一种具有免疫抑制作用的碳－21甾体苷

摘要

本发明涉及从中草药黑鳗藤(Stephanotismucronata)中提取分离得到的具有化学结构通式(I)、免疫抑制活性和抗类风湿性关节炎作用的一种新的C21甾体苷——SMA，其中式中R1表示CH3CO，R2表示,R3表示β－D－葡萄吡喃糖基－(1→4)－6－去氧－3－氧甲基－β－D－阿洛吡喃糖基－(1→4)－β－D－磁麻吡喃糖基－(1→4)－β－D－磁麻吡喃糖苷[β－D－glucopyranosyl－(1→4)－6－deoxy－3－O－methyl－β－D－allopyranosyl－(1→4)－β－D－cymaropyranosyl－(1→4)－β－D－cymaropyranoside]。本发明还涉及该化合物的制备方法，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物和药用组合物在免疫抑制和抗类风湿性关节炎方面的用途。

说明书

                            技术领域

本发明涉及从中草药黑鳗藤(Stephanotis mucronata)中提取分离得到的具有免疫抑制活性和抗类风湿性关节炎作用的一种新的C₂₁甾体苷——SMA及其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在免疫抑制和抗类风湿性关节炎方面的应用。

                            背景技术

随着基础和临床免疫学的发展，许多原因不明的疾病可以通过自身免疫反应来解释。自身免疫反应不仅能导致自身免疫疾病的产生，而且其本身存在恶性循环，可使疾病迁延不愈，预后不良。红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的形成是一个非常复杂的过程，人们主要应用免疫耐受的原理采用免疫抑制剂进行治疗，并在改善症状方面取得了一定的效果。另一方面，随着外科手术技术的改进和治疗水平的提高，器官移植的日渐普及，免疫抑制剂在器官移植排斥反应的预防和治疗中起着极其重要的作用。

黑鳗藤为萝藦科植物黑鳗藤Stephanotis mucronata的干燥根和藤茎，广泛分布于我国南部地区，资源十分丰富。具有强筋骨、祛风湿的功效，民间用于类风湿性关节炎。

                            发明内容

本发明的目的是提供一种具有免疫抑制活性和抗类风湿性关节炎作用的新的C₂₁甾体苷——SMA，提供从民间草药黑鳗藤中提取分离制备C₂₁甾体苷——SMA的方法，提供免疫抑制和抗类风湿性关节炎的药物组合物及其该化合物在制备免疫抑制剂和抗类风湿性关节炎药物方面的用途。

本发明的C₂₁甾体苷包括从中草药黑鳗藤中提取分离得到的SMA，该化合物具有下式的化学结构式(I)，式中R₁表示CH₃CO，R₂表示R₃表示β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-氧-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷[β-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]。

本发明提供的SMA，其化学系统名为12-氧-乙酰基-20-氧-(N-甲基)邻氨基苯甲酰基肉珊瑚苷元3-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-氧-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷[12-O-acetyl-20-O-(N-methyl)anthraniloyl sarcostin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropy-ranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside]，是从萝藦科植物黑鳗藤Stephanotis mucronatum的干燥根和藤茎中提取的，制备方法包括以下步骤：

a.将黑鳗藤(Stephanotis mucronata)的根或藤茎粉碎后，以乙醇提取；

b.乙醇提取液浓缩后用有机溶剂提取或黑鳗藤根或藤茎粗粉直接以有机溶剂提取，浓缩，得到总甾体皂苷；

c.总甾体皂苷在硅胶或氧化铝柱中进行色谱分离，以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷或它们的混合物为洗脱剂；

d.硅胶薄层色谱检查洗脱液，具有相同斑点的洗脱液合并浓缩，得到含SMA的流份；

e.含SMA的流份再经硅胶(包括Rp-18、Rp-8)或HPLC层析，以洗脱剂洗脱、分离，得到C₂₁甾体苷——SMA。

上述步骤b中所说的有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯，步骤e中所说的洗脱剂为甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水的混合物。

