表达人乳铁蛋白的重组菌株及其培养方法

摘要

本发明的一方面提供了一种能高效表达人乳铁蛋白的重组菌株，具体来说提供了重组菌株hLF/pPIC9K/SMD168。另外，本发明还提供了培养该菌株的方法。采用上述重组菌株和培养方法，能高效地表达出具有抗菌作用的人乳铁蛋白，节约生产成本，节省纯化时间，有利于产品的批量生产。

说明书

发明领域

本发明涉及到一种重组菌株，该菌株能高效表达人乳铁蛋白。另外，本发明还提供了培养该菌株的方法。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种相对分子量约为80kDa的铁结合性糖蛋白，主要存在于哺乳动物的各种外分泌物中，如乳汁、眼泪、唾液等。LF具有许多独特的生物学功能：增强铁的传递和吸收；光谱的抗菌性；免疫作用；抗氧化作用；促进肠道菌群的平衡；作为生长因子；抗炎症；抗病毒；抗癌作用等。

目前，应用的LF主要是从乳清中分离的天然蛋白，每公斤价格约为1000美元，成本较高。为了更广泛地应用LF，必须获得廉价的重组蛋白，因此应得到高效表达重组LF的转基因生物，以满足市场需求。

Patrick H.C等描述了用转基因牛的奶大规模生产重组人乳铁蛋白(rhLF)的方法(参见Patrick HC.，van Berkel，Mick M，Welling等，Large scale production ofrecombinant human lactoferrin in themilk of transgeniccows[J].Transgenic Research，2000，9：71-78)，其方法为：首先分离hLF的人类基因编码，随后将其与乳腺特异性表达调节元件牛α-S1酪蛋白基因相连接，用显微注射技术将构建号的载体DNA直接注射入牛受精卵的原核中，并将被注射的受精卵移入假孕母牛输卵管内继续发育，妊娠后出生的幼崽为转基因牛，在它们的泌乳期选择乳汁中表达有hLF的母牛，表达hLF量最高的母牛产下的第二代公牛，作为第三代转基因牛的父代，在进行繁殖得到转基因牛。该方法在牛奶中生产浓度可达每升数克级的rhLF。曹阳等通过PCR法克隆了hLF基因cDNA，山羊-乳球蛋白基因5’端调控序列，连接后克隆到表达载体pLNCX中。利用脂质体包裹的方法将乳腺特异表达重组质粒导入到小鼠乳腺癌细胞中，并在细胞中表达出具有活性的rhLF，从而为实现hLF基因的乳腺表达奠定了基础。他们得到的34kDa rhLF具有抑制大肠杆菌生长的作用，而且较hLF标准样品抑菌作用还强(参见曹阳等，人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究【J】.遗传，2002，24(1)：9-14)。

最近日本农水省生物资源研究所等单位开发出一种基因重组番茄。他们将人体乳腺中产生的hLF基因导入了番茄品种“秋玉”之中。实践表明，番茄“秋玉”的果实、叶、根的部分能生成hLF，在果实中，每100g质量可生成2.5～3.3mg的hLF(参见凌雪萍等，乳铁但不的最新研究进展【J】.食品科学，2003，24(1)：160-163)。

在用微生物生产hLF方面，Liang和Tom报告了hLF啤酒酵母(S.cerevisiae)中的表达。通过克隆的cDNA置于胶木鳌合素(chelatin)启动子的调控下，hLF成功地在酵母细胞中何处然后通过酵母转化酶分泌信号序列将rhLF分泌到细胞外，产率为1.5～2.0mg/L(参见Liang Q，Richardson T.Expression of human lactoferrin inS.cerevisiae[J].Agric Food Chem.1993，41：1800-1807)。ward等报告了有乙醇可诱导酒精脱氢酶启动子控制的hLF在构巢曲霉(A.nidulans)中的表达，rhLF的生产水平为5mg/L，但只有30％的rhLF分泌到细胞外(参见Ward PP.，May GS等，An inducibleexpression system for the production of human lactoferrin in Aspergillus nidulans[J].Gene，1992，122：219223)。

