含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用

摘要

本发明属于动物病毒学技术领域，具体涉及一种能与鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52株特异结合的短肽，含有所述短肽的噬菌体及其制备方法。所述的短肽氨基酸序列为GSHHRHVHSPFV，该短肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加能与鸡传染性支气管炎病毒H52株特异性结合。本发明还包括上述噬菌体在制备IBV鉴别诊断试剂盒中的应用。本发明的鉴别诊断试剂盒可用于鸡传染性支气管炎病毒的防制。

说明书

技术领域

本发明涉及动物病毒学技术领域，具体地说属于噬菌体展示技术领域。利用噬菌体展示技术筛选在表面展示了可与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体，并利用动物病毒学技术对筛选得到的噬菌体进行鉴定以及应用等。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Infections Bronchitis of chickens，IB)是鸡的一种急性高度接触性传染病，其病原为鸡传染性支气管炎病毒(Infections Bronchitis of chickens Virus，IBV，下文称之为IBV)。IBV导致严重的鸡呼吸系统疾病，为正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronavirdae)成员，其囊膜纤突蛋白(S)是病毒的受体结合蛋白(Casais R，Recombinant AvianInfectious Bronchitis Virus Expressing a Heterologous Spike Gene Demonstrates that the SpikeProtein Is a Determinant of Cell Tropism.J Virol.2003，77(16)：9084-9089；Wong S K，A193-amino-acid fragment of the SARS coronavirus S protein efficiently bindsangiotensin-converting enzyme 2.J.Biol.Chem.2003 Dec 11)，决定病毒的宿主嗜性。

IBV的血清型众多，目前已报道的血清型接近30个，新的血清型还在不断出现，不同血清型之间没有或仅有部分交叉免疫性。除此以外，IBV诊断抗原制备和免疫应答机理都比较复杂，这些给本病的诊断和防制带来了很多困难。

噬菌体展示技术(phdge display)近年来深受欢迎，用于受体配体及抗原抗体相互作用研究，并派生出各种方法，如抗原抗体相互作用研究包括用单克隆抗体从噬菌体肽库中筛选抗原表位(Wang L F，Epitopeidentification and discovery using phage display libraries：applications in vaccine developmentand diagnostics.Curr Drug Targets.2004，5(1)：1-15)，或固定病毒从噬菌体抗体库中筛选单克隆抗体(Higo-Moriguchi K，Isolation of human monoclonal antibodies that neutralize human rotavirus.J Virol.2004 Apr；78(7)：3325-32)等，用于机理研究、疫苗设计及诊断方法研究等。受体病毒相互作用包括用表达受体的完整细胞从噬菌体随机肽库中筛选特异性受体结合表位(Cao J，Phage displayselection on whole cells yields a small peptide specific for HCV receptor human CD81. CellRes.2003，13(6)：473-479)，或用表达受体的完整细胞从病毒的受体结合蛋白噬菌体肽库中筛选病毒的受体结合表位(Fontana L，General strategy for broadening adenovirus tropism.J Virol.2003，77(20)：11094-104.)，或用病毒蛋白从噬菌体随机肽库中筛选受体结构域(Ferrer M，Peptide ligands tohuman immunodeficiency virus type 1 gp120 identified from phage display libraries.J Virol.1999，73(7)：5795-5802)。所涉及的病毒包括丙型肝炎病毒、爱滋病病毒、腺病毒等。经检索PubMed资料库，迄今为止尚未发现用噬菌体展示技术鉴定与冠状病毒相互作用多肽及其应用的有关报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可与IBV特异性结合的短肽，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

本发明的目的之二是提供一种含有特异性短肽，可与IBV特异性结合的噬菌体。

本发明的目的之三是证实该噬菌体具有血凝抑制作用，阻断细胞感染作用，同时不能阻断抗原抗体反应，确定该噬菌体所含短肽位于IBV病毒受体结构域，从而提供一种快速，有效，廉价的鸡传染性支气管炎病毒诊断试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现：

一种能与鸡传染性支气管炎病毒H52株特异性结合的短肽，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

包含序列表SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的噬菌体(Enterobacteria phage)M13/Ph.D-H-IV-14，保藏在CCTCC，保藏时间2004年5月8日，保藏编号CCTCC NO：M204034。

