生物可降解性基因释放血管内支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种生物可降解性基因释放血管内支架，由高分子支架材料和原癌基因c－myc的反义核苷酸序列制成，其中：高分子材料选自聚乳酸、聚己内酯和L－乳酸/乙交酯共聚物中的两种或三种；原癌基因c－myc的反义核苷酸序列为acgttgaggggcat。本发明的优点是：支架由降解速率可控的多种高分子材料与防止再狭窄的基因结合制成，具有良好的机械强度和生物相容性，防治在血管再狭窄效果明显，使用安全；本发明制备方法简单、可控性强，便于实施。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物可降解性基因释放血管内支架及其制备方法，尤指一种含有针对原癌基因c-myc的反义核酸的可生物降解的高分子支架及其制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

经导管介入治疗是血管阻塞性疾病最常用的治疗手段之一，尤其是经皮穿刺腔内冠状动脉成形术(PTCA)是冠状动脉阻塞性疾病非常有效的治疗方法。目前临床使用的金属支架对人体来讲是一种异物，可引起人体的炎症反应，令人对其长期的安全性有疑虑。而且金属支架对动脉管壁也可造成损伤，引起炎症反应。后者激发人体的免疫系统，使免疫细胞在支架部位堆积，引起再狭窄。

为解决上述问题，发明人曾发明过一种生物可降解的药物复合高分子支架材料，其制备方法见中国专利ZL02104071.0。将高分子聚乳酸、聚己内酯和抗再狭窄药物溶于溶剂中；将制备的溶液倒入容器中，成膜，制成细丝；再将细丝在由L-乳酸和乙交酯共聚物、溶剂及抗再狭窄药物制备的混合溶液中浸蘸晾干，或冷冻干燥；然后在抗凝血溶液中浸泡，晾干；将细丝缠绕于模具上，热固成型。其中溶剂为氯仿、1，4二氧六环及二甲基亚砜；抗再狭窄药物为紫杉醇、紫杉特尔、芳维甲酸乙酯、普罗布考、地塞米松、西罗莫司；抗凝血溶液由羧基化硫酸酯化壳聚糖水溶液或肝素钠水溶液与丙酮混合配制。可降解高分子支架有较好的生物相容性，并可最终在体内降解消失，避免对人体的长期影响。高分子材料可以方便的通过吸附接枝等手段携带缓释药物，达到防止凝血和再狭窄的目的。该支架的使用效果良好，但是制备工艺相对复杂，比如为了使吸附药物的含量增加，需要通过冻干工艺在支架上造孔。

原癌基因c-myc(命名：v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog；GENEBANK中ID号：4609；基因序列号：NM-002467)也被称为早期快速反应基因，在平滑肌细胞周期的启动与维持中起重要作用，其编码的转录因子为DNA结合蛋白，进入细胞核内促进与肌细胞增殖相关的基因的激活，产生大量的生长因子样物质，刺激平滑肌细胞由静止的G₀期进入增殖的G₁期，从而诱导平滑肌细胞增殖。

反义技术的基础是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列的反义核酸，进入细胞与靶序列特异性结合，从而抑制特定基因的表达，该技术主要应用于肿瘤及增生性疾病(如瘢痕)的治疗领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够从分子水平有效防止血管再狭窄和凝血栓塞出现的新型生物可降解性基因释放血管内支架。

本发明的另一个目的是提供这种新型生物可降解性基因释放血管内支架的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种生物可降解性基因释放血管内支架，由高分子支架材料和原癌基因c-myc的反义核苷酸序列制成，其中：

高分子材料选自聚乳酸(PLLA)、聚己内酯(PCL)和L-乳酸/乙交酯共聚物(PLGA)中的两种或三种；

原癌基因c-myc的反义核苷酸序列选择引导mRNA启动子周围的序列，以针对mRNA的次级结构区域发挥效应，长度为12-15个碱基，例如：aacgttgaggggcat。

所述PLLA的分子量为10万至30万，PCL的分子量为10万至30万。

所述L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量为5万至15万。

本发明使用的高分子材料的安全性和可靠性均经过医疗实践证明。PLLA具有良好的硬度强度性能，加入一定量的PCL则可以提高支架的弹性，所以在支架的骨架中使用PLLA和PCL的混合物。随着高分子材料的降解，原癌基因c-myc的反义核苷酸序列或药物在局部被缓释到血液中，既可以发挥长时间的疗效，省去多次体外注射，也可以使药物对身体其他部分的副作用降到最小。

为了减少反义核酸失活和控制缓释的速度，支架表面还可设有L-乳酸/乙交酯共聚物缓释涂层。将反义核酸序列添加该材料中，涂敷在支架材料的表面，通过调整L-乳酸和乙交酯在共聚物中比例，可以调整聚合物的降解速率，控制反义核酸序列释放的速度。

一种生物可降解性基因释放血管内支架的制备方法，PLLA和PCL用氯仿溶解至质量体积浓度为1-20％，加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为0.01-1mol/ml，除去溶液中气泡，成膜并制成直径为0.1-0.6mm的细丝，于30-100℃下用模具固定成型。

一种生物可降解性基因释放血管内支架的制备方法，溶液1为PLLA和PCL用氯仿溶解至质量体积浓度为1-20％，除去溶液中气泡，成膜并制成直径为0.1-0.6mm的细丝，用模具固定成型；溶液2为PLGA用氯仿溶解至质量体积浓度为0.01-15％，加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为0.01-10mol/ml；固定成型后的细丝浸蘸溶液2后，取出于0-30℃下晾干。

