亚麻籽木脂素总糖苷提取物的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种从亚麻籽中提取纯化木脂素总糖苷的制备方法及其应用。该提取物可由下述方法制得：1)提取及碱水解：亚麻籽经榨油得到的亚麻饼粕，或脱壳处理的亚麻籽壳，经低级醇或含水低级醇提取，回收，粗提物碱水解，中和，过滤；或原料直接用碱性低级醇或含水低级醇溶液提取，中和，回收，滤过；2)分离：滤液上样于大孔吸附树脂柱，含水低级醇梯度洗脱，收集35％～60％含水低级醇洗脱液，3)干燥：洗脱液减压回收至干，干燥粉碎得亚麻籽木脂素总糖苷其中木脂素总糖苷含量为60％～85％。本发明得到的亚麻籽木脂素总糖苷提取物，可与药用辅料混合，制备具有预防和治疗妇女更年期的骨质疏松、血脂代谢紊乱的药物和保健食品。

说明书

技术领域：

本发明涉及从亚麻籽中提取分离木脂素总糖苷有效部位的方法，具体地说是从亚麻籽中提取分离具有预防和治疗妇女更年期的骨质疏松、血脂代谢紊乱的木脂素总糖苷提取物。

背景技术：

亚麻(Linum usitatissimum)，又称胡麻，是生产纤维(麻)、油(亚麻油)和食品的传统作物。亚麻籽中含有较多的木脂素糖苷类化合物，其主要的生物活性成分为开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(secoisolariciresinol diglucoside，SDG)，临床和药理试验证明亚麻籽及SDG具有植物雌激素的作用，抗肿瘤的作用，抗脂质过氧化的活性，对心血管疾病作用等重要的生理活性。亚麻在我国北方广泛种植，是我国的主要经济作物之一，亚麻籽年产量约42万吨，具世界第四位，我国目前主要用于榨油。(王萍.亚麻木酚素生理功能.粮食与油脂，2000：4：45-46.)。

亚麻籽中的木脂素糖苷类化合物SDG由于具有广泛的生物活性而得到重视，但该类化合物的大规模提取分离具有一定的难度，限制了在医药及食品补充剂中的运用。1956年Bakke等就报道了采用乙醇和二氧六环混合溶剂提取，再采用甲醇钠或甲醇钡水解的提取分离SDG的方法(Bakke J.E.，Proceeding of the North Dakota Academy of Science，1956，10：18-22.)；US 5705618专利报道了采用含水醇提取，碱水解，醋酸乙酯萃取或离子交换树脂分离，制备HPLC色谱纯化的制备工艺；US 6806356专利报道了采用丙酮水提取，碱水解的工艺；WO062812专利报道了采用超临界二氧化碳萃取和反相C₁₈色谱分离的工艺；CN 1162438C报道了采用含水醇提，碱水解，硅胶色谱分离的工艺。现有工艺均存在提取分离工艺成本高，容易带有溶剂残留，难以工业化生产的问题。

妇女更年期综合症是由于在绝经前后，由于卵巢功能退行性改变，雌激素水平低下所导致的以植物神经功能紊乱为主，伴有心理症状的一组症候群。据国内外有关资料报道，在45-50岁90％的妇女均有不同程度的临床表现并由此引起疾病，其中以骨质疏松和心脑血管疾病最为常见(韩学阳，女性生殖内分泌激素与补充治疗.北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993，3：48-57.)。亚麻籽中含有较大含量的木脂素糖苷类成分，该类植物雌激素前体活性成分能在肠道细菌的作用下形成两种主要的哺乳动物木脂素：肠内脂(enterolactone)和肠二醇(enterodiol)(Borriello S.P.，Journal of Applied Bacteriology，1985，58：37-43.)。运用亚麻籽中木脂素总糖苷有效部位，预防和治疗妇女更年期的骨质疏松、血脂代谢紊乱的动物试验和临床研究未见报道。最相关的资料是US 6498145专利公开了提纯的SDG在降血压制剂的运用；US 6673773专利公开了亚麻籽中木脂素、香草酸葡萄糖苷、戊二酸组合物在降胆固醇和动脉粥样硬化的应用。但以上专利均没有涉及妇女更年期疾病的预防和治疗，尤其是本发明的技术方案制备得到的木脂素总糖苷的活性报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种运用大孔吸附树脂从亚麻籽中提取分离木脂素总糖苷的方法。

