。相对于用酸和其盐形式作为缓冲液并和氨基酸碱联用，这种组合可以使溶液的重量克分子渗透浓度更低。这种组合的优点在于可以将较高浓度的精氨酸或赖氨酸助溶剂和/或抗氧化剂(例如，甲硫氨酸)加入液体组合物中而不会超过该溶液的等渗度。“基本上非盐形式的酸”指在该液体组合物中用作缓冲剂的其盐形式含量不到2％的酸。

当含有某酸的缓冲剂用于液体组合物中时，该缓冲剂一般用此酸的盐形式或次酸与其共轭碱的盐形式相组合来制备。因此，例如这种缓冲剂可以用酸和其共轭碱的钠盐，钾盐，铵盐，钙盐和/或镁盐来制备。当所选缓冲剂中含有碱形式的精氨酸或赖氨酸助溶剂和一种基本上非盐形式的酸时，该缓冲剂宜选自柠檬酸，琥珀酸，磷酸，谷氨酸，马来酸，苹果酸，乙酸，酒石酸和天冬氨酸。尤其优选柠檬酸和琥珀酸与游离碱形式的精氨酸联用作为缓冲剂。此外，如前所述，也可以用精氨酸的盐形式(例如，精氨酸的盐酸盐形式)。此时，缓冲剂一般包括上述的酸和其共轭碱的盐形式的组合。其它可以使用的缓冲剂包括组氨酸和咪唑。总体来说，优选的缓冲剂浓度约为0-50mM(例如，0，1，2，5，10，15，20，25，30，35，40，45或50mM)，更优选的浓度约为5-30mM。

如果使用的缓冲剂是氨基酸碱和基本上非盐形式的酸，制备的含TFPI或TFPI变体的组合物基本上是等渗的，而不需包括添加的等渗剂(例如，氯化钠)。基本上是等渗的组合物在体内给药之后，只造成极少的水或没有水流过周围细胞的膜。一般来说，为减少给药疼痛和最大程度降低高渗或低渗组合物相关的可能的溶血作用，需要该液体组合物是等渗的。与溶液的重量克分子渗透浓度相对应的等渗条件是约240mOsmol/L-340mOsmol/L(例如，240，250，260，270，280，290，300，310，320，330或340mOsmol/L)，这对本发明也是较适宜的。更优选达到重量克分子渗透浓度约290mOsmol/L的等渗条件。

然而，在有些情况下，用作缓冲剂的酸可是该酸的盐或该酸和其盐的混合物，这取决于TFPI或TFPI变体组合物所需要维持的性质(例如，pH和重量克分子渗透浓度)。在本例中，优选的缓冲剂是酸和其盐的混合物。这些酸可以是柠檬酸，琥珀酸，磷酸，谷氨酸，马来酸，苹果酸，乙酸，酒石酸或天冬氨酸。所选酸的盐形式可以是其共轭碱的钠盐，钾盐，钙盐或镁盐。尤其优选那些共轭碱的盐是钠盐的缓冲剂。这些缓冲剂包括柠檬酸/柠檬酸钠，琥珀酸/琥珀酸钠，磷酸/磷酸钠，谷氨酸/谷氨酸钠，马来酸/马来酸钠，苹果酸/苹果酸钠，乙酸/乙酸钠，酒石酸/酒石酸钠和天冬氨酸/天冬氨酸钠。当用精氨酸甚至其游离碱形式作为助溶剂时，优选的缓冲剂是柠檬酸/柠檬酸钠或琥珀酸/琥珀酸钠。在该情况下，优选的缓冲剂浓度是约5mM-30mM(例如，5，10，15，20，25或30mM)，更优选约20mM。

当联合使用以基本上非盐形式的酸来缓冲氨基酸碱时，该几乎等渗的制剂比用酸和其盐的混合物作为缓冲系统可具有更高浓度的起稳定作用的氨基酸。在这种情况下，与基本上等渗的该组合物相关的高浓度助溶剂，也可以改善TFPI或TFPI变体的稳定性，从而延长来其储存寿命。

