一种分批补料培养大肠杆菌的方法

摘要

本发明公开了一种分批补料培养大肠杆菌的方法，这种补料方法的内容包括：发酵过程分为五个阶段，不同阶段分别流加碳氮比不同的培养基，实现碳源和氮源的实时流加平衡。应用本发明的补料方法培养带有TRAIL基因表达载体的重组大肠杆菌C600，可以使菌体密度达到高值，有效提高可溶性TRAIL蛋白的表达量，同时减少发酵过程中乙酸的积累。

说明书

技术领域

本发明涉及发酵培养大肠杆菌的方法，尤其涉及分批补料培养大肠杆菌的方法。

技术背景

TRAIL蛋白，即肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，是新近发现的TNF家族成员之一，又称凋亡素2配体(apoptotin 2 ligand，Apo-2L)。TRAIL能够选择性的诱导肿瘤细胞凋亡而对正常组织细胞不敏感，因此在肿瘤的治疗中具有良好的前景。

大肠杆菌的遗传背景清楚、生长速率快、所需的营养成分简单，因此是外源蛋白表达最常用的宿主菌。碳源和氮源的流加是实现大肠杆菌高密度培养和高表达TRAIL的必需方法。在现有的碳源和氮源的补料流加工艺中，由于发酵过程中，尤其是发酵中后期，菌体对碳源的需求较大，因此碳源的流加速率和流加质量是考虑的重点，但氮源的流加也是非常重要的，而且还要考虑碳源和氮源在菌体生长的不同时期的不同配比关系。如果忽视了这点，例如，如果补加碳源过多，往往会出现菌体密度低，可溶性蛋白表达量少，而乙酸积累量大的缺点，如Paalme T等在Biotech.Bioeng，1990，35：312-319以及Shen Ya-Ling等在Biotech.Lett.2004，26：981-984的报道。而如果补加氮源过多，往往又会出现菌体自溶、生长缓慢、发酵液泡沫过多，单位发酵液的外源蛋白表达量低等缺点。

大肠杆菌在高密度发酵的过程中，对碳源和氮源的需求是变化的而不是一成不变的。例如，在发酵初期，大肠杆菌往往需要较多的氮源，过量的碳源反而会抑制菌体的生长，而且会产生大量的乙酸。发酵中期，由于菌体代谢旺盛，体内需要较多的碳源(葡萄糖)，以维持菌体的生长和能量的代谢需要，而对氮源的需求也同样较多。发酵后期，部分菌体开始自溶，菌体对氮源的需求减少，而对碳源的需求增多。因此，在发酵过程的菌体生长阶段，随着菌体浓度的增长，菌体所需的碳氮比呈现越来越高的趋势。而温度诱导期，由于要产生外源蛋白，菌体需要较多的氮源(主要为各种氨基酸)，同时也需要一定量的碳源(葡萄糖)用以维持能量代谢和菌体生长。

因此，本领域迫切需要依据发酵过程的不同时期，实时调控碳、氮源平衡的补料培养方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种根据菌体生长的不同时期，流加不同碳氮比的培养基的分批补料培养方法，以克服现有技术不能实现碳氮源实时流加平衡的不足。

本发明的构思是这样的，根据发酵过程中菌体生长的不同时期，流加不同碳氮比的碳源和氮源，在菌体培养阶段碳氮比随着培养时间的延长而上升，且升高的幅度逐渐增大；诱导期则迅速调整至较低值，从而实现碳氮源的实时流加平衡，最终获得高密度的菌体和高表达的外源蛋白。

本发明的技术方案公开的分批补料培养大肠杆菌的方法，将发酵过程分为五个阶段，每个阶段培养时间为4-7小时，各阶段培养基的碳氮比，即：葡萄糖/(蛋白胨+酵母粉)的质量比依次为0.75-0.9、1-1.2、2.4-2.6、4.5-5.4、0.9-1.2，

以体积比(种子液/发酵液)为2～7％接种，从第2阶段开始补料，补料流加速度使得菌体生长的比生长率在0.05-0.18h^-1之间；整个发酵过程，溶氧维持在20-30％之间，pH值为6.8～7.5；