本发明的另一目的是在于提供这种亚麻木脂素总糖苷在用于制备预防及治疗妇女更年期的骨质疏松、脂质代谢紊乱的药品和保健食品中的运用。

一种从亚麻籽木脂素总糖苷提取物的制备方法，包括以下步骤：

a.将亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕，或经脱壳处理得到的亚麻籽壳，粉碎成粒状粉末；

b.将a得到的亚麻籽原料，加低级醇或含水低级醇提取，回收，提取物经碱水解，中和，滤过，收集滤液；或将b得到的亚麻籽原料直接用碱性低级醇或含水低级醇溶液提取，中和，回收，滤过，收集滤液；

c.将b收集的滤液上样于大孔吸附树脂柱分离，含水低级醇溶液梯度洗脱，收集40％～60％含水低级醇洗脱液；

d.将c收集的40％～60％含水低级醇洗脱液减压回收至干，干燥粉碎得亚麻籽木脂素总糖苷，其中木脂素总糖苷含量为60％～85％。

所述的低级醇的碳数为C1～C3，优选的低级醇为乙醇；

步骤b可按下列任何一种方法进行：(i).提取的低级醇溶液为70％乙醇，加入量为5～10倍，提取次数为1-2次，提取时间为6～10hr,室温搅拌提取，提取液减压回收至干，提取物加入10-20倍量的碱水液，室温搅拌水解4～8hr，水解液加入浓酸中和至PH值为6-7，离心，或滤过，得滤液；(ii).碱性醇溶液为溶解无机碱的乙醇溶液或含水乙醇溶液，加入量为5-10倍，室温搅拌提取，提取时间为6～10hr，提取液中和至中性，回收溶剂，加入适量水溶解，离心，或滤过，得滤液；

所述用于水解提取物的无机碱为氢氧化钠或氢氧化钾，浓度为2～6％；碱性醇溶液为2～6％的氢氧化钠或氢氧化钾的乙醇溶液；

所述步骤c可采用滤液上样于大孔吸附树脂柱，依次用20％，50％，95％乙醇梯度洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压回收至干；

所述步骤c采用的大孔吸附树脂为聚苯乙烯骨架的极性或非极性大孔吸附树脂，可选用D101，AB-8，XAD-2，HP-20等型号的树脂。

提取方法包括室温搅拌提取、40℃搅拌提取、回流、渗漉等，为了所提取成分的稳定性及节约能源，最好采用室温搅拌提取。

亚麻籽木脂素总糖苷提取物的干燥方法为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥，最好为真空干燥。

一种亚麻籽木脂素总糖苷提取物，该亚麻籽提取物采用上述方法制备得到。

本发明提供的提取溶剂、浓度、提取方法、水解方法是通过试验比较确定；大孔树脂的洗脱工艺是通过严格的不同浓度含水醇梯度洗脱试验，通过HPLC含量监控确定，洗脱部位的木脂素总糖苷含量(主要成分为开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷，松脂醇二葡萄糖苷等)达到60％～85％，洗脱部位经化学法检识无氰苷类成分，气相色谱未检出本提取物中苯乙烯、甲苯等由于采用大孔树脂工艺带来的树脂残留物。

含量测定的方法：

照高效液相色谱法(中国药典2000版一部附录VID)测定。

色谱条件：Shimadzu CLC ODS C₁₈ 4.6×150mm；甲醇：0.2％HOAc(35∶65)；UV 280nm；

一种亚麻籽木脂素总糖苷提取物制剂，其特征在于：该制剂以本发明技术方案制备得到的亚麻籽木脂素总糖苷提取物为主要活性成分，加上药剂上或保健食品可接受的辅料，制成药剂或保健食品可接受的剂型。所述的辅料可选自亚麻油、大豆油、淀粉、蔗糖、糊精、葡萄糖、氯化钠、维生素E、维生素C、半胱氨酸、亚硫酸钠等中的任意一种或几种。所述的药剂或保健食品可接受的剂型为口服制剂或注射剂，优选为软胶囊、硬胶囊、片剂、滴丸、水针、粉针或输液。

本发明所得到的亚麻木脂素总糖苷提取物制备所需的药品或保健食品的各种剂型时，可以按照药剂或保健食品的常规生产方法制备。如将该提取物与一种或多种载体混合，然后制成相应的剂型。

本发明所得到的亚麻木脂素总糖苷提取物能够显著改善去卵巢大鼠的骨质疏松及血脂代谢紊乱的作用，可用于预防及治疗妇女更年期的骨质疏松、脂质代谢紊乱的病症。

本发明得到的木脂素总糖苷提取物，可与药用辅料混合，制备具有预防和治疗妇女更年期的骨质疏松、血脂代谢紊乱的药物和保健食品。

本发明的优点是：本发明所提供的亚麻木脂素总糖苷提取物，其制备工艺简单，成本低，无溶剂残留，适合工业化生产。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，并不以此限定本发明的实施范围。

