大麦黄矮病毒介体蚜虫体内与传毒有关蛋白基因及其应用

摘要

本发明为大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白基因及其应用。本发明涉及蚜虫体内传毒有关蛋白基因P50氨基酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5，及其编码基因的核苷酸序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、重组表达载体及转基因微生物、植物的制备方法。通过使用上述基因或其组合，并通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出抗病毒特性，应用于生产实践。

说明书

技术领域

本发明专利属于生物技术、生物遗传工程技术领域，特别是涉及一种与大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白基因。

背景技术

大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Viruses，BYDVs)可由多种麦蚜以持久性、非增殖方式传播，引起麦类作物的黄矮病，每年给小麦，大麦和燕麦等作物造成不同程度的损失。该病主要流行于我国北方冬、春麦区，引起的小麦黄矮病是重要的流行性病害。1987年仅陕西和甘肃两省就因黄矮病的流行损失5亿多公斤小麦，1998年大面积流行发生范围遍及陕西、山西、宁夏、甘肃、内蒙古和河北等多个省(自治区)。大麦黄矮病毒GAV(BYDV-GAV)由麦二叉蚜(Schizaphis graminum)和麦长管蚜(Sitobion avenae)传播，是引起我国小麦黄矮病的的主流毒源。

早在上世纪50年代就发现BYDVs与其介体麦蚜种类间存在高度的专化性，每种病毒(株系)只能由一种或少数几种蚜虫传播，蚜虫的传毒与否和传毒效率的高低与黄矮病的发生和流行的程度直接相关。关于小麦蚜虫传播大麦黄矮病毒(BYDVs)机制的研究一直是世界各国的重点研究内容，并已建立了BYDVs在蚜虫介体内运转的模型，提出病毒基因产物与介体后肠顶质膜和唾液附腺基质膜上的传毒相关蛋白(病毒受体)相互识别决定能否完成传毒过程。1994年Van den Heuvel等在桃蚜(Myzus persicae)体内确定出一种分子量为66kDa的蛋白与马铃薯卷叶病毒(PLRV)有较强结合能力，该蛋白是由内生共生细菌产生并分泌到血淋巴中，与PLRV粒体上的通读蛋白(RTP)结合可使病毒免受虫体内蛋白酶的破坏。1997年Filichkin等发现BYDV粒体的RTP也与之结合，但这种结合没有特异性，显然不是蚜传专化性的决定因素。目前对参与识别的病毒基因产物已有较深入的了解，但对参与识别的蚜虫介体细胞组分，及其蚜虫传毒专化性分子水平上的研究始终未获重大突破，另外目前的抗病毒基因工程研究中，绝大部分都是转入病毒基因，从而使植物对该病毒产生抗性。未见获得传毒介体中病毒受体蛋白基因的基因植株，通过阻断介体对病毒的传播，阻止病毒的扩散，来达到防治病毒病的目的；发掘新型抗病毒或抗介体传播病毒的基因对小麦抗病毒基因工程育种具有重要的理论价值和实用意义。

发明内容

针对上述不足，本发明在分离、纯化、定位了BYDV-GAV传毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内的传毒相关蛋白的基础上，提供与蚜虫传毒相关蛋白基因序列，并提供该基因在转基因微生物和转基因植物上的应用。

大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白，其特征是该蛋白质氮末端具有如SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。

大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白，其特征是该蛋白质具有如SEQ ID NO3或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。

大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白基因，其特征是该基因具有如SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。

一种重组表达载体，其特征在于含有大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白基因。

所述表达载体为pEmu-mcs-N。

一种基因，其具有与SEQ ID NO2、SEQ ID NO4或SEQ ID NO6所示的核苷酸序列至少90％同源性的序列。

一种转基因微生物或转基因植物的方法，，其特征在于将大麦黄矮病毒介体蚜虫体内传毒相关蛋白基因导入微生物或植物细胞或组织，获得转基因微生物或转基因植物。

所述植物为禾本科植物。

所述禾本科植物为小麦、大麦、燕麦或玉米。

所述禾本科植物为小麦。

本发明所提供的蚜虫与传毒相关蛋白基因，名称为P50，来源于麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)，其具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。进一步扩增了BYDV-GAV的传毒介体麦长管蚜和非传毒介体禾谷缢管蚜的传毒相关蛋白基因，将其核苷酸序列和氨基酸序列与麦二叉蚜的核苷酸序列和氨基酸序列进行了比较(图15和图16)，结果表明其与麦二叉蚜中的与传毒相关蛋白的基因同源性分别为97％和91％。

本发明所提供的蚜虫体内传毒相关蛋白的5’端序列(序列表中的SEQ ID NO1)，由15个氨基酸残基组成，与蚜虫传毒相关蛋白的序列(序列表中的SEQ ID NO3)，由409个氨基酸残基组成。

