具有广泛交叉免疫反应性的冠状病毒（SARS－CoV）B－细胞抗原决定簇

摘要

本发明涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的B－细胞抗原决定簇，一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的方法， 和/或一种检测受试者是否感染SARS－CoV的方法。本发明还涉及一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的试剂盒。本发明进一步涉及所述的冠状病毒B－细胞抗原决定簇用于制备预防重症急性呼吸道综合征的药物的用途，以及一种预防与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫苗。

说明书

发明领域

本发明涉及一组与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)的B-细胞抗原决定簇谱，一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的方法，和/或一种检测受试者是否感染SARS-CoV的方法。本发明还涉及一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的试剂盒。本发明进一步涉及所述的冠状病毒B-细胞抗原决定簇谱用于制备预防重症急性呼吸道综合征的药物的用途，以及一种预防与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫苗抗原。

背景技术

与人类相关的冠状病毒(Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus(SARS-CoV))已经被确认为新的一类病毒，人类以迄今最快的速度测定了其基因序列，主要由RNA-依赖性RNA聚合酶、刺突(S)、膜(M)、被膜(E)、核壳(N)、聚合酶(P)等蛋白组成(1、MarraMA等人，SARS相关冠状病毒的基因组序列，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；2、Rota PA等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒的表征，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月1日；3、Qin E’de，等人，SARS相关病毒的完整序列和比较分析(Isolate BJ01)，Chinese ScienceBulletin 2003，48(10)：941-948；4、Peoros JS，等人，重症急性呼吸道综合征的可能病因-冠状病毒，The Lancet，www.nejm.org，2003年4月8日；5、Ksiazek TG等人，与重症急性呼吸道综合征相关的新冠状病毒，N Engl J Med，2003，348(20)：1953～1966；6、Dorsten C等人，重症急性呼吸道综合征患者中新冠状病毒的鉴定，N Engl J Med，www.nejm.org，2003年4月10日；Anand K等人，冠状病毒主要蛋白酶(3CLpro)结构：设计抗SARS药物的基础，Sciencexpress，www.sciencexpress.org，2003年5月13日)。其中刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白和被膜(E)蛋白组成了病毒外壳，是病毒识别、结合并进入宿主细胞的蛋白质。尤其是刺突S蛋白是关键性蛋白(图1)。

虽然文献研究结果表明HCoV-229E刺突S蛋白的417-546序列是宿主受体结合的部位，但同时也指出不同的冠状病毒通过使用不同的受体进入宿主细胞。这很可能与刺突S蛋白的变异有关(Marra MA等人，出处同前)。核壳(N)蛋白属于胞浆内蛋白，处于病毒颗粒的核心部分，和基因组RNA以结合的形式存在。病毒RNA在细胞质中复制完成后会和N蛋白结合，结合产物可以被M蛋白识别并被包装到病毒颗粒中。所以N和M蛋白与病毒在宿主细胞中的复制具有明显的关系。N蛋白是宿主T-细胞识别的主要位点之一(见图1)。因而，发展合成病毒蛋白的多肽化合物化学库，对于寻找病毒表面蛋白的多重最小多肽抗原决定簇(包括B-细胞和T-细胞抗原决定簇)，进而寻求和发展合成多肽疫苗、临床诊断试剂和血清治疗方案有极其重要的意义。同时，该化学库还可用于筛选并发现病毒结合受体的多重配基，进而阻断冠状病毒进入宿主细胞，发展治疗药物(特别是对于耐药病毒的药物治疗)有极大的参考价值。

目前，寻找抗原决定簇最为常用的方法是利用各种计算机软件，通过已经发表的序列采用亲水性、疏水性、转角结构、HPLC滞留系数、螺旋结构、保守性等参数进行预测。我们的实验结果表明，这种预测方法与实际测得的序列仅有30％～50％的重复性(1、ZHANG XM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2000，868：157-164；2、ZHANGXM，LIU G和SUN MJ，Brain Research，2001，895：277-282.)。另一种方法是采用组合化学技术对蛋白抗原决定簇谱的研究(“交叉重叠”多肽化合物)

组合化学把化学合成、计算机设计选结为一体，能同时产生许多种结构相关但有序变化的化合物，并采用高度灵敏和高通量的生物学方法对这些化合物同时进行筛选，从中确定具有生物活性的物质，或者全新的先导化合物的技术。因而，本技术涉及了许多种类的“似药”分子，如小分子杂环化合物、天然产物、生物寡聚体及其模拟物等。本发明是在前述专利(一种肽文库、其合成方法及从该文库中筛选的活性片段，申请号：200310101892.6。)所组合合成的SARS-CoV“交叉重叠”生物寡聚体多肽化学库基础上进一确认了具有广泛交叉免疫反应性的抗原决定簇谱。该法的特点是以一定数目的氨基酸残基肽(比如1到50个氨基酸残基)为合成“交叉重叠”片段，将蛋白序列通过逐个错位(或者间隔错位，包括从2到合成肽片段的氨基酸的总位数)的方式全部合成出来，然后进行抗原-抗体反应(或者其它生物目的的筛选反应等，如筛选发现T-细胞免疫抗原决定簇，以及SARS-CoV的受体配基等)，一次便可以得到所有最短的抗原决定簇，进而绘成抗原决定簇谱。将这些活性短肽经过适当延长、或者有序线性连接后进行大规模的抗SARS-CoV人阳性血清筛选反应，从而确认了可用于制备诊断试剂、药物以及疫苗的B-细胞多肽化合物以及它们的图谱。