例如，用柠檬酸来缓冲加入到含TFPI或TFPI变体组合物中的精氨酸碱，并且pH值为5.5时，精氨酸的浓度可以增加到300mM而仍能维持该组合物的等渗性。这导致TFPI或TFPI变体在50℃的储藏寿命增加了30％。虽然用同样的精氨酸浓度和柠檬酸/柠檬酸钠作缓冲剂时，TFPI或TFPI变体也可以达到相似的储藏寿命，但精氨酸必须以其酸形式加入才能达到类似的pH值，而所得的组合物是高渗的。能够利用高浓度的氨基酸作为主要稳定剂消除了对较传统TFPI或TFPI变体助溶剂(例如，牛血清白蛋白或人血清白蛋白)的需求，这些传统助溶剂因为可能污染病毒，而不够理想。

其它稳定剂

本发明的TFPI或TFPI变体组合物中可以含有可增加TFPI或TFPI变体的作用或提高其质量的其它化合物，只要它们不会对氨基酸助溶剂联合抗氧化剂所达到的基础稳定作用产生不良影响即可。例如，因加工本发明的TFPI或TFPI变体组合物过程中的冻融或机械剪切作用可导致TFPI或TFPI变体多肽降解，在该组合物中加入表面活性剂以降低液-气界面的表面张力可抑制这种降解。合适的表面活性剂是非离子表面活性剂，包括聚氧乙烯山梨醇酯(如聚山梨醇酯80(吐温80)和聚山梨醇酯20(吐温20))；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯(如普卢兰尼克(Pluronic)F68)；聚氧乙烯醇(如Brij35)；二甲基硅油；聚乙二醇(如PEG400)；溶血磷脂酰胆碱和聚氧乙烯-p-t-辛烷基苯酚(如Triton X-100)。表面活性剂或乳化剂的经典药物稳定作用见Levine等(1991)J.Parenterl.Sci.Technol.45(3)：160-165中所述。实施本发明所用的优选表面活性剂是聚山梨醇酯80。

可任选加入其它稳定剂(例如白蛋白)以进一步提高TFPI或TFPI变体组合物的稳定性。加入白蛋白的量其浓度可约为1％w/v或更低。也可将糖或糖醇包含在本发明TFPI或TFPI变体组合物中。任何糖类，如单糖，二糖或多糖或水溶性的聚糖(如果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麦芽糖，乳糖，蔗糖，葡聚糖，支链淀粉，糊精，环糊精，可溶性淀粉，羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-钠)均可使用。蔗糖是最适宜的糖类添加剂。糖醇(即含有羟基的C₄-C₈碳氢化合物)也可用，例如甘露醇，山梨醇，环己六醇，半乳糖醇(galacititol)，卫矛醇，木糖醇或阿拉伯糖醇。甘露醇是最优选的糖醇添加剂。上述糖或糖醇可以单独使用也可以联合使用。其用量没有固定的限制，只要该糖或糖醇在液体制剂中可溶且不会对用本发明方法达到的稳定作用产生不良影响即可。糖或糖醇优选的浓度约为1％w/v-15％w/v，更优选约为2％w/v-10％w/v。

制备稳定的组合物

制备本发明的组合物宜预先将助溶剂，抗氧化剂，任选的缓冲剂和其它先于TFPI或TFPI变体加入的赋形剂相混合。加入适宜量的助溶剂和抗氧化剂来提高TFPI或TFPI变体稳定性后，可调节该组合物pH值到本文所述对于TFPI或TFPI变体最优的范围内。虽然pH值可以在加入TFPI或TFPI变体之后调节，但优选在加入之前调节，这样可以降低变性的危险。然后可用合适的机械装置适当混匀诸组分。

药学组合物

优选本发明的液体组合物可以是向对象给药的形式或可以是用于制备向对象给药的制剂形式。可将含TFPI或TFPI变体的液体组合物配成单剂型也可以配制成可注射或可灌注剂型(例如，溶液，悬浮液或乳剂)。本发明的液体组合物优选以液体制剂保存，其优点是可以提高本发明所达到的和如下所述的储存稳定性。TFPI或TFPI变体的药学组合物优选通过膜过滤除菌，保存在单剂量或多剂量容器内(如密封的小瓶或安瓿瓶)。也可以冷存这些组合物。