发明内容

本发明的一方面提供了一种能高效表达人乳铁蛋白的重组菌株，具体来说是重组菌株hLF/pPIC9K/SMD168(保藏地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO 1143，保藏日期：2004年4月29日。)，该菌株通过用重组质粒hLF/pPIC9K转化蛋白酶基因缺陷型菌株SMD1168和G418筛选而获得。

本发明的另一方面提供了培养上述菌株的优化方法。本发明采用常规的发酵罐培养上述菌株，优化的培养条件如下：

(1)pH值：pH＝3.0-3.5；

(2)诱导温度和时间：30℃时诱导72-96h；

(3)补料工艺：采用碳源饥饿法，设定溶氧90％为补料控制点，进行甲醇和甘油混合补料。

采用上述重组菌株和培养方法，能高效地表达出具有抗菌作用的人乳铁蛋白，节约生产成本，节省纯化时间，有利于产品的批量生产。

附图说明

图1不同抗G418能力与产量的关系。每组挑取5个菌落摇瓶实验(8mg组除外)，纵轴表示平均产量(mg/L)，数据通过摇瓶实验获得，测定方法采用酶免法，误差在10％范围内。

图2Dot Immunobloting实验确定摇瓶条件下最佳起始pH。诱导起始pH从1～7分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

图3、摇瓶条件下酸度与产量的关系。

图4、产物在发酵罐中随时间积累的western检测。lane1～7：marker；12hours；24hours；36hours；48hours；60hours；标准品。

图5：纯化前蛋白混合液的HPLC检测(箭头所示为乳铁蛋白吸收峰)。A：培养基中蛋白组分的HPLC分析；B：1g/L蛋白标准品溶于培养基溶液中的测定结果。

图6，纯化蛋白记录。

图7纯化后蛋白和标准品蛋白HPLC检测结果对比。A：透析后纯化产物；B：纯水溶解的标准品(99％，Sigma)。

图8纯化后样品的SDS-PAGE检测。lane1：marker；lane2：标准品，水溶解，1g/L，上样量：5μl；lane3：纯化后的浓缩样品，上样量：5μl。

图9重组蛋白的糖基化分析。A：蛋白电泳；B：western检测.lane1：发酵上清溶液(5μl)；lane2：NGase F处理的发酵上清；lane3：标准品经PNGase F处理(1g/L，5μl)；lane4：标准品(1g/L，5μl)；lane5：marker。

图10平板法测定不同纯化阶段重组乳铁蛋白的抑菌效果(大肠杆菌)。1.氨苄青霉素(2万单位)；2.样品a；3.样品b；4.样品c；5.样品d；6.空白对照。

具体实施方式

1材料与方法

1.1培养基

1.1.1摇瓶发酵用培养基

MGY培养基：1.34％YNB，1％甘油，4×10^-4％生物素。其中，YNB和生物素需要过滤除菌。

BMMY培养基：1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，100mM K₂HPO₄-KH₂PO₄ pH6.0，1.34％YNB，4×10^-4％生物素，0.5％甲醇。

1.1.2发酵罐用培养基：

丰富培养基：1.34％YNB，4％甘油，4×10^-4％生物素，1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，补料：50％甘油+2.68g/L YNB或者30％甲醇+1.34％YNB

基本无机盐培养基：每升培养基中含有：26.7ml 85％H₃PO₄，0.74g CaSO₄，18.2g K₂SO₄，14.9g MgSO₄*7H₂O，4.13g KOH，40g甘油。

微量元素：6.0g GuSO₄，0.8g KI，3g MnSO₄*H₂O，0.2g Na₂MoO₄*2H₂O，0.2g H₃BO₃，0.5gCaSO₄*2H₂O，20g ZnCl₂，65g FeSO₄*7H₂O，0.2g Biotin，5ml 98％H₂SO₄。过滤除菌后以2ml/L加入基本无机盐培养基中。补料：2ml/L加入50％甘油中或50％甲醇中。

1.2发酵设备概况

1.2.1KLF2000型3.7升发酵设备

该设备由瑞士比欧公司研制生产，具有温度控制，通气量控制，溶氧显示和控制，pH显示和控制，搅拌转速控制，可原位灭菌等优点，不经任何改装就可用于毕赤氏酵母的发酵生产实验。该设备采用模块化设计，各模块之间既可单独工作，也可以关联使用，还可以电脑集成。