所述的短肽，经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且能与鸡传染性支气管炎病毒H52株特异性结合的并由权利要求1衍生的短肽。

一种可与鸡传染性支气管炎病毒H52株特异性结合的噬菌体的制备方法，其步骤包括：

A.包被：将鸡传染性支气管炎病毒的纯化病毒包被96孔板，4℃过夜；

B.封闭：加封闭液4℃封闭1小时；

C.吸附：加噬菌体展示肽库试剂盒中所含噬菌体原库10μL；

D.洗脱：用0.1％TBST洗去非特异性结合的噬菌体，再加入洗脱液100μL，轻摇10分钟，将特异性结合噬菌体用洗脱下来，转入1.5mL离心管，立刻加入15μL 1M Tris-Hcl(PH9.1)中和；

E.扩增：将步骤D得到的洗脱产物加入到对数生长早期的宿主菌中扩增，PEG/NaCl沉淀；

F.下一轮筛选：重复步骤A-E，并将TBST中Tween-20的含量提高到0.5％；

G.挑取单克隆：四轮筛选后挑取单个克隆用3mL宿主菌扩增4小时，12000转离心1分钟取上清，得到第四轮筛选噬菌体的单个克隆；

H.病毒结合特性鉴定：将步骤G得到的噬菌体单个克隆分别包被ELISA板，4℃包被过夜，次日用封闭液4℃封闭1小时后依次叠加病毒、抗IBV兔血清和羊抗兔酶标二抗，并测定630nm处的吸光值；

I.将步骤H得到的阳性噬菌体组装成鉴别诊断鸡传染性支气管炎的试剂盒。

本发明的噬菌体或短肽可以应用于制备鸡传染性支气管炎鉴别诊断的试剂盒。

详细的技术方案如下所述：

1、IBV增殖与纯化：将IBV病毒H52毒株(程丽琴等，浙江大学学报.2002，28(3)：303-306)尿囊液接种10日龄鸡胚(0.2mL/枚)，96小时后收集尿囊液，-20℃冻融三次，低速离心3000转10分钟，取上清，PEG6000(NaCl 2.33％，PEG600010.00％)于4℃搅拌沉淀过夜。次日10000转离心30分钟，取沉淀，用PBS适当稀释悬浮，进行30-60％蔗糖密度梯度离心，35000转3小时，收集病毒带，兑PBS透析去蔗糖，PEG6000浓缩，分装到1.5mL离心管，-20℃保存。

2、抗IBV抗血清制备：将步骤1得到的纯化的IBV病毒免疫家兔，共4次免疫，第一次使用完全佐剂(购自SIGMA公司)，第二次到第四次使用不完全佐剂(购自SIGMA公司)，第四次免疫后14天收集血清，ELISA滴定抗血清效价为1∶10240。

3、噬菌体淘筛：按照噬菌体展示肽库试剂盒(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit，购自New England Biolabs公司)说明书中所述步骤，将步骤1得到的纯化病毒包被96孔板，加噬菌体展示肽库试剂盒中所含噬菌体原库10μL，用0.1％TBST(TBS+Tween-20)洗去非特异性结合的噬菌体，再加入洗脱液100μL，轻摇10分钟，将特异性结合噬菌体洗脱下来，转入1.5mL离心管，立刻加入15μL 1MTris-HCl(PH9.1)中和，然后加入到对数生长早期的宿主菌(OD₆₀₀~0.3)ER2738(Ph.D.-12^TM Phage DisplayPeptide Library Kit中提供，购自New England Biolabs)中扩增，PEG/NaCl沉淀后进行下一轮筛选，并将TBST中Tween-20的含量提高到0.5％。四轮筛选后挑取单个克隆用3ml宿主菌ER2738扩增4小时，12000转离心1分钟取上清，得到第四轮筛选噬菌体的单个克隆。

其中所用试剂配方如下：

包被液：0.1M NaHCO₃(pH8.6)

封闭液：0.1M NaHCO₃(pH8.6)，5mg/mLBSA，0.02％NaN₃.过滤除菌，4℃保存。

TBS：50mM Tris-Hcl(pH7.5)，150mM NaCl.121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。 