本发明人采用固相合成技术、射频编码技术短时间内合成了大量的“交叉重叠”多肽化合物，在首次合成与SARS-CoV相关的S、M、E和N蛋白的全部“交叉重叠”多肽的基础上，通过对所得具有交叉免疫活性的冠状病毒(SARS-CoV)B细胞抗原决定簇的短肽的顺序连接，使用更大规模的SARS-CoV感染者的阳性血清对其进行筛选，成功得到了具有广泛交叉免疫活性的B细胞抗原决定簇谱多肽，从而完成了本发明。

发明内容

本发明的一个方面，涉及一组衍生自冠状病毒的B-细胞抗原决定簇谱，其选自至少一种下列多肽序列，或其任一组合，包括：

S7：

NH2-ALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFEL-CONH2(SEQ ID NO：54)

S9：NH2-TDVSTAIHADQLTPAWRIYSTG-CONH2(SEQ IDNO：56)

S17：NH2-EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY-CONH2(SEQ ID NO：64)

N4：NH2-TEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKK-CONH2(SEQID NO：69)和

MEN-4e6(MEN-441)：NH2-LPQGTTLPKG-CONH2(SEQ IDNO：70)

本发明的完成是在化学合成了冠状病毒(SARS-CoV)结构蛋白“交叉重叠”肽库的基础上完成的。

具体的，本发明首先通过采用物理编码法依据现有技术中公开的相关信息，合成了“交叉重叠”多肽化学库，通过使该多肽化学库与部分SARS阳性血清反应，得到了具有免疫抗原性的下列十肽：

SEQ ID NO：1 TSGSDLDRCT

SEQ ID NO：2 SGSDLDRCTT

SEQ ID NO：3 SDLDRCTTFD

SEQ ID NO：4 TTFDDVQAPN

SEQ ID NO：5 FDDVQAPNYT

SEQ ID NO：6 MGTQTHTMI

SEQ ID NO：7 MIFDNAFNCT

SEQ ID NO：8 KSGNFKHLRE

SEQ ID NO：9 GNFKHLREFV

SEQ ID NO：10 KDGFLYVYKG

SEQ ID NO：11 SVLYNSTFFS

SEQ ID NO：12 VRQIAPGQTG

SEQ ID NO：13 TRNIDATSTG

SEQ ID NO：14 RNIDATSTGN

SEQ ID NO：15 WPLNDYGFYT

SEQ ID NO：16 YRVVVLSFEL

SEQ ID NO：17 QCVNFNFNGL

SEQ ID NO：18 CVNFNFNGLT

SEQ ID NO：19 NFNGLTGTGV

SEQ ID NO：20 DVSTAIHADQ

SEQ ID NO：21 IGAEHVDTSY

SEQ ID NO：22 SIAYSNNTIA

SEQ ID NO：23 ITTEVMPVSM

SEQ ID NO：24 YGECLGDINA

SEQ ID NO：25 LTVLPPLLTD

SEQ ID NO：26 TALGKLQDVV

SEQ ID NO：27 NFGAISSVLN

SEQ ID NO：28 AISSVLNDIL

SEQ ID NO：29 RLDKVEAEVQ

SEQ ID NO：30 RLITGRLQSL

SEQ ID NO：31 QLIRAAEIRA

SEQ ID NO：32 SANLAATKMS

SEQ ID NO：33 QSKRVDFCGK

SEQ ID NO：34 VPSQERNFTT

SEQ ID NO：35 WFITQRNFFS

SEQ ID NO：36 SGNCDVVIGI

SEQ ID NO：37 FKNHTSPDVD

SEQ ID NO：38 DVDLGDISGI

SEQ ID NO：39 VDLGDISGIN

SEQ ID NO：40 NASVVNIQKE

SEQ ID NO：41 KEIDRLNEVA

SEQ ID NO：42 LQELGKYEQY

SEQ ID NO：43 VVIGIINNTV

SEQ ID NO：44 MVTILLCCMT

SEQ ID NO：45 VTILLCCMTS

SEQ ID NO：46 MEN441：LPQGTTLPKG和

SEQ ID NO：47 MEN533：EASKKPRQKR

为了获得具有更为广泛的交叉免疫反应性的B细胞抗原决定簇谱，考虑到一般具有免疫原性的多肽要大于15个氨基酸残基，本发明人在上述短肽基础上，通过顺序连接短肽抗原决定簇得到的新的22个多肽序列，并采用42份抗SARS-CoV抗体阳性血清进一步筛选具有更广泛免疫交叉反应性的抗原决定簇谱，从中得到一组具有广泛交叉免疫反应活性的多肽，包括：