所述所述PLLA的分子量为10万至30万，PCL的分子量为10万至30万，L-乳酸/乙交酯共聚物的分子量为5万至15万。

原癌基因c-myc的反义核苷酸序列为aacgttgaggggeat。

所述制成直径为0.1-0.6mm的细丝的方法为模具成型或挤压成型。

所述用模具固定成型为用模具将成膜后的细丝固定为Z形或螺旋构形。

本发明的优点是：支架由降解速率可控的多种高分子材料与防止再狭窄的基因结合制成，具有良好的机械强度和生物相容性，防治在血管再狭窄效果明显，使用安全。制备方法简单、可控性强，便于实施。

具体实施方式

实施例1

一.材料和来源

PLLA分子量为30万，购自成都有机化学有限公司

PCL分子量为10万，购自成都有机化学有限公司

氯仿，购自成都有机化学有限公司

原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，委托上海生工公司合成，序列为acgttgaggggcat。

二.制备方法

PLLA和PCL(质量比为50％∶50％)用氯仿溶解至质量体积浓度为10％，搅拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为0.01mol/ml，充分搅拌并静置除去溶液中气泡；将溶液倒在条形模具中，在30℃下让溶液挥发成膜并制成宽度和厚度为0.1mm的细丝，将细丝缠绕于模具上，于37℃下用固定为Z形构形。

实施例2

一.材料和来源

PLLA分子量为20万，购自成都有机化学有限公司

PCL分子量为30万，购自成都有机化学有限公司

其余同实施例1

二.制备方法

PLLA和PCL(质量比为70％∶20％)用氯仿溶解至质量体积浓度为20％，搅拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为0.1mol/ml，充分搅拌并静置除去溶液中气泡；将溶液倒在条形模具中，在30℃下让溶液挥发成膜并制成宽度和厚度为0.6mm的细丝，将细丝缠绕于模具上，于37℃下用固定为螺旋构形。

实施例3

一.材料和来源

PLLA分子量为10万，购自成都有机化学有限公司

PCL分子量为30万，购自成都有机化学有限公司

其余同实施例1

二.制备方法

PLLA和PCL(质量比为40％∶60％)用氯仿溶解至质量体积浓度为20％，搅拌，充分溶解；加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为1.0mol/ml，充分搅拌并静置除去溶液中气泡；将溶液倒入一具有小孔的容器中，在30℃下让溶液挥发到一定程度后从小孔中挤出，控制挤出速率和孔径，制成直径为0.6mm的细丝，将细丝缠绕于模具上，于37℃下用固定为螺旋构形。

实施例4

一.材料和来源

PLLA分子量为10万，购自成都有机化学有限公司

PCL分子量为10万，购自成都有机化学有限公司

PLGA分子量为5万，购于成都有机化学有限公司

其余同实施例1

二.制备方法

溶液1为PLLA和PCL(质量比为50％∶50％)用氯仿溶解至质量体积浓度为1％，静置除去溶液中气泡，将溶液倒在条形模具中，在30℃下让溶液挥发成膜并制成厚度和宽度为0.1mm的细丝，在40℃下用模具固定为Z形构形；

溶液2为PLGA(L-乳酸∶乙交酯＝50％∶50％)用氯仿溶解至质量体积浓度为0.01％，加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为0.01mol/ml充分搅拌并静置除去气泡；

固定成型后的细丝浸蘸溶液2后，取出于0℃下晾干。

实施例5

一.材料和来源

PLLA分子量为30万，购于成都有机化学有限公司

PCL分子量为30万，购于成都有机化学有限公司

PLGA分子量为15万，购于成都有机化学有限公司

其余同实施例1

二.制备方法

溶液1为PLLA和PCL(质量比为20％∶80％)用氯仿溶解至质量体积浓度为20％，静置除去溶液中气泡，将溶液倒入一有孔容器中，在30℃下让溶液挥发一段时间后从小孔中挤出，控制挤出速率和孔径，制成直径为0.6mm的细丝，在100℃下用模具固定为螺旋构形；

溶液2为PLGA(L-乳酸∶乙交酯＝10％∶90％)用氯仿溶解至质量体积浓度为15％，加入原癌基因c-myc的反义核苷酸序列，使其浓度为10mol/ml充分搅拌并静置除去气泡；

固定成型后的细丝浸蘸溶液2后，取出于30℃下晾干。

实施例6

一.材料：

试验用小型猪40头；中国人民解放军总医院动物试验中心提供。

生物可降解基因释放支架40支，按照实施例4制备。

生物可降解裸支架40支，清华大学材料工程系提供。

二.方法

将生物可降解基因释放支架与裸支架分别置入试验小型猪的两侧肾动脉内，定期处死实验动物，观察两侧肾动脉支架置入段内膜增生情况。

三.结果

生物可降解基因释放支架置入段血管光镜观察结果：支架置入后1周，支架杆部可见少许纤维组织和少量血小板沉着；置入后2周，于支架杆部周围可见少量新生内膜生成，偶见炎性细胞浸润，多为淋巴细胞和巨噬细胞，未见中性粒细胞；裸支架周围也可见炎细胞浸润；置入后4周，基因支架杆大部分被新生内膜覆盖；裸支架部分被内膜覆盖；8周时支架完全被内膜覆盖，未见明显内膜增生，管壁光整，管腔通畅，炎性细胞消退；裸支架仍未完全被内皮覆盖；12周时基因支架血管标本经手压迫触摸，支架段血管弹性显著，仍有较强的支撑力与裸支架相似。支架置入后6个月可见支架不完全降解，9个月后支架几乎完全降解，支架段血管弹性显著，管腔通畅。

电镜观察结果：置入4周后，覆盖于支架表面的内皮细胞发育成熟，排列规则紧密，形态与邻近血管内膜相似。

再狭窄发生率，基因支架组为10％，裸支架组为30％，差异具有统计学意义。

四.结论

生物可降解基因释放支架可有效抑制血管再狭窄的发生。