携带有本发明P50的植物表达载体可通过基因枪方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可以是小麦、大麦、燕麦、玉米等单子叶植物，获得抗、耐小麦黄矮病毒的植物。

本发明提供BYDV传毒介体蚜虫体内的传毒相关蛋白(P50)的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的基因序列或基因序列组合，应用于转化植物，使之表现出抗病毒特性。进一步，为便于研究P50蛋白基因在禾本科植株内的表达，本发明构建了一种含有该基因的表达载体；并通过建立一套有效的表达系统，为该基因在植株内表达研究奠定基础。

附图说明

图1为麦二叉蚜P50蛋白基因3’端的扩增图谱

1.核酸标准分子量，2-5.麦二叉蚜mRNA。

图2为P50蛋白基因的5’扩增图谱(巢式PCR电泳结果)

1.核酸标准分子量((λDNA/EcoR I+Hind III))，2-3.麦长管蚜mRNA。

图3为禾谷缢管蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白基因的扩增图谱

1.禾谷缢管蚜，2.麦长管蚜，3.核酸标准分子量((λDNA/EcoR I+Hind III))

图4P50全长基因片段PCR扩增图谱

1.核酸标准分子量(DL2000)，2.PCR缓冲液，3.麦二叉蚜P50基因。

图5pGEM-6p-1和ORF的BamHI和XhoI酶切图

1：核酸标准分子量(λ-EcoT14 I digest DNA Marker)，2：pGEM-6p-1，3：ORF。

图6pGEM-6p-ORF的PCR鉴定

1.核酸标准分子量(DL2000)，2.阳性对照，3、4、5：三个不同的单菌落PCR。

图7pGEM-6p-ORF酶切鉴定

1.核酸标准分子量(λ-EcoT14 I digest DNA Marker)，2-4.三个不同的单菌落双酶切

图8pGEM-6p-ORF质粒构建流程图

图9P50基因原核表达产物的SDS-PAGE电泳图谱

1.低分子量蛋白质标准，2.非诱导表达产物，3和4.诱导表达产物。

图10.P50蛋白抗血清处理对麦长管蚜(S.avenae)和麦二叉蚜(S.graminum)传播BYDV-GAV效率的影响

1和2分别为麦长管蚜和麦二叉蚜饲食P50抗血清处理，3和4分别为麦长管蚜和麦二叉蚜饲食清水对照。

图11重组质粒pEmu-P50的双酶切鉴定图

1.核酸标准分子量(DL2000)，2-3.两个单单菌落。

图12P50基因植物表达载体pEmu-P50构建流程图

图13转P50蛋白基因T0代植株

图14转P50基因T0代植株的PCR鉴定

1.核酸标准分子量(λ-EcoT14 I digest DNA Marker)，2.非转基因植株，3-5.转基因植物

图15三种蚜虫中传毒相关基因的核苷酸序列比对

Sg：麦二叉蚜，Ma：禾谷缢管蚜，Rp：长管蚜

图16麦二叉蚜和长管蚜中传毒相关基因产物的氨基酸序列比对

sgaa：麦二叉蚜，maaa：麦长管蚜

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。

1.实验选用的材料：

1.1菌株与载体：大麦黄矮病毒GAV(BYDV-GAV)为本实验室长期保存且繁殖在燕麦的毒源，病毒抗体由美国普渡大学Lister教授提供。麦二叉蚜(Schizaphis graminum)、麦长管蚜(Sitobion avenae)和禾谷缢管蚜(Rhopalosiphum padi)在光照生长箱(温度18±2℃，光照强度4000Lux，光周期16小时/天)的小麦幼苗上隔离饲养。原核表达载体为PGEM-T-Easy(购自Promega公司)和pGEM-6p-1(购自Amersham公司)，植物表达载体为pEmu-mcs-N(澳大利亚P.Waterhouse教授惠赠)。转基因材料为小麦的晋麦64和杨麦158品种。

1.2主要试剂：Taq DNA聚合酶、连接酶和内切酶购自TaKaRa公司；金粉购自NEB公司；QuickPrep Micro mRNA Purification Kit购自Amersham公司；质粒提取试剂盒购自Marligen公司等。

1.3培养基：(1)MS培养基：大量元素母液(100ml)，微量元素母液(10ml)，铁盐母液(5ml)，肌醇母液(5ml)，甘氨酸母液(2ml)，烟酸母液(1ml)，盐酸硫胺素母液(1ml)，蔗糖(30g)，盐酸吡哚素母液(1ml)，琼脂(7g)，用NaOH溶液调节pH值至5.8。(2)LB培养基：酵母提取物(5g)，胰蛋白胨(10g)，NaCl(10g)。(3)SD2培养基的配制：大量元素母液(100ml)，微量元素母液(10ml)，铁盐母液(5ml)，盐酸硫胺素母液(1ml)，天冬酰胺(150mg)，2，4-D(2mg)，蔗糖(30g)，琼脂(4.8g)，用NaOH溶液调节pH值至5.8。