S7：

NH2-ALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFEL-CONH2(SEQ ID NO：54)

S9：NH2-TDVSTAIHADQLTPAWRIYSTG-CONH2(SEQ IDNO：56)

S17：NH2-EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY-CONH2(SEQ ID NO：64)

N4：NH2-TEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKK-CONH2(SEQID NO：69)和

MEN-4e6(MEN-441)：NH2-LPQGTTLPKG-CONH2(SEQ IDNO：70)

上述5个多肽与共42份抗SARS-CoV抗体阳性血清反应的结果表明，S7和S9分别与30血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，即交叉反应率均为71.4％；S17与28血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，即交叉反应率为66.7％；N4与38血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，即交叉反应率为90.5％；MEN4e6与32血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，即交叉反应率为76.2％。

此外，与SARS-CoV裂解液作为竞争性抗原对比实验表明(图1)，5个合成多肽竞争性抑制了SARS-CoV裂解液抗原与抗SARS-CoV抗体血清的结合，显示该5个抗原具有中和性。阴性对照肽分别为对照1：随机肽，对照2：位于SARS-CoV的S蛋白的945～963处，证实无抗原性。

上述结果证实所得抗原决定簇谱均具有的极高的交叉免疫反应性，同时表明，所述抗原决定簇谱能够用于与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的检测，以及制备预防与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒的疫苗。

本发明的又一方面涉及一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗体的方法，包括用检测有效量的至少一种本发明所述冠状病毒B-细胞抗原决定簇或其任一组合，在适于抗原抗体结合的条件下与待测样品结合或接触。如本发明中使用的ELISA方法，以及方法中使用的辣根过氧化酶及其底物。

相应的，本发明还涉及一种检测受试者是否感染SARS-CoV的方法，包括用检测有效量的至少一种所述冠状病毒B-细胞抗原决定簇或其任一组合，在适于抗原抗体结合的条件下与获自受试者的样品结合或者接触。

本领域普通技术人员知晓如何根据所选择的具体检测方式决定所采用的本发明所述多肽的用量，以及与所选择的检测标记相适应的显示方式。本领域普通技术人员也知晓能够通过将一种或一种以上的所述抗原决定簇多肽用于所述SARS相关冠状病毒的抗体检测方法中。

本发明的另一方面还涉及一种检测待测样品中是否含有与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒抗原的试剂盒，其中含有至少一种本发明所述的冠状病毒B-细胞抗原决定簇或其任一组合，以及适当的显色剂和缓冲液。

本发明还包括所述的冠状病毒B-细胞抗原决定簇用于制备预防重症急性呼吸道综合征的药物的用途。

本发明还特别包括一种预防与重症急性呼吸道综合征相关的冠状病毒感染的疫苗，其中含有预防有效量的所述冠状病毒B-细胞抗原决定簇，任选的佐剂，以及药学可接受的载体。

附图说明

图1与SARS-CoV病毒裂解液作为竞争性抗原结合实验的结果。

具体实施方式

组合化学研究分三个阶段：分子多样性化合物库的合成；群集筛选(进行活性检测)；活性分子的结构测定。

1、肽库的建立

要建立肽文库必须事先考虑许多方面：设计模板分子；选择合适的构建单元；确定合成方案；如何完成半自动或者自动合成等。

本发明中我们的主要目的是寻找针对SARS-CoV病毒的人的B-细胞线型抗原决定簇，并绘制具有交叉反应性的抗原决定簇谱。选择逐位错位的合成方式可以直接找到最小的抗原决定簇。因而，线型10肽被选择为模板分子。蛋白质以天然L-构型氨基酸组成，因而，本化学库的构建单元自然选择为20种天然L-构型氨基酸。高通量地合成方法一般采用固相合成技术，特点是中间体的纯化仅采用简单的洗涤和过滤操作即可完成。同时，反应中可以使用大大过量的构建单元来保证反应进行完全，并易半自动化或者自动化。因而，我们选择了固相合成技术，在树脂上完成了全部多肽化合物的合成。使用20种天然L-构型氨基酸为构建单元来合成数千个多肽化合物时，相同的反应条件可以在多肽编码的条件下同步进行，如相同的脱保护步骤、不同的多肽序列与相同的保护氨基酸进行反应步骤等。这样就可以完成大规模、快速地合成。其中编码方式有多种，如化学编码、物理编码等。物理编码的特点是无“化学污染”，无须多余的化学解码步骤等。因而，我们选择了IRORI编码-解码的分类技术。一次可操作数千个化合物的合成，本实验中我们选择了一次合成600～700个多肽化合物的规模。

