衍生自非洲淋巴瘤病毒VCA－p18衣壳抗原的肽及其用途

摘要

本发明涉及病毒诊断，特别是非洲淋巴瘤病毒(EBV)的诊断，证实EBV的方法和适当的手段。本发明还涉及衍生自p18－VCA的肽，所述肽得以将急性感染从过去的EBV感染中区分开。所述p18－VCA衍生的肽的特征在于它们比p18病毒抗原的N末端少最多100、特别是10－70个氨基酸。

说明书

本发明涉及病毒诊断领域，特别是非洲淋巴瘤病毒(Epstein-Barr virus，EBV)的诊断。提供了检测EBV感染的改进的方法和适用于这一目的的试剂。

非洲淋巴瘤病毒是一种人疱疹病毒，被认为是传染性单核细胞增多症的触发物。EBV感染经常是临床症状不明显地发生，偶然具有轻微的症状。然而，在免疫抑制的个体中，EBV感染可导致严重的恶性表现。

非洲淋巴瘤病毒(EBV)诊断的重要性

EBV诊断有相当不同的诊断重要性，因为急性EBV感染的症状可能与许多由其他病原体导致的或具有其他原因的临床表现交叠。因而，急性EBV感染可能与原发的HIV感染、风疹病毒感染、巨细胞病毒感染、典型肝炎病毒的感染、弓形体病、钩端螺旋体病、各种嗜神经性病原体的感染和与白血病或淋巴瘤相混淆。明确的EBV血清学因此成为为病人服务的主要目标。

EBV血清学的难题

典型的EBV血清学是基于对病毒衣壳抗原(VCA)和EBV特异性核抗原(EBNA)，特别是EBNA-1的IgG和IgM抗体应答的检测。

各种EBV抗原种类的分类是基于病毒增殖的生物周期，针对早期(EA)和晚期(VCA)所需的蛋白和用于维持潜伏性的抗原(EBNA)来进行。这些抗原种类在最初的血清学测试系统(用EBV感染的细胞进行免疫荧光)中是可检测的和可区分的。血清学测试系统的所有随后的进一步改进都保持了这个方案，因而容许对针对EBNA、VCA和EA的抗体特异性进行区分。

VCA和EBNA标记物是首先在免疫荧光检验技术中定义的。在更新近的测试中，使用了VCA复合物的纯化组分p18和p23(其通常通过重组方法制备)和相应于EBNA-1的p72。EBNA-1抗原在随着潜伏感染细胞的建立而进行的初期感染之后的晚期阶段形成，是负责维持这个阶段的因子之一。这意味着抗-EBNA-1只在初期感染之后超过6个月才会形成。然而同时，这也意味着当出现这一标记物时，诊断中可安全地排除新近感染，因而可以获得用于确定感染时间的重要标记物。

EBV血清学具有高度的易变性，如果仅确定了典型的标记物VCA-IgG、VCA-IgM和抗-EBNA-1，常常导致不明确的或错误的结果。因而，例如，不是所有的急性EBV感染都具有可检测的VCA-IgM反应，因此在这种情况中仅基于确定VCA-IgG和VCA-IgM的测试策略导致了错误的结论。另一方面，在少数病例中VCA-IgM也可持续数月的时间，从而冒充了新近感染。

阳性的抗-EBNA-1是过去的EBV感染的证据，与阳性VCA-IgG结合，是唯一明确的血清学状况。阴性的抗-EBNA-1(同时具有阳性VCA-IgG)既可表明急性EBV感染，又可由免疫抑制情况下的继发性抗-EBNA-1丧失而导致。此外，约5％的感染者从不出现可检测的抗-EBNA-1，从而在他们一生中都冒充了急性EBV感染的血清学状态。

因而，通过同时具有阳性VCA-IgG和抗-EBNA-1，安全地排除了急性EBV感染。然而，阳性VCA-IgG和阴性抗-EBNA-1表现出不明确的构象，其在三种状态下发生：

1)在新近EBV感染的情况中；

2)在过去的感染和细胞免疫系统抑制导致的抗-EBNA-1丧失的情况中；

3)在过去的感染和同时缺乏抗-EBNA-1形成(在约5％的健康人群中)的情况中。

例如，发现状态2)和3)在大医院检查的患者中比真正的新近EBV感染更加频繁。

这个EBV血清学的关键问题到目前为止仅可以通过复杂的额外测试或通过在较长时间内与临床数据相关联的重复来可靠地解决。

因此，缺乏抗-EBNA-1通常用作新近感染的指示。如上所述，这可在感染EBV的人群的情况中导致极端的错误判断，该感染EBV的人群维持了抗-EBNA-1阴性，或由于细胞免疫系统的抑制丧失了相关的抗体。当前在常规诊断中使用和应用抗-EBNA-1的方法不能安全地进行新近EBV感染的诊断。

