重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子外用液体制剂

摘要

本发明公开了一种稳定的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子外用液体制剂，含有1－10000微克/毫升的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，保持pH4.0－10.0范围的缓冲体系、保护剂、防腐剂、透皮吸收促进剂。可用于制备治疗皮肤烧伤、烫伤、溃疡等创面疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定的药用生物制品，是一种外用治疗溃疡、烫伤、烧伤等皮肤和粘膜创面疾病的外用液体制剂。

背景技术

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子是一种现代生物技术产品，简称GM-CSF，它是一种非糖基化的水溶性蛋白质，由127个氨基酸组成，具有促进骨髓粒系造血的恢复，升高外周血白细胞的作用。现已广泛用于白血病及肿瘤病人大剂量放化疗，严重白细胞减少疾病的治疗。由于GM-CSF还具有诱导炎症细胞浸润，刺激肉芽组织增生，促进组织重建，促进巨噬细胞吞噬，促进修复细胞的增殖分化等作用。所以近年来广泛将其应用于临床外用，主要采用含漱、用棉球擦拭，局部注射等途径。

GM-CSF原液在室温条件保存，随着时间的延长，其活性会逐渐降低。为了保持GM-CSF原液的生物活性，目前药用的GM-CSF制剂成品均制成冻干粉针剂型，达到了延长其生物活性的目的，保证药品稳定、安全、有效。但是冻干粉针在临床外用时，需要将其稀释后，再用棉球蘸湿在患处涂抹擦拭，使用时带来了很多的不方便。

发明内容

本发明是针对重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子冻干剂型在医疗外用存在着使用不方便的问题，研究开发的稳定外用液体制剂，达到使用方便、降低成本、保证疗效的目的。

本发明公开的GM-CSF外用液体制剂含有如下组分：

a)1-10000微克蛋白/毫升的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；

b)保持pH4.0-10.0范围的缓冲体系；

c)保护剂、防腐剂、透皮吸收促进剂。

制剂配方中缓冲体系可以是磷酸缓冲体系、醋酸缓冲体系、枸橼酸缓冲体系、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲体系、三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲体系，优选的缓冲体系为磷酸缓冲体系，pH为6.0-7.0；

制剂配方中保护剂可以是海藻糖、甘露醇、明胶、人血白蛋白、右旋糖苷、羟乙基淀粉-40，优选的保护剂为羟乙基淀粉-40，其浓度范围为1-1000mg/毫升，mg/毫升指保护剂的重量与制剂总体积之比；

制剂配方中防腐剂可以是苯甲酸、聚乙烯吡络烷酮、乙醇、乙二胺四乙酸二钠等，优选的防腐剂为乙二胺四乙酸二钠，其浓度范围为1-1000mg/毫升，mg/毫升指防腐剂的重量与制剂总体积之比；

制剂配方中透皮吸收促进剂可以是吐温-80、丙二醇、氮酮、十二烷基硫酸钠、苄泽等，优选的透皮吸收促进剂为吐温-80，其浓度范围为0.01％-10％(是体积百分比)。

本发明具有作用机理清楚，使用剂量小、疗效好、携带使用方便、质量稳定可控，能够形成规模化生产的特点。同时也将重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子制成为稳定的外用液体制剂，开发了此品种新的剂型。本发明所述的外用液体制剂包括但不限于喷雾剂、滴鼻剂、滴眼剂和擦剂。

具体实施方式

以下通过实施例、实验例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。

原、辅料来源见表1，其他未言明的，均为市售。

                      表1

  名称  级别  来源  羟乙基淀粉-40  药用  牡丹江温春双鹤制药有限公司  乙二氨四乙酸二钠  AR  中国医药上海化学试剂公司  吐温-80  药用  天津市瑞金特化学品有限公司  十二水合磷酸氢二钠  药用  哈尔滨市化学试剂厂  二水合磷酸二氢钠  药用  北京市红星化工厂  聚乙烯吡络烷酮  药用  上海市山浦化工有限公司  甘露醇  药用  锦州九泰药业有限公司  苄泽  药用  Sigma公司  人血白蛋白  药用  绿十字中国生物制品有限公司  海藻糖  药用  上海市山浦化工有限公司  柠檬酸  药用  天津市凯通化学试剂有限公司  柠檬酸三钠  药用  天津市凯通化学试剂有限公司  丙二醇  药用  哈尔滨市金丽化工试剂有限公司  十二烷基硫酸钠  药用  天津市石英钟厂霸州市化工分厂  右旋糖苷  药用  中国试剂上海化学试剂公司  碳酸钠  药用  广东汕头市西陇化工厂  碳酸氢钠  药用  广东汕头市西陇化工厂  氮酮  药用  山西省宏伟化学试剂有限公司  苯甲酸  药用  天津市凯通化学试剂有限公司  GM-CSF原液  药用  华北制药金坦生物技术股份有限公司  纯化水  药用  华北制药金坦生物技术股份有限公司