本发明的化合物动物实验结果显示出显著免疫抑制活性和抗类风湿性关节炎作用。本化合物对细胞免疫的抑制活性与当今临床广泛使用的免疫抑制剂——环孢菌素A相当，其体液免疫抑制作用优于环孢菌素A。本化合物对大鼠佐剂性关节炎的防治作用与雷公藤多苷(Tripterysium glucosides，TG)无显著性差异。所以，本发明的化合物有望开发成为一种新的免疫抑制药物。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的C₂₁甾体苷——SMA为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物和药物组合物可用于制备免疫抑制剂和制备治疗抗类风湿性关节炎的药物。

上文所述药学上可接受的载体是指药学领域的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂、甜味剂等。

本发明化合物可以组合物的形式通过口服、直肠、肠胃外或经皮给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊籍、丸剂、缓释微丸、固体分散体、包含物等，制成的液体制剂如混悬剂、乳剂、溶胶剂、糖浆剂、合剂、溶液剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性混悬剂、乳剂、脂质体、微囊、微球、毫微粒、外用的软膏剂等。优先的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、微丸、软膏剂和注射剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有活性成分占总重量比为0.1％～99.5％。最优选含有活性成分占总重量比为0.5％～95％。

本发明化合物的使用量可根据用药途径、患者年龄、体重、所治疗的器官移植种类、类风湿性关节炎严重程度等变化，其日剂量可以是0.01～100mg/Kg体重，优选0.1～10mg/Kg体重。可以一次或多次使用，并且毒性和副作用小。

                            附图说明

图1：SMA的¹³C NMR谱图

图2：SMA的DEPT谱图

图3：SMA的¹H NMR谱图

图4：SMA的HMBC谱图

图5：SMA的HMQC谱图

图6：SMA的¹H-¹H COSY谱图

图7：SMA对ConA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

图8：SMA对OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应的影响

图9：SMA对OVA受免小鼠血清中特异性IgG抗体水平的影响

                          具体实施方式

以下通过实例进一步说明本发明。

实施例1：C₂₁甾体苷SMA制备

黑鳗藤干燥根或藤茎20kg粉碎后，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物。乙醇提取物用氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯回流提取，或黑鳗藤根或藤茎粗粉直接以氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯回流提取，氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯萃取液或提取物，浓缩，得到总甾体皂苷。总甾体皂苷进行硅胶或氧化铝柱层析，先以氯仿、乙酸乙酯或二氯甲烷和甲醇(或乙醇)进行梯度洗脱，用薄层色谱检查洗脱液，含有SMA斑点的流份合并，浓缩，浸膏进一步经Rp-18柱层析或HPLC，以甲醇和水或乙腈和水或丙酮和水洗脱分离、纯化，得到C₂₁甾体苷——SMA。

C₂₁甾体苷SMA白色无定型粉末，Lieberman-Buchard反应阳性。高分辨质谱确定其分子式为C₅₈H₈₉NO₂₃(1168.5867[M+H]⁺，Calcd 1168.5898)。¹³C NMR(图1)和DEPT谱(图2)(125MHz，C₅D₅N)显示SMA含有58个碳原子，其中11个CH₃，10个CH₂，27个CH和10个季碳。由¹H NMR(图3)和¹³C NMR数据(表1)可知：SMA的苷元部分光谱数据与已知化合物prosapogenin基本一致[K.Yoshikawa，N.Okada，Y.Kann，S.Arihara，Chem.Pharm.Bull.1996，44，1790]。比较化合物SMA苷元和prosapogenin的¹³CNMR数据，可以观察到下列苷化位移：C2(-1.9ppm)，C4(-2.6ppm)和C3(+5.9ppm)，说明糖链部分连接在苷元prosapogenin的C-3位羟基上。¹³C NMR数据显示化合物SMA的甾体母核上有两个酰基取代基，即N-甲基邻氨基苯甲酰基(N-methylanthraniloyl)(δ：111.1，152.7，111.6，135.2，114.8，132.7，168.3，29.6)和乙酰基(acetyl)(δ：171.4和22.1)。在HMBC图谱(图4)中，N-methylanthraniloyl的碳信号δ168.3与母核C-20(δ74.9)次甲基氢的信号δ5.21(q，J＝7.0Hz)相关，说明N-methylanthraniloyl连接在C-20羟基上；乙酰基的碳信号δ171.4与母核C-12(δ74.2)次甲基氢的信号δ5.19(dd，J＝11.5，4.5Hz)相关，说明乙酰基连接在C-12羟基上，从而进一步确定其苷元为prosapogenin，即12-O-乙酰基-20-O-(N-甲基)-邻氨基苯甲酰基肉珊瑚苷元。化合物SMA的¹H NMR谱中，显示去氧糖的3个甲基，3个甲氧基信号和4个端基质子的信号：δ5.29(1H，d，J＝9.5Hz)，5.13(1H，d，J＝9.5Hz)，5.17(1H，d，J＝7.5Hz)和4.73(1H，d，J＝8.0Hz)，表明分子中含有4个糖，且均以β-键连接。故化合物SMA为12-O-乙酰基-20-O-(N-甲基)-邻氨基苯甲酰基肉珊瑚苷元3-O-四糖苷。