因此，EBV血清学的主要难题是一方面在急性EBV感染中区别原发性抗-EBNA-1阴性，和另一方面抗-EBNA-1的丧失和缺乏抗-EBNA-1形成，这个特别的难题在大多数公开的对血清学测试的评估中都没有被考虑到。必须假定，高达20％的EBV感染检查是不明确的并导致错误的发现。这些特别是在肿瘤学、移植医学和孕期照料中是最重要的。

本发明的一个目的是提供用于检测EBV感染的试剂，其能允许安全地区分急性感染和以前的感染。

令人惊讶地，发现通过修饰病毒EBV衣壳抗原p18，有可能得到与抗体反应的肽，所述抗体以与抗-EBNA-1类似的确定性仅在感染后的晚期阶段形成，并且不在相同程度上表现出在免疫抑制人群中的不形成(nonformation)或丧失的问题。

这些是衍生自EBV-p18抗原的肽，EBV-p18抗原由阅读框BFRF3编码。这个抗原早在1988年就已被描述为VCA标记物(Middeldorp和Herbrink，J.Virol.Meth.，21(1988)133-146)。

p18的分子排布和通过遗传工程方法制备蛋白、以及其特定免疫学活性片段的用途已经在EP 574 075 A2中描述。然而，对重组抗原或对化学合成的片段的性质的描述总是基于最佳的反应性的。

针对由重组方法制备的纯化的完整p18抗原的IgG抗体，即使在新近EBV感染的情况中也是可检测的，因此不适于分辨急性感染和以前的感染。

令人惊讶地，在研究的过程中发现，例如，通过删除p18抗原的N-端区域，可以达到随时间区分抗体反应：删除N-末端的p18可识别感染后仅数周形成的抗体。

因此，本发明涉及衍生自非洲淋巴瘤病毒的病毒p18抗原的肽，其中所述肽能与来自已有相对长时期前的非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应，但不与或微弱地与来自有急性非洲淋巴瘤病毒感染、或近期有非洲淋巴瘤病毒感染的个体的抗体反应。

“肽”的表述包括寡肽和多肽。肽的长度没有限制，除非进行了声明。

根据本发明的肽是修饰的p18抗原，即，它与“野生型蛋白”病毒p18不完全相同。相对于病毒p18的修饰没有特别的限制，只要修饰的肽与这样的抗体反应，所述抗体来自已有相对长时期前的EBV感染的个体，但不与或微弱地与那样的抗体反应，所述抗体来自有急性EBV感染的个体、或来自有近期的EBV感染的个体。

根据本发明的肽衍生自p18的事实意味着其包含具有完整病毒p18抗原的至少一个表位的至少一个片段。如果在对用血清孵化进行的行分析(lineassay)中(对照，实施例3)获得了阳性反应，则存在这种表位，所述血清来自已有相对长时期前的EBV感染的个体。

病毒的p18的氨基酸序列在附图7中示出(SEQ ID NO：1)。通常，根据本发明的肽具有与SEQ ID NO：1不同的氨基酸序列。它优选的包含一个或多个删除和/或替换。最优选的，根据本发明的肽与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相比具有一个或多个删除。氨基酸可在p18的N-末端删除，但也可在p18序列的C-末端和/或在内部位置删除。优选的，删除p18序列的N-末端的一个或多个氨基酸。

根据本发明的肽包含、或由氨基酸序列SEQ ID NO：1的至少10个连续氨基酸组成，优选的至少25个，更优选的至少50个，进一步优选的至少75个，进一步优选的至少100个，最优选的至少125个氨基酸序列SEQID NO：1的连续氨基酸。

优选完整p18-VCA的至少一个表位不存在于本发明的肽中，在感染后针对该表位形成抗体。

通常，根据本发明的肽在N-末端比病毒的p18抗原短1到100个氨基酸，优选的5到90个氨基酸，更优选的10到70个氨基酸，进一步优选的15到50个氨基酸，进一步优选的20到40个氨基酸，最优选的约30个氨基酸。在优选的实施方式中，根据本发明的肽由氨基酸序列SEQ ID NO：2组成。这个氨基酸序列相应于SEQ ID NO：1的氨基酸31到176。在进一步优选的实施方式中，根据本发明的肽实质上具有选自以下构成的组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：1的氨基酸21到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸22到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸23到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸24到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸25到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸26到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸27到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸28到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸29到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸30到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸32到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸33到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸34到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸35到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸36到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸37到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸38到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸39到176，

SEQ ID NO：1的氨基酸40到176，和

SEQ ID NO：1的氨基酸41到176。

本领域的技术人员也知道，如果插入、替换或删除了氨基酸，所述序列的免疫性质通常仅不显著地改变。通常被认为是保守性替换的是替代氨基酸的化学性质类似于被替换的氨基酸的那些替换。被认为是保守性的氨基酸组合是，例如，Gly/Ala、Asp/Glu、Asn/Gln、Val/Ile/Leu、Ser/Thr、Lys/Arg和Phe/Tyr。

