大肠杆菌热敏毒素B亚单位的真核表达方法

摘要

本发明涉及一种大肠杆菌热敏毒素B亚单位(E.coli heat－labile enterotoxin B subunit，LT－B)的真核表达方法，其主要步骤是：首先将LT－B的核酸序列(如SEQ ID NO：1所示)通过限制性核酸内切酶位点与穿梭质粒pPICZαA连接获得重组表达载体，然后将重组表达载体导入毕赤酵母(Pichia pastoris)X－33或KM71经发酵表达获得目标蛋白(LT－B)。本发明为开发具有商业价值的大肠杆菌热敏毒素B亚单位奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种大肠杆菌热敏毒素B亚单位(E.coli heat-labile enterotoxin B subunit，LT-B)的真核表达方法。

背景技术

早在上世纪四十年代，人们就发现某些血清型的大肠杆菌(Eschericha coli，E.coli)会引起幼畜及婴儿的流行性腹泻，意识到E.coli不都是肠道“正常”寄生菌，并把可以引起人和动物发生腹泻的E.coli称为肠道病原性E.coli(Enteropathogenic，E.coli，EPEC)。进一步研究表明EPEC引起人和动物腹泻的主要原因是由于其产生肠毒素，因此，又把这种可产生肠毒素的E.coli称为肠毒素原性E.coli(Enterotoxingenic E.coli，ETEC)。

ETEC主要产生两种类型的肠毒素：其一为E.coli耐热毒素(E.coli heat-stableenterotoxin，ST)，其二为E.coli热敏毒素(E.coli heat-labile enterotoxin，LT)。LT分子是由1个约28kDa的A亚基(LT-A)和5个约11.5KDa的B亚基(LT-B)组成的6聚体毒素蛋白，其分子量约为74～91KDa。完整LT-A可由胰酶裂解成LT-A₁与LT-A₂，二者分子量分别为24KDa和526Da。LT-A₂位于LT-A₁的C末端，二者以二硫键连接，在进入靶细胞后，二硫键被还原，LT表现出毒性。现已基本明确LT-A和LT-B在LT分子毒素活性中的功能，LT-A有ADP-核糖基转移酶的作用，它能透过细胞膜，激活细胞的腺苷酸环化酶(AC)，引起细胞内cAMP升高，刺激肠粘膜细胞过度分泌水和电解质，导致腹泻，是LT的毒力活性部分；LT-B可与靶细胞上的特异受体GM₁结合，打开通道，介导LT-A进入靶细胞，以产生毒素活性。全LT分子及无毒的LT-B均具有良好的抗原性，在免疫学上具有重要意义。

具有粘膜免疫活性的大肠杆菌热敏毒素B亚单位(LT-B)已被采用多种方式表达过，如有大肠杆菌、枯草杆菌或转基因番茄等表达法(1.Clements，J.D.，Hartzog，N.M.，Lyon，F.L.，1988.Adjuvant activity of Escherichia coli heat-labile enterotoxin and effect on the induction of oraltolerance in mice to unrelated protein antigens.Vaccine 6，269.，2.Wang J，Li L，Zheng J，et al.Highly efficient expression，purification of recombinant LTB protein and its activity againstmucosal immunoadjuvant by nasal immunization.Chin Med J(Engl).2003 Jul；116(7)：1115-1117.，3.Walmsley AM，Alvarez ML，Jin Y，et al.Expression of the B subunit of Escherichia coliheat-labile enterotoxin as a fusion protein in transgenic tomato.Plant Cell Rep.2003 Jun；21(10)：1020-1026.)，但无论是在蛋白表达量、转录后加工与高级结构形成方面，还是在蛋白的纯化及检测方面存在不同程度的缺陷。因此，寻求一种大肠杆菌热敏毒素B亚单位表达量高且所表达的蛋白易于纯化及检测的大肠杆菌热敏毒素B亚单位的表达法成为本发明需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种高表达且所表达的蛋白易于纯化及检测的大肠杆菌热敏毒素B亚单位的表达法，以此克服现有技术中存在的缺陷。

本发明所说的大肠杆菌热敏毒素B亚单位(LT-B)的表达方法，其主要步骤是：首先将LT-B的核酸序列通过限制性核酸内切酶与表达载体连接得重组表达载体，然后将重组表达载体导入宿主细胞经发酵表达获得目标蛋白(大肠杆菌热敏毒素B亚单位)，其特征在于，其中所说的LT-B具有SEQ ID NO：1所示的核酸序列，所说的表达载体为穿梭质粒pPICZαA，所说的宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33或KM71(由从美国英骏公司购得)。

