生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法

摘要

一种用于清洗生物芯片的生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法，将杂交后的生物芯片浸于缓冲液中，并将该缓冲液置于电场中，电场将游离的带负电荷的核酸分子移向电场正极，使非特异键合探针离开芯片进入电泳缓冲液中而被清除。本发明能够有效清除地芯片杂交后非特异键合探针，提高信噪比以及单碱基错配的识别能力，使获取的信息准确可靠。本发明是在微阵列芯片杂交后用电泳代替传统的洗涤过程。电泳过程中，杂交剩余的标记靶序列首先被有效清除。由于参与形成双链结构的靶标物和自由靶标物之间存在动态平衡，在电泳不断移走靶标物的情况下，参与杂交的靶标物会随双链的打开也被电泳移走。

说明书

技术领域

本发明涉及一种清除生物芯片杂交过程中的非特异键合探针的方法，尤其涉及一种生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法。

背景技术

基因芯片是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。所谓基因芯片就是按特定的排列方式固定有大量基因探针(寡核苷酸探针或cDNA探针)的硅片、玻片、塑料片。基因芯片技术是高效地大规模获取相关生物信息的主要手段。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。九十年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，不到十年的功夫，芯片技术得以迅速发展，并呈现发展高峰。目前基因芯片的制备可以分成点样制备和原位合成制备法。在基因芯片的使用方面，不管是通过固定的DNA核酸探针与标记的核酸之间的杂交来检测目标核酸分子，还是先通过与固定的DNA核酸探针与核酸之间杂交，最后利用形成的双链DNA来检测蛋白质分子。最重要的是在固定的DNA核酸探针与核酸之间杂交后，核酸间杂交形成的完全正配的双螺旋结构能够给出最大的杂交信号，而核酸间杂交形成的错配的双螺旋结构和杂交剩余的标记靶序列希望能够完全清除，给出最小的杂交信号，这样方便有用信息的准确获取。目前，非特异键合探针的清除通常采用两种手段来实现：对于与固定探针杂交构成碱基错配的标记靶序列，则采用优化杂交温度，使其具有最少形成双链结构的形式；对于杂交剩余的标记靶序列，采用缓冲液洗涤芯片的方法。很明显，基因芯片的杂交检测只能采用一个杂交温度，由于芯片上具有成千上万个固定的核酸探针分子，因此通过优化满足所有探针的杂交温度是很困难的，有时甚至是不可能的，这样，与碱基错配序列杂交的标记靶序列探针就很可能给出较强的杂交信号，区分单碱基错配序列变得困难，尤其对于杂交信号强度均匀性不太好的情况更是如此。而采用缓冲液洗涤芯片的方法对于玻璃、石英等硬质载体而言，由于载体吸附能力差，洗涤可以有效地清除杂交剩余的标记靶序列。但是对于凝胶等多孔载体，由于其多孔结构强烈吸附标记的靶序列而使检测的背景噪音很高，导致分析结果的错误。上诉情况表明，采用目前的洗涤方法不能够有效地清除非特异键合的靶序列，导致芯片检测的数据不可靠。

发明内容

本发明提供一种能够提高检测信号的识别能力且适用性广的生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法。

本发明采用如下技术方案：

一种用于清洗生物芯片的生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法，将杂交后的生物芯片浸于缓冲液中，并将该缓冲液置于电场中，电场将游离的带负电荷的核酸分子移向电场正极，使非特异键合探针离开芯片进入电泳缓冲液中而被清除。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明能够有效清除地芯片杂交后非特异键合探针，提高信噪比以及单碱基错配的识别能力，使获取的信息准确可靠。