1.4本发明设计和引用的引物序列

1.4.1扩增P50蛋白基因3’端序列的引物

P3 5’-CC(T/C/G/T)CA(A/G)GC(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)

    TC(A/C/G/T)CA(A/G)GG-3’

P4  5’-CC(T/C/G/T)CA(A/G)GC(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)

    AG(C/T)CA(A/G)GG-3’

P5  5’-CCGCGTCTAGA(T)₁₅

1.4.2扩增P50蛋白基因5’端序列的引物

GSP1(外侧引物)：5’-CATCTGAGTATGTGCAACGAC-3’

GSP2(内侧引物)：5’-CTTGAGTACTTGACAAAAGCC-3’

1.4.35′RCAE试剂盒有两个引物

AAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’

AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’

1.4.4P50蛋白基因全长序列扩增的引物

5’端引物pGEM-55’-GATCGCGGATCCATGTCTCATCGTAAATTTAGTG

3’端引物pGEM-33’-TGCCATACTCGAGTTATTTTGCAGCTGCAGTAGC

1.4.5构建植物表达载体(pEmu-P50)的P50蛋白基因全长序列扩增的引物

5’端引物pEmu-55’-GATCGCTCTAGAATGTCTCATCGTAAATTTAGTG

3’端引物pEmu-33’-TGCCATAGAGCTCTTATTTTGCAGCTGCAGTAGC

2.P50蛋白N-末端氨基酸序列测定

王锡锋等通过双向电泳和病毒覆盖测定技术确定出BYDV-GAV介体麦二叉蚜和麦长管蚜的蛋白质中，有一个分子量为50kDa，等电点约为4.9的蛋白(P50)与BYDV-GAV有最明显的亲和反应，而在BYDV-GAV非介体禾谷缢管蚜的蛋白提取液中未发现与提纯病毒起亲和反应的蛋白。P50蛋白存在于蚜虫的后肠细胞膜或唾液附腺细胞膜，是一种细胞膜蛋白，其参与了介体麦蚜与病毒的识别过程，是一种与传播BYDV-GAV有关的传毒相关蛋白(王锡锋等，科学通报2003(15)：1671-1675，大麦黄矮病毒介体麦二叉蚜和麦长管蚜体内传毒相关蛋白的确定)。

在上述研究基础上，本发明采用双向电泳分离技术，将50kDa蛋白转移到PVDF膜上，用Applied Biosystems公司自动氨基酸测序仪进行N-末端氨基酸序列测定。测定结果表明该蛋白N-末端15个氨基酸序列为SLYFSGPQYYSGYEA(SEQ ID NO1)。在GeneBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中未发现有同样序列的蛋白登录，说明P50是一种新鉴定的蛋白。

3.P50蛋白基因的克隆

本发明应用Amersham的QuickPrep Micro mRNA Purification Kit提取麦二叉蚜的mRNA，采用INVITROGEN的Thermo Script RT-PCR System，以Poly(T)₁₅为引物反转录得到cDNA第一链。并根据已经测定的N-末端氨基酸序列设计的简并引物P3和P4，序列如下：

P3  CC(T/C/G/T)CA(A/G)GC(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)

    TC(A/C/G/T)CA(A/G)GG

P4  CC(T/C/G/T)CA(A/G)GC(A/C/G/T)GG(A/C/G/T)AC(A/C/G/T)

    AG(C/T)CA(A/G)GG

P5  5′-CCGCGTCTAGA(T)₁₅

以P3和P4等量混合物为3’端引物，以P5为5’端引物进行PCR扩增，得到约为1300bp产物，电泳图谱见图1。

本发明用PGEM-T-Easy载体，克隆该PCR片段，转化到JM109菌株、筛选得到阳性质粒，重组质粒命名为pT-P50a，通过PCR和酶切鉴定其含有目的片段，测序结果表明该片段长1293bp，其5′端序列中开始的27个碱基有24个与引物相匹配，说明该序列是麦二叉蚜传毒相关蛋白基因。

修饰cDNA的3′端，根据已测得的基因序列设计外侧引物(GSP1)和内侧引物(GSP2)，及Invitrogen的5′RCAE试剂盒引物AAP和AUAP。以GSP1和AAP为引物对进行第一次PCR，以第一次PCR产物为模板、GSP2和AUAP为引物对进行第二次PCR(图2)，PCR扩增得到目的基因的5′序列，该片段有537bp。

将1293bp和537bp的片段拼接得到了长为1441bp片段(SEQ IDNO 2)。该序列包含一个长为1227bp的开放阅读框架(ORF)。推测出该基因编码的蛋白质氨基酸序列(SEQ IDNO 3)，翻译的蛋白大小约为45KD，其开始的15个氨基酸中有11个与已测定的氨基酸匹配。因此我们认定这个序列是麦二叉蚜中的大麦黄矮病毒结合蛋白基因的序列。