SMA在酸性条件下水解，得到苷元，磁麻糖，葡萄糖(在TLC上与标准磁麻糖、标准葡萄糖对照)和一个未知糖(在TLC上显示)。该苷元的¹³C NMR数据与文献报道的Prosapogenin数据一致[K.Yoshikawa，N.Okada，Y.Kann，S.Arihara，Chem.Pharm.BulL.1996，44，1790]。在HMBC，HMQC(图5)和¹H，¹H COSY(图6)图谱中，从端基碳δ104.9及其质子δ5.17(d，J＝7.5Hz)出发可以找出未知糖的其余质子和碳原子的化学位移值(见表1)，并与文献数据对照[K.Yoshikawa，N.Okada，Y.Kann，S.Arihara，Chem.Pharm.Bull.1996，44，1790.]，结果表明该未知糖为6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛糖(6-deoxy-3-O-methyl-β-D-allose，简称为AllMe)。通过比较文献中化合物数据显示：在吡啶溶液中，AllMe的端基质子信号出现在δ＞5.00的低场，而β-D-黄花甲竹桃糖(β-D-thevetose，简称为Thv)的端基质子信号出现在δ＜5.00的高场[K.Yoshikawa，N.Okada，Y.Kann，S.Arihara，Chem.Pharm.Bull.1996，44，1790.K.Yoshikawa，K.Matsuchika，S.Arihara，H.C.Chang，J.D.Wang，Chem.Pharm.Bull.1998，46，1239.]，进一步确定δ5.17为AllMe的端基质子信号。在化合物SMA的¹H NMR中，δ5.29和5.13应分别归属于两个磁麻塘的端基质子信号，且从耦合常数判断为β构型。在其¹³C NMR中，δ37.3和37.1分别归属于两个磁麻糖的C-2信号，进一步确定它们均为β-D构型[R.Vleggaar，F.R.van Heerden，L.A.P.Anderson，G.L.Erasmus，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.11993，483.]。在HMBC图谱中可见明显的相关峰：Sa-H1(δ5.29，d，J＝9.5Hz)与苷元的C-3(δ77.7)；Sb-Hl(δ5.13，d，J＝9.5Hz)与Sa-C4(δ83.2)；Sc-H1(δ5.13，d，J＝9.5Hz，1H)与Sb-C4(δ83.1)；Sd-H1(δ5.17，d，J＝7.5Hz，1H)与Sc-C4(δ83.1)，Sd-H1(δ4.73，d，J＝8.0Hz，1H)与Sc-C4(δ83.5)，表明糖链部分的连接顺序为(β-D-葡萄糖)-(6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛糖)-(β-D-磁麻糖)-(β-D-磁麻糖)-(prosapogenin的C-3位)，而且均为1→4连接。

综上所述，化合物SMA的结构推断为12-O-乙酰基-20-O-(N-甲基)邻氨基苯甲酰基肉珊瑚苷元3-O-β-D-葡萄吡喃糖基-(1→4)-6-去氧-3-O-甲基-β-D-阿洛吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖基-(1→4)-β-D-磁麻吡喃糖苷。