具体实施方式

实施例1

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、3倍量体积的70％乙醇，室温搅拌提取2次，第一次8小时，第二次2小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入10倍量体积的4％NaOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物82g，木脂素总糖苷含量为75％。

实施例2

经脱壳处理得到的亚麻籽壳5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、3倍量体积的70％乙醇，室温搅拌提取2次，第一次8小时，第二次2小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入10倍量体积的4％NaOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物95g，木脂素总糖苷含量为78％。

实施例3

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、3倍量体积的碱性70％乙醇溶液(2％NaOH)，室温搅拌提取2次，第一次8小时，第二次2小时。提取液合并，加入浓盐酸中和至PH 6，减压回收至无醇味，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物82g，木脂素总糖苷含量为75％。

实施例4

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、3倍量体积的70％乙醇，室温搅拌提取2次，第一次8小时，第二次2小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入10倍量体积的4％NaOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物68g，木脂素总糖苷含量为80％。

实施例5

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、5倍量体积的70％乙醇，回流搅拌提取2次，每次3小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入10倍量体积的4％NaOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以50％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物72g，木脂素总糖苷含量为82％。

实施例6

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、5倍量体积的70％乙醇，回流搅拌提取2次，每次3小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入10倍量体积的4％KOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物65g，木脂素总糖苷含量为72％。

实施例7

亚麻籽经榨油得到的基本不含油脂的亚麻饼粕5Kg，粉碎，加入药材重量8倍、5倍量体积的70％乙醇，回流搅拌提取2次，每次3小时。提取液合并，减压回收至干；醇提物加入20倍量体积的4％NaOH溶液，室温搅拌水解4小时，水解液中加入浓盐酸中和至PH 6，离心(3500rpm，5min)，上清液上样于已处理好的D101大孔吸附树脂柱，以水洗去杂质，再以60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，所得浸膏真空干燥，即得亚麻木脂素总糖苷提取物56g，木脂素总糖苷含量为78％。

实施例8

亚麻籽木脂素总糖苷提取物对去卵巢大鼠骨质疏松症、血脂紊乱的作用

1.建立模型与分组：

取Wistar健康6月龄雌性大鼠50只，随机分为5组，以30mg/kg体重的剂量腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液，无菌条件下摘除双侧卵巢作为模型大鼠；阴性对照组切除腹部双侧一小块脂肪，作为假手术组(对照组，10只)；证明彻底去势后的模型大鼠随机分为去势空白对照(模型组，10只)，去势阳性药物组(10只)，亚麻籽木脂素总糖苷低剂量组(FS-L，10只)，亚麻籽木脂素总糖苷高剂量组(FS-H，10只)。

2.给药：

手术后2周后各组分别经口给予以下药物：假手术组：去离子水(10ml·kg^-1·d^-1)；去势空白对照组：去离子水(10ml·kg^-1·d^-1)；去势阳性药物组：尼尔雌醇(E₃)1.5mg·kg^-1·d^-1；低剂量组：FS50mg·kg^-1·d^-1；高剂量组：FS150mg·kg^-1·d^-1。灌胃容积为2ml/只，每天1次。各组动物给药90天后，2％戊巴比妥注射麻醉，腹主动脉取血分离血清置冰箱冷藏集中测试，取股骨剥离干净作骨密度检测，完整摘取子宫称重计算子宫指数。

3.检测指标和方法：

血清雌二醇(E₂)用放射免疫分析法测定；骨密度用双能X线骨密度仪检测；血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(AKP)采用试剂盒法(放射免疫分析法)测定；总胆固醇采用CHOD-PAP法测定；甘油三酯(TG)采用GPO-PAP法测定；高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)采用酶法测定；低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)采用CHOD-PAP法测定；具体方法按各试剂盒说明书操作；以上各项指标的测定方法若为酶法，采用全自动生化分析仪(Olympus 400，日本)；若为沉淀法，采用半自动生化分析仪(CBI 71型，中国)。

4.结果

(1)对体重、子宫系数及血清雌二醇的影响

各组大鼠体重无明显差异。与对照组相比较，模型组的子宫系数明显降低；与模型组相比，尼尔雌醇组、FS二个剂量组的大鼠子宫系数升高；相对于模型组，尼尔雌醇组及FS的二个剂量组血清雌二醇(E₂)水平皆显著升高。结果见Tab.1。

Tab.1FS对大鼠体重、子宫系数和血清雌二醇含量的影响(n＝10，x±s)