2、群集筛选

总的来讲，筛选可分为随机筛选和定向筛选。但无论是随机筛选还是定向筛选，都要考虑：选定筛选模式为固相筛选或者液相筛选，或用何法(细胞功能筛选、受体筛选、抗体筛选等)进行筛选，用何种指示剂(同位素标记、荧光标记、染料染色)等。具体的筛选方法有三种：固相筛选、液相筛选和两者的结合。本发明中使用的ELISA筛选方法属于定向液相筛选，生物反应是抗原-抗体结合实验。人抗SARS-CoV阳性血清中含有人抗SARS-CoV多克隆抗体(包括IgG和IgM)。当包被在96孔反应板中的多肽化合物与人抗SARS-CoV多克隆抗体结合后，经过仔细的洗涤即可洗去未结合多余的、甚至是非特异的结合抗体和血清。此时，加入用辣根过氧化酶标记的抗IgG或者抗IgM抗体就会完成二次结合，并将辣根过氧化酶保留在体系内。该辣根过氧化酶在一定的条件下可以催化水解对应的底物，并可以在特定的波长下测得吸收值。此吸收值的大小与人抗SARS-CoV多克隆抗体结合的强弱和多少相关。

3、确认活性分子结构

编码技术已应用于解析组合库中高活性化合物的结构。最早提出此技术的是Brenner和Lerner，Nicolaou等提出了射频编码合成仪突破了以往的编码形式，它是建立在射频信号及应用多功能微反应仪的半导体记忆装置基础上的。

本发明中使用的射频编码技术可以直接将裂解到96孔板中多肽化合物编码对应孔号。因而，筛选得到的活性孔经过与编码子序号对比即可给出多肽的序列。

具体的，在下面的实施例中分别制备了所述多肽文库，并通过采用抗SARS-CoV阳性血清，筛选所述肽化学库。在所得多肽文库的基础上进一步顺序合成多肽，获得了本发明所述的针对SARS-CoV病毒B-细胞的抗原决定簇谱。

实施例1：多肽的制备步骤

为了合成本发明所述多肽，采用的编码仪器为IRORI Sorting固相合成仪，MicroKan微反应器和Rf射频编码子，制造商：IroriQuantum Microchemistry，9640Towne Centre Drive，San Diego CA92121，USA)