根据本发明的肽也可以比病毒的p18短一个或多个C-末端氨基酸而且不丧失其功能。通常，与p18相比在C-末端缺少不超过10个，更优选的不超过5个，最优选的不超过2个氨基酸。在特别的改进中，肽实质上包含选自以下构成的组的氨基酸序列：

SEQ ID NO：1的氨基酸31到166，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到167，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到168，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到169，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到170，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到171，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到172，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到173，

SEQ ID NO：1的氨基酸31到174，和

SEQ ID NO：1的氨基酸31到175。

然而，如果根据本发明的肽与病毒的p18相比在C-末端没有变短，是优选的。

为了创造一种“连接物”可以在N-或C-末端添加额外的氨基酸或化学基团，通过它所述肽可以方便地连接到载体。通常，这样的“连接物”具有1到60个氨基酸，但大都具有1到10个氨基酸。肽与载体或固相的结合不必是共价的。也可以添加半胱氨酸残基来实现与其他肽的偶联。

本发明的肽可进一步通过例如糖基化、酰胺化、羰基化或磷酸化来修饰。本发明还涉及功能性衍生物，例如，盐、酰胺、酯、C-酰胺化或N-酰化的衍生物。

以本申请中的信息为基础，本领域的技术人员可容易地确定某一p18衍生物是否适于区分急性感染和以前的感染。为此，例如，仅需在如实施例3中描述的行分析中对给定的p18衍生物进行检测。

根据本发明的肽可以通过本领域技术人员已知的各种方法来制备。通常，既可通过化学合成又可通过在适合的宿主细胞中表达重组DNA来制备它们。

可使用固相合成或液相合成作为肽的化学合成方法。固相合成是优选的。肽的化学合成方法在Bodanszky和Ondetti：Peptide Synthesis，IntersciencePublishers，New York(1966)；The Peptides，Analysis，Synthesis，Biology，Volume 1-3(Ed.Gross and Maienhofer)1979，1980，1981(Academic Press，Inc.)中已有描述。

关于根据本发明的肽的重组制备，首先提供编码该肽的氨基酸序列的核酸。核酸可以是DNA或RNA，DNA是优选的。编码核酸通常被导入到包含允许表达编码的肽的合适序列的载体或质粒中。这种合适的序列是，例如，启动子、终止子序列和允许质粒复制的序列。它们可以是用于在原核生物或真核生物中表达的表达质粒。本领域的技术人员知道使用不同的启动子序列。原核表达质粒是优选的。

本发明还涉及包含编码根据本发明的肽的核酸的载体或质粒。制备载体和质粒的惯常方法在Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2001，Cold spring Harbour Laboratory Press中已有描述。此外，将载体或质粒导入到合适的宿主机体中，例如，哺乳动物细胞或优选细菌，然后使它们在适当的条件下培养以便发生期望肽的表达。本发明还涉及包含根据本发明的载体或根据本发明的质粒的细胞。本发明的进一步的方面是制备根据本发明的肽的方法，其包括在适当的条件下培养根据本发明的细胞以便表达期望的肽，并选择性的回收该肽。在表达完成之后，可以通过本领域技术人员本身已知的方法来回收该肽。适合的肽重组表达方法在Molecular Cloning：A Laboratory Manual by Sambrook等(见上)中已有描述。

肽优选的以分离的形式存在，即实质上不含其他肽。根据本发明的肽的纯度优选的大于90％，更优选的大于95％，最优选的大于99％，由SDS-PAGE及随后的考马斯染色来确定。

在表达完成后，通常对肽进行纯化。可以使用本领域技术人员已知的各种纯化方法。纯化蛋白和肽的方法在Methods in Enzymology，Vol.182，Guide to Protein Purfication，Academic Press，New York 1990或Scopes R.K.，Protein Purification，Springer-Verlag，Heidelberg 1994中已有描述。

根据本发明的肽由这一事实进行区别，即它与这样的抗体反应，所述抗体来自已有相对长时期前的非洲淋巴瘤病毒感染的个体，但不与或微弱地与那样的抗体反应，所述抗体来自有急性非洲淋巴瘤病毒感染的个体、或来自有近期的非洲淋巴瘤病毒感染的个体。优选的，所述肽不与抗体反应，所述抗体来自有近期的非洲淋巴瘤病毒感染的个体。数据优选的涉及IgG抗体。