其它配制组合物的方法通常是该领域所公知的，只要它们不会对本文所述的助溶剂，抗氧化剂和缓冲液的有益作用造成不良影响，可用于进一步提高液体TFPI或TFPI变体组合物的储存稳定性。有关配制和选择药学上可接受的载体，助溶剂等的讨论见Remirgton’Pharmaceutical Science(1990)(第18版，MackPub.CO.，Eaton，Pennsylvania)。

提供以下实施例是为了说明而非限制。本文中所引用的所有专利，专利申请和参考文献的内容作为参考。

实验

采用以下实施例1-6中的方案来测定具体的助溶剂和/或抗氧化剂对液体TFPI或TFPI变体组合物存储期间的降解和稳定性作用。

反相(RP)HPLC

RP-HPLC在Waters 626 LC系统上进行，该系统装备了717自动进样器(Waters公司，Milford，Maine)，使用Vydac214BTP54 C₄柱和Vydac214GCCP54预柱(Separation Group，Hesparia，California)。柱子先用流动相A(10％乙腈，0.1％TFA)平衡。该RP-HPLC方法把检测到的TFPI或TFPI变体单体作为主峰。可分辨其它含有单个或多个氧化甲硫氨酸残基的蛋白质的峰及代表TFPI或TFPI变体的乙酰化和氨基甲酰化形式的峰。

离子交换HPLC(IEX-HPLC)

如Chen等(同上)所述，离子交换(IEX)-HPLC在Pharmacia Mono-s HR5/5玻璃柱上进行，使用Waters 626 LC系统和717加热/冷却自动进样器。柱子先用80％流动相A(70∶30 v/v，20mM乙酸钠∶乙腈，pH5.4)和20％流动相B(70∶30 v/v，20mM乙酸钠和1M氯化铵∶乙腈，pH5.4)平衡。进样后，TFPI和TFPI变体用流动相B递增到85％洗脱，流速0.7ml/min，21分钟。TFPI和TFPI变体大约在16.5分钟时呈单峰洗下，用Waters吸光度检测仪检测280nm处紫外吸收值。数据的获得和处理用Perkin-Elmer Turbochrom系统进行。蛋白质浓度将该峰的积分面积和已知浓度样品的标准曲线作比较进行估算。

pH值和重量克分子渗透浓度的测定

各种制剂的溶液pH值用Orion pH计(611型，Orion Research IncorporatedLaboratory Products Group，Boston，Massachusetts)检测。PH计的校验按照生产商推荐的双缓冲液校验法进行。两种缓冲液是pH4标准液(FisherScientific，Cat.NO.SB101-500)和pH7标准液(Fisher Scientific，Cat.NO.SB107-500)。

这些制剂的溶液重量克分子渗透浓度用Wescor的蒸气压力渗透压计(5500型，Wescor Inc，Logan，Utah)检测。渗透压计用生产商提供的两种标准品校验，分别是290mmol/kg标准品(Wescor，Reorder No.OA-010)和1,000mmol/kg标准品(Wescor，Reorder No.OA-029)。

其它材料和方法

制剂的缓冲溶液用Chiron Tech Service制备。获得10-cc的I-型管状玻璃小瓶和Daikyo Gummi分层的非硅化塞子用于以下研究。

TFPI和TFPI变体小瓶中的溶氧水平用Nova BioProfile200测定。用KaleidaGraph软件(Stnergy Software，Reading Pennsylvannia)程序估算TFPI氧化的表观一级速率常数。

