人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽及其用途

摘要

本发明涉及了一种分离的肽，所述肽包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，且所述肽特异地结合乙肝病毒表面抗原大蛋白的前表面抗原区。本发明还涉及所述肽的核苷酸序列、构建物、细胞和应用。本发明的肽能特异地俘获慢性乙肝病人血清中的乙肝病毒颗粒，显示出该肽作为特异的竞争性抑制剂阻断乙肝病毒感染人肝细胞的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程、基因工程和生物医药领域，具体涉及肽、其核苷酸编码序列以及它们在预防或治疗乙肝病毒感染或乙型肝中的应用。

背景技术

中国是乙肝病毒感染的高危区，人口的10％以上为乙肝病毒携带者，由乙肝病毒感染引起的慢性乙型肝炎易发展为肝硬化和肝癌。

乙肝病毒的基因组含有四个基本阅读框架，编码四种蛋白，它们分别是表面蛋白(又称为表面抗原)、核心蛋白(核心抗原)、聚合酶和X蛋白。表面抗原又有三种，即表面抗原主蛋白、中蛋白和大蛋白。表面抗原大蛋白比主蛋白在其氨基端多了174个氨基酸(以Adr1基因亚型为例)，该区域被称为前表面抗原区(PreS)。它又可分为前后两段，即PreS1(氨基酸1-119)和PreS2(氨基酸120-174)，PreS1序列只存在于表面抗原大蛋白上，而PreS2序列除了存在于表面抗原大蛋白上外，也存在于表面抗原中蛋白上。表面抗原位于乙肝病毒颗粒的最外层，在乙肝病毒感染宿主细胞的初始阶段，通过其表面抗原与人肝细胞接触，从而启动后续的感染过程。许多研究结果显示表面抗原大蛋白的PreS是乙肝病毒结合和感染人肝细胞所必需的(Le Seyec J，et al.1999.Infection process of the hepatitis B virus depends on the presence of a definedsequence in the pre-S1 domain.J.Virol.73：2052-2057)，并且PreS中的氨基酸21-47区段可能结合未知的人肝细胞表面的乙肝病毒受体，是所谓的受体接触位点。也有报道认为PreS的其它区段也可能影响乙肝病毒与人肝细胞的结合。

虽然基因工程乙肝疫苗已应用于预防乙肝病毒的感染，但有近5-10％的接种者不能产生保护性抗体。此外，临床上对慢性乙肝患者尚无很有效的治疗手段。目前使用的治疗慢性乙肝的药物主要是两种：干扰素和贺普丁(lamivudine)，前者有效率较低，副作用大，且价格昂贵。后者如长期使用，可能由于耐药变异株的产生而影响疗效。因此，本领域中仍然迫切需要研制出更为有效的新型治疗慢性乙肝的药物。

发明内容

为实现上述目的，本发明者以PreS融合蛋白为靶分子筛选噬菌体展示随机肽文库，经鉴定得到一组结合PreS蛋白的短肽，从中选择代表性的三种短肽进行详细分析，发现这三种短肽都结合于PreS(aa21-47)区段，比较这些短肽的序列，进而获得了与PreS(aa21-47)结合的肽所具有的保守氨基酸序列，从而完成了本发明。

具体而言，本发明一方面提供了一种分离的肽，其特征在于，所述肽包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，且所述肽特异地结合乙肝病毒表面抗原大蛋白的前表面抗原区。

本发明另一方面提供了一种分离的编码本发明肽的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了一种构建物，所述构建物含有本发明上述核苷酸序列以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。

本发明另一方面提供了一种细胞，所述细胞含有本发明上述的肽、核苷酸序列或构建物。

本发明另一方面提供了一种用乙肝病毒前表面抗原区的融合蛋白作为靶标分子筛选噬菌体随机肽文库来筛选与乙肝病毒前表面抗原区结合的肽的方法。

本发明另一方面还提供了本发明上述的肽、核苷酸序列、构建物或细胞在制备预防或治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎的药物中的用途，以及含有所述肽、核苷酸序列、构建物或细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。

