抑制嗜热微生物在造纸机和纸板机中形成生物膜

摘要

本发明涉及抑制造纸机和纸板机的嗜热粘附微生物在造纸机和纸板机的表面上形成生物膜、和/或从所述表面除去这样的生物膜的方法，其通过向造纸机或纸板机的循环水中添加至少一种从植物分离的纯物质、或至少一种植物提取物或其混合物，其浓度能有效对抗嗜热粘附微生物。本发明还涉及确定是否需要向纸和纸板的生产工艺中添加抗生物膜试剂的方法和适用于该方法的组合包。

说明书

技术领域

本发明涉及抑制造纸机和纸板机表面上的生物膜的方法，该生物膜由嗜热细菌和/或霉菌形成，并影响加工。本发明还涉及确定是否需要向制备纸和纸板的工艺中定量配备抗生物膜试剂的方法和适用于该方法的组合包。

背景技术

造纸机的环境有利于各种微生物的生长。造纸机的水为微生物提供了它们需要的营养物、合适的pH(4至9)和温度(45至60℃)。微生物随着原料(例如纤维、化学物质和水)进入生产中。自由游动的微生物不象粘附在造纸机表面并形成生物膜的微生物那样对生产有害。难以从造纸机表面洗掉生物膜，经常需要使用强烈的化学试剂。生存在生物膜中的微生物比自由游动的微生物更能耐受生物杀灭剂。当自发地从表面脱落时，生物膜沉淀物可能堵塞过滤器，造成网破损，并影响纸的质量，例如通过形成孔或污点。如果没有生物污染，造纸机的运行能力和由此的生产力会显著优于目前。

根据最新的研究(M.Kolari，J.Nuutinen和M.S.Salkinoja-Salonen，Mechanism of biofilm formation in paper machines byBacillus species：the role of Deinococcus geothermalis，Journalof Industrial Microbiology & Biotechnology(2001)，pp.343-351)，生物膜形成中的要素是所谓的初级粘附细菌(Deinococcusgeothermalis)，其可以诱导生物膜的形成。该细菌在造纸机中很常见。通过阻止该细菌粘附到钢表面，由此减少对造纸机的运行有害的生物膜形成。

Marko Kolari，Academic Dissertation in Microbiology：Attachment Mechanisms and Properties of Bacterial Biofilms onNon-Living Surfaces，Dissertationes Biocentri ViikkiUniversitatis Helsingiensis 12/2003，a doctoral thesis，theUniversity of Helsinki已经研究了在造纸过程中发现的一些生物膜形成者的发生和相互作用等，例如生物膜中的Deinococcusgeothermalis，以及营养物和化学试剂对这些微生物的作用。通常，测定采用分离的微生物的纯培养物。

专利公开US 6 267 897 B公开了防止在商业的和工业的水系统中形成生物膜的方法，其包括向该系统中加入精油。作为水系统的实例，该文献特别引用了冷却水，食品工业中的水，纸浆和造纸厂的系统，啤酒厂的巴氏灭菌装置，淡水系统等。该专利公开描述了一个实验，其研究了浮游球衣菌(Sphaerotilus natans)在玻璃表面上的生物膜形成，该菌是一种中温粘液样微生物，在造纸厂中常见。实验结果表明，桉油、肉桂皮油和茶树油防止所研究的细菌粘附在玻璃表面上比用作参考化合物的环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物更有效。根据该专利公开，桉油和肉桂皮油(商业上的药物制品)是特别有利的精油，并通过在蒸汽中蒸馏来制备，如众所周知的。在该专利公开中指出的其它精油通过在蒸汽中蒸馏或通过压榨来制备。

在现代的热造纸机中不会发现所述的中温细菌浮游球衣菌，因为它不能在50至60℃的温度生长。取而代之，在现在的造纸机中真正成为问题的细菌是Deinococcus geothermalis，其在高温(最高56至57℃)生长。其它嗜热的成问题的微生物包括粘附细菌Meiothermussilvanus，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)和Thermomonas sp.和粘附霉菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。