实施例1

凝血酶原时间试验

合适的凝血酶原时间试验见美国专利5,888,968和WO96/40784。简言之，可用血凝度计(例如，Organon Teknika的Coag-A-Mate MTXII)测定凝血酶原时间。合适的试验缓冲液是100mM的氯化钠，50mM的Tris，pH值调至7.5，含有1mg/ml的牛血清白蛋白。其它所需的试剂是正常人血浆(如Organon Teknika的“Verifyl”)，促凝血酶原激酶试剂(如Organon Teknika的“Simplastin Excel”)，和TFPI标准溶液(如每毫升试验缓冲液含有20μg100％纯度(或与其等量的)的ala-TFPI)。

通过分析TFPI标准溶液的一系列稀释液(如最终浓度1-5μg/ml)的凝固时间获得标准曲线。为测定凝结时间，将样品或TFPI标准品先用试验缓冲液稀释，加入正常人血浆。加入促凝血酶原激酶试剂启动凝结反应。仪器会记录下凝固时间。将凝固时间的对数对TFPI浓度的对数作图获得线性TFPI标准曲线。以TFPI标准品的纯度为基础，将标准曲线校整到相应于100％纯标准品等当量的TFPI浓度。例如，如果标准品是97％生化纯的ala-TFPI制剂(即按照分子量计，含有3％无TFPI生物学活性的物质)，那该标准品的每种稀释液的浓度乘以0.97得到其实际TFPI浓度。那么，按照97％纯制剂的实际浓度，1.0μg/ml的TFPI标准品相当于浓度1.0×0.97或0.97μg/ml，并按照此实际浓度处理。TFPI治疗脓毒血症和其它一系列病症的疗效也是能测定的，包括测定28-天与安慰剂相比各种原因死亡率的降低作用和一些多器官功能失调(MOD)的改善作用。

实施例2

在各种组合物中L-精氨酸浓度对ala-TFPI稳定性的作用

pH值5.5，ala-TFPI终浓度0.15mg/ml的ala-TFPI组合物可用0.6mg/ml储存溶液制备而得。透析交换储存溶液的缓冲液，用UV/可见光光度法分析所得ala-TFPI的浓度，然后用柠檬酸缓冲液将其稀释到起始的目标浓度0.15mg/ml，该缓冲液中可含或不含柠檬酸钠。只有当L-精氨酸助溶剂是L-精氨酸盐酸盐时才这在样品中加入柠檬酸钠，而含有L-精氨酸碱的组合物只用柠檬酸作为缓冲剂。

将这些溶液等分装入3-cc小瓶中(每份1ml)稳定保存。留出足够的小瓶用于启动时间点的浓度测定。将其它小瓶置于50℃孵育箱中用于加速稳定性研究。四份样品的组合物中含有0.15mg/mlala-TFPI，pH5.5，其中的助溶剂和缓冲液浓度列于下面：

1)20-150mM的L-精氨酸盐酸助溶剂和10mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；

2)20-150mM的L-精氨酸碱助溶剂，用柠檬酸滴定到pH5.5；

3)100-300mM的L-精氨酸盐酸助溶剂和10mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；

4)100-300mM的L-精氨酸碱助溶剂，用柠檬酸滴定到pH5.5；

在3，7，14和30天，将每个小瓶中的内含物转移到1.7ml的微离心管中，然后10,000rpm离心约2分钟。离心后，样品中的可溶性蛋白质与聚合/沉淀蛋白质相分开。可溶性蛋白质的含量用IEX-HPLC方法测定(Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88(9)：881-888)。将作为储藏时间函数的浓度数据应用于一级指数衰变模型(Y＝T₀e^-ks)，并使用KaleidaGraphgraphic软件计算残留的可溶性蛋白质在储存期间的半衰期。

将ala-TFPI制剂储存期间半衰期(t_1/2)值作图作为精氨酸浓度的函数(见图1)。数据显示随着L-精氨酸浓度的增加，ala-TFPI的储存半衰期亦得到延长。该组合物中单用L-精氨酸助溶剂，与很少量不用助溶剂的组合物相比，其储存半衰期显著延长。