C₂₁甾体苷SMA的实验数据白色无定形粉末。HR-EI-MS：1168.5867(C₅₈H₈₉NO₂₃，Cal.1168.5898[M+1]⁺)。EI-MS m/z：1190.6[M+Na]⁺，1005.2[M-glc]⁺。¹³C NMR、¹H NMR和HMBC数据见表1。

取C₂₁甾体苷SMA 50mg溶于10mL的9％盐酸甲醇中，加热回流2h，放冷，加入Ag₂CO₃粉末中和至pH7，过滤，除去沉淀，滤液减压浓缩至干，然后用柱层析(硅胶10g，CHCl₃∶MeOH＝100∶1→50∶1V/V)分离，得到苷元(21mg)和糖的混合物。TLC中：水解产物显示与Cymarose，glucose标准品Rf值一致的斑点。苷元的¹³C NMR数据见表1。

实施例2

片剂：活性成分         1.0g

      乳糖             18.7g

      玉米淀粉         5.0g

      硬脂酸镁         0.3g

制备方法：将活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，活性成分含量10mg。

表1 C₂₁甾体苷SMA的¹³CNMR、¹HNMR和HMBC数据(C₅D₅N)

  position  ¹³C NMR  ¹H NMR  HMBC ¹³C NMR of aglycone  1  38.9(t) 38.6  2  29.9(t)  1.70，m；2.03，m 30.8  3  77.7(d)  3.84，m 71.8  4  39.3(t) 41.9  5  139.3(s) 139.7  6  119.4(d)  5.33，br s 118.2  7  35.0(t) 34.3  8  74.4(s) 74.1  9  44.1(d)  1.70，m 43.1  10  37.3(s) 36.7  11  25.7(t)  1.97，m；2.26，m 24.7  12  74.6(d)  5.19，dd(11.5，4.5)  C-1′，C-18 73.5  13  57.0(s) 56.0  14  89.0(s) 87.8  15  34.0(t) 32.2  16  33.8(t) 32.9  17  87.7(s) 87.8  18  11.4(q)  2.05，s  C-12，C-14，C-17 10.3  19  18.1(q)  1.32，s  C-5，C-9，C-10 18.2  20  74.9(d)  5.21，q(7.0)  C-7″，C-21 73.9  21  15.7(q)  1.55，d(6.0)  C-17，C-20 15.0  12-O-acyl  Ac  Ac  1′  171.4(s)  171.4  2′  22.1(q)  2.14，s  C-1′  21.7  20-O-acyl  Anth  Anth  1″  111.1(s)  109.6  2″  152.7(s)  152.2  3″  111.6(d)  6.74，d(8.5)  C-1″，C-5″  110.9  4″  135.2(d)  7.43，ddd(8.5，8.0，1.5)  C-2″，C-6″  134.8  5″  114.8(d)  6.60，t(7.5)  C-3″  114.4  6″  132.7(d)  8.36，d(8.0)  C-2″，C-4″，C-7″  131.4  7″  168.3(s)  167.2  CH₃  29.6(q)  2.80，d(5.0)  C-2″  29.5  Cym  Sa-C1  96.5(d)  5.29，d(9.5)  C-3  Sa-C2  37.3(t)  1.78，m；2.54，m  Sa-C3  78.1(d)  4.05，m  Sa-C4  83.2(d)  3.50，dd(9.5，2.5)  Sb-C1，Sa-C6  Sa-C5  69.4(d)  4.22，m  Sa-C6  18.7(q)  1.40，d(6.5)  Sa-C4；Sa-C5  Sa-3-OCH₃  59.1(q)  3.63，s  Cym  Sb-C1  100.5(d)  5.13，d(9.5)  Sa-C4  Sb-C2  37.1(t)  1.78，m；2.46，m  Sb-C3  78.1(d)  4.00，m  Sb-C4  83.1(d)  3.88，d(9.0)  Sc-C1，Sb-C6  Sb-C5  69.1(d)  4.23.m  Sb-C6  18.6(q)  1.59，d(6.0)  Sb-C4，Sb-C5  Sb-3-OCH₃  59.0(q)  3.60，s  Allm  Sc-C1  104.9(d)  5.17，d(7.5)  Sb-C4  Sc-C2  75.0(d)  4.05，m  Sc-C3  86.0(d)  3.74，t(9.0)  Sc-C2，Sc-C4，Sc-3-OCH₃  Sc-C4  83.5(d)  3.54，dd(9.5，2.5)  Sd-C1  Sc-C5  72.1(d)  4.25，m  Sc-C6  18.8(q)  1.78，d(6.0)  Sc-C4，Sc-C5  Sc-3-OCH₃  60.7(q)  3.97，s  Glc  Sd-C1  106.1(d)  4.73，d(8.0)  Sc-C4  Sd-C2  75.9(d)  4.00，m  Sd-C3  78.8(d)  4.26，m  Sd-C4  Sd-C4  72.1(d)  3.91，m  Sd-C5  78.2(d)  4.09，m  Sd-C6  63.2(t)  4.72，dd(12，5)；4.55，dd(12，3)  Sd-C4，Sd-C5