洗脱液：0.2M甘氨酸-盐酸(pH2.2)

PEG/NaCl：20％(w/v)聚乙二醇8000，2.5M NaCl，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

4、结合特性鉴定：申请人将噬菌体展示肽库试剂盒(Ph.D.-12^TM Phage DisplayPeptide Library Kit，购自New England Biolabs)说明书中所述检测阳性噬菌体方法加以改良，具体做法是：将步骤3得到的噬菌体单个克隆包被ELISA板，4℃过夜。次日用封闭液4℃封闭1小时后依次叠加病毒、抗IBV兔血清(由步骤2得到)和羊抗兔酶标二抗(购自Southern Biotechnology Associates公司)，底物显色，测定630nm处的吸光值。

按照如下配比制备所用试剂：

包被液：0.1M NaHCO₃(pH8.6) 

封闭液：0.1M NaHCO₃(pH8.6)，5mg/mLBSA

洗涤液：50mM Tris-Hcl(pH7.5)，150mM NaCl，0.5％Tween-20

底物液：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用终止液(0.025％ HF)：HF(40％)625μL，ddH₂O 100mL

5、测序鉴定：将步骤4中鉴定的阳性克隆进行测序。

测序引物序列由噬菌体展示试剂盒提供，为：5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’(Ph.D.-12^TM PhageDisplay Peptide Library Kit，New England Biolabs)。

将测序结果翻译为氨基酸，得到序列为“G S H H R H V H S P F V”的12短肽(推导的氨基酸序列如序列表1所示)。

本发明的有益成果总结如下：

1、本发明的有益成果之一是得到了可与IBV H52株的特异性结合的噬菌体，及其表面展示的特异性短肽序列。由于噬菌体淘筛过程周期短，操作简单，与单克隆抗体的制作相比更加方便，快捷，且不失特异性。因此，用于鉴别诊断时更具优势。

2、本发明的有益成果之二是该噬菌体能抑制IBV病毒的血凝作用，衍生肽血凝抑制试验表明将该噬菌体所含特异性氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加得到的含有新的氨基酸序列的噬菌体仍能特异性抑制IBV的血凝作用。同时，非特异性抑制实验表明该抑制作用是特异性的。

具体做法是：

 1)阳性噬菌体克隆的扩增：取5μL技术方案步骤4中得到的阳性噬菌体克隆加入到20mL对数生长早期的(OD₆₀₀~0.3)宿主菌ER2738(Ph.D.-12^TMPhage Display Peptide Library Kit中提供，购自New EnglandBiolabs公司，)中，扩增4小时，10000转离心10分钟，取上清，PEG/NaCl沉淀两次，最后用200μLTBS溶解，得到扩增的阳性噬菌体克隆(命名为Ph.D-H-IV-14)。(所需试剂配方同技术方案步骤3)

2)血凝抑制试验：将技术方案步骤1中得到的纯病毒用1％胰酶处理后按照常规方法测定其血凝单位，将步骤1)得到的Ph.D-H-IV-14从2倍开始做倍比稀释，与25μL 4个血凝单位的病毒(经1％胰酶处理)等体积混合，37℃作用1小时，加入50μL0.5％新鲜鸡红细胞，37℃作用1小时，观察记录结果。以完全抑制血凝的噬菌体最高稀释度为血凝抑制效价。该噬菌体的血凝抑制价为1∶16(见图2)

3)衍生肽血凝抑制试验：将技术方案5得到的噬菌体所含特异性氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加得到含有新的氨基酸序列的噬菌体，按照步骤1)和步骤2)所述步骤进行血凝抑制试验。实验结果表明，将本发明噬菌体所含特异性氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加得到的含有新的氨基酸序列的噬菌体仍能特异性抑制IBV的血凝作用。(见图3)