实施例3

ala-TFPI制剂的降解动力学

ala-TFPI在2-8℃储存时，其主要降解途径之一是甲硫氨酸残基的氧化。用反相-HPLC(RP-HPLC)法可以分辨出被氧化的甲硫氨酸部分，洗脱时早于主峰流出。图6是ala-TFPI样品的RP-HPLC色谱图，显示可分辨氧化的甲硫氨酸。A峰含有多个MetSO，C峰含有一个MetSO，D峰是正缬氨酸(norvaline)取代的ala-TFPI，E峰和F峰是酰基化和/或氨基甲酰化的ala-TFPI。将A峰和C峰分别积分。所有其余的部分，包括主峰，D峰，E峰和F峰组合在一起作为主峰积分。

为了解30℃时的降解动力学，制备2mlala-TFPI样品(如实施例2所述)。每份样品含有0.15mg/mlTFPI，20mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液和300mML-精氨酸。将这些样品注入10-cc玻璃小瓶(每瓶2ml样品)，30℃孵育。先检测因聚合/沉淀所导致的可溶性蛋白质损失，因为此现象会造成HPLC峰总面积减少。30℃储存8周后，IEX-HPLC和RP-HPLC均显示稳定样品的峰总面积下降了2％-5％，表明用以上制剂只有相当少量的ala-TFPI发生聚合/沉淀。甲硫氨酸氧化引起的降解可用RP-HPLC的主峰，A峰和C峰作为30℃储存时间的函数作图进行评价，并把这。伴随着主峰降低，A峰和C峰却增高了。储存8周后，约有11％和9％的氧化甲硫氨酸是单个MetSO和多个MetSO甲硫氨酸。这提示基于目前可采用的检测方法，甲硫氨酸氧化是在标准储存条件下重要的降解途径。表1中的结果揭示MetSO的形成随温度增长的情况。

          表1.温度对ala-TFPI氧化的作用

  温度  RP-HPLC测定的ala-TFPIMetSO峰面积(C峰)(％)  开始物质  4周后  40℃  6.8  23.7  30℃  6.8  10.4  2-8℃  6.8  7.0

实施例4

溶氧对ala-TFPI稳定性的作用

如实施例3所述制备组合物的样品。通过发酵罐装置向小瓶液面上空间吹氮气/空气取代气体混合物来改变溶氧水平。将每个样品的缓冲液调节至pH5.5。为促进液面上空间和液体之间的使取代气体达到平衡，在吹气的同时以200rpm小瓶振摇1小时。然后将小瓶保持在30℃，在指定的时间点取出ala-TFPI样品分析稳定性。每个小瓶中的溶氧水平在各时间点再次测定作稳定性分析。

在最初的先导研究中，将ala-TFPI小瓶制备成含有不同的溶氧水平，例如0％、20％、100％和200％的空气饱和度(假设空气在100％饱和条件下含有21％的氧气)。图2显示30℃稳定性评价的结果。该结果表明，当氧气水平降低到接近0％空气饱和度时，ala-TFPI的氧化基本上被抑制。0％空气饱和度意味着液面上方的大气基本上是纯的氮取代气体。比较而言，溶氧从200％下降到20％的空气饱和度所导致的稳定性增加相对较小。

然后进行了第二项研究，更具体地评价含有溶氧为0％到12％空气饱度的ala-TFPI样品的稳定性能。对稳定性的实质作用见于此范围内。30℃，ala-TFPI的储存半衰期与溶氧水平之间的关系见图3。当样品的溶氧水平降到5％空气饱和度以下(氧气含量约1％)时，ala-TFPI稳定性得到极大的提高。也测定了ala-TFPI浓度分析时间点各单个样品小瓶中的溶氧水平，未观察到小瓶中溶氧水平有明显变化。这些结果表明用氮气这样的取代气体取代足够量的氧气，如果能使溶氧浓度降低到足够低的水平，可极大提高ala-TFPI的储存稳定性。氮气这样的取代气体抑制了ala-TFPI的氧化，因此可认为它们是抗氧化剂。