实施例3

片剂：活性成分        1.0g

      乳糖            18.8g

      硬脂酸镁        0.2g

制备方法：将活性成分与乳糖、硬脂酸镁混合，过筛，装入硬胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量10mg。

实施例4：C₂₁甾体苷SMA体内免疫抑制作用

实验方法

(1)免疫程序ICR小鼠随机分成6组，以卵清白蛋白(OVA)为抗原(200μg/只)，以氢氧化铝(1mg/只)为佐剂，分别于第1和15天皮下注射免疫小鼠，同时设立生理盐水对照组。OVA免疫小鼠于第1天开始，分别腹腔注射SMA(25μg/只、50μg/只、100μg/只)、环孢菌素A(CsA，50μg/只)和生理盐水，间隔7天给药1次，连续给药5次。二免后14天，分离脾淋巴细胞供淋巴细胞增殖实验，及制备血清进行抗体滴度测定。

(2)脾细胞悬液制备  小鼠放血处死，70％乙醇浸泡1-2分钟，无菌条件下取小鼠的脾，加适量Hanks液研磨，以200目不锈钢网滤过，1500rpm离心5分钟，弃上清，加Hanks液重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI 1640培养液混悬，以台盼兰拒染法计数，活细胞数不小于95％，加RPMI 1640完全培养液稀释，并调整细胞浓度至1×10⁷个/ml。

(3)淋巴细胞增殖反应  于96孔微量板中，每孔加100μl脾细胞悬液(1×10⁷cell/ml)，每个样品重复12孔，并分别加Con A液(终浓度为5μg/ml)、LPS液(终浓度为10μg/ml)、OVA液(终浓度为20μg/ml)或RPMI 1640培养液至总体积为200μl。另设空白对照组。37℃、5％CO₂培养44h后，各孔加入50μl MTT溶液(2mg/ml)，继续培养4h。1000rpm离心5分钟，弃去各孔上清，分别加150μl酸性DMSO溶液，振荡，于室温暗处放置15min，以酶标仪于波长578nm处测定OD值，并按下式计算刺激指数(SI)：SI(刺激指数)＝

(4)血清中OVA特异性抗体效价测定  采用间接ELISA法检测血清中OVA特异性IgG抗体滴度。方法如下：在96孔酶标板上，每孔加入100μl包被液(含50μg/ml OVA的0.01mol/L碳酸盐缓冲液)，置4℃孵育24h，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。每孔加封闭液200μl，于37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。加100μl待测血清稀释液，重复3孔，倍比稀释至六个稀释度。37℃孵育2h，用洗涤液洗涤3次，每次3分钟。加100μl/孔按说明书规定的使用浓度的辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠IgG抗体稀释液，37℃孵育2h，洗涤3次，每次3分钟。每孔加100μl底物缓冲液，37℃暗处放置10min，加50μl/孔2N H₂SO₄溶液终止反应。置酶标仪于波长492nm处测定OD值。