该发酵设备的供气系统采用压缩空气，经0.2μm烧结陶瓷过滤后供到罐内，在底部多孔通气管出气，顶部排气，排气孔和罐内的连接也设计一过滤器，这样防止在内压低于外压时外界空气污染。

通气量在发酵毕赤氏酵母时特别重要，通气量通常用如下公式计算：

$>>G>=>F>*>>>>P>2>>>P>1>\; >>>>>T>1>>>T>2>\; >>>s>$

G：实际通气量L/min

F：空气流量表读数L/min

P2：进气管气压bar

P1：出气管气压bar

T1：罐内温度273+℃

T2：管道气温273+℃

KLF2000型3.7升发酵罐可以达到最大通气量300L/h，可以达到中等密度发酵的要求。

温度控制采用数字控制加热/冷却装置，加热器最大功率2000瓦，数控调节输出功率，冷却装置采用外接冷却循环水，由控制器控制电磁阀来精确控制温度，温度波动在0.5％范围内。此外，原位灭菌也通过温度控制系统来实现，一般采用115℃30分钟。

溶解氧的影响因素很多，通气量，搅拌转速，补料速度，罐内压力，甚至消泡剂都可以大幅度影响溶解氧的含量，通常在没有外接纯氧的情况下通过调整补料速度来控制溶解氧以使酵母不至于窒息。

1.2.2LP351 42L型发酵罐

该发酵罐也是瑞士比欧公司产品，整体为不锈钢设计，需要外接蒸汽和冷却循环水来控制温度。使用蒸汽通过热交换器，夹套的过热水加热。其他控制系统与KLF2000型发酵罐类似，但对安全有更高的要求。

1.3灭菌与接种

摇瓶培养基(MGY)采用高压锅灭菌，挑取单菌落，在1L的三角瓶中装大约200ml培养基(MGY)，摇瓶2天，达到OD₆₀₀约12-15，接种3.7L发酵罐(丰富培养基)。发酵罐的基本无机盐培养基用115℃30分钟灭菌，在3.7升罐中培养24小时，达到OD₆₀₀约60左右，接种到42升发酵罐(丰富培养基)。42升发酵罐的灭菌也是115℃30分钟，在给42升发酵罐灭菌的同时灭菌无菌传送线和两端阀门。

通常毕赤氏酵母的接种量为1/10，这样可以保持菌的高活力。

1.4发酵方法

1.4.1三段发酵

该方法对于3.7L\42L发酵罐都适用，首先将发酵罐的温度设置为30℃，pH设置为5.0，并自动控制，通常pH值的调节使用磷酸和氨水。对于KLF2000型3.7升发酵罐，将通气量设置为每升培养基3L/min，可以通过调节压力来达到，对于LP351型42升发酵罐，可以达到最大每升培养基5L/min或更高，固定通气量不动。甘油的起始浓度设置为4％。接种后随着菌密度的增加，溶氧迅速下降，将溶解氧控制器与搅拌转速控制器关联，搅拌转速设置为200-800rpm。当甘油耗竭时，溶氧显示迅速升高，此时，OD₆₀₀达到60-70，打开自动补料系统，使之与溶氧关联控制，通过设置补料控制器的PID参数，使补料平稳，溶氧波动在30±5％左右，这样培养OD₆₀₀可最大达到600。当OD₆₀₀达到400以上时，需要加大通气量，并加大管道压力，使之达到每升培养基6L/min，三段发酵对于通气量的要求极严格，往往需要将排气过滤器去掉以达到较高的数值。

由于HLF/pPIC9K/SMD1168菌株的AOX1基因被插入失活，其基因型是Mut^s型的，甲醇诱导阶段只需要在甘油耗竭之后半小时(此时溶氧可达到110以上)，这时，以1ml/Lhr的速度流加甲醇，在4小时后，增加到3ml/Lhr，这时溶氧显示会下降5％左右，诱导60小时结束发酵过程，在整个诱导过程中，菌密度基本维持在诱导前的状态。