本发明获得的肽能特异地俘获慢性乙肝病人血清中的乙肝病毒颗粒，显示出该肽作为特异的竞争性抑制剂阻断乙肝病毒感染人肝细胞的应用前景，为研制新型抗乙肝病毒感染药物奠定了基础。

附图说明

图1显示了SDS-PAGE电泳检验CBD-PreS蛋白(图a)、thio-PreS蛋白(图b)的表达和纯化结果。在图a中，左侧泳道是蛋白分子量标准，泳道1为诱导后全细菌裂解物，泳道2为纯化的可溶性CBD-PreS蛋白。在图b中，左侧泳道是蛋白分子量标准，泳道1为诱导前全细菌裂解物，泳道2为诱导后全细菌裂解物，泳道3为纯化的可溶性thio-PreS蛋白。

图2显示了代表性肽结合于PreS的氨基酸21-47区段。

图3显示了与PreS(氨基酸21-47)结合的肽所具有的保守氨基酸序列。将代表性结合肽进行氨基酸序列的比对，获得结合PreS(氨基酸21-47)的肽所具有的保守氨基酸序列，其中X指任意氨基酸。

图4显示了对本发明的寡肽的保守氨基酸进行突变分析的结果。分别将本发明的寡肽的第一位或后两位色氨酸突变为丙氨酸。偶联有GST融合的本发明的寡肽或其变异体的Sepharose凝胶珠与MBP融合的PreS不同区段在室温下温育，以PBS缓冲液洗涤去除非特异性吸附后，对结合产物进行SDS-PAGE电泳，转膜后，以针对MBP的单抗作免疫印迹检测。图中p1为筛选得到的结合肽#1；pC为本发明的寡肽(WTAWW)；pCm(W1-A)表示第一位色氨酸被丙氨酸置换的肽(ATAWW)；pCm(W2W3-AA)表示后两位色氨酸被丙氨酸置换的肽(WTAAA)。

图5显示了本发明的肽俘获乙肝病人血清中的乙肝病毒颗粒的结果。如图所示合成了本发明肽及其变异体(后两个色氨酸被丙氨酸置换)，在合成肽的氨基末端进行了生物素标记。将生物素标记的肽及其变异体分别包被在链霉亲和素偶联的96孔板上，将倍比稀释的慢性乙肝病人的血清(初始病毒滴度为10⁶/ml)与包被板温育，经PBS洗涤后，以HRP偶联的乙肝病毒表面抗原特异的多抗检测俘获的乙肝病毒颗粒。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种分离的肽，所述肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，且所述肽特异地结合乙肝病毒表面抗原大蛋白的前表面抗原区。

本文所用的术语“肽”指氨基酸的聚合物，说明书中所用的“寡肽”、“短肽”、“多肽”和“蛋白”均包括在其定义中。该术语也不排除对肽的表达后修饰，例如与糖基、乙酰基、磷酸基、脂类基团等共价连接的肽也包括在该术语中。该定义内还包括含有一个或多个氨基酸类似物(例如，包括非天然存在的氨基酸、只在不相关生物体系中存在的氨基酸、来自哺乳动物系统经修饰的氨基酸等)的肽、带有本领域技术公知的修饰的肽，例如可对所述肽进行末端生物素标记。

对于所述肽的氨基酸数并没有特别限制，只要所述肽中除所示序列外的其它氨基酸不会影响所示序列与乙肝病毒表面抗原大蛋白的PreS，特别是PreS的乙肝病毒受体接触位点(氨基酸21-47)特异性结合的性质即可。在较佳的情况下，所述肽的氨基酸数目宜为5-30，更佳的为5-20，还要佳的为5-15。

在本发明中，“寡肽”如无特殊定义，指具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。这些氨基酸组成构成了本发明肽具有特异地结合乙肝病毒表面抗原大蛋白的PreS，特别是结合PreS的乙肝病毒受体接触位点(氨基酸序列21-47)的性质的化学和结构基础。术语“短肽”如无特殊定义，指具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列，且能特异地结合乙肝病毒表面抗原大蛋白PreS的肽。因此，在本发明的一个较佳的实施方案中，本发明的肽为具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列的肽。