实验结果

(1)SMA体内对ConA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应的影响SMA体内对ConA诱导的OVA受免小鼠T淋巴细胞增殖反应影响的结果见图8。由图8可见，SMA在25μg、50μg和100μg剂量下均能极显著抑制ConA诱导的OVA受免小鼠T淋巴细胞增殖反应(P＜0.001)。

(2)SMA体内对OVA诱导的OVA受免小鼠淋巴细胞增殖反应的影响SMA体内对OVA诱导OVA受免小鼠特异性淋巴细胞增值反应影响的结果见图9。由图9可见，SMA在25μg、50μg和100μg剂量下均能显著或极显著抑制OVA诱导的OVA受免小鼠B淋巴细胞增殖反应(P＜0.01或P＜0.001)，且呈剂量依赖性关系。

(3)SMA对OVA受免小鼠血清中OVA特异性IgG抗体效价的影响SMA对OVA受免小鼠血清中OVA特异性IgG抗体效价的影响见图10。由图10可见，SMA在25μg、50μg和100μg剂量均极显著抑制OVA受免小鼠血清中OVA特异性IgG抗体效价(P＜0.05或P＜0.01)，且呈剂量依赖性关系。

上述动物实验结果表明：本发明的化合物SMA具有显著的免疫抑制活性，其对细胞免疫的抑制活性与环孢菌素A相当，而对体液免疫的抑制作用优于环孢菌素A。

实例5：C21甾体苷SMA对大鼠佐剂性关节炎的防治作用试验

取SD大鼠56只，雄性，体重200～250g，按体重平均分为5组，每组10-16只，从致炎前1天开始给药，分别按20、40和80mg/kg剂量灌胃给予SMA，给药体积均为10ml/kg体重，每天1次，连续21天，阳性组给予雷公藤多苷(Tripterysium glucosides，TG)80mg/kg，模型对照组给予等容积常水；致炎当天，用自制测量装置测定大鼠双侧后肢踝关节周长作为致炎前数据，给药后30分钟，所有大鼠均在左侧足趾皮下注射Freund′完全佐剂100μl致炎，致炎后1d、3d、5d、8d、11d、14d、17d、20、23d，用自制测量装置测定左侧踝关节周长，按下列方法计算肿胀度(肿胀度＝(致炎后周长-致炎后周长)/致炎前周长×100％)，观察SMA对原发病变的影响。从第8天开始同时测定右侧踝关节周长，同法计算肿胀度，并观察大鼠耳部红斑、尾部结节、前足红肿等继发病变的出现情况，记录尾部结节数，按五级评分法评价前足红肿程度(0分无红肿，1分小趾关节红肿，2分趾关节和足趾肿胀，3分踝关节以下足肿胀，4分包括踝关节在内全部足爪肿胀)，以此评价SMA对佐剂性关节炎大鼠继发病变的影响。结果见表2～表5。

                                                             表2 SMA对大鼠佐剂性关节炎原发性病变的影响(X±SD)

 组别  剂量   (mg/kg)  致炎前周   长(mm)                                                     致炎后不同时间致炎足肿胀度(％)   1d   3d   5d   8d   11d   14d   17d   20d Control TG SMA SMA SMA  --  80  80  40  20  22.1±0.6  21.9±0.7  21.7±0.8  22.1±0.6  21.4±0.6  31.8±8.8  28.8±9.7  27.5±7.2  33.2±5.4  37.0±7.0  28.5±10.5  23.1±8.1  25.7±8.8  29.9±10.6  34.9±8.8  24.1±7.0  18.1±7.2  17.4±6.9  22.4±7.7  29.0±9.2  21.8±12.0  17.2±8.1  15.8±8.8  22.7±13.8  32.0±10.4  15.4±8.5  15.1±7.8  9.9±9.0  16.0±11.3  17.0±9.8  18.3±9.4  11.0±4.6^*  8.1±6.8^*  14.3±12.0  16.6±10.3  12.5±9.5  4.0±6.6^*  4.7±5.7^*  5.9±11.8  16.6±12.3  10.6±10.8  7.4±7.1  7.2±5.4  11.7±11.9  17.4±10.3