1.4.2改良2段发酵

与三段发酵的不同点在于当培养基中最初的4％甘油耗尽后，直接以混合碳源诱导培养，当甘油耗竭30分钟后，以1∶1，1∶2，1∶5，1∶8的甘油/甲醇比例进行诱导培养，此时溶解氧设置在70％，以保证甘油的不足和甲醇的过量，这种条件下，菌密度稳步上升，在诱导结束时OD₆₀₀可以达到300-350。整个过程通气量维持在每升培养基5L/min，整个诱导过程需要96小时。

1.4.3继续培养过程中和诱导过程中DO跃迁时间的检测

DO跃迁时间是指在转速恒定在800rpm，通气量恒定时，关闭补料泵，看溶氧升高10％所需要的时间，在继续培养和诱导过程中DO跃迁时间需要经常检查以确定是否有碳源的积累，如果碳源过量会导致生长过快，特别在两段发酵时，控制碳源的量以控制生长速度往往可以得到良好的效果。有研究证明甲醇不足时AOX1启动子的效率提高近10倍。

1.5超滤

超滤器采用Pall公司的Centramate系统，其50KD 0.1m²膜包足以截留乳铁蛋白。每次在使用膜包之前，首先用蒸馏水彻底清洗，具体方法是：完全打开进液和回液阀，关闭滤液出口，以1L/min的速度冲洗2分钟，以去除膜包中的NaOH，然后关闭回液阀，以0.5L/min的速度冲洗1分钟，注意整个处理时间内压力不能高于30psig。在使用之前最好用与待过滤的蛋白原料相同的缓冲溶液冲洗该系统。这样，可以达到pH与离子强度的稳定一致，并去除气泡。

在膜包的整个使用过程中，要经常检测水通量，水通量的测定方法如下：

NWP₂₀＝WFF/TMP×TCF

NWP₂₀：20℃时标准水通量

WFF：水滤出速度(L/hr·m²)

TMP：过膜压力(Psig)

TCF：温度矫正因子

如果水通量低于60％的初始水通量，则需要清洗。一般对于蛋白类，首先使用蒸馏水将缓冲液冲进液/回液通路中冲掉，然后冲洗滤出通路。检查水通量，如果恢复不到95％，用1L0.5N NaOH冲洗膜包，之后用1L0.1N NaOH冲洗膜包，之后用2L纯水冲洗膜包，每次冲洗都是先进/回液通路，后滤出通路。冲洗完成后再测定水通量，需要达到95％以上的初始水通量之后方可继续使用。

在使用完膜包后需要再用以上方法彻底冲洗膜包，然后用0.1N NaOH在30Psig下循环10分钟，将膜包取出，完全浸泡在0.1N NaOH中保存。

除NaOH之外，其他的清洁剂也可使用，对于Centramate膜包来说，0.5NNaOH+200-400ppmNaClO为最佳清洁剂。

此外，0.1-0.5M H₃PO₄(25-35℃)，30-60分钟对高等电点杂质有效。

Triton X-100或SDS处理30-90分钟对脂肪、油、蛋白等杂质有效。

酶类，如胰蛋白酶、P3 ultrasil 56对清洗被细胞碎片严重堵塞的膜有效。

1.6Heparin CL-6B亲和层析纯化

蛋白分泌到培养基中需要很容易地纯化下来，由于乳铁蛋白能特异结合肝素，使用肝素亲和层析能很容易地纯化到所需要的蛋白。经过超滤后，溶液中的蛋白约50％都是所需要的蛋白。经过进一步亲和层析，纯度能达到95％以上。具体的方法是：每2升菌液(约含1克纯乳铁蛋白)，超滤脱盐后的冻干粉溶于50mM K₂HPO₄-KH₂PO₄ pH8.550mM NaCl溶液50ml中。在25cm×2cm的玻璃柱中填充50mlHeparin CL-6B FF柱，使用50mMK₂HPO₄-KH₂PO₄ pH8.550mM NaCl溶液平衡5个柱体积，以100ml/hr的流速平衡。然后上样，继续平衡2个柱体积。以50-1500mMNaCl250ml梯度洗脱，洗脱液收集在99管的部分收集器中，以紫外吸收的0.5A挡自动记录，将收集的溶液每个峰做免疫点杂交以确定阳性峰，然后将阳性峰(通常就一个)透析、冻干。