  组别  剂量(mg/kg)  体重(g)  子宫系数(g/kg)  E₂(pg/ml)  对照组  模型组  尼尔雌醇组  FS-L  FS-H    1.5  50  150  314±23  302±17  307±14  302±15  309±13  1.542±0.270  0.542±0.147^#  1.421±0.293^**  1.084±0.126^*  1.124±0.252^*  64.2±17.2  31.3±14.7^#  57.1±13.8^*  50.7±12.7^*  49.5±15.7^*

注：与对照组比较：^#p＜0.01；与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(2)对大鼠骨密度(BMD)和骨代谢生化指标的影响

与对照组比较，模型组的BMD值显著降低；与模型组比较，尼尔雌醇组、FS的二个剂量组的BMD值显著升高；各组大鼠的血清钙(Ca)含量组间无显著性差异。与对照组比较，模型组的碱性磷酶(AKP)显著升高，血磷(P)含量明显降低；与模型组比较，尼尔雌醇组、FS的二个剂量组的AKP显著降低，血磷(P)含量明显升高。结果见Tab.2。

                Tab.2FS对大鼠BMD和骨代谢生化指标的影响(n＝10，x±s)

  组别 剂量(mg/kg)  BMD(g/cm²)  AKP(U/L)  Ca(mmol/L)  P(mmol/L)  对照组  模型组  尼尔雌醇  FS-L  FS-H   1.5  50  150  0.157±0.015  0.126±0.017^#  0.172±0.023^*  0.157±0.034^*  0.160±0.027^*  217.2±43  291.0±52^#  253.2±56^**  226.0±48^*  232.7±53^*  2.75±0.34  2.70±0.18  2.63±0.25  2.71±0.17  2.72±0.52  1.75±0.51  1.12±0.23^#  1.70±0.45^*  1.55±0.38^*  1.60±0.45^*

注：与对照组比较：^#p＜0.01；与模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

(3)对大鼠血脂谱的影响

与对照组比较，模型组大鼠的血清中的总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)低密度脂蛋白(LDLc)分别升高了98.1％、33.9％和43.8％，但高密度脂蛋白(HDLc)下降了13.4％，与模型组比较，尼尔雌醇组和Fs的两个剂量组均能明显降低因去势形成的TC、TG和LDLc的升高，但对HDLc影响不大。可能对高血脂(尤其是LDLc)有一定的调节作用。

                      Tab.3FS对去卵巢大鼠血脂水平的影响(n＝10，x±s)

  组别  剂量(mg/kg)  TC(mmol/L)  TG(mmol/L)  LDLc(mmol/L)  HDLc(mmol/L)  对照组  模型组  尼尔雌醇  FS-L  FS-H    1.5  50  150  41.2±6.88  81.6±19.12^#  59.6±8.17^*  63.4±7.68^*  66.3±9.46^*  69.0±10.32  92.4±13.45^#  77.5±14.16^*  80.1±10.11^*  81.8±9.89^*  4.16±0.38  5.98±0.33^#  4.72±0.16^*  4.99±0.21^*  4.86±0.19^*  20.14±4.92  17.44±3.21^#  18.77±4.16  18.69±3.24  19.12±3.64

注：与对照组比较：^#p＜0.05；与模型组比较：^*p＜0.05。

5.讨论

人体内雌激素水平的高低与脂代谢和骨代谢密切相关，体内雌激素水平下降，是绝经后妇女骨质疏松和心血管发病率增高的主要原因。文献研究表明，植物雌激素如大豆异黄酮可抑制骨吸收，减少妇女绝经后的骨丢失，预防骨质疏松的发生；同时雌激素可促进血脂的降解和排泄，降低TC、LDLc水平，减少胆固醇在动脉壁的沉着，抑制动脉粥样硬化斑块形成(Uesugi T，Bio1.Pharm.Bull.，2001，24(4)：368-372.)。本研究动物试验表明，本发明的亚麻籽木脂素糖苷提取物能够显著增高去卵巢大鼠的骨密度，同时显著降低血清中碱性磷酸酶活性，从而抑制雌激素缺失所致的骨代谢高转换状态；以上提示本品具有较好的改善去卵巢大鼠的骨质疏松作用。本品对于去卵巢大鼠的血脂代谢结果表明，亚麻籽木脂素糖苷提取物能够显著降低血清中TC，LDLc水平，对HDLc影响不大，提示本品具有较好降血脂及降低动脉粥样硬化风险的作用。

综上所述，本发明的亚麻籽木脂素糖苷提取物具有预防和治疗妇女更年期的骨质疏松症、血脂紊乱的作用。