4)非特异性试验：按照常规方法测定新城疫病毒(李洪彬，鸡新城疫的综合防制，农业科技通讯：1998.6：23-24)禽流感病毒H9N2株(李自立等，湖北省禽流感的诊断及病毒株的分离与初步鉴定，中国预防兽医学报：2001.23(2)：146-148)血凝单位，将步骤1)得到的Ph.D-H-IV-14从2倍开始做倍比稀释，分别与25μL 4个血凝单位的新城疫病毒，禽流感病毒H9N2株等体积混合，同时，将含非相关肽噬菌体从2倍开始倍比稀释，与25μL 4个血凝单位的IBV病毒(经1％胰酶处理)等体积混合，并设阳性噬菌体、IBV、新城疫病毒，禽流感病毒H9N2株及红细胞自凝对照，37℃作用1小时，加入50μL0.5％新鲜鸡红细胞，37℃作用1小时，观察记录结果。结果显示，Ph.D-H-IV-14对新城疫病毒和禽流感病毒H9N2株，含非相关肽噬菌体对IBV的血凝均无抑制，只有Ph.D-H-IV-14对IBV的血凝有抑制作用。(见图4)

3、本发明有益成果之三是利用抗原抗体阻断试验证实此短肽序列并非位于病毒抗原结构域，而是存在于病毒受体结构域。

具体做法是：将技术方案步骤1得到的纯病毒包被ELISA板，依次叠加步骤1)得到的Ph.D-H-N-14(由上至下10×开始倍比稀释)，抗IBV兔血清(由步骤2得到)，羊抗兔酶标二抗(购自Southern BiotechnologyAssociates公司)和底物，测定630nm处吸光值。(所需试剂配方同技术方案步骤4)。利用SAS软件的方差分析对各组数据进行统计学分析，表明噬菌体阻断组与病毒对照组间无显著差异(P＞0.05)，证实噬菌体对病毒抗体反应无阻断作用，提示噬菌体中所含短肽并非病毒的抗原位点序列，可能为病毒的受体序列。并且，由于受体序列的相对保守性，该噬菌体用于病毒诊断与抗原抗体反应相比可能更具广谱性。(具体结果见表1)

表1本发明的噬菌体短肽对抗原抗体反应的阻断作用(OD₆₃₀)

噬菌体稀释倍    数  噬菌体数    (PFU)噬菌体对照病毒对照噬菌体阻断    10×    20×    80×    160×  2.5×10³¹  1.25×10³¹  6.25×10³⁰  3.125×10³⁰    0.000    -0.006    -0.008    0.006    0.723    0.711    0.731    0.662    0.805    0.767    0.675    0.681  320×    640×    1280×    2560×    平均值±SD  1.563×10³⁰  7.812×10²⁹  3.906×10²⁹  1.953×10²⁹    0.108    0.033    0.031    0.062    0.03±0.03    0.737    0.671    0.646    0.721    0.69±0.07    0.682    0.638    0.626    0.636    0.70±0.03

注1)噬菌体对照列中上面4个为缺失病毒和一抗层对照，下面4个孔为缺失病毒层对照；

注2)病毒对照列为不加噬菌体的病毒抗体正常反应，所有值均为重复孔；

注3)噬菌体阻断列为1∶10开始倍比稀释的噬菌体对病毒抗体反应的阻断效果；列中所有值均为3个重复孔的平均OD₆₃₀值；

4、本发明的有益成果之四是利用病毒感染阻断试验证明该噬菌体能够阻断病毒感染细胞。具体做法是：将技术方案步骤1得到的纯病毒感染HeLa细胞，用常规方法测得TCID₅₀，然后用100个TCID₅₀病毒进行病毒感染阻断试验。具体做法是：将步骤1)得到的Ph.D-H-IV-14从10×开始倍比稀释，然后与等体积的200个TCID₅₀的病毒混合，37℃作用2小时，滴加到96孔板，每孔100μL，再加入100μLHeLa细胞悬液，并设细胞对照，病毒对照和噬菌体对照。结果表明，含有特异性短肽的噬菌体可以明显阻断病毒对细胞的感染，说明该短肽与病毒受体结合位点结合，具有一定的抗病毒作用。(具体结果见图5和表2)