1.7HPLC检测

HPLC紫外检测采用SHIMADZU公司SPD-10A vp，平流泵采用SHIMADZU公司LC-10A vp，采用C-18色谱柱，由大连依利特公司提供，填料是Hypersil 300A C18 5μm，柱长200mm，管径4.6mm。

流动相采用80∶20乙晴∶H₂O，同时含有0.1％三氟乙酸，样品经过过滤，透析之后直接上样，流量为4ml/min。

1.8抑菌活性检测

菌株及菌液制备：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门杆菌及志贺菌均通过商业途径获得。取试验菌种，接种于5ml LB培养基中，37℃培养过夜，制成1×10⁸pfu/ml的菌悬液；

乳铁蛋白样品制备

分为如下几组，在pH值都在7.5左右情况下，比较盐浓度对乳铁蛋白抑菌性能的影响：

a组，超滤前发酵液，该样品含多种盐类，；

b组，超滤后发酵液，盐浓度很低；

c组，透析前纯化产物，盐浓度在0.6M左右；

d组，透析后纯化产物，盐浓度小于0.01M。

上述四组样品均为用去离子水溶解等量冻干品制备，浓度为20mg/ml。

重组乳铁蛋白抑菌试验及其效价测定

采用试管培养和平板培养两种方式检测重组乳铁蛋白的抑菌活性。

(1)平板培养：将含1×10⁸pfu/ml的细菌悬液均匀涂布于LB培养基上，取上述制备的乳铁蛋白样品100μL加入培养基上的抑菌杯中，37℃培养过夜，通过测定抑菌环大小，确定不同样品的抑菌情况。另外，以同样方法测定了对大肠杆菌、沙门菌及志贺菌等肠道菌群的最小抑菌浓度。

(2)试管培养：在1ml LB培养基中分别加入乳铁蛋白样品100μL和100μL菌液，37℃培养16小时后测定OD₆₂₀。

(3)重组乳铁蛋白的效价测定：采用平板培养法。取20mg重组乳铁蛋白与不同量的氨苄青霉素进行比较，确定其抑菌效价。

以上所有试验均设立空白组或氨苄青霉素组作为对照。

2结果与讨论

2.1通过使用重组pPIC9K质粒获得多拷贝插入的菌株

pPIC9K质粒在多克隆位点上EcoR1和NOT1位点上插入hLF基因，在5’AOX1 Sac1位点线性化，转入SMD1168菌株，首先将随机挑选的300株His+克隆子分别接种到5mL YPD培养基，28℃摇培36h，然后用接种针将每个科隆子转接种于90mm含有不同浓度G418的YPD培养皿上，每个培养皿接种30个克隆子，28℃培养3-5天后观察克隆子在不同浓度G418培养基上的生长情况。，结果见下表：

                                       表1、G418梯度筛选

  G418浓度   (mg/ml)   0.5   1.0   2.0   4.0   8.0  菌落个数  300  268  31  1  1  对应的拷贝   数   ≥1   ≥1   ≥2   ≥5   ≥5

由表中可以看出，多拷贝转化子大约占总数的10％，事实上，当G418的浓度等于4mg/ml时，拷贝数在5-7，而且抗性大于4mg/ml时不能简单确定拷贝数，需要用其他的方法确定(Mike Romanos et al.1998)。抗性4mg组和8mg组实际上是同一株。

单拷贝的转化子的表达能力有时非常低，在本实验中，代表单拷贝的转化子分泌重组人乳铁蛋白的能力很低，随拷贝数的增加，产量大幅度上升。其他的研究也有类似的报导()。拷贝数与产量的关系很复杂，具体的产量需要实验分析。图1是基因拷贝数与产量关系的直方图。