1.加树脂及射频子：选取47个Microkan并分别装入15毫克Rink树脂和射频子并盖紧盖子；

2.合并Microkan，在一个适当的容器中用20％哌啶/DMF脱Fmoc保护基15min×2；

3.洗涤树脂：DMF 3min×6，DCM 3min×3，重蒸DMF3min×3；

4.IRORI射频子编码(或解码)：采用IRORI Sorting程序，按照多肽编码次序将Microkan分配至不同氨基酸反应瓶中；

5.在每一个反应瓶中加入溶解于DMF中计算量的Fmoc-保护氨基酸、HOBt、HBTU，振摇反应3h；

6.合并Microkan并洗涤树脂DMF 3min×3次；

7.重复步骤3～7，直至连接全部氨基酸；

8.合并Microkan，重复3～4步；

9.采用15％Ac₂O/CH₂Cl₂乙酰化多肽的氨基端15min；

10.用CH₂Cl₂3min×3次后，室温晾干；

11.采用IRORI Sorting解码Microkan并分配到对应的15毫升裂解管中；

12.每一个Microkan用1mL在室温下裂解液裂解2h；

13.再用1mL裂解液浸泡洗涤Microkan 5min；

14.合并裂解液和洗涤液；

15.惰性气体流吹干浓缩至残留少量裂解液；

16.加入事先用冰水浴充分冷却的甲基叔丁基醚/石油醚(v/v：3/1)，放入冰水浴中冷却20min；

17.离心沉淀多肽化合物(3000rpm以上)，10min后小心倾去上清夜；

18.再加入冷却的甲基叔丁基醚/石油醚，充分洗涤、离心，倾去上清夜，共两次；

19.将多肽残余物置于室温下，直至完全干燥；

20.将多肽化合物用10％HOAc/H₂O或30％CH₃CN/H₂O或60％CH₃CN/H₂O溶解后，经HPLC-MS检测纯度和正确的分子量。

依照上述步骤，分别合成了如下十肽(SEQ ID NO：1-47)：

SEQ ID NO：1 TSGSDLDRCT

SEQ ID NO：2 SGSDLDRCTT

SEQ ID NO：3 SDLDRCTTFD

SEQ ID NO：4 TTFDDVQAPN

SEQ ID NO：5 FDDVQAPNYT

SEQ ID NO：6 MGTQTHTMI

SEQ ID NO：7 MIFDNAFNCT

SEQ ID NO：8 KSGNFKHLRE

SEQ ID NO：9 GNFKHLREFV

SEQ ID NO：10 KDGFLYVYKG

SEQ ID NO：11 SVLYNSTFFS

SEQ ID NO：12 VRQIAPGQTG

SEQ ID NO：13 TRNIDATSTG

SEQ ID NO：14 RNIDATSTGN

SEQ ID NO：15 WPLNDYGFYT

SEQ ID NO：16 YRVVVLSFEL

SEQ ID NO：17 QCVNFNFNGL

SEQ ID NO：18 CVNFNFNGLT

SEQ ID NO：19 NFNGLTGTGV

SEQ ID NO：20 DVSTAIHADQ

SEQ ID NO：21 IGAEHVDTSY

SEQ ID NO：22 SIAYSNNTIA

SEQ ID NO：23 ITTEVMPVSM

SEQ ID NO：24 YGECLGDINA

SEQ ID NO：25 LTVLPPLLTD

SEQ ID NO：26 TALGKLQDVV

SEQ ID NO：27 NFGAISSVLN

SEQ ID NO：28 AISSVLNDIL

SEQ ID NO：29 RLDKVEAEVQ

SEQ ID NO：30 RLITGRLQSL

SEQ ID NO：31 QLIRAAEIRA

SEQ ID NO：32 SANLAATKMS

SEQ ID NO：33 QSKRVDFCGK

SEQ ID NO：34 VPSQERNFTT

SEQ ID NO：35 WFITQRNFFS

SEQ ID NO：36 SGNCDVVIGI

SEQ ID NO：37 FKNHTSPDVD

SEQ ID NO：38 DVDLGDISGI

SEQ ID NO：39 VDLGDISGIN

SEQ ID NO：40 NASVVNIQKE

SEQ ID NO：41 KEIDRLNEVA

SEQ ID NO：42 LQELGKYEQY

SEQ ID NO：43 VVIGIINNTV

SEQ ID NO：44 MVTILLCCMT

SEQ ID NO：45 VTILLCCMTS

SEQ ID NO：46 MEN441：LPQGTTLPKG和

SEQ ID NO：47 MEN533：EASKKPRQKR。

在上述合成的多肽基础上，通过进一步顺序设计连接，采用同样的编码和解码合成路线和方法，得到如下多肽序列：

S1：NH₂-SGSDLDRCTTFDDVQAPNYT-CONH₂(12～31，20AA，SEQ ID NO：48)

S2：NH₂-SKPMGTQTHTMIFDNAFNCTFEY-CONH₂(141～163，23AA，SEQ ID NO：49)

S3：NH₂-TAFSPAQDTWGTSAAAYFVGYLKPTTF-CONH₂(236～262，27AA，SEQ ID NO：50)

S4：NH₂-GIYQTSNFRVVPSGD-CONH₂(298～312，15AA，SEQID NO：51)

S5：NH₂-RKKISNCVADYSVLYNSTFFSTFKCYG-CONH₂(342～368，27AA，SEQ ID NO：52)

S6：NH₂-VLAWNTRNIDATSTGNYNYKYRYLRH-CONH₂(420～445，26AA，SEQ ID NO：53)

S7：

NH₂-ALNCYWPLNDYGFYTTTGIGYQPYRVVVLSFEL-CONH₂(471～503，33AA，SEQ ID NO：54)

S8：NH₂-CVNFNFNGLTGTGV-CONH₂(524～537，14AA，SEQID NO：55)

S9：NH₂-TDVSTAIHADQLTPAWRIYSTG-CONH₂(604～625，22AA，SEQ ID NO：56)

S10：NH₂-ITTEVMPVSMAKTSVDCNMY-CONH₂(704～723，20AA，SEQ ID NO：57)

S11：NH₂-AQKFNGLTVLPPLLTDD-CONH₂(834～850，17AA，SEQ ID NO：58)

S12：NH₂-VKQLSSNFGAISSVLNDIL-CON₂(945～963，19AA，SEQ ID NO：59)

S13：NH₂-RLDKVEAEVQIDRLITGRLQSL-CONH₂(965～986，22AA，SEQ ID NO：60)

S14：NH₂-SANLAATKMS-CONH₂(1003～1012，10AA，SEQ IDNO：61)

S15：NH₂-REGVFVFNGTSWFITQRNFFSPQIITTD-CONH₂(1073～1100，28AA，SEQ ID NO：62)

S16：NH₂-TSPDVDLGDISGINASVVNIQKEID-CONH₂(1142～1166，25AA，SEQ ID NO：63)

S17：NH₂-EIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQY-CONH₂(1164～1191，28AA，SEQ ID NO：64)

M1：NH2-A W I M L L Q F A Y S N R N R F L Y I I-CONH2(29～48，20AA，SEQ ID NO：65)

N1：NH2-G R N G A R P K Q R-CONH2(32～41，10AA，SEQ IDNO：66)

N2：NH2-S R G N S P A R M A-CONH2(203～212，10AA，SEQID NO：67)

N3：NH2-E A S K K P R Q K R T A T-CONH2(254～266，13AA，SEQ ID NO：68)

N4：NH2-T E P K K D K K K K T D E A Q P L P Q R QKK-CONH2(367～389，23AA，SEQ ID NO：69)

对照多肽

MEN 4e6：LPQGTTLPKG(SEQ ID NO：70)

S1-b10：PSGFNTLKPI(SEQ ID NO：71)

实施例2：ELISA法研究B-细胞抗原决定簇的免疫交叉反应

将实施例1获得的多肽化合物分别与42份抗SARS-CoV抗体阳性血清反应。由于SARS-CoV阳性血清中含有抗SARS-CoV抗体，测定其与多肽抗原的结合，其具体步骤如下：