        表2本发明噬菌体短肽对细胞感染的阻断作用

噬菌体稀释倍数  1  1∶10  2  1∶2031∶40 4 1∶80 5 1∶16061∶32071∶640  10^-1  10^-1.310^-1.6 10^-1.9 10^-2.210^-2.510^-2.8噬菌体数(PFU)  5×10³¹  2.5×10³¹1.25×10³¹ 6.25×10³⁰ 3.125×10³⁰1.563×10³⁰7.812×10²⁹细胞病变(cpe) 孔数  1  1 1  3 345未出现细胞病变(cpe)孔数  4  4 4  2 210细胞病变(cpe) 孔总数  1  2 3  6 91318未出现细胞病变 (cpe)孔总数  17  13 9  5 310感染率  1/18  2/15 3/12  6/11 9/1213/1418/18保护率(％)  94  87 75  45 2570

注1)：以上数据均为接毒后2.5天纪录

注2)：结果按Reed-Muench两氏法计算：

距离比例＝(75-50)/(75-45)＝25/30＝0.83

高于50％保护率血清稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数＝-1.6+0.83*(-0.3)＝-1.849＝-1.85

-1.85的反对数为1/71，即1∶71稀释的噬菌体可保护50％细胞出现细胞病变。

5、本发明的有益效果之五是提供的鉴别诊断试剂盒使用方便。本发明在提供了鉴别诊断方法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行。

附图及说明

图1：本发明的技术流程图

图2：噬菌体血凝抑制活性测定

第1排为从1∶2开始倍比稀释噬菌体的血凝抑制反应；第2排为4个血凝单位IBV病毒的血凝对照；第3排为噬菌体加红细胞对照，无非特异性凝集反应；第4排为0.5％红细胞自凝对照，无自凝现象。

图3：衍生肽血凝抑制试验

第1列至第8列为含有将本发明噬菌体所含特异性短肽的一个或几个氨基酸残基经过取代，缺失或添加的其他短肽的噬菌体1∶2开始倍比稀释后对IBV的血凝抑制作用；第9列为4个血凝单位IBV病毒的血凝对照；第10列为噬菌体加红细胞对照，无非特异性凝集反应；第11列为0.5％红细胞自凝对照，无自凝现象。

说明：含有将本发明噬菌体所含特异性短肽的一个或几个氨基酸残基经过取代，缺失或添加的其他短肽的噬菌体仍具有和本发明噬菌体相似的血凝抑制作用

图4：非特异性检测试验效果

第1，3，7列分别为4个血凝单位的禽流感病毒H9N2株，新城疫病毒，IBV(1％胰酶处理)血凝对照；第2，4列分别为Ph.D-H-IV-14对禽流感病毒H9N2株和新城疫病毒血凝抑制作用；第6列为含非相关肽噬菌体对IBV(1％胰酶处理)血凝抑制作用；第5列为Ph.D-H-IV-14对IBV(1％胰酶处理)血凝抑制作用；第8列为噬菌体加红细胞对照，无非特异性凝集反应；第9列为0.5％红细胞自凝对照，无自凝现象。说明：Ph.D-H-IV-14对新城疫病毒和禽流感病毒H9N2株，含非相关肽噬菌体对IBV的血凝均无抑制，只有Ph.D-H-IV-14对IBV的血凝有抑制作用。

图5：噬菌体短肽对细胞感染的阻断作用

图中：A)：病毒对照；B)：细胞对照；C)：噬菌体对照：

D)：噬菌体10倍稀释时对细胞感染的阻断

E)：噬菌体320倍稀释时对细胞感染的阻断

F)：噬菌体1280倍稀释时对细胞感染的阻断

说明：以上均为接毒后2.5天的细胞。由图A，B，C可以看出，细胞对照和噬菌体对照的细胞均未病变，而A所示的病毒对照已有病变，说明细胞病变是由病毒引起，噬菌体本身不会引起细胞病变；D中细胞保持完好，并可由E，F得出明显梯度，说明噬菌体对细胞感染有阻断作用。

具体实施方式

实施例1 含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体的淘筛和鉴定

1.1 IBV病毒的纯化

将H52毒株(程丽琴等，鸡传染性支气管炎病毒H52毒株S基因的克隆及序列分析，浙江大学学报.2002，28(3)：303-306)尿囊液稀释10倍后过滤，取1mL做无菌检验。具体做法是：将1mL尿囊液加到25mL培养基中，37℃振动培养3小时，没有变混浊则证明已是无菌。

