具有药物控释功能生物活性的植入体、其控释方法和制备方法

摘要

本发明涉及一种载有或含有纳米级磁体载药复合物的具有药物控释功能生物活性的植入体、通过该植入体控释药物的方法，及该具有药物控释功能生物活性的植入体的制备方法。所述载有或含有纳米级磁体载药复合物的植入体，在振荡磁场作用下，植入体中的磁性微粒通过自体的运动和/或带动周围物质运动，促进植入体内载药复合物内部、表面和(或)周围药物的释放或扩散，从而达到促进或部分控制植入体内药物释放的目的。振荡磁场可利用纳米级磁体载药微粒的磁性或超顺磁性能，使其具有局部初步靶向、部分控释药物释放的性能。本发明药物控释过程中具有无创、操作简便、安全、可重复使用等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及磁场领域、生物药物制剂及靶向药物控释系统领域。具体涉及到药物智能传递系统中脉冲释药系统，用振荡磁场或静磁场中叠加的另一个脉冲磁场。实施对药物释放信号的空间及时间控制。

背景技术

对于大多数药物传递系统而言，多数聚合物的释药为扩散释放，因此药物释放受多种因素影响而较难控制。药物智能传递系统中脉冲释药系统为解决这类问题提供了科研方向，即通过环境影响如：温度、光、超声波、微波和磁场等物理与pH、葡萄糖等化学刺激信号使材料的结构与功能发生变化，实施对药物释放信号的空间及时间控制。

如：美国专利：U S Patent 5,019,372 1991年所述，利用乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(EVAc)将牛血清与钐钴(SmCo)永磁体包埋，在体外施加振荡磁场，能将牛血清释放速率提高5-10倍。但这类磁性植入式缓释制剂中永磁体的代谢存在一定的问题。另外一种是美国加州大学伯克力分校正在开发的基于渗透压泵驱动的药物释放系统。这两类药物释放系统虽然工作原理各不相同，但是却有一个共同的不足，就是在所装填的药物释放完毕之后，必须通过手术将所植入的药物释放系统取出。这样就增加了使用成本，又给临床使用增加困难，特别是给病人带来更多的不便和痛苦。

随着近年来纳米粒子研究的发展，磁性材料也进入了纳米粒子的研究应用阶段。如中国专利CN 1290721 A、CN 1302831 A、CN 1345885 A和CN 1515629A所公开的技术，可见超微磁性粒子制备技术已日趋成熟。特别是由纳米Fe3O4制备的超顺磁性微粒，具有强的磁响应性，在无外加磁场时磁性可以很快消失，纳米Fe3O4能够最终排出体外，是理想的医用磁性微粒。

发明内容

本发明的目的是提供一种载有或含有纳米级磁体载药复合物的具有药物控释功能生物活性的植入体、一种通过植入体控释药物的方法，及具有药物控释功能生物活性的植入体的制备方法。

为实现上述目的之一，本发明采用的技术方案是：所述植入体载有或含有纳米级磁体载药复合物。所述含有纳米级磁性载药复合物与植入体复合的方式为注入、填入、嵌入、吸附或沉积。所述纳米级磁体载药复合物中的纳米级磁体为具有磁性的物质，是Fe₃O₄、Fe₂O₃、Co₂O₃、NiO中的至少一种，按重量百分比占有1％-99％；其纳米级磁性微粒与药物及包裹材料之间的结合可以通过吸附、混合、嵌入、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附的方式；或/和通过配位、键合的生物性结合方式而形成的复合物；此复合物可以是通过各种方法制备而成的微球、微囊、微泡、或混合而成的固体、半固体。

上述纳米级磁体微粒的粒径小于100nm；较佳的粒径范围是1nm-30nm；最好的粒径范围是1nm-16nm。

所述含有纳米级磁性载药复合物中的药物，是指生物活性制剂，包括三大类：1)靶向制剂：包括抗体及其片断，如疫苗、细胞因子、抗体、受体、配体；2)各类药物，如消炎痛、灭滴灵、链霉素、阿克拉霉素、红霉素，以及阿霉素、表阿霉素、甲氨喋吟、顺铂、阿糖胞苷各种抗肿瘤药物和各类基因物质，如：hVEGF、hBMP及其与病毒或非病毒载体的复合物；3)其他活性功能制剂，如干细胞、工程细胞、转基因细胞。