本发明的“肽”定义中还包括了上述寡肽或短肽的变异体。变异体可以是天然发生的或非天然发生的。这些变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，它可能是一个或多个(较佳的不超过2个)氨基酸的取代、缺失或插入，只要其不从实质上改变所述肽与乙肝病毒表面抗原大蛋白的PreS，特别是PreS的乙肝病毒受体接触位点(氨基酸21-47)特异性结合的功能。

本发明的肽还可与其它基因或基因片断形成融合蛋白。适用于本发明的所述其它基因没有特别限制，几乎所有的基因、基因片断或多聚核苷酸都可用于本发明。代表性的例子包括(但并不限于)：谷胱甘肽S-转移酶(GST)，几丁质结合域(CBD)或麦芽糖结合蛋白(MBP)。

本发明另一方面还涉及编码本发明上述肽的核苷酸序列，以及含有所述核苷酸序列以及与所述核苷酸序列操作性相连的表达调控序列的构建物。所述核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。

本文所用的术语“可操作连接”是指核苷酸序列与包括指导转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列之间的连接。“构建物”是指包含编码本发明的寡肽、短肽、多肽或蛋白的核苷酸序列以及指导其转录起始、翻译起始、转录终止和翻译终止的调控序列的载体或质粒。“载体”指本领域熟知的原核或真核克隆和表达质粒、病毒载体(噬菌体、植物病毒、昆虫病毒、哺乳动物病毒)或其他载体。此外，载体包含一个或多个选择性标记基因，以用于选择转化或转染的宿主细胞的表型，如真核细胞使用的新霉素抗性，大肠杆菌使用的四环素或氨苄青霉素抗性等。

在本发明中，可使用本领域的技术人员熟知的方法将包含编码本发明的寡肽、短肽、多肽或蛋白的核苷酸序列插入到载体中。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。

上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞，以使其能够表达所编码的本发明的寡肽、短肽、多肽或蛋白。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如昆虫细胞和哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、毕赤酵母、果蝇S2或Sf9细胞、哺乳动物CHO、COS、293细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于：磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。

因此，本发明另一方面还提供了含有本发明上述的肽、核苷酸序列或构建物的细胞。

本发明的寡肽、短肽、多肽或蛋白可在细胞内表达、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种方法分离和纯化表达产物。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明另一方面还提供了一种筛选与乙肝病毒前表面抗原区结合的肽的方法，该方法是用乙肝病毒前表面抗原区的融合蛋白作为靶标分子筛选噬菌体随机肽文库来获得所述肽。

如本文所用，“筛选”是指具有特定性质的物质从其原始环境中分离出来。如结合乙肝病毒PreS的短肽从噬菌体随机肽文库中分离纯化，则为筛选。利用靶分子筛选噬菌体展示随机肽文库已成为新药研制中高通量筛选先导化合物的主要方法之一(Cortese R，et al.1996.Selection of biologically active peptides by phage display ofrandom peptide libraries.Curr.Opin.Biotechnol.7：616-621)。由于大肠杆菌系统表达的全长PreS蛋白不可溶，并且极易降解，因此在该技术方案中，所用的乙肝病毒前表面抗原区的融合蛋白宜为原核系统表达的融合蛋白，较佳的可采用大肠杆菌系统表达的融合蛋白，例如乙肝病毒前表面抗原区与选自几丁质结合域、巯基氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白之一的融合蛋白。

本发明还涉及上述肽、核苷酸序列、构建物或细胞在制备预防或治疗乙肝病毒感染或乙型肝炎的药物中的用途，以及含有所述肽、核苷酸序列、构建物或细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的肽、核苷酸序列、构建物或细胞相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述条件)实施，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：用于文库筛选的靶蛋白CBD-PreS，thio-PreS的制备