本发明特别地意在防止这样的生物膜形成，其包含作为主要部分的嗜热的成问题的微生物，其能在现在的造纸机的高温(50至60℃)生长。

因此，本发明的目的是提供一种方法和其中所用的试剂，其可以有效地用于防止嗜热微生物在造纸机或纸板机的表面上形成生物膜。

发明内容

现在已经发现，在天然植物所含的化合物中可以找到环保的、天然的和有效的生物膜预防方法，这些化合物中的许多能有效地抗微生物生长。这类化合物是自然界中植物存活所必需的。进行了实验室测试，其中选择了110种化合物，它们是从植物原始地分离，或者是化合物的合成衍生物(已经在其它的研究中发现它们具有生物学作用)，以及92种芬兰的天然植物提取物。通过使用其中最有效的试剂，可以减少嗜热细菌形成生物膜，由此可以增加造纸机和纸板机的产出率。根据进行的实验室研究，最有效的试剂能将生物膜微生物向表面的粘附降低甚至超过90％。

因而，本发明提供了一种方法，其可以用于防止造纸机和纸板机中发现的嗜热粘附微生物(细菌和/或霉菌)在造纸机和纸板机的表面上形成生物膜，和/或其可以用于从所述表面除去已经形成的有害的生物膜。该方法的特征在于，向造纸机和纸板机的循环水中添加有效浓度的至少一种从植物分离的纯物质、或至少一种植物提取物或其混合物，其能有效地抗嗜热粘附微生物。

在这方面，纯物质是指从植物分离出的天然物质、或其合成的等同物或衍生物，另外，它能有效地抗嗜热微生物在表面形成生物膜和/或能从表面除去这样的生物膜。分别地，植物提取物应当能有效地抗嗜热微生物在表面形成生物膜和/或能从表面除去这样的生物膜。生物膜的减少应当是至少50％、优选至少70％和最优选至少90％。

所述的植物提取物可以源自下面的植物或植物部分：蔷薇，夹竹桃柳叶菜，绣线菊或鼠尾草。可以通过用溶剂或溶剂混合物提取植物或植物部分来得到植物提取物。一种优选的溶剂是甲醇。适用于提取的其它溶剂包括丙酮、乙醇、己烷和氯仿。

所述的从植物分离出的纯物质或其合成衍生物可以是酚类化合物，例如酚酸的酯。优选的酚酸酯是没食子酸的烷基酯，其优选地是没食子酸辛酯或没食子酸月桂酯或其混合物。

将纯物质或植物提取物或其混合物添加到造纸机或纸板机的循环水中，其产品浓度可以是1至1000ppm，优选5至200ppm，最优选10至100ppm，以纯物质或植物提取物的干重计算。

纯物质或植物提取物或其混合物可以在造纸机或纸板机的循环水中定量供给，可以为周期性地，优选每天2至8次，或作为单一剂量每天供给一次。这些试剂或其混合物还可以以500至5000ppm(以干物质计算)的高剂量定量投入容器中，以通过所谓的休克给料来使容器表面的各种粘附细菌脱落。

根据本发明，可以使用从所述植物制备的粗提取物或从这些粗提取物分离出的最有效的成分。

本发明还涉及所述的纯物质(其是从植物分离出的)或所述的植物提取物或其混合物的应用，用于预防造纸机或纸板机的嗜热粘附微生物(细菌和/或霉菌)在造纸机或纸板机的表面上形成生物膜，和/或从所述表面除去这类生物膜。