本发明大肠杆菌E.coli O6：H16(LT⁺，ST⁺)LT-B全基因为模板，以引物Pb1：5’-ATG AATAAA GTA AAA TGTAT-3’和Pb2：5’-GAA TTC TAG TTT TCC ATA CTG ATT GCC-3’，经过高保真PCR扩增出带信号肽的LT-B核酸序列，亚克隆入pGEM-T(购自美国Promega公司)：再以pGEM-LT-B为模板，利用引物P1：5’-GAA TTC CTC GAG AAA AGA GCT CCC CAGACT ATT ACA GAA-3’(引入EcoR I和Xho I限制性酶切位点)和P2：5’-GCG GCC GCCTAG TTT TCC ATA CTG ATT GCC GC-3’(引入Not I限制性酶切位点)，经过高保真PCR扩增出不带信号肽序列的LT-B。同时，在pPICZaA-LT-B的构建过程中，考虑到毕赤分泌时的正确识别与切割LT-B，在引物P1的LT-B的N末端引入了Kex2 signal cleavage可识别的LeuGlu Lys Arg氨基酸，以Xho I和Not I位点定向亚克隆入以同样酶完全切割的毕赤酵母(Pichiapastoris)分泌型表达载体pPICZαA构建了包含LT-B目的基因、酵母信号肽α因子、合适的酶切位点及HIS₍₆₎-tag纯化标签的毕赤酵母(Pichia pastoris)pPIC-ZαA-LT-B表达载体，(构建过程请参见图2和图3)，该表达载体经电转化和一系列筛选、鉴定，包括抗性筛选、表型筛选、基因水平和蛋白水平鉴定，获得了可分泌表达LT-B-6×HIS于培养基的毕赤酵母基因工程株X-33/pPIC-ZαA-LT-B和KM71/pPIC-ZαA-LT-B，发酵培养了表达LTT-B的毕赤酵母工程菌，并采用镍性的亲和层析柱简单、快捷地分离纯化到了免役佐剂LT-B。

本发明的特点与优点在于：

(1)首次对原核生物大肠杆菌来源的热敏毒素B亚基通过基因工程手段在真核表达系统毕赤酵母基因工程株X-33/pPIC-ZαA-LT-B和KM71/pPIC-ZαA-LT-B中实现了表达，并均可分泌于培养基上清，以可溶性蛋白存在，而且具有比天然产毒素性大肠杆菌有较高的表达水平，因此采用本系统比大肠杆菌生产更具有实用价值：

(2)在酵母表达载体构建方法上，在去除LT-B自身信号肽的基础上，采用了毕赤酵母容易识别的酿酒酵母信号肽α因子，并在LT-B的N末端除了引入了酶切位点外，还引入了Kex2 signal cleavage识别位点Leu Glu Lys Arg氨基酸，使LT-B在毕赤酵母分泌表达时能够正确进行切割加工，而能够有效地分泌表达入培养基上清。同时在目的蛋白质的C末端还带有His-Tag纯化标签，以便于检测和纯化；

(3)在目的蛋白的纯化与检测方法上，采用Zeocin作为抗性标记和多拷贝筛选检测手段，比采用通过所用的其它抗生素干扰因素少、特异性强和简便快捷。由于目的基因片段与His-Tag纯化标签以融合蛋白的形式被分泌表达于培养基上清，而酵母分泌表达入培养基上清的本体蛋白较胞内表达蛋白少得多，这使得所表达的融合蛋白易于分离纯化和检测，只要使用镍性的亲和层析柱分离就可以简便地纯化，利用His酶标抗体便可方便地检测到目的蛋白的表达，使得其应用更加方便、快速、低廉；

(4)由该系统表达生产的粘膜免疫佐剂LT-B，对所有与其一同用于粘膜免疫的疫苗抗原具有显著的通用性，即由此系统表达生产的LT-B可以与非特异性的与特定的易于从粘膜侵入的病原微生物抗原一起通过各种粘膜途径进行免疫，均可激发产生针对特异性病原的免疫预防作用。

附图说明

图1是不带信号肽序列的LTB的高保真PCR扩增结果电泳图；

其中：lane1和2为经高保真PCR扩增的不带信号肽序列的LTBlane3为DNA Marker.

图2是分泌型毕赤酵母表达载体/pPICZαA-LT-B构建图；

图3是表达与毕赤酵母中的LT-B序列分析与构建策略图；

图4是酵母表达载体的酶切鉴定与酵母表达菌株PCR鉴定结果电泳图；

其中：A为酵母表达载体pPICZαA-LT-B的Xho I-Not I双酶切鉴定结果lane1-4为表达载体pPICZαA-LT-B经Xho I-Not I双酶切鉴定电泳条带。Lane5为DNA Marker.