由于大肠杆菌系统表达的全长PreS蛋白不可溶，并且极易降解，因此我们采用大肠杆菌系统表达的几丁质结合域融合的PreS蛋白(CBD-PreS)和巯基氧还蛋白融合的PreS蛋白(thio-PreS)作为文库筛选的靶蛋白。编码PreS的核酸序列克隆在几丁质结合域的氨基端或巯基氧还蛋白的羧基端。编码CBD-PreS或thio-PreS的原核表达质粒转化大肠杆菌Top10F’(Invitrogen Life Technologies)，在37℃，0.1mM IPTG诱导4小时表达CBD-PreS或thio-PreS。细菌经超声裂解，离心后上清中的CBD-PreS通过几丁质柱(NEB)纯化，thio-PreS通过thio-bond^TM(Invitrogen Life Technologies)纯化，纯化过程均根据相应公司提供的操作流程进行。如附图1a泳道2、1b的泳道3分别所示，纯化后的CBD-PreS和thio-PreS蛋白具有理想的可溶性，且不降解。

实施例2：筛选噬菌体展示随机肽文库获得PreS结合肽

筛选使用的文库是一个噬菌体展示的12随机肽文库，该文库为自制，具体操作如下：反义的单链随机寡聚核苷酸oligo-12由Invitrogen Life Technologies公司合成。序列为5’-ATTGCGGATCCACACC(SNN)₁₂GCCTGCTGCCATTGCTGGCT-3’；其中N表示为随机的A、T、C或者G，S为G或A。同时合成一段互补序列oligo-for：5’-CAGCAATGGCAGCAGGC-3’。随机寡聚核苷酸双链分子由oligo-for和单链随机寡聚核苷酸oligo-12退火并以Taq酶作延伸反应获得。退火反应体系为：5μg oligo-12，3μg oligo-for，5μl 10×退火缓冲液(500mM NaCl，2mM EDTA，100mM Tris/HCl，pH7.5)，补足水至总体积50μl，混匀后置于沸水中，自然冷却至室温。延伸反应体系为，50μl退火反应后产物，5μl 10mM dNTP，20μl 10×Taq酶反应缓冲液(生工公司)，16μl25mM MgCl₂，Taq酶20U，补足水至总体积200μl，于PCR扩增仪上进行延伸反应。延伸反应条件为，52℃ 2min接70℃ 2min，共作10轮循环。以酚氯仿(1∶1v/v)抽提延伸反应产物，加入0.1体积3M NaAC pH4.8，0.5μl糖原(Roche，20mg/ml)，和2.5倍体积的无水乙醇，于-70℃ 1小时沉淀DNA。以BamHI充分酶切随机寡聚核苷酸双链分子，产物经8％非变性PAGE电泳并割胶纯化，测定OD₂₆₀作DNA定量分析。应用SfiI和BamHI双酶切pFuse8载体(以M13噬菌体的p8基因序列取代pCANTAB5E〔Amersham Phamarcia Biotech〕中M13p3基因序列而得到)，纯化的5μg酶切载体中加入1μg酶切的随机寡聚核苷酸双链以足量的T4DNA连接酶14℃连接过夜。同时新鲜制备XL1-Blue F′感受态菌，于1ml感受态菌中混合40μl连接反应产物，每50μl加入0.2cm电转化杯(Bio-Rad)中进行电转化(2.5KV，25μF，200Ω)，共20个转化反应。合并电转化菌，迅速转移至50ml SOC培养基(0.05％NaCl，0.5％酵母抽提物，2％trptone，20mM葡萄糖，2.5mM KCl，pH7.0)中，37℃ 180rpm培养1小时。分别取复苏的菌液0.01μl、0.1μl、1μl和10μl涂布含100μg/ml氨苄青霉素的2×YT(0.5％NaCl，1％酵母提取物，1.6％trptone)平板过夜培养，滴定原始文库的大小。在50ml复苏的菌液中添加氨苄青霉素至50μg/ml，继续培养1小时，再加入10¹²PFU的辅助噬菌体VCSM13(Stratagene)进行超感染，室温静置感染15min，补充氨苄青霉素至100μg/ml，37℃180rpm培养1hr。1000g离心10min，弃除培养上清，菌体重悬于200ml 2×YT培养液中，其中含有100μg/ml氨苄青霉素，12.5μg/ml四环素，35μg/ml卡那霉素，继续培养1小时后，补充卡那霉素至终浓度70μg/ml，37℃250rpm培养过夜。离心转移上清，加入0.2体积PEG8000/NaCl(20％PEG8000，14％NaCl)，放置冰浴1小时，4℃10000g离心20min，沉淀纯化噬菌体，重悬于PBS(13.7mM NaCl，0.27mM KCl，0.14mM KH₂PO₄，0.43mM Na₂HPO₄，pH7.4)中，获得噬菌体形式文库，保存于4℃备用。