实施例5

金属螯合剂对ala-TFPI氧化的作用

将10mg/ml的ala-TFPI主液用缓冲液稀释至0.15mg/ml，该缓冲液中含1mm或4mM浓度的金属螯合剂EDTA或DTPA。这些组合物也含有20mM柠檬酸/柠檬酸钠和作为助溶剂的300mML-精氨酸。将稀释后的ala-TFPI溶液注入10-cc玻璃小瓶(每瓶2ml样品)中并储存在2-8℃或30℃作稳定性分析。

用RP-HPLC分析了维持于30℃储存温度时主峰面积的稳定性曲线，见图4。下表2列出了本项研究在2-8℃和30℃条件下得到的储存半衰期数据。金属螯合剂稳定ala-TFPI呈浓度依赖方式，提示ala-TFPI甲硫氨酸残基氧化受溶液中的金属离子的催化。不论其实际作用机理，金属螯合剂能阻止ala-TFPI氧化，故而是有效的抗氧化剂。

实施例6

游离甲硫氨酸对ala-TFPI氧化的作用

将10mg/ml的ala-TFPI主液用含甲硫氨酸的缓冲液稀释至0.15mg/ml。这些组合物也含有20mM柠檬酸/柠檬酸钠和作为助溶剂的300mML-精氨酸。将稀释后的ala-TFPI溶液注入10-cc玻璃小瓶(每瓶2ml样品)中，并储存在2-8℃或30℃作稳定性分析。

用RP-HPLC分析了维持于30℃储存温度时主峰面积的稳定性曲线，见图5。下表2列出了本项研究在2-8℃和30℃条件下得到的储存半衰期数据。这些数据表明组合物中含有2-10mM甲硫氨酸能有效地抑制ala-TFPI甲硫氨酸残基的氧化。实际上，在含有2-10mM甲硫氨酸的情况下，即使在2-8℃储存6个月后，也未检测到ala-TFPI氧化降解。由于使用了抗氧化剂，含L-精氨酸助溶剂的ala-TFPI组合物的稳定性得到再一次提高，此例中抗氧化剂是氧捕获剂甲硫氨酸。不受任何特定理论的束缚，据信游离甲硫氨酸抑制ala-TFPI氧化是通过提供“牺牲品”甲硫氨酸进行的，从而使蛋白质上的甲硫氨酸不大可能受到影响。

多种因素可导致甲硫氨酸氧化，包括金属离子、溶氧和过氧化物。现已鉴定数种抗氧化剂能阻止蛋白质中甲硫氨酸的氧化。例如螯合剂、氧捕获剂、还原剂和取代气体。螯合剂可络合催化氧化反应的金属离子。氧捕获剂能与氧反应而优先氧化，从而除去氧化源保护了蛋白质。还原剂可减弱氧化剂对蛋白质的氧化作用。取代气体能降低容器上方空间的氧分压使溶氧浓度下降。

表2比较了金属螯合剂(如实施例4所测试的)和氧捕获剂甲硫氨酸降低ala-TFPI氧化的效果。与含0.15mg/mlala-TFPI，20mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液和300mML-精氨酸的对照样品(按实施例3配制)相比较，所有抗氧化剂均提高了ala-TFPI的储存半衰期。评价了所有条件，其中在ala-TFPI制剂中加入10mM甲硫氨酸特别有效地保护了ala-TFPI蛋白质的氧化降解。

              表2.抗氧化剂对ala-TFPI稳定性作用的比较

  抗氧化剂 2-8℃储存半衰期(月)  30℃储存半衰期(月)                             金属螯合剂(实施例4)  1mMEDTA 63  25  4mMEDTA 157  28  1mMDTPA 52  11  4mMDTPA 160  23                            氧捕获剂(实施例5)  2mM甲硫氨酸 直到储存了6个月也未检 测到降解  23  5mM甲硫氨酸  24  10mM甲硫氨酸  39                                 对照组合  20mM柠檬酸盐，300mM精  氨酸，pH5.5 36  5.3