进一步采用相同的方法扩增了BYDV-GAV的传毒介体麦长管蚜和非传毒介体禾谷缢管蚜的传毒相关蛋白基因(图3)，并对其核苷酸序列和氨基酸序列与麦二叉蚜相应序列进行了比较(SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5)。结果表明，BYDV-GAV的非传毒介体禾谷缢管蚜和传毒介体麦长管蚜中的基因序列分别为1403和1393bp，与麦二叉蚜中的传毒相关蛋白基因的同源性分别为97％和91％。但是非传毒蚜禾谷缢管蚜中有多个开放阅读框架(SEQID NO 6)。麦长管蚜仅有一个开放阅读框架，长为1227bp，与二叉蚜开放阅读框架的长度相同；它们翻译出来的蛋白质共有408个氨基酸，其中有13个氨基酸的不同。这可能是由于三种麦蚜在长期的自然进化过程中，发生了一些基因突变，从而使翻译出来的蛋白质功能发生了变化，也就是说在麦二叉蚜体内表达的这种蛋白质可以与大麦黄矮病毒结合，使病毒能够在麦二叉蚜体内完成循环；而在禾谷缢管蚜没有这种功能。

4.P50蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和功能研究

根据P50蛋白基因的序列，本发明设计了扩增全长P50基因的一对引物pGEM-5和pGEM-3，并根据表达载体上的多克隆位点，在引物两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点。序列如下：

pGEM-5  5’-GATCGCGGATCCATGTCTCATCGTAAATTTAGTG

pGEM-3  3’-TGCCATACTCGAGTTATTTTGCAGCTGCAGTAGC

本发明利用pGEM-5和pGEM-3扩增得到P50全长基因片段(图4)。将PCR产物和pGEM-6p-1分别用BamHI和XhoI酶切(图5)、T4DNA连接酶连接，导入原核表达载体pGEM-6p-1质粒中，获得重组质粒命名为pGEM-6p-ORF。对pGEM-6p-ORF进行酶切和PCR鉴定，结果参见附图(图6，7)，pGEM-6p-ORF构建流程图见附图(图8)。将P50蛋白基因的表达载体pGEM-6p-ORF导入E.coli JM110中，均匀涂布在含氨苄抗生素的LB平板上，挑选出阳性克隆。然后提取质粒，通过PCR和双酶切鉴定。

本发明将阳性克隆按1/100的比例接种于5mL LB培养液的试管中，37℃，200rpm振荡培养2-3小时后加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG。在30℃下继续培养12小时左右进行诱导表达。pGEM-6p-1经IPTG诱导后，高效表达出一个约为71KD大小的融合蛋白，其中包括45KD大小的由ORF表达的蛋白和26KD大小的GST标签。对P50基因表达产物进行SDS-PAGE，确定P50蛋白基因表达产物的含量，得到电泳结果(图9)。

收集菌体后加入1ml样品缓冲液(1×SDS Loading buf.：50mM Tris-HCl pH6.8，100mMDTT，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)煮沸10min，以12％的凝胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，取出凝胶用蒸馏水冲洗2min，然后用冰冷的0.25mM KCl，1mM DTT溶液浸泡10min，切下乳白色的目标蛋白条带，将切下的凝胶切成1-2mm大小的胶块合并装入内径8mm，长12cm的双通玻璃器中，玻璃管的一端用封口封住，然后倒入5％的浓缩胶溶液，去除气泡，水封口后放置60min待其聚合，胶聚合后除去封口，并在玻璃管下端套上装满洗脱缓冲液(每升含甘氨酸1.44g，SDS 1g，Tris 0.3g)的透析袋，水封端向上垂直插入圆盘电泳槽装置内，去除水封层，将上下槽均装满电洗脱缓冲液，上槽接负极，下槽接正极，以每管10mA的电流恒流电洗脱4小时，电洗脱后取出透析袋，放入蒸溜水中透析12小时，然后装入小离心管中-70℃冷冻，真空干燥器抽干，再用适量重蒸水溶解固体，经电泳分析纯度后制备抗血清。

表达产物(P50蛋白)抗血清的制备：先将表达蛋白浓度调整1mg/ml，然后与等量的Frund’s不完全佐剂充分混合乳化，再进行家兔肌肉注射，每周一次共注射四次，然后取少许兔血进行效价测定，最后一次加强注射后一周大量取血，将取出的兔血4℃放置12小时，然后10000rpm离心10min，取上清加入0.1％的NaN₃，小管分装后-20℃保存。