来自已有相对长时期前的非洲淋巴瘤病毒感染的个体的血清，可具有以下血清学特征：

-抗-EBNA-1-IgG：阳性；

-抗-p23-IgG：阳性；

-抗-p54-IgG：阴性；

-抗-p138-IgG：阴性；和

-抗-p23-IgM：阴性。

根据本发明的肽与来自具有这些血清学特征的血清的抗体反应。

通常，已发生约1.5年前的感染可被定义为“已有相对长时期前的感染”。

如果存在传染性单核细胞增多症的临床表现，个体的EBV感染被认为是“急性的”。来自有近期的EBV感染的个体的血清，可具有以下血清学特征：

-抗-EBNA-1-IgG：阴性；

-抗-p54-IgG和/或抗-p138-IgG(EA)：阳性；

-抗-p23-IgG(VCA)：阳性；和

-抗-p54-IgM和/或抗-p138-IgM和/或抗-p54-IgM：阳性。

根据本发明的肽不与或仅微弱地与来自具有这些血清学特征的血清的抗体反应。

通常，约4周前已发生的感染可被定义为“近期的感染”。

在本申请的上下文中，肽与抗体“反应”的表述意思是在使肽和抗体相互接触后肽与一个或多个抗体形成抗原-抗体免疫复合物。如果在使肽和抗体相互接触后没有形成抗原-抗体免疫复合物或仅微量地形成抗原-抗体免疫复合物，称为肽与抗体不反应或微弱地反应。肽是否与抗体反应可通过“行分析”来确定，如实施例3所述。

本发明进一步的涉及融合肽，其包含上述根据本发明的肽，和一个或多个进一步的氨基酸，这些氨基酸与病毒p18抗原的氨基酸序列不一致。可以包括各种各样的异源序列。然而，如果在融合肽中仅包含几个异源氨基酸则是优选的，是为了避免异源氨基酸与抗体的交叉反应。异源序列的实例是便于表达的肽的亲和纯化的氨基酸序列，例如在N-或C-末端的寡聚组氨酸段(stretch)(6到8个连续组氨酸残基)。

本发明进一步的方面是用于检测针对非洲淋巴瘤病毒的抗体的诊断试剂，包含根据本发明的肽和/或根据本发明的融合肽。在本发明的上下文中“诊断试剂”包含固相或示踪物。固相可以是，例如，微测试板、细胞、脉管、膜、滤纸、测试条带或微粒，如小珠。将肽结合到固体表面或固相的方法是本领域的技术人员本身已知的。

示踪物可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶、染色剂等。根据本发明的肽或融合肽可以是标记的或未标记的，取决于计划的用途。标记可以是任何一种，例如，酶的、化学的、荧光的、发光的或放射性的。

可以通过使根据本发明的诊断试剂与源自个体的血清相互接触，然后检测形成的抗原-抗体复合物，来检测针对非洲淋巴瘤病毒的抗体。因此本发明还涉及在样品中检测针对非洲淋巴瘤病毒的抗体的方法，包括使根据本发明的肽或融合肽、或根据本发明的诊断试剂与样品接触，然后检测形成的抗原-抗体复合物。

样品通常是源自个体的体液。优选的，样品是源自个体的血清。血清可用适当的液体稀释。

在根据本发明的方法中，通常使用前述的诊断试剂。取决于诊断试剂的性质和进一步的特征，免疫化学反应是所谓的三明治反应、凝集反应、竞争或抑制。

在该方法的优选的形式中，根据本发明的肽或融合肽被固定化在固相上。然后使固相与待研究的样品例如血清接触，结果是能形成抗原-抗体复合物。然后洗涤固相一次或几次以除去结合的抗体。然后鉴别固定化的抗原-抗体复合物。这可以通过，例如，与标记物偶联的所谓抗-抗体来实现。因而，在洗涤之后，可使固相与已和辣根过氧化物酶偶联的抗-IgG抗体接触。这个抗-抗体与固定化的免疫复合物结合。结合的第二抗体可用已知方法通过辣根过氧化物酶的酶反应来显像。第二抗体优选的特异性地识别人IgG。

优选的在该方法中使用在其上固定化了一个或多个抗原的膜或测试条带。在该方法的另一个实施方式中，进行ELISA测试。这种方法的程序是本领域的技术人员本身已知的。适合的检测方法的综述可在“Labor undDiagonose”[Laboratory and Diagnosis]，L.Thomas；Die medizinischeVerlagsgesellschaft，Marburg；ISBN 3-921320-21-6中找到。

为了进行ELISA，通常将肽或多个肽的混合物结合到固相上，例如，连接到微量滴定板上。使待测试的适当稀释度的体液(血清)与固相接触，固相上结合有肽或多个肽。随后的孵化进行一段时期，该时期足以形成抗原-抗体复合物。然后洗去未结合的成分。通常通过特异性结合人免疫球蛋白的和被标记了(关于合适的标记物，见上述)的抗体，可有效的检测免疫复合物。在添加了底物之后，然后形成了易于可视地、光度测定地、光谱测定地、发光测定地、电化学地检测的产物。

另一个变形是竞争分析，这也是本领域技术人员已知的。

在该方法的一个特定实施方式中，使非洲淋巴瘤病毒的进一步的抗原与样品接触，然后检测形成的抗原-抗体复合物。EBV的进一步的抗原优选的是新近感染特有的抗原。进一步的抗原优选的选自由p18、p23、p138和p54构成的组。在该方法进一步的实施方式中，除根据本发明的肽或融合肽之外还使用晚期核抗原EBNA-1(p72)。在进一步的实施方式中，除根据本发明的肽或融合肽之外还使用抗原p72、p18、p23、p138和/或p54。