为实现上述目的之二采用的技术方案是：将载有或含有纳米级磁体载药复合物的植入体置于振荡磁场中，在振荡磁场作用下，植入体中的纳米级磁性微粒通过自体的运动和/或带动周围药物运动，促进植入体载有或含有的具有生物活性的药物向周围释放、扩散或/和定向聚集。

上述振荡磁场可以是由各种永磁体与机械设备组合而产生、或由交流电或直流电通过电子线路设计而产生振荡磁场及在一个静磁场中叠加的另一个脉冲磁场。所述振荡磁场是指由各种方法形成的振荡磁场强度范围在100-10,000gauss，频率范围从1Hz-1000Hz；较好的振荡磁场强度及频率范围分别是300-2000gauss；10Hz-200Hz；振荡磁场作用时间范围为1秒-24小时；较好的振荡磁场作用时间范围为10分钟-6小时

为实现本发明目的之三而采用的技术方案是：所述的具有药物控释功能生物活性的植入体的制备方法包括的步骤如下：

(1).植入体的制备：植入体采用可生物降解的天然的和人工的聚合物；天然类可生物降解的聚合物包括：葡聚糖、聚乙烯亚胺、壳聚糖及其衍生物；硫酸软骨素、透明质酸、壳聚糖、甲壳素、海藻酸钠、淀粉、纤维素、白蛋白、胶原蛋白、明胶、酪蛋白、蚕丝蛋白以及它们中的一种或两种以上的混合体及卵磷脂、脑磷脂、胆固醇；或人工合成聚合物是聚乙二醇、聚乳酸、聚乙烯醇、聚乙醇酸中一种或其两种以上的混合物、共聚物和同聚物；或为人或动物植入体为人或动物的非活体组织、骨骼制备的植入体；或生物可降解或不降解的骨粉、骨水泥及其混合物制成的植入体；所述植入体的形状为中空的带孔隙或不带孔隙的圆形、柱形、条形、方形或各种不规则立体结构，也可以为中空的带孔隙或不带孔隙的螺钉、螺拴样植入体。

(2)、植入体纳米级磁体载药复合物的制备：纳米级磁体为采用Fe₃O₄、Fe₂O₃、Co₂O₃、NiO中的至少一种，与药物及包裹材料之间按重量百分比为1％-99％；其纳米级磁性微粒与药物及包裹材料之间的结合可以通过吸附、混合、嵌入、填入、包覆、包埋、相嵌、粘附的方式；或/和通过配位、键合的生物性结合方式而形成的复合物；此复合物可以是通过各种方法制备而成的微球、微囊、微泡、或混合而成的固体、半固体。

(3)、植入体与纳米级磁体载药复合物的结合：当植入体具有空隙或中空结构时，中空处为含有纳米级磁性载药复合物与植入体复合的场所，此复合物与植入体复合的方法为注入、填入、嵌入、吸附或沉积的方法；或/和载植入体的表面附着纳米级磁体载药复合物。

本发明利用振荡磁场提供磁场及动能，使纳米磁性复合微粒中磁性微粒磁化并随振荡磁场的振动而运动，其促进磁性复合微粒中药物释放的可能机制有1.磁性微粒的机械振动使其与周围的介质之间产生间隙形成通道，从而使微粒中的药物能够顺浓度梯度从间隙向外扩散，当磁性微粒振动停止时，周围的介质的弹性回缩使间隙通道关闭或减小，又使药物扩散回复到原来的状况。2.振荡磁场使磁性微粒带动整个磁性复合微粒振动，起到局部机械搅拌的作用从而加快药物的扩散。3.磁性微粒的机械振动使局部温度生高，也可能促进磁性复合微粒中药物的扩散。