表达产物(P50蛋白)的生物学测定：麦二叉蚜、麦长管蚜和禾谷缢管蚜的二龄若虫饲食稀释500倍的抗血清48小时，再进行正常的薄膜饲毒实验，然后把麦蚜转至健康的燕麦幼苗(品种Coast Black)进行传毒72小时，去除麦蚜的幼苗置于强光照生长箱，对照发病后计算传毒效率。麦长管蚜饲食500倍稀释的抗血清后，传毒效率显著下降，对照传毒效率为75.8％，而用饲食抗血清的传毒效率仅为8.5％。麦二叉蚜的处理也有相似的结果，传毒效率由对照的72.3％下降为26.6％。在所有的试验中，无论处理与否均未发现禾谷缢管蚜能够传播BYDV-GAV，饲食正常兔血清的麦二叉蚜和麦长管蚜传毒效率基本未发生改变(分别为73.4％和71.6％)(图10)。上述结果证明，原核表达产物与从麦二叉蚜体内提取的P50蛋白功能相同，参与了介体麦蚜与病毒的识别过程，是与传播BYDV-GAV有关的P50蛋白。

5.P50蛋白在禾本科植物内的表达

植物表达载体的构建：根据P50蛋白基因的序列和植物表达载体pEmu-mcs-N的酶切位点，本发明设计了带有酶切位点XabI和SacI的特异性引物P6和P7，序列如下：

5’端引物pEmu-55’-GATCGCTCTAGAATGTCTCATCGTAAATTTAGTG

3’端引物pEmu-33’-TGCCATAGAGCTCTTATTTTGCAGCTGCAGTAGC

本发明利用pEmu-5和pEmu-3扩增得到P50全长序列，PCR退火温度设定55℃。将PCR产物与pEmu-mcs-N质粒分别用XbaI和SacI酶切、连接。将连接产物热激转化大肠杆菌JM110，均匀涂布在含氨苄抗生素的LB平板上，挑取出阳性克隆，然后提取质粒，通过PCR和双酶切鉴定(图11)，结果表明含有目的基因P50的植物表达载体pEmu-P50构建成功，质粒构建流程图见附图(图12)。

禾本科植物的转化：采用大量质粒提取试剂盒(Marligen)纯化含有目的片段的重组质粒pEmu-P50。获得质粒浓度达2-3mg/ml，含有90％以上的超螺旋DNA。

剥取授粉约14天的幼胚在SD2培养基上，盾片向上，胚芽向下，在26℃黑暗条件下诱导愈伤组织。幼胚直径约1-1.5mm，两胚芽相互间距0.5em左右。7-10天后用基因枪将含有目的片段的重组质粒pEmu-P50转化经0.4mol/L渗透压培养基(SD2添加0.2mol/L甘露醇，0.2mol/L山梨醇)处理4～6h的愈伤组织。轰击后的愈伤组织继续在原渗透压培养基上处理16～18h，然后转入SD2培养基黑暗条件下(26℃)恢复培养2周。随后将愈伤组织移到MS+NAA(1mg/L)+KT 1mg/L+除草剂Bialaphos(PPT)3～5mg/L的培养基上诱导分化3周(每日10h光照，24℃)，出现绿芽分化后转到无激素培养基(MS+Bialaphos 3～5mg/L)上(每日10h光照，24℃)，直到小苗生长到1～2cm时，移入MS+IAA(0.5mg/L)+Bialaphos(3mg/L)的培养基上壮苗，再生植株生长到适宜大小(苗高6～8cm，根系较好)时放入4℃冰箱中春化处理20～30天，然后移入装有灭菌土的纸营养钵中，外罩保鲜膜保湿；结果得到转基因小麦植株(图13)。

6.转基因小麦植株的PCR鉴定

CTAB法提取植物总DNA：取0.2g组织样品，加入液氮研磨，加入600μl CTAB buffer(2％CTAB，20mmol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，0.1mol/L Tris-HCl，0.1％β-巯基乙醇)，轻轻混匀，65℃孵育1hour；再加入等体积的苯酚：氯仿(1∶1)，混匀，11000rpm离心20min，取上清；加入等体积的氯仿，混匀，11000rpm离心20min，取上清；加入2/3体积的异丙醇，-20℃放置1hour，11000rpm离心20min，取沉淀；70％乙醇洗涤2次，8000rpm离心5min，取沉淀，干燥后加入30μlDEPC处理的无菌水溶解。

总DNA的PCR检测：以转化植株中提取的植物总DNA为模板，用PCR扩增检测转基因植物中外源基因的整合情况，扩增引物为：

5’端引物pEmu-55’-GATCGCTCTAGAATGTCTCATCGTAAATTTAGTG

3’端引物pEmu-33’-TGCCATAGAGCTCTTATTTTGCAGCTGCAGTAGC

PCR反应系统：在0.5ml灭菌离心管中加入

          5’-Primer(62.5μM)            1.5μl

          3’-Primer(62.5μM)            1.5μl

          10X Buffer(1.5mM Mg⁺⁺)        5μl

          dNTP(10mM)                     2μl

      Taq DNA polymerase(5U/μl)        1μl

      DNA                               1μl

      ddH₂O                            34μl

反应总体积为50μl，混匀后低速离心30秒，94℃预变性2min，94℃变性1min，52℃退火90sec，72℃延长2min，反应共40个循环，最后72℃延长10min。PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳，电压每厘米2伏，电泳2-3小时，紫外下观察照像(Kodak EDAS290型凝胶成像仪)(图14)。