1、包被：包被液为0.07M NaHCO₃，0.03M Na₂CO₃(pH＝9.6)，包被浓度10μg/mL，100μL/孔，4℃过夜或37℃2小时。

2、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

3、封闭：封闭液为1～3％的BSA，200μL/孔，4℃过夜或37℃2小时。

4、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

5、加入一抗：病人血清用生理盐水1∶100稀释，100μL/孔，37℃孵育2小时。

6、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

7、加入二抗：HRP-兔抗人IgG抗体用PBS1∶1000～1∶3000稀释，100μL/孔，37℃孵育2小时。

8、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

9、加入酶反应底物：酶反应底物为TMB，100μL/孔，37℃孵育15～30分钟。

10、加终止液：2MH₂SO₄，100μL/孔，37℃孵育5～10分钟。

11、读数：在酶标仪中测量450nm和630nm的OD值。

12、中和实验：筛选得到的阳性多肽化合物与抗SARA-CoV阳性血清混合物在37℃孵育30分钟后重复上述ELISA实验步骤。

13、对照及数据处理：每一个多肽样品取三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔，和三个正常对照血清复孔进行对比实验。三个正常对照血清复孔的OD平均值控制在0.1以下。三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔OD值的平均值减去三个正常对照血清复孔的OD平均值即为最终的结果。阳性多肽化合物经过中和实验确认特异性结果。结果如表1和表2所示。

表1合成的十肽与三份抗SARS-CoV抗体阳性血清的交叉免疫反应原性结果

  SEQ  ID肽序列与位置  血清  血清  血清  No：  No.1  No.2  No.3  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  TSGSDLDRCT(11-20)  SGSDLDRCTT(12-21)  SDLDRCTTFD(14-23)  TTFDDVQAPN(20-29)  FDDVQAPNYT(22-31)  PMGTQTHTMI(143-152)  MIFDNAFNCT(151-160)  KSGNFKHLRE(175-184)  GNFKHLREFV(177-186)  KDGFLYVYKG(190-199)  SVLYNSTFFS(353-362)  VRQIAPGQTG(394-403)  TRNIDATSTG(425-434)  RNIDATSTGN(426-435)  WPLNDYGFYT(476-485)  YRVVVLSFEL(494-503)  QCVNFNFNGL(523-532)  CVNFNFNGLT(524-533)  NFNGLTGTGV(528-537)  DVSTAIHADQ(605-614)  IGAEHVDTSY(637-646)  SIAYSNNTIA(686-695)  ITTEVMPVSM(704-713)  -  +  -  +  -  -  +  +  -  -  -  +  -  +  -  ++  +  ++  +  +++  -  +++  +  +++  ++  ++  ++  -  ++  +  ++  +++  -  +++  ++  -  ++  +  ++  +++  ++  +++  ++  +  ++  +++  -  ++  ++  ++  +  -  +  -  -  -  -  +  +  -  -  +  +  ++  ++  +  -  ++  +  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  YGECLGDINA(819-820)  ITVLPPLITD(840-849)  TALGKLQDVV(925-934)  NFGAISSVLN(951-960)  AISSVLNDIL(954-963)  RLDKVEAEVQ(965-974)  RLITGRLQSL(977-986)  QLIRAAEIRA(993-1002)  SANLAATKMS(1003-1112)  QSKRVDFCGK(1018-1027)  VPSQERNFTT(1050-1059)  WFITQRNFFS(1084-1093)  SGNCDVVIGI(1105-1114)  FKNHTSPDVD(1138-1147)  DVDLGDISGI(1145-1154)  VDLGDISGIN(1146-1155)  NASVVNIQKE(1155-1164)  KEIDRLNEVA(1163-1172)  LQELGKYEQY(1182-1191)  VVIGIINNTV(1210-1219)  MVTILLCCMT(1211-1220)  VTILLCCMTS(1212-1221)  MEN441：LPQGTTLPKG  MEN533：EASKKPRQKR - - - - + ++ - - - + + - - - ++ ++ - + + - - +++ +++  -  -  +  -  +  +++  -  +  -  -  ++  ++  +  ++  ++  +++  +++  +  +  ++  ++  +++  +++  +  -  -  ++  +  ++  -  -  -  ++  -  +  -  +  +  +  +  -  -  ++  -  +++  +++