很显然，当所述含有纳米级磁体载药复合物的有生物活性的植入体，在振荡磁场作用下，植入体中的磁性微粒通过自体的运动和/或带动周围物质运动，促进植入体内载药复合物内部、表面和/或周围药物的释放或扩散，从而使此植入体具有局部初步靶向、药物控释的功能。一方面因生物活性材料的不断降解、破碎，使包藏的磁性复合药物逐步得以释放，特别是在振荡磁场作用下，可以实现药物释放的空间及时间控制。另一方面该系统在药物释放完以后其骨架材料也将逐步在体内酶的作用下降解成单体小分子，被机体所吸收。不需再经手术取出，从而可以减轻用药者的痛苦和麻烦，这些正是本发明重要的优点。

附图说明

本发明的上述内容及其效果可以通过附图进一步说明。

图1载有或含有磁性载药复合物的植入体样品示意图；

图2振荡磁场发生装置实施例的样品示意图；

图3磁性Fe₃O₄壳聚糖纳米粒透射电镜照片(×100 000)；

图4磁性Fe₃O₄壳聚糖纳米粒透射电镜照片(×80 000)；

图5磁性链霉素PELA微球(磁场下呈串珠状)光镜图(×400倍)；

图6链霉素PELA微球粒径分布图；

图7磁性链霉素PELA微球粒径分布图；

图8链霉素药物溶出累计浓度与时间关系图；

图9链霉素每日药物溶出浓度与时间关系图；

图8，9中：系列1：磁性链霉素PELA微球，每天用磁场；系列2：磁性链霉素PELA微球，21天后用磁场；系列3：链霉素PELA微球。

图10超顺磁性明胶微球质粒溶出浓度与时间关系图；

图11质粒溶出浓度与磁场强度关系图；

图12质粒溶出浓度与磁场作用时间关系图；

图13质粒转染后第四天荧光显微镜图。

具体实施方式

本发明的实现和技术效果可以通过以下实施例进一步说明。

首先，制作一种能产生振荡磁场的机械或机电装置，使其产生一定磁场强度和频率的振荡磁场。其次，制备具有超顺磁性的载药复合物，再将磁性复合物包裹于支架材料中或置于中空的支架内制备成植入体。将此载药后的植入体置于一定药物溶出介质(液体、组织等)中，局部施加振荡磁场，促使磁性复合微粒加快药物的释放，即可在体外模拟观察植入体药物释放现象。

具体的实施放案如下：

将78-1型磁力加热搅拌器(上海精科实验有限公司)进行改进，主要是将旋转条上的磁铁按需要改变为各种不同磁场强度的磁体，旋转条转动时即可形成不同磁场强度的振荡磁场。(见图2)

实例一：振荡磁场对含超顺磁性链霉素PELA微球血凝块体外药物释放的促进作用

1.超顺磁性壳聚糖纳米球的制备

以化学共沉淀法制备超顺纳米磁性壳聚糖纳米粒：将硫酸亚铁铵与硫酸铁铵混合物57.40g[Fe²⁺/Fe³⁺(mol)＝1.2]，溶于含2％SC(w/v)的乙酸溶液中(pH，5.5)配制成A液，移入带搅拌的500mL三颈烧瓶中；配制6mol/L NaOH成B液；在氮气保护下，快速搅拌中加热A液至55℃。快速滴入B液，维持反应10min；降低搅拌速度，加热A液至85℃，维持反应90min；加适量戊二醛，维持反应30min。蒸溜水洗涤除去SO₄^2-、Cl^-等离子后，得黑色胶状沉淀，真空干燥，得干粉产物。室温保存。其外形用透射电子显微镜观测。(见图3、4)

2超顺磁性链霉素PELA微球的制备

用双乳化(W/O/W)溶剂蒸发法制备超顺磁性链霉素PELA微球：将适量PELA溶入二氯甲烷+乙酸乙酯混合液中成油相；将5％硫酸链霉素2.5mL与5mL超顺磁性壳聚糖纳米球混悬液(约350mg)旋涡混合成内水相；将适量pluronicF-68加入30mL 2％PVA水溶液中(w/v)成外水相。将内水相加入油相超声乳化10min(功率100W)得W/O初乳；再将初乳注入外水相中，置均质机下均质5-10s(10000转/分)，得复乳。搅拌挥发12小时祛除有机溶剂，蒸溜水洗涤，离心(3000转/分)倒出上清液，(所有洗涤液均收集用于测定其中链霉素含量)即得超顺磁性链霉素PELA微球湿粉。冻干得干粉，-4℃保存。