B为毕赤酵母表达株的菌落PCR鉴定结果

lane1为DNA Marer.Lane2-5为利用LT-B特异性引物对毕赤酵母表达株的菌落PCR鉴定的电泳条带。

图5是毕赤酵母表达株表达结果的SDS-PAGE与Western Blotting鉴定结果图。

其中：(A)为Western Blotting分析结果：(B)为SDS-PAGE分析结果lane1，lane4分别为对照菌株诱导的培养基上清lane5，lane8的Western Blotting分析结果；lane2为阳性菌株X-33/pPICZαA-LT-B甲醇诱导的培养基上清lane6的Western Blotting分析结果；lane3为阳性菌株KM71/pPICZαA-LT-B甲醇诱导的培养基上清lane7的Western Blotting分析结果；lane9为标准蛋白。

图6经Ni⁺Chelating Sepharose纯化后的LT-B的电泳图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明内容而非限制本发明的保护范围。

                         实施例

1.带信号肽序列的LT-B基因的克隆与序列测定

以插入pGEM-T载体上的克隆自致病性大肠杆菌E.coli O6：H16(LT⁺，ST⁺)LTB全基因为模板，以引物Pb1：5’-ATG AAT AAA GTA AAA TGT TAT-3和Pb2：5’-GAA TTC TAG TTT TCCATA CTG ATT GCC-3，经过高保真PCR扩增出带信号肽序列的LT-B(如下所附序列)，亚克隆入pGEM-T，经测序带信号肽序列的LT-B正确，其序列如下，共372bp，可编码成熟肽LT-B的103个氨基酸。

1   atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atgtgcatac

71  ggagctcccc agtctattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg

121 ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gtaaaagaga aatggttatc

181 attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac

241 tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag

301 accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc

361 agtatggaaa ac

2.pPICZαA-LT-B的构建

以pGEM-LT-B模板，利用引物P1：5’-GAA TTC CTC GAG AAA AGA GCT CCC CAGACT ATT ACA GAA-3(引入EcoR I和Xho I限制性酶切位点)和P2：5’-GCG GCC GCC TAGTTT TCC ATA CTG ATT GCC GC-3(引入Not I限制性酶切位点)，经过高保真PCR扩增出不带信号肽序列的LTB。同时，在pPICZaA-LTB的构建过程中，考虑到毕赤分泌时的正确识别与切割LTB，在引物P1的LTBd的N末端引入了Kex2 signal cleavage可识别的Leu Glu LysArg氨基酸，以Xho I和Not I位点定向亚克隆入以同样酶完全切割的毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA(参见构建图2和图3)，通过转化大肠杆菌Top10F’，按《分子克隆》(科学出版社，第二版)方法制备和转化感受态方法，获得大量大肠杆菌转化子，利用常规方法提取质粒进行鉴定。

3.重组酵母表达载体鉴定

从加有100mM Zeocin的LB平皿上选取生长的菌落，提取质粒进行酶切鉴定，用Xho I和Not I双酶切，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定的结果可见(如图4A所示)，除约3.6kb的载体片段外，可看到约300bp大小的目的条带，利用酵母通用引物测序结果与构建分析结果如图4，结果表明，LT-B片段已正确插入pPICZαA载体，即pPICZαA-LT-B已经构建成功。

4.重组酵母表达株的筛选与鉴定与多拷贝筛选

按Invitrogen操作手册制备毕赤酵母野生型X-33和突变型KM71菌株的感受态细胞。将pPICZαA-LT-B用Sal I酶切线性化后电转入以上感受态细胞中(750伏、25uF、400欧)，立刻加入1ml预冷的1M山梨醇，转移至管中离心，涂布在含200mM Zeocin的YPD平板上，30℃培养2-3天。选择不同生长速度的酵母转化子分别接种YPD液体培养基，过液生长后，根据《精编分子生物学实验指南》，利用特异性引物P1和P2进行菌落PCR法扩增同源重组入酵母基因组的LT-B目的基因，扩增结果的1％的琼脂糖凝胶电泳显示，如图4 B获得了预期大小的目的条带。对菌落PCR法鉴定正确的重组酵母菌株，分别逐级接种于含有500、1000、1500、2000、5000mM Zeocin的YPD平板上，各自30℃培养2-3天，通过对抗生素Zeocin的不同耐受性来筛选多拷贝重组子，最终获得可以存活于含5000mM Zeocin的YPD平板上的少数几株X-33和KM71高拷贝菌株。

5.目的蛋白的小量表达与表达产物的SDS-PAGE分析

从含5000mM Zeocin的YPD平板上取挑X-33和KM71各2个克隆，分别培养在10mlBMGY培养基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH＝6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油)，30℃，250rpm下培养至OD₆₀₀＝2.0-6.0。细胞离心后重悬在2mlBMMY培养基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸钾缓冲液，pH＝6.0，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇)以诱导蛋白表达。30℃、250rpm条件下培养6天，每隔24小时添加甲醇至终浓度为0.5(v/v)％。6天后离心收集上清，取少量进行15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图5(B)所示。