本发明进一步的方面是用于检测针对非洲淋巴瘤病毒的抗体的测试试剂盒，其包含根据本发明的肽或融合肽和/或如上述的诊断试剂。测试试剂盒可进一步包含适于实现根据本发明的方法的试剂，例如，包含第二抗体的组合物。测试试剂盒优选的包含固相。其上固定化了至少一个根据本发明的肽或融合肽的蛋白质印迹测试条带是特别优选的。进一步的EBV抗原可被固定化，例如，p18、p23、p72、p54和/或p138。该条带可以是硝化纤维条带。测试试剂盒可进一步包含洗涤溶液，优选的为浓缩的形式。

本发明进一步的方面是修饰的非洲淋巴瘤病毒衣壳抗原的用途，用于确定是否存在急性EBV感染/近期的EBV感染、或已有相对长时期的/以前的EBV感染。根据本发明的用途的优选实施方式相应于上述的肽、融合肽、诊断试剂、测试试剂盒和/或方法的优选实施方式。本发明进一步涉及修饰的非洲淋巴瘤病毒衣壳抗原的用途，用于新近感染/短期前的感染和以前的感染的血清学辨别。本发明进一步涉及非洲淋巴瘤病毒修饰的衣壳抗原的用途，用于检测针对EBV的抗体。优选的可以区分新近感染和以前的感染。本发明进一步涉及非洲淋巴瘤病毒修饰的衣壳抗原的用途，用于检测以前的EBV感染。最后，本发明涉及非洲淋巴瘤病毒修饰的衣壳抗原的用途，用于区分以前的EBV感染和新近EBV感染。根据本发明的用途的修饰的病毒衣壳抗原优选的相应于根据本发明的肽或融合肽。以上描述的本发明的所有进一步优选的变体，在上下文中应用到本发明的用途上。

在本申请中描述的本发明的所有方面和优选的实施方式可以以各种各样的方式相互组合。本发明同样涉及这样的组合。

除EBNA-1之外，本发明提供第二种晚期标记物，其额外地不具有抗体不形成(nonformation)的问题。与EBNA-1相比，针对p18的抗体在细胞的免疫抑制后不会丧失。鉴定根据本发明修饰的针对p18的IgG因此可靠地排除了急性EBV感染。

通过在适当的测量系统例如，免疫印迹中使用修饰的p18，因此即使在抗-EBNA反应是非典型的时也有可能检测新近EBV感染和以前的EBV感染。

附图1表明了通过使用修饰的p18抗原在EBV诊断的信息能力方面的改进。

附图图示性地表明了，在上半部中，是用于检测针对EBV抗体的常规的免疫印迹，在下半部中，是根据本发明的测试，其额外地包含在N-末端截短了的p18抗原(在条带上标示为“p18”)。标记物p23(VCA)、p54(早期抗原)和p138(早期抗原)是血清阳性的标记物，它们不能区分新近感染和以前的感染。这些标记物的抗体应答是多变的，从而可能检测到免疫反应的不同模式。对这些标记物中的至少一个的阳性抗体应答，允许诊断出“感染了EBV”，而不能进一步区分“新近感染”和“以前的感染”。对p72(＝EBNA-1)的阳性IgG反应允许可信地诊断“以前的感染”。在常规测试中，以阳性的p72-IgG为基础正确地识别出典型的以前的EBV感染(A1)，而没有p72-IgG形成的以前的EBV感染(A2)、或具有随后的第二p72-IgG丧失的以前的感染(A3)，不能同还没有p72-IgG应答的真正新近EBV感染(B)区别开来。在常规测试中情况A2和A3因此通常被错误地诊断。然而，在日常实践中这些情况比真正的新近EBV感染的频率更高。

通过运用包含例如，在N-末端截短的p18(在附图1中指示为“p18”)的修改的测试(下半部分)，即使在没有p72-IgG时，缺乏p18-IgG的新近感染(B)也可以清楚的与以前的EBV感染(A1-A3)区别开来。

附图2显示各种肽的表达。显示了诱导之后大肠杆菌表达克隆的溶菌产物的用考马斯蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶(对照实施例1)。各泳道对应于以下批次：

泳道1：在N-末端截短的p18的表达(p18-30)

泳道2：在pDS载体中完全p18(total p18)的表达

泳道3：在pQE载体中完全p18的表达

泳道4：分子量标记物

在完全p18抗原的数量上的差异是基于不同的N-末端氨基酸；pQE载体具有额外的组氨酸标签。如所期望的，在N-末端截短的p18所具有的分子量低约4kDa。

附图3显示了在免疫印迹中肽的反应性。带有两个p18变体的诱导的大肠杆菌克隆溶菌产物通过凝胶电泳分离，然后转移到硝化纤维膜上(蛋白质印迹)。

泳道1：无组氨酸标签的完全p18

泳道2：p18-30(截短的p18变体)