其中前四个阶段，碳氮比逐渐升高，且升高的幅度逐渐增大；第五个阶段，调整碳氮比回落至0.9-1.2。

各个发酵阶段的时间间隔为：

(1)分批培养阶段，以接种时开始算起，至发酵5-7小时为止(OD₆₀₀值为6-11之间)；

(2)补料初期，以接种后的5-7小时开始算起，至发酵12-14小时为止(OD₆₀₀值为20-28之间)；

(3)补料中期，以接种后的12-14小时开始算起，至发酵18-20小时为止(OD₆₀₀值为40-55之间)；

(4)补料后期，以接种后的18-20小时开始算起，至发酵23-25小时为止(OD₆₀₀值为70-90之间)；

(5)42℃温度诱导期，以接种后的24-26小时开始算起，至发酵28-30小时为止(OD₆₀₀为85-110之间)。

在本发明的一个优选的方案中，葡萄糖/(蛋白胨+酵母粉)的质量比依次为0.88、1.13、2.51、5、1。

在本发明的一个优选的方案中，，培养基的组成和比例如下：

蛋白胨                            10

酵母粉                            5

NaCl                              1

葡萄糖                            X

NaH₂PO₄·12H₂O                2

Na₂HPO₄·3H₂O                 7

K₂HPO₄·3H₂O                  4

ZnSO₄·7H₂O                     0.575

MgSO₄                            1

其中各种组分的比值为质量份数比，例如，当NaCl为1份，则酵母粉为5份，蛋白胨为10份；X代表葡萄糖的份数，在五个发酵培养阶段的具体数值依次为：11.25-13.5、15-18、36-39、67.5-81、13.5-18。

在本发明的一个优选的方案中，在五个发酵培养阶段葡萄糖的份数依次为13.2、17、37.65、75、15。

在本发明一个优选的方案中，第1-4阶段为菌体生长阶段，菌体的比生长率为0.1-0.18h^-1之间。

在本发明一个优选的方案中，第5阶段为诱导表达阶段，菌体的比生长率为0.05-0.1h^-1之间。

在本发明的一个优选的方案中，大肠杆菌选用带有表达质粒pBV220-TRAIL大肠杆菌C600，菌体生长阶段的温度为30℃，诱导表达阶段的温度为42℃；其中TRAIL指肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)基因。

与现有技术相比，本发明的分批补料培养方法特点如下：

(1)精细的分段调控策略。将大肠杆菌表达TRAIL蛋白的发酵过程精细的分为五个补料阶段，分别为分批培养阶段、补料初期、补料中期、补料后期和诱导期。这样的分段调控方式，使得每个阶段的发酵条件尽可能的与菌体的实际需要相适应，大大有利于菌体的生长和外源蛋白的高效表达。

(2)独特的补料方式。通过调整和优化每个补料阶段的碳氮比，五个补料阶段采取不同的碳氮比进行流加，随着培养时间的延长，碳氮比逐渐升高，且升高的幅度逐渐增大，最后的诱导期，使碳氮比回落至0.9-1.2。这种补料方式，可以有效避免由于发酵某个阶段氮源过量而造成的乙酸积累，和避免由于发酵某个阶段氮源过量而造成的菌体自溶现象；而诱导期使碳氮比回落至0.9-1.2，则有利于可溶性外源蛋白TRAIL的表达。

通过分段调控和分别补料，本发明的可溶性TRAIL蛋白表达量在总蛋白中的比例可高达6.7％，TRAIL蛋白含量可达1.7g/L。

附图说明

图1为各发酵阶段的碳氮比(质量比)的变化图，其中C/N指碳氮比，既葡萄糖质量/(蛋白胨+酵母粉)质量比。

具体实施方式

本发明中表达质粒pBV220-TRAIL的构建见中国专利CN 02110880.3，表达载体pBV220-TRAIL即CN 02110880.3公开的pBV-Apo-2L I₁₀₀；pBV220-TRAIL转化按常规CaCl₂转化法转化到宿主菌C600中，获得了重组菌C600-TRAIL，操作方法见《分子克隆》(科学出版社，第二版，2002年)。

蛋白胨、酵母粉为OXOID公司产品，匍萄糖和其他试剂为国产分析纯试剂。

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的是为了更好的理解本发明的内容，因此，所列举的实例并不限制本发明的保护范围。

                         实施例1

初始发酵体积1.5L，采用的初始培养基组成如下(g/L)【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝0.88∶1(质量比)】：

蛋白胨                        10

酵母粉                        5

葡萄糖                        13.23

NaCl                          1

NaH₂PO₄·12H₂O            2

Na₂HPO₄·3H₂O             7

K₂HPO₄·3H₂O              4

ZnSO₄·7H₂O                0.575

MgSO₄                       1

补料初期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝1.13∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    170g/L