实施例 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子外用液体制剂的制备

实施例1：

配制10毫升pH为6.0的醋酸缓冲液，加入苯甲酸0.02克，苄泽为0.02克，加入海藻糖为1克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例2：

配制10毫升pH为6.5的枸橼酸盐缓冲液，加入聚乙烯吡络烷酮0.02克，丙二醇为0.01毫升，加入甘露醇为1克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例3：

配制10毫升pH为7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)盐缓冲液，加入乙醇0.02毫升，十二烷基硫酸钠为0.01克，加入右旋糖苷为1克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例4：

配制10毫升pH为7.5的碳酸钠-碳酸氢钠盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.02克，氮酮为0.01毫升，加入人血白蛋白为0.2毫升，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例5：

配制10毫升pH为6.4的磷酸盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.02克，吐温80为0.002毫升，加入羟乙基淀粉-40为2克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例6：

配制10毫升pH为6.4的磷酸盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.01克，吐温80为0.01毫升，加入羟乙基淀粉-40为1克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白800微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，制备成GM-CSF喷雾剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例7：

配制10毫升pH为6.4的磷酸盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.1克，吐温80为0.02毫升，加入羟乙基淀粉-40为5克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的喷雾剂瓶中，然后将喷雾剂泵头装于瓶上，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的活性。

实施例8：

配制10毫升pH为7.0的磷酸盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.05克，吐温80为0.05毫升，加入羟乙基淀粉-40为4克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的PVC塑料瓶中，然后将瓶盖装于瓶上，制备成GM-CSF擦剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例9：

配制10毫升pH为7.0的磷酸盐缓冲液，加入羟乙基淀粉-40为4克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的滴眼剂瓶中，然后将滴眼剂瓶头装于瓶上，制备成rhGM-CSF滴眼剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实施例10：

配制10毫升pH为6.5的磷酸盐缓冲液，加入乙二胺四乙酸二钠0.05克，吐温80为0.05毫升，加入羟乙基淀粉-40为8克，加入重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子蛋白200微克，加入后经过无菌过滤处理，将溶液分装于10毫升规格的滴鼻剂瓶中，然后将滴鼻剂瓶头装于瓶上，制备成GM-CSF滴鼻剂，测定其溶液中重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物活性。

实验例 重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子外用制剂的稳定性实验，实施例1-10

含量检测方法根据《中国生物制品规程2000年》附录  重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子生物学活性测定法(TF-1细胞/MTT比色法)稳定性试验数据见表2

表2(单位：1×10⁴IU/ml考察试验：25℃)

  考察  日期  实施  例1  实施  例2  实施  例3  实施例  4  实施例  5  实施例  6  实施例  7  实施例  8  实施  例9  实施例  10  0周  22.4  21.8  22.8  22.4  21.8  81.6  22.8  21.1  20.3  20.8  1周  22.4  21.8  22.8  22.4  21.8  81.6  22.8  21.1  20.3  20.8  2周  22.3  21.7  22.9  22.3  21.8  81.5  22.8  21.1  20.3  20.7  3周  22.3  21.8  22.7  22.4  21.7  81.5  22.7  21.0  20.2  20.8  1个月  21.9  21.4  22.7  22.3  21.6  81.3  22.7  21.0  20.2  20.7  2个月  21.7  21.3  22.6  22.1  21.6  81.2  22.6  20.9  20.1  20.8  4个月  21.6  21.1  22.4  22.0  21.4  81.3  22.4  20.7  20.0  20.6  8个月  21.3  21.1  21.9  21.9  21.2  81.3  22.3  20.5  19.9  20.5  12个月  21.2  20.9  21.7  21.7  21.0  81.1  22.2  20.3  19.7  20.4  18个月  20.8  20.6  21.2  21.5  20.9  81.1  21.9  20.1  19.3  20.0  24个月  20.4  20.1  20.9  21.1  20.5  80.5  21.8  19.8  19.1  19.8

由以上结果可知，本发明公开的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子外用制剂有很好的稳定性。