表2.新设计并合成的多肽以及它们与12份抗SARS-CoV人阳性血清的交叉免疫反应性^*

  肽  Ser  1  Ser  2  Ser  3  Ser  4  Ser5  Ser  6  Ser  7  Ser  8  Ser9  Ser1  0  Ser1  1  Ser1  2  S-1  S-2  S-3  S-4  S-5  S-6  S-7  S-8  S-9  S-10  S-11  S-12  S-13  S-14  S-15  S-16  S-17  M-1  N-1  N-2  N-3  N-4   MEN  4e6  +  +-   +-    +++   ++  +-  +       ++   +-  +-  +-  +-   +++  +-  +   +-   +-  +++  +-  +   ++   +   +-  +  ++  +-  +  +   +-   ++  +-    +-   +-  +++   +   ++    +-   +-  ++  +-  +  +-  +-  +++   +  +-      +-  +++   ++   +    +-   +  +  +-  +-  +-  +  +   +  +-      +-  +++   ++   +      +-  ++      +++  +  +-  +-     +-  +++   +++         +   +-  +-  +-  ++   +  +      +  +++   ++  +-  +      +-  ++   +-  +  +  ++   +++   +-     +  +++   +        +  ++   +-  +-  +  ++   +  +  +-   +-   +  +++   +   +    +-   +-  ++    +-  +  +++  +  +++  +-  +     ++  +++  ++  +++      +  +  +-  +++   +  ++  +  +++   +  +  +     +  +++   +  +  +  +-  +-    +-  ++   +-  +-  +  +   +     +-   +  +++   +-   +-       +   +-  +-  +-  S1b1  0  +-  +-  +-  +-  +-  +-  +-

^*阴性对照：OD吸收约为0.2.+-，+，++，+++，和++++，代表OD吸收范围分别在0.25～0.35，0.4～0.7，0.7～1.0，1.0～2.0，和＞2.0。MEN4e6和S1-b10是事先鉴别为阳性的对照。

其中S7S9S17N4和MEN4e6分别在与30份抗SARS-CoV人阳性血清进行交叉免疫反应，结果为：S7和S9都与30血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，交叉反应率均为71.4％；S17与28血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，交叉反应率为66.7％；N4与38血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，交叉反应率为90.5％；MEN4e6与32血清抗SARS-CoV抗体阳性血清呈阳性反应，交叉反应率为76.2％。

实施例3：ELISA法确定B-细胞抗原决定簇的竞争性实验

将实施例2之表2中获得的多肽化合物库与SARS-CoV阳性血清反应，由于SARS-CoV阳性血清中抗SARS-CoV抗体被合成多肽完全或部分中和，因而血清中抗SARS-CoV抗体则与检测试剂盒中的标准抗原(这里是SARS-CoV病毒裂解液，华大Gibio的诊断性ELISA试剂盒)的结合减弱或完全不结合，其具体步骤如下：

以过量的多肽(或多肽混合物)为抗原加入SARS病人抗血清的稀释液(1∶100)，终体积为100μl，于37℃共孵育60min。肽的终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0和40.0μmol/L。两个多肽----Contrl1和Contrl2作为阴性对照，Contrl1是通过随机得出；Contrl2是S蛋白的含第945～963个氨基酸残基的多肽，实验证明无抗原性。

1、包被：包被液为0.07M NaHCO₃，0.03M Na₂CO₃(pH＝9.6)，包被浓度10μg/mL(SARS-CoV病毒裂解液)，100μL/孔，4℃过夜或37℃2小时。

2、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

3、封闭：封闭液为1～3％的BSA，200μL/孔，4℃过夜或37℃2小时。

4、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

5、加入一抗：病人多肽中和血清，100μL/孔，37℃孵育2小时。

6、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

7、加入二抗：HRP-兔抗人IgG抗体用PBS1∶1000～1∶3000稀释，100μL/孔，37℃孵育2小时。

8、清洗：PBST(pH＝7.4，含0.05％的Tween 20)清洗5遍，拍干。

9、加入酶反应底物：酶反应底物为TMB，100μL/孔，37℃孵育15～30分钟。

10、加终止液：2MH₂SO₄，100μL/孔，37℃孵育5～10分钟。

11、读数：在酶标仪中测量450nm和630nm的OD值。

12、中和实验：筛选得到的阳性多肽化合物与抗SARA-CoV阳性血清混合物在37℃孵育30分钟后重复上述ELISA实验步骤。

13、对照及数据处理：每一个多肽样品取三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔，和三个正常对照血清复孔进行对比实验。三个正常对照血清复孔的OD平均值控制在0.1以下。三个抗SARA-CoV阳性血清反应复孔OD值的平均值减去三个正常对照血清复孔的OD平均值即为最终的结果。阳性多肽化合物经过中和实验确认特异性结果。结果如图1所示。

                       序列表

<110>中国医学科学院医药生物研究所

<120>具有广泛交叉免疫反应性的冠状病毒(SARS-CoV)B-细胞抗原决定簇

<130>IDC040057

<160>71

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>1

Thr Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>2

Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr

1               5                   10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>3

Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp

1               5                   10

<210>4

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>4

Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn

l               5                   10

<210>5

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>5

Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr

1               5                   10

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>corona virus

<400>6

Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile

1               5

<210>7

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>7

Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr

1               5                   10

<210>8

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>8

Lys Ser Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu

1               5                   10

<210>9

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>9

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val

1               5                   10

<210>10

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>10

Lys Asp Gly Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly

1               5                   10

<210>11

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>11

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser

1               5                   10

<210>12

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>12

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

1               5                   10

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>13

Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly

1               5                   10

<210>14

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>14

Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn

1               5                   10

<210>15

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>15

Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr

1               5                   10

<210>16

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>16

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

1               5                   10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>17