6.Western Blotting检测LT-B蛋白活性

将X-33/pPIC-ZαA-LT-B或KM71/pPIC-ZαA-LT-B两株工程菌的加醇诱导表达的培养基上清中的蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS-PAGE电泳结束时，切出含待转移蛋白的凝胶，剪6张同样大小的Whatman 3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜(Millipore HAWP)，用软铅笔在纤维膜一角做好标记。将它们漂浮于ddH₂O水平面上，润湿后浸于水中5min，驱除膜上的气泡，再浸泡于转移缓冲液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中。在塑料支架上依次叠放浸湿的海绵、3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜对齐，且各层之间无气泡存在；将塑料支架夹紧插入电转移槽中；硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，加转移液(39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris.Cl，0.037％SDS，20％甲醇)没过凝胶，以30V～35V电压，4℃转移14～16h。转移完毕，将硝酸纤维素膜浸于封闭液(5％脱脂奶粉或3％BSA，150mmol/L NaCl，0.02％Tween-20)中约室温2h，以封闭无关蛋白结合位点，同时对凝胶进行染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后，用洗涤液(10 mmol/L Tris.Cl pH7.5，0.15mol/L NaCl，0.05％Tween-20)洗膜3次，每次5min；将一抗(兔抗GPV或MPV的血清)用抗体稀释液(0.01mol/L TBS，1％BSA，0.05％Tween-20)作适当稀释，滴在保鲜膜上，然后将硝酸纤维素膜正面(吸附抗原面)向下覆盖在加抗体的保鲜膜上，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；同样方法加酶标二抗(碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG)，室温反应2h；用洗涤液洗膜3次，每次5min；膜稍干，加酶底物反应液进行反应。将洗涤过的膜移入浅托盘中，按0.1mL/cm²加入底物反应液，平缓摇动于室温进行温育显色。显色结束后，将硝酸纤维素膜移至蒸馏水中，终止显色。

7.目的蛋白的大量表达

挑选表达量最高的KM71/pPIC-ZαA-LT-B工程菌克隆进行大量表达，即在3.7升发酵罐中进行发酵。具体操作按Invitrogen的发酵手册(Pichia Fermentation Process Guidelines，Invitrogen 2002)进行。120小时后离心收集上清，-80℃保存。取上清液分别少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，经面积积分扫描分析软件可知其最高表达量可达分泌入上清总蛋白的17％。

8.表达于培养基上清中的LT-B蛋白的纯化

取1升发酵上清液，加入PMSF至终浓度为1mM，以防止蛋白降解。并加入1/10总体积的1.0M Tris(pH8.0)将培养基的pH值调至8.0。然后加入硫酸铵至饱和度为60％以沉淀蛋白质，在冰浴下搅拌2小时。沉淀离心后重悬在40ml 20mM Tris-HCl，pH为7.9中，透析过夜。加入imidazole和NaCl至终浓度分别为：0.5M和5mM。然后将样品上Ni⁺Chelating Sepharose(BBST NTA Resin)柱，经洗涤液(20mM Tris/HCl，pH7.9，60mM imidazole，0.5M NaCl)充分洗净杂质后，用洗脱液(20mM Tris/HCl，pH7.9，0.5M imidazole，0.5M NaCl)将目的蛋白洗下。利用15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图6所示。

结果表明具体实施过程中将LT-B克隆入pPICZαA载体及宿主酵母系统后，获得了比较高的表达，同时采用Zeocin抗生素作为筛选标记，不仅简便快速、假阳性干扰少，而且可以简便地筛选多拷贝转化子。分泌表达入培养基是清中的LT-B以可溶性蛋白存在，具有较强的免疫活性，而且因酵母分泌的自身蛋白较少且表达产物带有组氨酸纯化标签，因此是目的蛋白质的纯化工艺大大简化，这些也验证了利用真核毕赤酵母完全可以较好地实现原核来源的毒素基因的表达，可以产生具有较强免疫活性的LT-B，因此，是一个有价值、有前景的表达系统。

                  SEQUENCE LISTING

<110>华东理工大学

<120>大肠杆菌热敏毒素B亚单位的真核表达方法

<130>说明书，权利要求书

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>372

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgaataaag taaaatgtta tgttttattt acggcgttac tatcctctct atgtgcatac    60

ggagctcccc agtctattac agaactatgt tcggaatatc gcaacacaca aatatatacg    120

ataaatgaca agatactatc atatacggaa tcgatggcag gtaaaagaga aatggttatc    180

attacattta agagcggcgc aacatttcag gtcgaagtcc cgggcagtca acatatagac    240

tcccaaaaaa aagccattga aaggatgaag gacacattaa gaatcacata tctgaccgag    300

accaaaattg ataaattatg tgtatggaat aataaaaccc ccaattcaat tgcggcaatc    360

agtatggaaa ac                                                        372