对文库中的每一个噬菌体而言，它的p8表面蛋白的氨基端都融合了一段12个氨基酸的随机肽。以实施例1中纯化的CBD-PreS和thio-PreS蛋白为靶蛋白，共设计进行了5轮筛选。为了避免富集结合CBD或巯基氧还蛋白的噬菌体，其中第1、2和第5轮筛选应用融合蛋白CBD-PreS，第3、4轮应用融合蛋白thio-PreS。应用CBD-PreS的筛选首先以约50μl几丁质亲和树脂结合过量的CBD-PreS，偶连蛋白的树脂以PBS充分洗涤3次，加入0.5ml PBST缓冲液以及约10¹⁰-10¹¹的噬菌体文库，在室温下混合、轻柔转动结合约10min；2000g离心2min，移去上清液体，并以PBST旋转洗涤结合噬菌体的树脂4次，每次4min；加入500μl甘氨酸/盐酸缓冲液(1％BSA，0.1MHCl，以固体甘氨酸调节至pH2.2)轻柔转动10min洗脱结合噬菌体，迅速以2M Tris溶液中和。

应用thio-PreS的筛选如下所述，thio-PreS以包被液(PBS，pH8.0)稀释，按每孔1μg/100μl包被微量反应孔(Nunc)，4℃过夜，PBS洗涤两次后，以10％脱脂奶粉于室温封闭2hr。包被孔中加入约10¹⁰-10¹¹噬菌体，室温结合1hr。以PBST洗涤4次，每次15S，最后每孔中加入100μl甘氨酸/盐酸缓冲液，室温静置10min洗脱，并用2M Tris溶液中和。将每轮筛选洗脱的噬菌体感染10ml XL1-Blue F′宿主菌(新鲜培养至OD₆₀₀约0.5)。噬菌体计数、扩增和纯化方法同建库过程所描述。

从最后一轮筛选富集的噬菌体中随机挑选了13个特异结合PreS的噬菌体，它们包含的随机肽的氨基酸序列见下表1。

表1

  编号  氨基酸序列  出现频率  CBD-PreS/CBD^a  1  WTDMFTAWWSTP(SEQ ID NO：2)  4  16  2  NNWWYWWDTLVN(SEQ ID NO：3)  1  12  3  GLWRFWFGDFLT(SEQ ID NO：4)  2  10  4  GGWTQWWWTAFY(SEQ ID NO：5)  1  10  5  QMMLTLLWAFWY(SEQ ID NO：6)  1  9  6  MSEALWTAWTQW(SEQ ID NO：7)  1  9  7  WVEYMYSWIPTA(SEQ ID NO：8)  1  6  8  MTGRLISWWWSL(SEQ ID NO：9)  1  5  9  GLWRFWFGDFLT(SEQ ID NO：10)  1  5

a：相同实验条件下，同一种噬菌体结合CBD-PreS的数量与结合CBD的数量的比率，该比率直接反映所述噬菌体结合PreS的特异性。氨基酸以通用的单字母缩写形式表示。

实施例3：代表性肽结合于PreS的氨基酸21-47区段

发明人选择结合特异性相对较高和出现频率较大的三种肽(编号1、2、3)作进一步的分析。为了验证上述肽结合在PreS蛋白的哪个区段，在大肠杆菌系统中表达了麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein，MBP)融合的PreS的不同区段(如附图2所示)，以及与GST融合的上述结合肽。具体是GST-#1、GST-#2和GST-#3，使偶联有GST融合的结合肽的Sepharose凝胶珠与MBP融合的PreS的不同区段(PreSaa1-177、aa1-65、aa47-177、aa21-47、aa1-20)在室温下温育，以PBS缓冲液洗涤去除非特异性吸附后，对结合产物进行SDS-PAGE电泳，转膜后，以针对MBP的单抗(NEB)作免疫印迹检测。结果如附图2所示，这些肽均结合于PreS的氨基酸21-47区段，这一区段恰好是PreS上的所谓乙肝病毒受体接触位点。