Gln Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu

1               5                   10

<210>18

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>18

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr

1               5                   10

<210>19

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>19

Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

1               5                   10

<210>20

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>20

Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln

1               5                   10

<210>21

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>21

Ile Gly Ala Glu His Val Asp Thr Ser Tyr

1               5                   10

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>22

Ser Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala

1               5                   10

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>23

Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met

1               5                   10

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>24

Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala

1               5                   10

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>25

Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp

1               5                   10

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>26

Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val

1               5                   10

<210>27

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>27

Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn

1               5                   10

<210>28

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>28

A1a Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu

1               5                   10

<210>29

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>29

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

1               5                   10

<210>30

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>30

Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu

1               5                   10

<210>31

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>31

Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala

1               5                   10

<210>32

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>32

Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1               5                   10

<210>33

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>33

Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys

1               5                   10

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>34

Val Pro Ser Gln Glu Arg Asn Phe Thr Thr

1               5                   10

<210>35

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>35

Trp Phe Ile Thr Gln Arg Asn Phe Phe Ser

1               5                   10

<210>36

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>36

Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile

1               5                   10

<210>37

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>37

Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp

1               5                   10

<210>38

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>38

Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile

1               5                   10

<210>39

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>39

Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1               5                   10

<210>40

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>40

Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu

1               5                   10

<210>41

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>41

Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

1               5                   10

<210>42

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>42

Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr

1               5                   10

<210>43

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>43

Val Val Ile Gly Ile Ile Asn Asn Thr Val

1               5                   10

<210>44

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>44

Met Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr

1               5                   10

<210>45

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>45

Val Thr Ile Leu Leu Cys Cys Met Thr Ser

1               5                   10

<210>46

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>46

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly

1               5                   10

<210>47

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>47

Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg

1               5                   10

<210>48

<211>20

<212>PRT

<213>corona virus

<400>48

Ser Gly Ser Asp Leu Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala

1               5                   10                  15

Pro Asn Tyr Thr

            20

<210>49

<211>23

<212>PRT

<213>corona virus

<400>49

Ser Lys Pro Met Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala

1               5                   10                  15

Phe Asn Cys Thr Phe Glu Tyr

            20

<210>50

<211>27

<212>PRT

<213>corona virus

<400>50

Thr Ala Phe Ser Pro Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

Tyr Phe Val Gly Tyr Leu Lys Pro Thr Thr Phe

            20                  25

<210>51

<211>15

<212>PRT

<213>corona virus

<400>51

Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp

1               5                   10                  15

<210>52

<211>27

<212>PRT

<213>corona virus

<400>52

Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn

1               5                  10                   15

Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

            20                  25

<210>53

<211>26

<212>PRT

<213>corona virus

<400>53

Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr Gly Asn

1               5                   10                  15

Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His

            20                  25

<210>54

<211>33

<212>PRT

<213>corona virus

<400>54

Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr

1               5                   10                  15

Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu

            20                  25                  30

Leu

<210>55

<211>14

<212>PRT

<213>corona virus

<400>55

Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val

1               5                   10

<210>56

<211>22

<212>PRT

<213>corona virus

<400>56

Thr Asp Val Ser Thr Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp

1               5                   10                  15

Arg Ile Tyr Ser Thr Gly

            20

<210>57

<211>20

<212>PRT

<213>corona virus

<400>57

Ile Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp

1               5                   10                  15

Cys Asn Met Tyr

            20

<210>58

<211>17

<212>PRT

<213>corona virus

<400>58

Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp

1               5                   10                  15

Asp

<210>59

<211>19

<212>PRT

<213>corona virus

<400>59

Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn

1               5                   10                  15

Asp Ile Leu

<210>60

<211>22

<212>PRT

<213>corona virus

<400>60

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr

1               5                   10                  15

Gly Arg Leu Gln Ser Leu

            20

<210>61

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>61

Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser

1               5                   10

<210>62

<211>28

<212>PRT

<213>corona virus

<400>62

Arg Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gln

1               5                   10                  15

Arg Asn Phe Phe Ser Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp

            20                  25

<210>63

<211>25

<212>PRT

<213>corona virus

<400>63

Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser

1               5                   10                  15

Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp

            20                  25

<210>64

<211>28

<212>PRT

<213>corona virus

<400>64

Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu

1               5                   10                  15

Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr

            20                  25

<210>65

<211>20

<212>PRT

<213>corona virus

<400>65

Ala Trp Ile Met Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ser Asn Arg Asn Arg Phe

1               5                   10                  15

Leu Tyr Ile Ile

            20

<210>66

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>66

Gly Arg Asn Gly Ala Arg Pro Lys Gln Arg

1               5                   10

<210>67

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>67

Ser Arg Gly Asn Ser Pro Ala Arg Met Ala

1               5                   10

<210>68

<211>13

<212>PRT

<213>corona virus

<400>68

Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr

1               5                   10

<210>69

<211>23

<212>PRT

<213>corona virus

<400>69

Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Thr Asp Glu Ala Gln Pro

1               5                   10                  15

Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys

            20

<210>70

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>70

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly

1               5                   10

<210>71

<211>10

<212>PRT

<213>corona virus

<400>71

Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile

1               5                   10