其磁性由磁天平检测：用磁天平测定纳米壳聚糖Fe₃O₄及磁性链霉素PELA微球增重现象(环境温度：28℃)：磁场强度为10mT；50mT；150mT的磁场时，纳米壳聚糖Fe₃O₄溶液(磁流体比重：0.0539g/mL)增重分别为：0.0193g；0.02632g；0.0581g。磁性链霉素PELA微球增重分别为：0.0112g；0.01094g；0.2787g。磁场强度从600mT逐次下调至0mT时，两种材料在十秒钟内增重下降至零。这表明两种材料有较强磁感应强度，且具有超顺磁性质^[5]。光镜下可见磁性链霉素PELA微球沿磁力线呈串珠样排列(图5)。

其粒径由激光衍射粒度分析仪测定。平均粒径分别为链霉素PELA微球：Φ＝1.745μm，超顺磁性链霉素PELA微球粒径：Φ＝1.585μm。(见图6、7)

作为对照用的链霉素PELA微球亦参照此法制备，仅内水相中不加纳米超顺磁性壳聚糖。

3.微球体外溶出度实验

按《中国药典》溶出度测定第一法(转篮法)，用ZRS-6型智能溶出试验仪行体外溶出度实验。以三种方式观测药物溶出情况：A组，超顺磁性链霉素PELA微球+振荡磁场；B组，超顺磁性链霉素PELA微球+第21天加用振荡磁场；C组，链霉素PELA微球。每组观测两份样品，每份样品0.050g，与新抽的兔血2mL混合形成血凝块后，分别装入转篮中，各置于1000mL溶出液中。

振荡磁场干预方法：振荡磁场磁感应磁场强度为500mT(毫特斯拉)，转速为50-80转/分。振荡磁场干扰时间点为：A组，按每次取样前2小时，每次振荡磁场作用时间为1小时。B组，第21天，用振荡磁场干扰，每次干扰方式同A组。C组，不用振荡磁场干扰，作空白对照。

溶出液采用Ringer’s人工模拟体液，配方：NaCl 8.5g；KCl 0.2g；CaCl0.2g；NaHCO3 0.2g；加水至1000mL。设置温度(37土1)℃，转篮速度100转/分。第一次于溶出试验开始后12h；以后每隔24h采样，至26天结束。取样时用0.4μm滤膜过滤并补加模拟体液，以维持溶出液体积不变。每个时间点取样三次，样品药物浓度用ELISA法测定[链霉素(Streptomycin)试剂盒(北京望尔生物技术有限公司)]。据标准吸光度曲线计算不同时间微囊释放链霉素的量，计算累计释放量，绘制体外释放曲线。(图8，图9)

微球体外溶出度实验显示：振荡磁场能够增加超顺磁壳聚糖PELA微球中链霉素释放速率，振荡磁场每日能够使药物释放速率提高2-4倍。

实例二：振荡磁场对含超顺磁性壳聚糖hVEGF质粒明胶微球支架的体外药物释放

1.超顺磁性壳聚糖纳米球的制备

以化学共沉淀法制备超顺纳米磁性壳聚糖纳米粒：同实例一。(略)

2.人VEGF₁₆₅-红色荧光融合蛋白真核表达质粒(pDsVEGF₁₆₅Red1-N1)由中日友好医院邹海波博士赠。

3.超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1明胶微球的制备

用交联固化法制备超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球：

1.分别将超顺磁性壳聚糖(壳聚糖含量约800mg)5ml(醋酸缓冲液配制pH5.5)，加热至55℃，将20％(w/v)浓缩质粒(pDsVEGF₁₆₅Red1-N1)8ml加热至55℃，旋涡混和20s，复合1小时，成A液。