从图1中可以看出，增加拷贝数在拷贝数较低时对产量的影响是非常大的，但是再增加对产量的影响并不延续这种趋势。我们确定这株8mg组的菌株为目的菌。

2.2诱导表达过程中pH对产量的影响

SMD1168是pep4-菌株，PEP4基因编码蛋白酶B。毕赤氏酵母共有三种蛋白酶，分别是蛋白酶A、蛋白酶B和羧肽酶Y，其中蛋白酶A和羧肽酶Y的本身活性不高，在蛋白酶B的作用下，蛋白酶A和羧肽酶Y被切割激活。蛋白酶B的缺失菌株仍然存在少量的蛋白酶A和羧肽酶Y活性，可能正是这种原因导致在没有任何抑制剂的无机盐培养基中使极易降解的乳铁蛋白被切成多肽。这些蛋白酶有一个共同的特点是酸抑制。

虽然在pH6.5最适宜表达，但通过设定的pH梯度摇瓶实验表明，pH5.0以下时既可以表达外源蛋白，同时也抑制了蛋白酶的活性，使产物积累(图2和表1)。

    表1、在摇瓶条件下pH与产量的关系

   诱导前pH值   诱导后pH值  产物含量(mg/L   ±10％)  4  2.5  8  4.5  2.6  90  5  2.8  10  5.5  3.3  1  6  4.5  1  6.5  4.6  0.1  7  4.4  0.1

以上实验，可以通过图3来表示。事实上，我们在放大培养的条件下也观察到相似的现象。在3.7升发酵罐的pH梯度实验中，在pH小于3.5时产量最好，但是当pH小于3.0时，产量又会下降，说明这时酸度会抑制酵母的活力。

2.3诱导温度、诱导时间与产量的关系

通过HPLC检测产量，设置不同的诱导温度，发现在小于22℃时产物积累速度会急剧下降，在25-28℃时，产物积累速度与30℃相当，但是通过摇瓶诱导实验发现，30℃时产物积累最快，可能在温度稍低的时候酵母活力保持较好的原因。为此，每次发酵均选择30℃培养。

同时我们设计了一组实验，通过检测酵母的活力来确定产量与诱导时间的关系。将30℃诱导条件下每隔12小时取样一次，每次取样50ml，离心，用蒸馏水反复冲洗细胞，之后，在BMMY培养基中诱导24小时，看这24小时的蛋白分泌量，实验结果如下：

                     表3、不同诱导时间之后酵母分泌蛋白的能力

  取样时间   (小时)   0   12   24   36   48   60   72   84  分泌量   (mg/L)   31.8   10.5   3.4   2.0   1.2   1.6   0.8   0.3

由上表可以得出这样的结论，在30℃的诱导条件下，在诱导12小时后酵母分泌蛋白的活力迅速下降，但至少在前60小时的诱导过程中产物是在不断积累的。因此，本次试验的最佳诱导时间一般采用72小时左右，最长也不超过96小时。

2.4补料策略与产量的关系

由3.3的结果推论，保持酵母活力是提高产量的关键，实践证明，在甲醇为单一碳源且其供应量还要限制其生长的时候，酵母活力持续下降，而如果在补料的初始时间确定在合适的菌密度，并采用混合碳源补料，则可能保持较强的酵母活力。在3.7升发酵罐中，在不同菌密度条件下开始诱导，采用酶免法测定产物，得出结果如下表：

        表4不同菌密度条件下开始诱导的产量(产量测定的误差为10％)

  OD₆₀₀  100  200  300  400  500  产量(mg/L)  250  400  500  480  450产量/OD  2.5  2  1.7  1.2  0.9

由表4可见，并非菌密度越高产量越高，在菌密度较低时，单位酵母产蛋白的量明显高，具体的原因不明。可能在菌密度高时酵母的分泌蛋白活力会降低。在最初的4％甘油中在无机盐的培养基中酵母可以长到最大OD₆₀₀ 60-70左右，这时如果就以混合碳源诱导培养，从42升发酵罐中每12小时取样，常规western检测(见图4)发现：至少在前60小时的诱导过程中产物是在不断积累的，说明在混合碳源中酵母的分泌蛋白活力在前60小时变化不大。