将尿囊液接种10日龄鸡胚，37℃保湿培养96小时后收集尿囊液，冻融三次，低速离心3000转10分钟，取上清，PEG6000(Nacl 2.33％，PEG600010.00％)于4℃搅拌沉淀过夜。次日10000转离心30分钟，取沉淀，用PBS适当稀释悬浮，进行30-60％蔗糖密度梯度离心，35000转3小时，收集病毒带，兑PBS透析去蔗糖，PEG6000浓缩，得到纯化的IBV病毒，将其分装到1.5mL离心管，-20℃保存。

1.2兔抗IBV抗血清制备

将步骤1.1得到的纯化的IBV病毒免疫家兔，共4次免疫，第1次使用等体积完全佐剂(购自SIGMA公司)，第2次到第4次使用等体积不完全佐剂(购自SIGMA公司)，每两次免疫之间间隔14天，第4次免疫后14天收集血清，ELISA滴定抗血清效价。

1.3噬菌体淘筛

1.3.1特异性噬菌体淘筛 在150μL包被液中加入2μL纯病毒，包被96孔酶标板，置于潮湿环境中于4℃过夜。次日倾去包被液，加满含1％BSA的封闭液，4℃封闭1-2小时。倾去封闭液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20)洗涤6次，加入1.5×10¹¹个(100μLTBST中)噬菌体(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit中提供，购自New England Biolabs公司)，室温(25℃)60分钟。倾去噬菌体，用TBST洗10次，加入洗脱液，轻摇洗脱至多10分钟，将洗脱物转至1.5mL离心管中，立刻加入15μL 1M Tris-Hcl(PH9.1)中和。将洗脱物加入20mL对数生长早期(OD₆₀₀~0.3)的宿主菌ER2738(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit中提供，购自New England Biolabs公司)中，37℃培养4.5小时，10000转离心10分钟，取上清，再离心一次，取80％上清至50mL离心管中，加入1/6体积的PEG/Nacl，4℃沉淀过夜。次日10000转离心15分钟，取沉淀，用1mLTBS悬浮，转到1.5mL离心管中，离心5分钟去掉残余的细胞碎片，将上清转至一新管中，加1/6体积PEG/Nacl沉淀1小时，离心10分钟，取沉淀，用200μLTBS，0.02％NaN₃悬浮，离心1分钟去掉未溶的残渣，将上清转至一新管中，即为扩增产物。

1.3.2噬菌体滴度测定 将噬菌体扩增产物(或洗脱产物)(由步骤1.3.1得到)10倍稀释，取10μL稀释后的噬菌体加入到3mL预热的顶琼脂中，快速铺于LB/IPTG/X-gal平皿上，37℃培养过夜，对蓝斑进行记数，算出噬菌体滴度。

1.3.3利用噬菌体滴度算出1.5×10¹¹个噬菌体所需扩增产物的体积，进行下一轮筛选，并将TBST中Tween-20的含量提高到0.5％。四轮筛选后检测阳性噬菌体。

按照如下配比制备所用试剂：

包被液：0.1M NaHCO₃(PH8.6)

封闭液：0.1M NaHCO₃(PH8.6)，5mg/mLBSA，0.02％NaN₃.过滤除菌，4℃保存。

TBS：50mM Tris-Hcl(PH7.5)，150mM Nacl.121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

洗脱液：0.2M甘氨酸-盐酸(PH2.2)

PEG/Nacl：20％(w/v)聚乙二醇8000，2.5M Nacl，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

LB培养基：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5gNacl，加水至1L，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

LB/IPTG/X-gal平皿：LB培养基+15g/L琼脂粉，121℃高温灭菌30分钟，冷却到＜70℃，加入IPTG和X-gal，使IPTG终浓度为0.05mg/mL，X-gal终浓度为0.04mg/mL。4℃避光保存。

顶琼脂(Agarose Top)：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5gNacl，1gMgcl·6H₂O，7g琼脂糖。121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

1.4噬菌体短肽与病毒(IBV)结合特性鉴定(ELISA)