实施例4：PreS(氨基酸21-47)的结合肽所具有的保守氨基酸序列

由于上述代表性肽均结合于PreS的氨基酸21-47区段，因此可以将这些结合相同区段的肽进行序列比对，从而推导出这些结合肽所包含的保守氨基酸序列，也即本发明的寡肽(如图3所示)。

实施例5：本发明的寡肽的突变分析

为了验证本发明的寡肽所含氨基酸的重要性，我们对序列中的个别氨基酸进行了突变分析，具体是分别将本发明的寡肽的第一位或后两位色氨酸变为丙氨酸。在大肠杆菌系统中分别表达了GST融合的寡肽及其变异体。具体是pC〔WTAWW〕、pCm(W1-A)〔ATAWW〕和pCm(W2W3-AA)〔WTAAA〕。将这些融合物分别与MBP融合的PreS(aa1-65)区段进行结合实验。如附图4所示，变异体pCm(W1-A)和pCm(W2W3-AA)与PreS(aa1-65)区段的结合能力显著降低，说明实施例4推导出的保守序列中的保守氨基酸是本发明的寡肽结合PreS所必需的。

实施例6：本发明的寡肽可俘获乙肝病人血清中的乙肝病毒颗粒

目前，早期培养的人原代肝细胞是人乙肝病毒能够感染的唯一体外模型，但由于组织来源非常有限，且实验重复性不易保证，因此在实际研究中难以经常应用。本实施例中采用乙肝病毒的俘获实验来证明本发明的寡肽与乙肝病毒颗粒的结合能力。如图5所示合成本发明肽及其变异体，在合成肽的氨基末端进行了生物素标记(由上海吉尔公司合成和标记)。野生型的序列为：生物素-S-G-S-G-W-T-N-W-W-S-T，变异体的序列为生物素-S-G-S-G-W-T-N-A-A-S-T，其中S-G-S-G为间隔臂，将生物素标记的肽及其变异体分别包被在链霉亲和素偶联的96孔板上，将倍比稀释的慢性乙肝病人的血清(初始病毒滴度为106/ml)与包被板温育，经PBS洗涤后，以HRP偶联的乙肝病毒表面抗原特异的多抗检测俘获的乙肝病毒颗粒。如图5所示的结合曲线可见，本发明的肽能特异地结合乙肝病人血清中的病毒颗粒，其变异体则失去了结合病毒颗粒的能力。这显示出本发明的寡肽作为特异的竞争性抑制剂阻断乙肝病毒感染人肝细胞的应用前景，为研制新型抗乙肝病毒感染药物奠定了基础。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                             序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽及其用途

<130>044825

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>Trp或Phe

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<220>

<221>misc_feature

<222>(2)..(3)

<223>任意氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

<223>Trp或Phe

<400>1

Xaa Xaa Xaa Trp Xaa

1               5

<210>2

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>2

Trp Thr Asp Met Phe Thr Ala Trp Trp Ser Thr Pro

1               5                   10

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

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<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>3

Asn Asn Trp Trp Tyr Trp Trp Asp Thr Leu Val Asn

1               5                   10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>4

Gly Leu Trp Arg Phe Trp Phe Gly Asp Phe Leu Thr

1               5                   10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>5

Gly Gly Trp Thr Gln Trp Trp Trp Thr Ala Phe Tyr

1               5                   10

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>6

Gln Met Met Leu Thr Leu Leu Trp Ala Phe Trp Tyr

1               5                   10

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>7

Met Ser Glu Ala Leu Trp Thr Ala Trp Thr Gln Trp

1               5                   10

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>8

Trp Val Glu Tyr Met Tyr Ser Trp Ile Pro Thr Ala

1               5                   10

<210>9

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>9

Met Thr Gly Arg Leu Ile Ser Trp Trp Trp Ser Leu

1               5                   10

<210>10

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>人乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前表面抗原区结合肽

<400>10

Gly Leu Trp Arg Phe Trp Phe Gly Asp Phe Leu Thr

1               5                   10