2.将5g明胶加入12ml去离子水中，加热至50℃成溶液，得B液。

3.将A液与B液混合后倒入三颈烧瓶中，300转/分钟，搅拌20分钟成复合液。

4.将液体石蜡油加热至50℃，用均质机10000转/分钟搅拌下，加入上述复合溶液，显微镜观察到成微球后。加入冰水，将体系温度降至4℃。

5.将上一步所得的微球和石蜡油移至三颈烧瓶中，持续搅拌(100转/分钟)，用冰水维持体系温度至4℃。

6.依次加入适量37％甲醛及异丙醇，维持搅拌1小时。

7.用乙醚、去离子水洗涤5-8次，离心收集微球，冻干，-4℃保存。

8.非磁性的壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球的制备与上述方法相同，仅第一步用壳聚糖替代超顺磁性壳聚糖。

磁性由磁天平检测；磁场强度为50mT(环境温度：37℃)时，超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球增重为：0.02935g。

粒径由激光衍射粒度分析仪测定。超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球平均粒径：Φ＝1.468μm。

4.超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架体外溶出度实验将等重量的上述明胶微球填入中空带侧孔的生物活性支架中。

1.在衡温水浴振荡器中观察微球体外溶出情况。

以三种方式观测药物溶出情况：A组，超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架+振荡磁场；B组，超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架；C组，壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架。每组观测两份样品，每份样品0.200g，放入25ml三角烧瓶中，加20ml磷酸缓冲液(PBS液)后，三角烧瓶置于衡温水浴振荡器中，水浴温度37℃，振荡频率100次/分钟。

2.振荡磁场干预方法：

振荡磁场磁感应磁场强度为50mT(毫特斯拉)，转速为50-80转/分。振荡磁场干扰时间点为：A组，按每次取样前1小时，每次振荡磁场作用时间为1小时。B组，第8天，用振荡磁场干扰，每次干扰方式同A组。C组，不用振荡磁场干扰，作空白对照。

每次采样1ml，离心后取上清0.5ml，剩余样品用PBS液补足至1ml后，还回三角烧瓶中，以维持溶出液体积不变。每个时间点取样三次，样品药物浓度用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪(260nm)测定溶出液中质粒的含量，计算每日及累计质粒释放量，绘制体外释放曲线。(图10)

结果显示：振荡磁场能促进超顺磁性的壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架体外溶出，一周能提高原有的质粒溶出达2-5倍。溶出的质粒用于细胞转染，转染率仍达10％±。(图13)

实例三：不同振荡磁场强度对含超顺磁性壳聚糖hVEGF质粒明胶微球支架的体外药物释放的影响

超顺磁性壳聚糖纳米球的制备、超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1明胶微球的制备及超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架制备与实例二相同。体外溶出度实验安排，振荡磁场干预方法调整如下：

1.备4组相同的超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架，编号为1，2，3，4。每组三枚，分别放入25ml三角烧瓶中，加20ml磷酸缓冲液(PBS液)，备用。

2.按编号每组施加不同的逐渐增大的振荡磁场，磁场强度分别为：1组50mT；2组200mT；3组800mT；4组1600mT

3.振荡磁场作用时间均为1小时，振荡磁场频率均为50-80转/分。取溶出液用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪(260nm)测定溶出液中质粒的含量。三次取样，得平均值。结果见图11。

实例四：相同振荡磁场强度不同作用时间对含超顺磁性壳聚糖hVEGF质粒明胶微球支架的体外药物释放的影响

超顺磁性壳聚糖纳米球的制备、超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1明胶微球的制备及超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架制备与实例二相同。体外溶出度实验安排，振荡磁场干预方法调整如下：

1.备4组相同的超顺磁性壳聚糖pDsVEGF₁₆₅Red1-N1质粒明胶微球支架，编号为1，2，3，4。每组三枚，分别放入25ml三角烧瓶中，加20ml磷酸缓冲液(PBS液)，备用。

2.按编号振荡磁场每组施加时间不同，振荡磁场作用时间分别为：1组1小时；2组6小时；3组12小时；4组24小时。

3.振荡磁场的强度均为100mT，振荡磁场频率均为50-80转/分。取溶出液用SmartSpecTM3000核酸蛋白测定仪(260nm)测定溶出液中质粒的含量。三次取样，得平均值。结果见图12。