实施例7

ala-TFPI蛋白质浓度对ala-TFPI氧化的作用

检测ala-TFPI浓度在0.15mg/ml-10mg/ml时，对ala-TFPI氧化的作用。将10mg/ml主液用20mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(如实施例3)稀释到3，1，0.6，0.3和0.15mg/ml制备稳定性测试样品。这些样品也含有300mML-精氨酸。然后将未稀释的和稀释的主样品注入10-cc玻璃小瓶(每瓶2ml样品)中，塞上塞子储存于2-8℃或30℃作稳定性评价。

用RP-HPLC分析了维持于30℃加速温度条件下和2-8℃实际储存条件下的主峰稳定性曲线，表明ala-TFPI的储存半衰期强烈依赖其蛋白质浓度，呈相反的关系。表3列出了这些稳定性曲线的半衰期值。蛋白质浓度较低氧化速率增加。不受任何特定理论的束缚，我们相信溶液中氧化剂与蛋白质分子比率的增加可能导致氧化速率的增加。

表3.经RP-HPLC检测，以不同浓度储存于30℃或2-8℃的3期TFPI的主峰储存半衰期

  储存  温度                      以不同蛋白质浓度储存T1/2(月)    10    (mg/ml)  3  (mg/ml)  1  (mg/ml)   0.6   (mg/ml)  0.3  (mg/ml)  0.15  (mg/ml)  30℃    22  28  9.3   8.5  6.4  5.6  2-8℃    195  157  98   85  59  44

实施例8

存活研究

为比较新鲜配制的临床级重组ala-TFPI(rTFPI)(TFPI92)与临床级，有部分脱酰胺的和氧化的TFPI(TFPI78)，进行了小鼠盲肠结扎和穿刺研究。该模型通过直接粪便污染和盲肠坏死来诱导多种微生物的腹膜内和全身性感染，接近地模拟了人腹内脓毒血症(Opal等人著，Critical Care Medicine 29，13-18，2001)。

制备两种TFPI制剂的方法见下列专利文件：2003年8月13日提交的，序列号No.60/494,546；2003年10月8日提交的，序列号No.60/509,227和2003年10月20日提交的，序列号No.60/512,199中所述。这些申请文件的内容引入作为参考。rTFPI78，rTFPI92或稀释的对照组在48小时期间(SQ q12小时×4剂量)均以盲法给药。在外科手术之前和之后48小时，采血测定菌血症、内毒素和细胞因子(α-肿瘤坏死因子和白介素-6)的定量水平。每天观察动物，并在发生死亡时进行记录。所有的动物都进行尸体解剖，评估实验结束时器官损伤的组织学证据和进行细菌学定量检测。

Kaplan-Meier存活图见图7。从中可以看到，接受新鲜配制的rTFPI的小鼠与接受部分氧化的，脱酰胺形式的rTFPI的小鼠相比存活优势明显。两rTFPI组均比接受稀释液的对照组小鼠情况更好。如同预料的那样，假手术(外科介入对盲肠进行鉴定而不作结扎和穿刺)的小鼠在研究期间存活了7天。在用rTFPI进行治疗的两组之间，菌血症、内毒素症或细胞因子产生的二级终点无明显差别。

本项研究说明TFPI似乎可赋予存活优势，虽然作用机理不能通过细菌、内毒素或细胞因子的血浆水平来解释。脱酰胺的、氧化的TFPI相对于新鲜配制的TFPI保护作用要差一些。

序列表

<110>希龙公司(CHIRON CORPORATION)

<120>稳定的含组织因子通路抑制剂(TFPI)或组织因子通路抑制剂变体的液体组合物

<130>12441.00055

<150>US 60/438,519

<151>2003-01-08

<150>US 60/474,577

<151>2003-08-13

<150>US 60/509,260

<151>2003-10-08

<150>US 60/512,090

<151>2003-10-20

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>276

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1               5                   10                  15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

            20                  25                  30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

        35                  40                  45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

    50                  55                  60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65                  70                  75                  80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

                85                  90                  95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

            100                 105                 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

        115                 120                 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

    130                 135                 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145                 150                 155                 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

                165                 170                 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

            180                 185                 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

        195                 200                 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

    210                 215                 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225                 230                 235                 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys

                245                 250                 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

            260                 265                 270

Val Lys Asn Met

        275