7.转基因植株对大麦黄矮病毒的抗性测定：

本发明采用生物学方法测定了转基因小麦植株大麦黄矮病毒-GAV株系(BYDV-GAV)的抗病性。

蚜虫饲食大麦黄矮病毒：将感染小麦黄矮病毒(BYDV-GAV)的燕麦叶片剪成5cm小段，置保湿培养皿中，在15℃黑暗条件下，喂食不携带病毒的介体麦二叉蚜(Schizaphisgraminum，Sg)和麦长管蚜(Sitobion avenae，Ma)48小时，获得带毒蚜虫。

转基因植株的接种：将带毒蚜虫接种到转P50蛋白基因的T0代幼苗上，每株接种5头蚜虫，3天后用稀释1000倍的敌百虫杀死所有蚜虫，将植株移入18℃、16小时/日光照的人工环境箱中(光照25，000Lux)。

本发明共鉴定了转基因植株T0代材料148株，设小麦品种中5为抗病对照，CA8686(冬)为感病对照。接种14天后感病对照开始显现病症，开始记载病情。接种21天感病对照完全显现病症，进行系统调查(结果见表1)。按国际统一的分级标准将病级分为0-9级，0级为免疫、1级和2级为抗病株。3级以上(包括3级)为感病株。抗性鉴定结果表明：供试的148株材料中有5株表现为抗病，其中3株为I级，2株为II级，其余143株供试材料表现为感病。

                表1  转P50蛋白基因的小麦植株的抗病性鉴定

  编号                          转基因植株  感病对照  抗病对照  2003-3  2003-15  2003-47  2003-104  2003-133  CA8686  中5  病级  II  I  I  II  I  V  0  抗性评价  RT  RT  RT  RT  RT  S  HRT

注：RT-抗耐病，S-感病，HRT-高抗、高耐。

附录：本发明所涉及蛋白的氨基酸序列、及核苷酸酸序列

SEQ ID NO1(P50蛋白N-末端氨基酸序列)

NIAAVIPQAGTSQGR

SEQ ID NO2(麦二叉蚜的P50核苷酸序列)：(1403bp)