本发明是在微阵列芯片杂交后用电泳代替传统的洗涤过程。电泳过程中，杂交剩余的标记靶序列首先被有效清除。由于参与形成双链结构的靶标物和自由靶标物之间存在动态平衡，在电泳不断移走靶标物的情况下，参与杂交的靶标物会随双链的打开也被电泳移走。由于完全正配的双链结构比错配的双链结构稳定，这样通过电泳，只有完全匹配序列才具有明显的杂交信号，而错配序列的杂交荧光信号则与背景相同且无关于错配碱基数目的多少。通过电泳可以区分完全匹配的序列和单碱基错配的序列。处理过程中，采用电泳代替传统的洗涤方法来清除基因芯片杂交后的非特异键合探针更有效。因为核酸分子带有负电荷，电泳过程中，没有参与杂交的标记探针被首先清除，随着电泳的继续进行，标记探针与固定核酸分子杂交形成的双链结构由于游离的标记探针在电泳下被移走，并衡被打破，使得杂交形成的双链结构开始解链，由于完全正配得双链结构比含有错配碱基的双链结构稳定，只有完全匹配序列才具有明显的杂交信号，而错配序列的杂交荧光信号则与背景相同且无关错配碱基数目的多少。通过电泳可以更有效区分完全匹配的序列和单碱基错配的序列，可用于单碱基突变识别和SNP分型。由于该方法与目前广泛使用的DNA芯片兼容，可以更准确和可靠地获得检测核酸、蛋白质等生物分子信息。

由于芯片上排列方式固定有大量基因探针，这些探针与靶序列杂交很多情况下无法保持相同的Tm值，因此选择一个“优化杂交温度”并不适合芯片上所有的基因探针的杂交温度，因而“优化杂交温度”的方式和杂交后缓冲液洗涤的传统方法并不能有效的区别完

全正配序列和单碱基错配序列，尤其是杂交信号不均匀的情况下，这种区分难度更大。而采用电泳后处理的方法，不管基因探针的杂交温度是否一致，采用常温杂交将所有可能杂交的模式完成杂交，然后再通过控制电泳条件则可以很好地将完全正配序列和单碱基错配序列实现有效的区分。

附图说明

图1是一种寡聚核苷酸微阵列的杂交荧光图象。

图2是一种寡聚核苷酸微阵列芯片的杂交荧光图象。

图3是一种cDNA微阵列芯片的杂交荧光图象。

具体实施方式

一种用于清洗生物芯片的生物芯片杂交中的非特异键合探针的电泳清除方法，将杂交后的生物芯片浸于缓冲液中，并将该缓冲液置于电场中，电场将游离的带负电荷的核酸分子移向电场正极，使非特异键合探针离开芯片进入电泳缓冲液中而被清除，在本实施例中，电场电压为1-600V，电流强度为1-100mA，例如：电场电压为520V、260V或90V，电流强度为15mA、50mA或90mA，最佳电场电压为50-100V，电流强度为10-20mA，上述电场方向与芯片方向平行或垂直，探针为荧光标记的探针、化学发光标记的探针、酶标记的探针或者胶体金标记的探针中的一种。

(参照附图1)一种寡聚核苷酸微阵列的杂通过电泳方法有效清除没有参与杂交的标记靶序列提高信噪比。将丙烯酰胺修饰核酸通过和丙烯酰胺单体聚合形方法将核酸固定在玻璃片上制备的一种含寡聚核苷酸探针和聚丙烯酰胺凝胶(不含核酸的空白样品)的微阵列。图1是杂交后处理采用传统洗涤和电泳方法的比较结果。图中第3、4行是没有寡核酸的3％聚丙烯酰胺凝胶，1、2行是含有1uM寡核苷酸的3％聚丙烯酰胺凝胶。图1A是与互补荧光标记序列杂交后采用通常的洗涤方法得到的荧光扫描图像。从采用强烈洗涤方式得到扫描图可以看出这种方法不能有效的清除导致高的背景。第3、4行的平均荧光强度为48431和47105。第1、2行的平均荧光强度为55110和54349，这个强度几乎等于背景(聚丙烯酰胺凝胶)的强度，其荧光强度的比值仅为1.14。这么强烈的荧光背景是不能被接受的，空白样品不含有寡核酸自然不会与靶标物杂交因此不应具有荧光信号，造成这么强的荧光信号归结为聚丙烯酰胺凝胶的强烈吸附作用。因此杂交后处理采用传统的洗涤方式是不能有效地清除非特异键合的靶标记物的。图1B是杂交后处理采用电泳方式得到的扫描图。通过电泳非特异键合的靶标物被有效的清除，空白样品的相对荧光强度也仅为981，而寡核酸的相对荧光强度则为24772，虽然寡核酸的相对荧光强度也降低了，但与空白样品的比值则从1.14升至了25.3。通过电泳可以大大增加信(号)这样便可以很清楚的一结果表明电泳能够有噪(音)比，清除地知道样品和空白。