将硝化纤维膜与来自EBV-阳性人群的血清孵育，然后用与过氧化物酶偶联的第二抗-IgG抗体和TBM染色使特异性结合的抗体可见化。

A；有新近EBV感染的患者的血清

B；有以前的EBV感染的血清

附图4显示了在基于条带的商售EBV抗体测试(来自Viramed，Planegg-ViraStripe EBV)中，在N-末端截短的p18和全长p18-VCA之间反应性的比较。

在每种情况中，有先前的EBV感染但有疑问的血清学(微弱的抗体滴度，缺乏抗-EBNA-1；A)的人群的10份血清，和来自有新近EBV感染的患者的10份样品(B)，使用两种形式的EBV抗原条带来测试：

“Mikrogen”条带除N-末端截短的p18外还包含额外的EBV抗原EBNA-1、p23(VCA)和p54和p138(EA)。

Viramed条带除完整的p18抗原之外也还包含EBV蛋白EBNA-1、EA-p54和gp125(VCA)。

在左半部分(Mikrogen测试)中，“p18”表示在N-末端截短的p18。在右半部分(Viramed测试)中，“p18”表示病毒的全长p18。

在先前的感染(A)的情况中，在两个测试中发现了或多或少的显著的抗-p18反应。

然而，在新近感染之后病人的血清(B)在运用N-末端截短的p18的测试中的任何情况下不显示反应，但在运用ViraStripe(完全p18)的所有样品中显示反应。

附图5显示了根据本发明的测试与商售的ELISA系统的反应性比较。

有新近EBV感染(急性)的患者的32份样品，和有以前的(旧)EBV感染的人群的25份血清样品，每一个都用N-末端截短的p18(喷到硝化纤维条带上，Mikrogen(对照，附图4的抗体条带))、和具有常规的p18-VCA抗原的商售ELISA(来自Sorin)进行测试。

在这两个图表中，在每个情况下两个测试的OD值针对彼此绘出；x轴-N-末端截短的p18的带强度；y轴-完全p18的ELISA值。ELISA的OD值通过通常的ELISA读取器确定，在0到3.0之间；扫描N-末端截短的p18的硝化纤维条带，带的强度通过软件程序的方法确定；在此，尺度包含从0到200的值。两条额外的线条表示各自的截止点(cut-off)。

附图6显示了在各种测试形式中p18反应性的相关性。来自实施例4的新近和以前的感染的血清的测试结果(附图5)额外地在条带测试中用常规VCA-p18(来自Viramed)进行研究，将结果与VCA-ELISA值和N-末端截短的p18的反应性相关联。

图像评估按照类似于在之前的实例中描述的方式进行：x轴为ELISAOD值(从0到2.0)；y轴是两个条带测试的p18反应性(圆圈-完全p18的Viramed)；点-N-末端截短的p18抗原)。

以下实施例更详细地解释本发明。

实施例1：完全p18和N-末端截短的p18抗原的重组制备

描述了与病毒完全p18相比在N-末端缺少30个氨基酸的抗原的表达克隆，作为N-末端截短的p18的实例。

利用PCR方法和来自分离的EBV-DNA(B95-8株)的相应寡核苷酸引物，扩增编码p18抗原氨基酸31-176的区域。

(阅读框BFRF3；序列数据根据遗传序列数据库记录)

完全p18的引物：

5’-引物：

GAG GGA TCC ATC ATG AAA CGC CGG CTG CCC AAG CCC ACC(SEQID NO：3)

3’-引物：

CGC CTG CAG TTA CTG TTT CTT ACG TGC CCCGCG(SED ID NO：4)

截短的p18的引物：

5’-引物：

GAG GGA TCC CTG AAC CAG AAT AAT CTC CCC(SEQ ID NO：5)

3’-引物：

CGC CTG CAG TTA CTG TTT CTT ACG TGC CCC GCG(SEQ IDNO：6)

粗体的核苷酸相应于p18编码序列；斜体的核苷酸表示限制性内切酶接口，用于进一步的克隆步骤(GGATCC-BamH1；CTGCAG-Pst1)。

用标准方法和使用标准缓冲液在100μl批次中进行PCR(在94℃变性1分钟；在55℃引物结合1分钟；在72℃合成1分钟；总共40个循环)。

在凝胶电泳中检查了PCR产物的正确大小之后(完全p18约530nt和截短的p18约440nt)，用常规方法对两个PCR产物进行纯化和脱盐，然后用BamH1和Pst1切割，最后插入到表达载体pDS1的相应位置。pDS1是一个具有氨苄青霉素抗性和优化的lac启动子和随后的含有BamH1和Pst1位点的翻译起点的载体，能允许PCR产物按正确的阅读框进行正确的翻译。