由步骤1.3得到的第4轮筛选的噬菌体不做扩增，直接测定滴度，挑取平皿上长出的单个噬斑到对数生长早期(OD₆₀₀~0.3)的ER2738(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit中提供，购自New EnglandBiolabs公司)中扩增4.5个小时，离心取上清，重复一次。将每个克隆的上清分别作倍比稀释包被ELISA板，4℃过夜。次日倾去包被液，加满封闭液，4℃1-2小时。TBST洗3次，每孔加入2μL纯病毒(TBST稀释)，37℃2小时，TBST洗板，加入抗IBV兔血清(封闭液600倍稀释)(由步骤2得到)，37℃1小时，TBST洗板，加羊抗兔酶标二抗(购自Southern Biotechnology Associates公司)(封闭液4000倍稀释)，37℃1小时，TBST洗板，每孔加100μL底物液，闭光静置15分钟，读取630nm处吸光值，从而检测出阳性噬菌体。

按照如下配比制备所用试剂：

包被液：0.1M NaHCO₃(PH8.6)

封闭液：0.1M NaHCO₃(PH8.6)，5mg/mLBSA

洗涤液：50mM Tris-Hcl(PH7.5)，150mM Nacl，0.5％Tween-20

底物液：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液：底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用终止液(0.025％ HF)：HF(40％)625μL，ddH₂O 100mL

1.5阳性噬菌体的测序

取步骤1.4得到的500μL噬菌体克隆上清加入200μL PEG/Nacl，颠倒混匀，室温静置10分钟，离心10分钟，去上清，甩一下，用枪头将残余上清吸干，用100μL Iodide Buffer溶解沉淀，再加入250μL无水乙醇，室温孵育10分钟，离心10分钟，去上清，70％乙醇洗，真空干燥后用30μL TE缓冲液溶解，即得测序模板。使用自动测序仪进行测序，测序引物如下(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit中提供，购自New England Biolabs公司)：

5’-^HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’

按照如下配比制备所用试剂：

Iodide Buffer：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，4M NaI，室温(25℃)避光保存。

PEG/Nacl：20％(w/v)聚乙二醇8000，2.5M Nacl，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。

TE缓冲液：10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA，室温(25℃)保存。

实施例2阳性克隆的应用

2.1阳性噬菌体克隆的扩增：取5μL步骤1.4中得到的阳性噬菌体克隆上清加入到20mL对数生长早期(OD₆₀₀~0.3)的宿主菌ER2738(Ph.D.-12^TM Phage Display Peptide Library Kit中提供，购自New EnglandBiolabs公司)中，扩增4小时，10000转离心10分钟，取上清，PEG/Nacl沉淀两次，最后用200μLTBS溶解，得到扩增的阳性噬菌体克隆，再计算出它的滴度(所需试剂配方同步骤3)。

2.2血凝抑制试验：将步骤1.1中得到的纯病毒用1％胰酶处理后在血凝板上由100×开始做倍比稀释，每孔加入50μL0.5％新鲜鸡红细胞，37℃反应1小时，记录血凝单位。取25μL与步骤2.1得到的扩增过的阳性噬菌体等体积混合，使病毒终浓度为4个血凝单位。37℃作用1小时，加入50μL0.5％新鲜鸡红细胞，37℃作用1小时，观察记录结果。

2.3衍生肽血凝抑制试验：将步骤1.5得到的噬菌体所含特异性氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加得到含有新的氨基酸序列的噬菌体，按照步骤2.1和步骤2.2所述步骤进行血凝抑制试验。实验结果表明，将本发明噬菌体所含特异性氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代，缺失或添加得到的含有新的氨基酸序列的噬菌体仍能特异性抑制IBV的血凝作用。

2.4非特异性检测试验：按照常规方法测定新城疫病毒(李洪彬，鸡新城疫的综合防制，农业科技通讯：1998.6：23-24)，禽流感病毒H9N2株(李自立等，湖北省禽流感的诊断及病毒株的分离与初步鉴定，中国预防兽医学报：2001.23(2)：146-148)血凝单位，将步骤2.1得到的Ph.D-H-IV-14从2倍开始做倍比稀释，分别与25μL 4个血凝单位的新城疫病毒，禽流感病毒H9N2株等体积混合，同时，将含非相关肽噬菌体从2倍开始倍比稀释，与25μL 4个血凝单位的IBV病毒(经1％胰酶处理)等体积混合，并设阳性噬菌体、IBV、新城疫病毒，禽流感病毒H9N2株及红细胞自凝对照，37℃作用1小时，加入50μL 0.5％新鲜鸡红细胞，37℃作用1小时，观察记录结果。