补料中期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝2.51∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    200g/L

酵母粉                    100g/L

葡萄糖                    753g/L

补料后期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝5∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    753g/L

42℃温度诱导期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝1∶1(质量比)】为∶

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    150g/L

以5％(体积比)的接种量接入大肠杆菌种子液，30℃、pH7.0分批培养7小时至OD₆₀₀为11。

然后进行初期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.13h^-1，培养至整个发酵过程中的第14小时，OD₆₀₀为28时，停止初期补料。

改为中期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.11h^-1，培养至整个发酵过程中的第20小时，OD₆₀₀为55时，停止中期补料。

改为后期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.10h^-1，培养至整个发酵过程中的第25小时，OD₆₀₀为90时，停止后期补料。

改为诱导期补料，将温度升42℃，菌体的比生长速率控制为0.05h^-1，诱导4小时后，OD₆₀₀为110时，发酵结束。

整个发酵过程控制溶氧在20-30％之间。发酵完毕后可溶性TRAIL蛋白占可溶性总蛋白的6.7％，含量为1.7g/L。乙酸含量为0。

使用的流加碳氮比策略见图1。

                          实施例2

初始发酵体积1.5L，采用的初始培养基组成如下(g/L)【葡萄糖∶(蛋白胨十酵母粉)＝0.8∶1：(质量比)】：

蛋白胨                        10

酵母粉                        5

NaCl                          1

葡萄糖                        12

NaH₂PO₄·12H₂O            2

Na₂HPO₄·3H₂O             7

K₂HPO₄·3H₂O              4

ZnSO₄·7H₂O                0.575

MgSO₄                       1

补料初期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝1.07∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    160g/L

补料中期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝2.47∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    370g/L

补料后期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝5.2∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    780g/L

42℃温度诱导期的补料液各成分浓度【葡萄糖∶(蛋白胨+酵母粉)＝1.1∶1(质量比)】为：

蛋白胨                    100g/L

酵母粉                    50g/L

葡萄糖                    165g/L

以5％(体积比)的接种量接入大肠杆菌种子液，30℃、pH7.0分批培养7小时至OD₆₀₀为8。

然后进行初期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.17h^-1，培养至整个发酵过程中的第13小时，OD₆₀₀为22时，停止初期补料。

改为中期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.12h^-1，培养至整个发酵过程中的第18小时，OD₆₀₀为40时，停止中期补料。

改为后期补料，控制补料速率，使得菌体的比生长速率为0.12h^-1，培养至整个发酵过程中的第23小时，OD₆₀₀为74时，停止后期补料。

改为诱导期补料，将温度升至42℃，菌体的比生长速率控制为0.06h^-1，诱导4小时候，OD₆₀₀为94时，发酵结束。

整个发酵过程控制溶氧在25％之间。发酵完毕后可溶性TRAIL蛋白占可溶性总蛋白的6.0％，含量为1.5g/L。乙酸含量为0。

                        实施例3

采用传统发酵补料方法，目的是与例1和例2进行对比，从而看出本发明所说的流加策略的优点。

初始发酵体积2L，采用的初始培养基组成如下(g/L)：

蛋白胨                        10

酵母粉                        5

NaCl                          1

葡萄糖                        10

NaH₂PO₄·12H₂O            2

Na₂HPO₄·3H₂O             7

K₂HPO₄·3H₂O              4

ZnSO₄·7H₂O                0.575

MgSO₄                       1

补料液各成分浓度为：

补料1：葡萄糖，170g/L

补料2：蛋白胨，100g/L；酵母粉，50g/L

首先，以5％(体积比)的接种量接入大肠杆菌种子液，30℃、pH7.0分批培养7小时至OD₆₀₀为6.8。

然后进行补料，以补葡萄糖为主(补料1)，控制菌体的比生长速率为0.15h^-1。蛋白胨和酵母粉在整个补料过程中采用恒速补料(补料2)，补料速率为：蛋白胨3.5克/小时，酵母粉1.75克/小时。培养23小时后将温度升至42℃，诱导4小时OD₆₀₀为80时，发酵结束。

整个发酵过程控制溶氧在20-30％之间。发酵完毕后可溶性TRAIL蛋白占可溶性总蛋白的4.2％，含量为0.98g/L。乙酸含量为4.6g/L。