2.5重组蛋白的纯化

图5是纯化前培养基中乳铁蛋白含量的HPLC检测结果。从图中可以看到，在未纯化的蛋白混合液中重组人乳铁蛋白占很大的比例，从峰高推断其产量在1.2g/L左右。

蛋白混合液经过肝素亲和层析后，其分析结果见图6、3.7和3.8。图6是肝素亲和柱纯化乳铁蛋白时，在记录仪上得到的280nm色谱分离曲线。由于混合液中其他蛋白和肝素没有亲和力，所以不能吸附在柱子上，其含量也最多，因此OD₂₈₀最大。随后的吸收峰(箭头所示)为0.5～0.6M NaCl/PBS缓冲液洗脱得到的蛋白吸收峰。该洗脱峰脱盐后经HPLC检测即为目的产物(图7)，从峰高、面积与标准乳铁蛋白(0.6g/L)比较，其浓度大致为660mg/L～800mg/L，与纯化(1.2g/L)前比较，大约损失了30～45％。因此在纯化中应尽量减少处理步骤，以期降低损失率。

而洗脱液浓缩后经SDS-PAGE检测(见图8)发现，除正常分子量大小的乳铁蛋白外，降解的乳铁蛋白片断含量也很高。由于乳铁蛋白的讲解片断的抗菌性更强，并不影响后面的功能试验，因此本实验没有再作其他纯花分离。

2.6重组蛋白的糖基化分析

为了检测重组乳铁蛋白的糖基化水平，本试验利用PNGase-F分别对样品及标准品在相同条件下进行去糖基化分析，结果如图9。从图中可以发现，在去糖基化之前，重组乳铁蛋白和标准蛋白的分子量都明显大于去糖基化后，表明重组乳铁蛋白与天然乳铁蛋白一样，在宿主细胞内发生了糖基化。

2.7重组蛋白的抑菌效果。

抑菌试验结果见图10和表5。从图10中可以发现，不同纯化阶段样品都表现出较强的抑菌作用，其中以c组样品，即透析前纯化产物的抗菌效果最强，其抑菌圈最大直径达20.0mm，其次就是a和d组样品，它们的抑菌圈直径分别为8.5mm和8.0mm，虽然b组的抑菌圈较小，但抑菌杯中不见有任何细菌生长，而空白对照孔可明显看到生长的细菌。试管法结果与平板抑菌实验结果一致(表5)，进一步证明了重组乳铁蛋白与天然蛋白一样，都具有较强的抑菌性能。

  表5试管法测定不同纯化阶段重组乳铁蛋白的抑菌效果

  组别  水  a  b  c  d 氨苄青霉素(2万^u)  吸收值  0.483  0.382  0.389  0.377  0.386 0.076

以上结果表明，不同纯化阶段的重组乳铁蛋白均具有一定的抑菌活性，而一定盐浓度能明显增强重组蛋白的抗菌活性，同时产物浓度越高，其抗菌性能也越强，透析前纯化产物的抗菌活性最强说明了这一点。此外，由于不经任何纯化处理的发酵液就具有明显的抑菌效果，因此有利于大批量生产要求不严格的产品。

进一步研究表明，重组乳铁蛋白的抗菌性能也与细菌种类有关。从测定最小抑菌浓度试验发现(表6)，重组乳铁蛋白对肠道类菌群的最小抑菌浓度在10mg以下，对重组蛋白最为敏感的是大肠杆菌，10mg的重组蛋白能产生直径21mm的抑菌环，其次是志贺菌属，效果最差的是沙门菌。而抑菌效价测定表明，20mg的重组乳铁蛋白相当于2万单位的氨苄青霉素的抗菌效果。

表6重组乳铁蛋白最小抑菌浓度测定(抑菌环直径单位为mm)

  乳铁蛋白量   (mg)   10   16   24   30  大肠杆菌  21.0  23.0  25.5  27.0  志贺菌  10.0  12.5  14.5  16.0  沙门菌  9.00  11.0  13.0  15.0

多次实验结果都表明，透析前纯化产物的抗菌活性明显高于任何纯化阶段的产物，因此，在纯化过程中可考虑不用脱盐处理，这样既节约了生产成本，也节省了纯化时间，更有利于产品的批量生产。