AGGTATTCGTTCATTTCGTTTGGAATCATCGTACTCATTACTACTCCGGTGGTTGTCGCGTCCTTCGCAC  70

ATCCACTGTCATCAAGTATTTTTATTTTTTTTTTCATCCACTTCAATCGACTGAAACATCCGTTATGTCT  140

ATACGTGCATTTAGTGCTCCTGCAGGTACTTCCATGGGTCGTTACCCAAAGAAGCGCGCACGTCGTCATC  210

GTGGTAGAGTAAAGTCTTTCCCTAAAGATGATCCGAGCAAGCCAATCCATTTAACTGCTTTCATTGCATA  280

CAAAGCTGGTATGACCCACGTTGTTCGTGAAGCTGACCGTCCAGGATCAAAACTCAACAAGAAGGAAATT  350

GTAGAGCCCGTTACTATTTTGGAAGCTCCACCCATGATCATTGTTGGCGTTGTAGGTTATGTTGAGACTC  420

CATATGGTCTTAAGCCGTTGAAGACAGTGTTCGCTGAACATTTGTCTGAAGATTGCCGCAGACGTTTCTA  490

CAAGAACTGGTACAAATCAAAGAAGAAGGCTTTTGTCAAGTACTCAAGGAAGTGGCAAGATGAAAATGGC  560

AAAAGACAAATTGCCAAAGATCTTAGTAAAATTGCCAAATACTCTAAAGTTATCCGTGTCGTTGCACATA  630

CTCAGATGAAATTGTTGAGGAAACGTCAAAAGAAAGCTCACATTATGGAAATCCAAGTTAATGGAGGTAC  700

AGTTGCTGAAAAGGTGCAATGGGCTAAAGAACATTTTGAAAAGCCGGTACCTGTTTCTCATGTTTTCGCT  770

CCAGATGAGATGATTGATTGTATTGGTGTCACTAAGGGTCGTGGATACAAAGGTGTTACATCTCGTTGGC  840

ATACAAAGAAATTGCCACGCAAGACCCATAAAGGTCTTCGTAAAGTTGCTTGTATTGGAGCATGGCATCC  910

GAGTCGTGTCCAGTTCACTGTTGCTCGTGCTGGTCAAAAAGGTTACCATCATCGAACTGAAGTCAATAAG  980

AAGATATACCGTATTGGTCTTGGAATTCATACCAAGGATGGAAAGGTTATTAAAAACAATGCATCGACGT  1050

AGTATGATTTGACCGAGAAGACCATTACTCCTATGGGAGGTTTCCCGCATTATGGTGAAGTTAACAATGA  1120

TTTCCTCATGATCAAGGGATGTTGTGTTGGTCCTAAGAAGCGAGTCATTACTCTTCGTAAATCTTTGTTG  1190

GTACACACAAAACGTGCTGCTTTGGAAAGTATCAACTTGAAATTCATCGATACCTCATCCAAATTCGGTC  1260

ATGGACGTTTCCAGACTGTTGCTGACAAGGCAGCCTTCATGGGTCCATTGAAGAAGGACAGGATTCGAGA  1330

AGAAGAAAAGGCTACTGCAGCTGCAAAATAATTGTACAATTTTATTATTTGACAATTATAATAAAAACCT  1400

AAA

SEQ IDNO3(麦二叉蚜P50蛋白的氨基酸序列)

SIRAFSAPAGTSMGRYPKKRARRHRGRVKSFPKDDPSKPIHLTAFIAYKAGMTHVVREAD   60

RPGSKLNKKEIVEPVTILEAPPMIIVGVVGYVETPYGLKPLKTVFAEHLSEDCRRRFYKN   120

WYKSKKKAFVKYSRKWQDENGKRQIAKDLSKIAKYSKVIRVVAHTQMKLLRKRQKKAHIM   180

EIQVNGGTVAEKVQWAKEHFEKPVPVSHVFAPDEMIDCIGVTKGRGYKGVTSRWHTKKLP   240

RKTHKGLRKVACIGAWHPSRVQFTVARAGQKGYHHRTEVNKKIYRIGLGIHTKDGKVIKN   300

NASTEYDLTEKTITPMGGFPHYGEVNNDFLMIKGCCVGPKKRVITLRKSLLVHTKRAALE   360

SINLKFIDTSSKFGHGRFQTVADKAAFMGPLKKDRIREEEKATAAAKZ

SEQ ID NO 4(麦长管蚜的P50核苷酸序列)(1393bp)

AGGTATTCGTTCATTTCGTTTGGAATCATCGTTCATCGTAGTTCGGTGGTTGTCGCGTCATCCGCACATC   70

TACTTTCGTCAAGTCTTTTTTTTTCATCCTCTTCGATCTTCCAGGTCGTCGACCATGTCTCATCGTAAAT   140

TTAGTGCTCCTCGGCATGGTTCTATGGGTTTCTACCCAAAGAAGCGCGCACGTCGTCATCGTGGTAGAGT   210

AAAGTCTTTCCCCAAAGATGATCCCAGCAAGCCAATCCATTTAACCGCTTTCATTGCATACAAAGCTGGT   280

ATGACCCACGTTGTTCGTGAAGCCGATCGTCCAGGATCAAAACTCAACAAGAAGGAAATTGTGGAGCCTG   350

TTACCATTTTGGAAGCTCCTCCCATGATCATTGTTGGTGTTGTAGGTTATGTTGAAACTCCATATGGTCC   420

TAAACCTTTGAAGACTGTGTTCGCTGAACATTTATCTGAAGATTGCCGTCGTCGTTTTTACAAGAACTGG   490

TACAAATCAAAAAAGAAGGCTTTTGTCAAGTACTCTAGGAAGTGGCAAGATGAAAACGGAAAAAGACAAA   560

TTGCCAAAGATCTTGGTAAAATTGCCAAATACTCCAAAGTTATCCGCGTTGTTGCTCGCACTCAGATGAA   630

GTTGTTGAAGAAACGTCAAAAGAAGGCTCATATCATGGAGATCCAAGTTAATGGAGGTACTATTGCTGAA   700

AAAGTACAATGGGCTAAGGAACATTTTGAAAAGCCAGTACCTGTGTCTCATGTATTTGCTCCAGATGAGA   770

TGATAGATTGTATTGGTGTCACCAAGGGTCGTGGATACAAGGGTGTTACATCCCGTTGGCATACAAAGAA   840

ACTGCCCCGTAAGACACATAAGGGTCTTCGTAAGGTTGCTTGCATCGGAGCATGGCATCCTAGTCGTGTC   910

CAGTTCACTGTTGCACGTGCTGGTCAAAAGGGTTACCATCATCGTACTGAAATCAATAAGAAGATATACC   980

GTATTGGACTTGGAATTCATACCAAGGATGGAAAGGTTATCAAAAATAATGCTTCAACTGAGTACGATTT   1050

GACCGAGAAGACTATCACCCCCATGGGAGGTTTTCCTCATTATGGTGAAGTTAACAATGATTTCTTGATG   1120

ATCAAGGGATGTTGTGTTGGCCCCAAGAAGCGAGTTATCACTCTTCGTAAATCTTTGTTGGTACACACAA   1190

AACGTGCTGCTTTGGAAAGTATCAACTTGAAATTCATCGATACCTCATCCAAATTCGGTCATGGACGTTT   1260

CCAGACTATTGCCGACAAGGCAGCTTTCATGGGTCCATTGAAGAAGGACAGGATTCGAGAGGAAGAGAAA   1330

GCCACAGCGGCTGCAAAATAATTGTACAATTTCATTATTTGACAATTATAATAAAAACCTAAA

SEQ ID NO 5(禾谷缢管蚜的P50核苷酸序列)(1403bp)