注：n＝10(对照组n＝16)，^*p＜0.05(与模型对照组比较)

                                表3 SMA对大鼠佐剂性关节炎继发性病变的影响(对侧足肿胀度，X±SD)

   组别  剂量   (mg/kg)  致炎前周长   (mm)                                   致炎后不同时间对侧足肿胀度(％)  8d  11d  14d  17d  20d  Control  TG  SMA  SMA  SMA  --  80  80  40  20  21.7±0.8  21.4±0.6  21.4±0.3  21.5±0.6  21.6±0.7  10.6±4.5  10.9±4.2  11.3±5.7  9.6±4.6  10.1±4.9  8.9±4.3  8.4±5.0  4.9±4.8  3.2±4.9^*  4.9±4.1  5.3±4.9  3.7±3.8  5.2±3.9  3.5±4.4  3.9±4.8  0.3±3.6  -0.3±2.4  -0.7±3.6  0.2±3.1  2.2±3.7  0.4±4.7  -0.2±5.1  2.7±4.7  1.0±5.7  5.4±4.7

注：n＝10(对照组n＝16)，^*p＜0.05(与对照组比较)。

                            表4 SMA对大鼠佐剂性关节炎继发病变的影响(尾部结节，X±SD)

   组别  剂量   (mg/kg)                                            尾部结节数  8d  11d  14d  17d  20d  23d  Control  TG  SMA  SMA  SMA  --  80  80  40  20  3.1±0.6  2.2±0.4^*  2.3±0.5^*  2.4±0.5^*  2.2±0.7^*  3.1±0.5  2.5±0.5^*  2.6±0.5^*  2.8±0.4  2.9±0.3  3.6±0.5  2.9±0.3^*  2.8±0.4^*  3.0±0.5^*  3.0±0.0^*  3.6±0.5  2.7±0.5^*  2.6±0.5^*  2.9±0.3^*  3.0±0.0^*  3.4±0.5  2.7±0.5^*  2.7±0.5^*  3.0±0.5  3.1±0.6  4.0±0.4  2.8±0.4^*  2.7±0.5^*  3.0±0.0^*  2.8±0.4^*

注：n＝10(对照组n＝16)，^*p＜0.05(与模型对照组比较)

                          表5 SMA对大鼠佐剂性关节炎继发病变的影响(前足红肿计分，X±SD)

   组别  剂量   (mg/kg)                                           前足红肿计分  8d  11d  14d  17d  20d  23d  Control  TG  SMA  SMA  SMA  --  80  80  40  20  2.0±0.5  1.6±0.5  1.5±0.5^*  1.5±0.5  1.7±0.9  2.7±0.5  1.7±0.5^*  2.0±0.7^*  1.8±0.4^*  2.2±0.4^*  2.8±0.4  1.6±0.5^*  1.8±0.6^*  2.0±0.5^*  2.2±0.4^*  2.8±0.4  2.0±0.5^*  1.7±0.5^*  1.6±0.5^*  2.1±0.8^*  2.8±0.4  2.0±0.5^*  1.6±0.5^*  1.6±0.5^*  2.4±0.5  2.8±0.4  1.9±0.3^*  1.6±0.5^*  2.0±0.8^*  2.0±0.0^*

注：n＝10(对照组n＝16)，^*p＜0.05(与模型对照组比较)

由表2～表5可见，SMA组对佐剂所致的大鼠关节炎早期局部原发性炎症有一定的防治作用，作用强度与雷公藤多苷相当。也能明显抑制12天后的再度肿胀，对前足红肿及尾部结节等继发性病变的发生也有显著的防治作用。

综上所述，本发明的C₂₁甾体苷SMA对小鼠细胞免疫和体液免疫均具有显著的抑制活性，对大鼠佐剂性关节炎有显著的防治作用试。这些药效学实验结果表明：本发明的C₂₁甾体苷SMA可作为免疫抑制剂，可用于治疗包括器官移植、类风湿性关节炎、系统性红斑性狼疮、慢性肾炎等自身免疫性疾病以及变态反应性疾病等各种免疫性疾病。