其他表达系统也是适合的。

为了进行比较，完全p18编码片段最后也被插入到商售载体pQE30(QIAGEN)中。

在转化之后，用标准方法诱导具有表达质粒和正确的插入物的大肠杆菌克隆，用SDS凝胶电泳和随后的考马斯染色分析溶菌产物。

每个批次都显示了重组p18或p18衍生物的清晰表达。完全p18具有约22kDa的分子量，N-末端截短30个氨基酸的蛋白具有约18kDa的大小，具有稍低的表达产量。

完全p18的pQE30表达具有类似范围的产量，由于额外存在的组氨酸残基该产物稍大(附图2)。

实施例2：完全p18与N-末端截短的抗原的反应性比较

完全p18和截短的p18克隆的溶菌产物再次用凝胶电泳分离，转移到硝化纤维，然后研究它们对于各种EBV-阳性血清的反应性。

为此，使硝化纤维膜与1∶100稀释的血清一同孵育，用第二过氧化物酶偶联的抗体和随后的染色反应使特定的抗体可视化。缓冲液、稀释剂和孵育时间与Mikrogen开发的EBV蛋白质印迹“recomBlot EBV”类似。

也可使用其他蛋白质印迹程序或染色方法。

测试了新近感染后(约3周前)和一段时期前发生的感染(约1.5年)的每种一个血清(附图3)。

令人惊讶地，发现完全p18抗原与截短的形式相比在反应性上有实质上的区别：

在已发生一段时期的感染的情况中，两个抗原变体以大约相同的程度反应；然而在新近感染的血清的情况中，仅完全p18抗原显示了实质上的反应。

因此，有两个标记物(除EBNA-1之外)可被用于确定EBV感染的时间。

实施例3：利用商售的免疫斑点测试比较反应性

用常规方法相对大量地表达并纯化p18抗原的截短的变体；在此主要是以下步骤：

-裂解带有表达产物的诱导的大肠杆菌细胞；

-通过离心以不溶的“包含体”形式分离p18；

-用各种非离子洗涤剂洗涤不溶的球状物；

-在8M尿素缓冲液中溶解余下的含p18的球状物；

-进行各种离子交换层析：DEAE、Q-琼脂糖、S-琼脂糖(都来自Pharmacia)。

从而可获得纯度＞99％的蛋白。

可选择地，也可以使用其他纯化方法或柱步骤顺序。通过使用pQE30-p18产物，有可能特别地利用其对Ni鳌合柱的选择性结合。

在行分析(line assay)中研究纯化的产物与来自有EBV感染的人群的抗体的反应性。为此，用所谓接触针(Isoflow，来自Imagene Inc)将产物和其他重组EBV抗原(EBNA-1、p23-VCA、p138-EA、p54-EA)一起点在硝化纤维膜上窄的行中，然后进一步处理来得到测试条带(浸透膜上的非结合区域，添加标记物，剪成窄的条带)。行分析的测试原理相应于商售的来自Mikrogen的免疫分析“recomLine EBV IgG”(商品号：4572)。

用新近EBV感染和以前的感染的血清测试条带。为此，将条带与1∶100稀释的血清一同孵育。洗涤三次之后，用抗-人-IgG(辣根过氧化物酶结合的)进行孵育。再次洗涤(三次)之后，用TMB底物溶液进行孵化。只要截止点对照带可见，就移除底物溶液并用水洗涤条带。如果带的强度等于或大于截止点对照带的强度，反应被认为是阳性的。因而，如果得到了带强度等于截止点值或大于截止点值，则肽与抗体反应。不反应或微弱地反应意味着没有带或带的强度低于截止点值。在这个测试中，截止点值被定义为，使用在条带上所谓对照带(截止点带)的微弱染色强度作为评估抗原条带反应性的限度(对照，例如上述Mikrogen的免疫分析“recomLine EBV IgG”)。暗淡的截止点带染色总是相同的，这是由在所有程序和患者样品的情况中某种试剂的使用造成的。

作为比较，进行Viramed Planegg(EBV-ViraStripe)的商用条带测试，其与以上描述的条带类似，但有时候含有其他EBV抗原，包括完全p18。

附图4的免疫染色条带中清晰明显的是，完全p18(右)或N-末端截短的p18(左)在以前的EBV感染的血清的两个测试中同样好地被识别，并且反应性非常相似。另一方面，在新近EBV感染的人群的血清的情况中有实质上的区别：在与常规p18的对比测试中，这在所有情况中或多或少地被识别；在截短的p18抗原的条带上，在任何新近的情况中都没有发现反应。

这再一次强调了修饰的p18对于分析EBV状态的价值和可靠性。

实施例4：利用商售的ELISA系统比较反应性

新近EBV感染(“急性”)的患者的32份样品和以前的(旧的)EBV感染的人群的25份血清，在每种情况下都用来自实施例3的截短的p18(喷洒到硝化纤维条带上，行分析p18)和常规VCA抗原的商用ELISA(非洲淋巴瘤病毒衣壳抗原ETI-VCA-G；来自DiaSorin)进行测试(附图5)。