AGGTATTCGTTCATTTCGTTTGGGATCATCGTACTCATTACTACTCCGGTGGTTGTCGCGTCCTCCGCAC   70

ATCCACTGTCATCAAGTATTTTTATTTTTTTTTCATCCATTTCAATCGACTGAAACATTCGCAATGTCTC   140

ATCGTAAATTTAGTGCTCCTCGTCATGGTTCTATGGGTTTCTACCCAAAGAAGCGCGCACGTCGTCATCG   210

TGGTAGAGTAAAGTCTTTCCCTAAAGATGACCCGAGCAAACCAATCCATTTAACTGCTTTCATTGCATAC   280

AAAGCTGGTATGACCCACGTTGTTCGTGAAGCTGACCGTCCAGGATCAAAACTCAACAAGAAGGAAATTG   350

TAGAGCCCGTTACCATTTTGGAAGCTCCACCCATGATCATTGTTGGCGTTGTAGGTTATGTTGAGACTCC   420

CTATGGTCTTTAACCTTTGAAGACAGTGTTCGCTGAACATTTGTCTGAAGATTGCCGCAGACGTTTCTAC   490

AAGAACTGGTACAAATCAAAGAAGAAGGCTTTTGTCAAATACTCGAGGAAGTGGCAAGATGAAAACGGCA   560

AAAGACAAATTGCCAAAGATCTTGGTAAAATTGCCAAGTACTCCAAAGTTATCCGTGTCGTTGCACATAC   630

TCAGATGAAATTGTTGAAGAAACGTCAAAAGAAAGCTCACATTATGGAAATCCAAGTTAATGGAGGTACA   700

GTTGCTGAAAAAGTGCAATGGGCTAAAGAACATTTTGAGAAGCCAGTACCTGTTTCTCATGTTTTCGCTC   770

CAGATGAGATGATTGATTGTATTGGTGTAACTAAGGGTCGTGGATACAAAGGTGTTACATCTCGTTGGCA   840

TACAAAGAAATTGCCACGCAAGACCCATAAAGGTCTTCGTAAGGTTGCTTGTATTGGAGCATGGCATCCC   910

AGTCGTGTCCAGTTCACTGTTGCTCGTGCTGGTCAAAAAGGTTACCATCATCGAACTGAAATCAATAAGA   980

AGATATACCCGTATTGGTCTTGGAATTCATACTAAGGATGGAAAGGTTATTAAAAACAATGCATCAACTG   1050

AGTATGATTTGACTGAGAAGACAATTACTCCCATGGGAGGTTTCCCACATTATGGTGAAGTTAACAATGA   1120

TTTCCTCATGATCAAGGGATGTTGTGTTGGTCCTAAGAAGCGAGTCATTACTCTTCGTAAATCTTTGTTG   1190

GTACACACAAAACGTGCTGCTTTGGAAAGTATCAACTTGAAATTCATCGATACCTCATCCAAATTCGGTC   1260

ATGGACGTTTCCAGACTGTTGTCGACAAGGCAGCTTTCATGGGTCCATTAAAGAAGGACAGGATTCGAGA   1330

AGAAGAAAAGGCTACTGCAGCTGCAAAATAATTGTACAATTTTATTATTTGACAATTATAATAAAAACCT   1400

AAA

SEQ ID NO6(麦长管蚜中传毒相关基因产物的氨基酸序列)

SHRKFSAPRHGSMGFYPKKRARRHRGRVKSFPKDDPSKPIHLTAFIAYKAGMTHVVREADRPGSKLNKKE       70

IVEPVTILEAPPMIIVGVVGYVETPYGPKPLKTVFAEHLSEDCRRRFYKNWYKSKKKAFVKYSRKWQDEN       140

GKRQIAKDLGKIAKYSKVIRVVARTQMKLLKKRQKKAHIMEIQVNGGTIAEKVQWAKEHFEKPVPVSHVF       210

APDEMIDCIGVTKGRGYKGVTSRWHTKKLPRKTHKGLRKVACIGAWHPSRVQFTVARAGQKGYHHRTEIN       280

KKIYRIGLGIHTKDGKVIKNNASTEYDLTEKTITPMGGFPHYGEVNNDFLMIKGCCVGPKKRVITLRKSL       350

LVHTKRAALESINLKFIDTSSKFGHGRFQTIADKAAFMGPLKKDRIREEEKATAAAKZ