(参照附图2)一种寡聚核苷酸微阵列芯片杂交后采用电泳处理方法对寡聚核酸完全正配和碱基错配的区分。具体如下：将四种不同序列的寡聚核苷酸和不含核酸的空白样品(例如，分别与Cy3颜料标记序列Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′完全正配，中央位置错配1，2，3个碱基的序列5′-TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3′(P0)；5′-TCA ACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3′(P1)；5′-TCA ACA CAG CACGAT CAC TCA CAG CA-3′(P2)；5′-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3′(P3)制备成核酸阵列(下表带下划线的字母表示错配碱基。分别表示P0，P1，P2，P3序列和不含核酸的空白样品P的各10个寡核酸阵点构成寡核酸微阵列)。DNA微阵列芯片在常温下与10uM的Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′序列杂交2小时，杂交完成后芯片置于常温(24℃)或者50℃的1×TBE缓冲液中5V/cm条件下电泳30分钟。用扫描仪扫描分别得到两种电泳温度下的杂交荧光图象(图2A和图2B)。在图1B中电泳不仅将没有参与杂交的标记探针清除掉了，而且与含有错配碱基探针杂交的标记探针也被完全除掉，因此只有完全匹配序列(P0)具有明显的杂交信号，而错配序列的杂交荧光信号则与背景相同；而在图1A中电泳仅仅将没有参与杂交的标记探针清除掉了，而且与含有错配碱基探针杂交的标记探针没有被完全除掉，因此只有完全匹配序列(P0)和错配序列均具有相应的杂交信号，其错配1，2，3个碱基的荧光强度分别为完全正配的51.9％，2.48％和0.899％。很明显信号强度随着碱基错配数目的增加而下降很快，虽然该条件下也能区分正配和单碱基错配序列，但显然没有图2B中电泳条件下区分容易，尤其对于探针阵点信号强度序列均匀性不好情况下，图1B的电泳条件更更容易区分正配和单碱基错配序列。

(参照附图3)一种cDNA微阵列芯片其杂交后采用电泳处理方法对氧化的低密度脂蛋白受体基因(Ox-LDL receptor 1 gene)14417位点的单核苷酸多态性(SNPs)分析。三个已知14417位点多态性冠心病病人的新鲜血样本经PCR后，由PCR产物固定得到相应的cDNA微阵列。cDNA微阵列芯片在常温下与10uM的标记序列5′-Cy3-GGA AAA CAGCCA A-3′，5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3′序列杂交2小时，杂交完成后芯片置于常温(24)1×TBE缓冲液中5V/cm条件下电泳8分钟。扫描得到杂交荧光图象(图3)。通过杂交图像三个样本的基因型很容易被确定。纯合子14417C/C给出强的CY3荧光信号(图3A中4，5行，绿色荧光)。纯合子14417G/G给出强的Cy5荧光信号(图2B中7，8行，红色荧光)。杂合型14417C/G即给出Cy3的荧光信号又同时给出Cy5的荧光信号(图3A和图3B中1，2行)，两种染料叠加后，给出强的黄色荧光信号(图3C中1，2行)。这个分型结果与传统测序列的结果相一致(图3D)。