在这两个图表中，在每个情况下两个测试的OD值针对彼此绘出。x轴相应于截短的p18的带强度。y轴相应于完全p18的ELISA值。

ELISA的OD值通过常规的ELISA读取器确定，在0到3.0之间；扫描截短的p18的硝化纤维条带，带的强度通过软件程序的方法确定；此处，尺度包含从0到200的值。

两条额外的线条表示各自的截止点。

反应性上的不同是清晰明显的：

在以前的感染的情况中，反应性分布在很高程度上类似：一个测试中的高度阳性血清一般也被另一个测试识别为强阳性，即，在以前的感染的情况中，ELISA抗原和截短的p18以非常相似的方式反应。

新近感染的情况中的表现显著不同：在ELISA值的情况中，以及在之前的感染的情况中，所有的值发生在截止点和高度阳性(OD 3.0)之间；与以前的感染的情况相比没有区别。

然而，截短的p18的OD值大部分低于截止点，仅在两个情形中位于稍微阳性区。这令人印象深刻地展示了截短p18在新近的和以前感染的情况中不同的反应性。

实施例5：在不同的测试形式中p18反应性的比较研究

在进一步的研究中，来自实施例4的新近的和以前的感染的血清额外地在条带测试中利用常规VCA-p18(来自Viramed)进行研究，将结果与VCA-ELISA值和来自实施例3的截短p18的反应性相关联(附图6)。

图像评估按照类似于前述实施例中描述的方式进行：

沿x轴绘出ELISA OD值(从0到3.0)；y轴相应于两个条带测试的p18反应性(圆圈：完全p18(来自Viramed)，点：截短的p18抗原)。

在以前的感染血清的情况中，所有的血清如期望的是ELISA阳性，同时在两个测试条带中都是有反应的；即，测试形式没有影响。

然而，在新近感染的血清的情况中，再次发现了截短的p18的完全不同的反应性：ELISA值如期望的从截止点直到强反应区域中是分散的；在完全p18的测试条带的血清显示了同样的模式；另一方面，截短的p18抗原位于阴性区或在两个样品的情况中位于轻微阳性区。

这个评估再次非常清楚地展示了目前EBV测试系统对用VCA标记物区分过去的和新近感染的无能性。依靠描述的测量，修饰的p18抗原(在N-末端截短)可进行这种区分。

因此，通过使用截短的p18，在大多数案例中发现了用于诊断新近感染的进一步的可靠的标记物，这个标记物与已知的EBV标记物结合，在解释血清学EBV状态方面可产生实质上的改进和可靠性。

更多参考文献：

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                                    序列表

<110>米克罗根分子生物技术发展有限责任公司(MIKROGEN molekularbiologische Entwicklungs-GmbH)

<120>衍生自非洲淋巴瘤病毒VCA-p18衣壳抗原的肽及其用途

<130>改良的VCA

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>176

<212>PRT

<213>人疱疹病毒4(Human herpesvirus 4)

<400>1

Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gly Arg Leu Glu Ala

1               5                   10                  15

Asp Phe Pro Asp Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gln Glu Leu Asn Gln

            20                  25                   30

Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser Tyr Leu

        35                  40                  45

Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln Arg Thr

    50                  55                  60

Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln Arg Ala

65                  70                  75                  80

Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser Ser Ala

                85                  90                      95

Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr Gly Ala

            100                 105                 110

Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala Thr Pro

        115                 120                125

Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser Gly Ala

   130                 135                 140

 Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly

 145                 150                 155                 160

Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys Lys Gln

                165                 170                 175

<210>2

<211>146

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>N-末端被截短的p18

<400>2

Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe Arg Glu Ala Gln Arg Ser

1               5                   10                  15

Tyr Leu Val Phe Leu Thr Ser Gln Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr Val Gln

            20                  25                  30

Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg Gln Arg Ala Ile Asp Lys Arg Gln

        35                  40                  45

Arg Ala Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His Leu Gly Gly Ser

   50                   55                  60

Ser Ala Thr Pro Val Gln Gln Ala Gln Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr

65                  70                  75                   80

Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr Ala Val Ala Gln Ser Ala

                85                  90                      95

Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Leu Arg Ala Ala Thr Ser

            100                 105                     110

Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser

        115                 120                 125

Gly Gly Gly Gly Gln Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala Arg Lys

    130                 135                 140

Lys Gln

145

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gagggatcca tcatgaaacg ccggctgccc aagcccacc                                39

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

cgcctgcagt tactgtttct tacgtgcccc gcg                                       33

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

gagggatccc tgaaccagaa taatctcccc                                                 30

<210>6

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgcctgcagt tactgtttct tacgtgcccc gcg                                             33