2.5抗原抗体阻断试验：将步骤1.1得到的纯病毒包被ELISA板，4℃过夜，次日倾去包被液，每孔加入200μL封闭液，4℃1小时。TBST洗3次，加入步骤2.1得到的浓缩噬菌体(10×开始倍比稀释)，37℃2小时，TBST洗板，加入抗IBV兔血清(封闭液600倍稀释)(步骤2得到)，37℃1小时，TBST洗板，加羊抗兔酶标二抗(购自Southern Biotechnology Associates公司)(封闭液4000倍稀释)，37℃1小时，TBST洗板，每孔加100μL底物液，闭光静置15分钟，读取630nm处吸光值(所用试剂配方同步骤4)。

2.6病毒感染阻断试验：用步骤1.1得到的纯病毒感染HeLa细胞，用常规方法测得TCID₅₀，然后用100个TCID₅₀病毒进行病毒感染阻断试验。具体做法是：将步骤2.1得到的噬菌体10×开始倍比稀释，然后与等体积的病毒混合，使病毒的终浓度为100个TCID₅₀。37℃作用2小时，滴加到96孔板，每孔100μL，再加入100μLHeLa细胞悬液，并设细胞对照(即不加病毒，也不加噬菌体)，病毒对照(不加噬菌体)和噬菌体对照(不加病毒)。

2.7鸡传染性支气管炎病毒鉴别诊断试剂盒构成及制备方法

1、试剂盒包括：

本发明噬菌体    1管    0.5mL/管

阳性病毒对照    1管    0.5mL/管

10×生理盐水    1瓶    50mL/瓶

10×PBS缓冲液   1瓶    50mL/瓶

阿氏液          1瓶    20mL/瓶

2、相关溶液配方

10倍PBS缓冲液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄2g，双蒸水加至1000mL(pH7.4)。

10倍生理盐水：NaCl8.5g，双蒸水加至100mL

阿氏液：葡萄糖2.05g，构檬酸钠0.80g，枸檬酸0.05g，NaCl 0.42g，蒸馏水加至100ml。以上药品混合后加热溶化，115℃10分钟灭菌，4℃保存备用。

3、试剂盒的操作步骤及判定标准

操作步骤：

1)0.5％鸡红细胞制备：取新鲜鸡血(阿氏液与鸡血液按1∶3比例混合)倒入离心管中，3000转/分离心5分钟，吸去上清液，沉积红细胞加20-30倍体积生理盐水，重新悬浮红细胞，再3000转/分离心5分钟，吸去上清液，再重复数次，然后按压积红细胞的体积用生理盐水液配成0.5％的鸡红细胞悬液。

2)按常规方法测定待测病毒血凝单位

2)将噬菌体在血凝板上从1∶2倍开始倍比稀释，加入25μL等体积4个血凝单位待测病毒，37℃1小时，加入50μL0.5％新鲜鸡红细胞，37℃1小时，观察记录结果。同时，设待测病毒血凝，阳性病毒血凝，阳性病毒血凝抑制及红细胞自凝对照。

判定标准：

孔中所见                                                    结果

一层红细胞均匀铺于孔底，即100％红细胞凝集。                 ++++

红细胞铺于管底，但边缘不整，孔底有大圈。                    +++

红细胞于孔底呈小环状，四周有小凝块。                        ++

红细胞于孔底呈一小团，边缘不光滑，周围有少量凝集。          +

红细胞于孔底呈一小圆点，边缘光滑整齐，红细胞无凝集现象。    -

当阳性病毒血凝及血凝抑制正常，待测病毒血凝为++++，噬菌体抑制待测病毒为-时，判定待测病毒为阳性。

鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽序列(SEQUENCE LISTING)

<110>华中农业大学

<120>含有与鸡传染性支气管炎病毒特异性结合短肽的噬菌体及应用

<130>

<141>2004-07-01

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>DOMAIN

<222>(1)..(12)

<223>

<400>1

Gly Ser His His Arg His Val His Ser Pro Phe Val

  1               5                   10