现在还已经发现，在造纸过程中，通过包括下述步骤的方法，可以监测该过程中是否存在能形成生物膜的粘附微生物，可以从生产样品直接检测能阻止生物膜形成的试剂(所谓的抗生物膜试剂)对目标粘附微生物的作用：

i)从造纸过程中取样，例如从造纸机或纸板机的表面、生产用水或原料取样，

ii)如果需要，从样品中除去任何游离(loose)的无机物质和/或有机物质，并将剩余的样品悬浮在水性溶液中，

iii)在含有营养液和任选地含抗生物膜试剂的培养装置中摇动悬浮的样品8至48小时、优选12至24小时，

iv)从装置除去生长溶液和可能从所述溶液游离的任何物质，例如任何浮游生物和没有充分粘附的生物膜细菌，并对粘附在装置壁上的微生物进行染色，和

v)在颜色形成和强度的基础上，定性地和/或定量地检测在所述的悬浮样品中、和任选地在用所述的抗生物膜试剂处理的所述的悬浮样品中粘附微生物的存在。

在这方面，术语″抗生物膜试剂″通常是指具有减少或阻止微生物的生长、特别是粘附微生物在生产纸或纸板的过程中造成的生物膜形成或团块的活性的试剂。该术语特别指造纸中已知的生物杀灭性化学试剂，还有用于本发明的基于植物的试剂，例如从植物分离出的纯物质、植物提取物、其混合物，和它们的合成等同物。

基于该方法的结果，即颜色形成和强度，因而可以确定和评估在加入抗生物膜试剂之前和/或之后向过程中加入(即定量供给)抗生物膜试剂的必要性；换言之，是否应当向过程中加入和/或再次加入任何抗生物膜试剂。特别优选地，进行测定来监测在加入根据本发明的基于植物的抗生物膜试剂之前和/或之后过程中能形成生物膜的微生物的存在。

在另一个优选的实施方案中，测定用于选择适用于阻止在目标过程中生物膜形成的试剂，即抗生物膜试剂，优选从植物分离出的纯物质或植物提取物或其混合物，和/或定义有效地阻止生物膜形成所需的所述抗生物膜试剂的浓度。

在测定方法(i)中，样品典型地是从生产用水或从设备壁取出的/脱离的粘泥或生物膜/沉淀物。

根据本发明，从样品中除去任何游离的无机物质和/或有机物质，例如通过在开始实际试验之前进行过滤和/或洗涤。在优选的实施方案中，样品是例如沉淀物样品，其在步骤(ii)中洗涤以除去任何容易地游离的微生物物质、任何浮游微生物和任何所谓的二级生物膜细菌。优选地进行洗涤，例如通过将样品混合到洗涤液中，例如无菌水中，使得到的溶液沉降，由此可以沉淀出仍然成团块的部分样品，通过除去在可能的沉淀上面的液相，和优选地通过重复该方法共5至10次。洗涤可由此用来提高测定对实际的问题制造者的选择性，所述问题制造者即初级生物膜形成菌，其能粘附在清洁表面上并生长，二级粘附细菌可以依次粘附于其上。而且，洗涤可以用于减少无害的浮游微生物的影响，例如，当确定能有效地阻止生物膜形成的抗生物膜试剂时。

如果是生产用水的样品，则该样品无需洗涤。

纸工业中的粘泥样品经常是非常粘的；因此，将样品、优选洗涤后残留的样品以已知的方式悬浮到无菌水中或水性溶液中，例如以1∶10-1∶40的稀释，通过有效地混合来得到均质化的样品，以将其应用到阶段(iii)。然后将悬浮样品应用到培养装置的一个或多个凹坑中，例如带孔平板的孔中。就本发明而言，还发现样品的均质化可能会产生问题；因此，特别是当测定是作为一系列样品来进行时，即作为试验系列和/或一系列的抗生物膜试剂处理，有利的是将悬浮液应用到每个凹坑中，其量是本领域不常用的，即至少1.5ml，优选约2至10ml，更优选2至5ml，例如2至3ml。为此目的，可以使用例如商业上可得到的6-或12-孔的带孔平板作为培养装置。如果需要，还可以使用试管等。

在适用于生物膜形成菌的营养液中进行了没有和有抗生物膜试剂的样品摇动培养。典型地，在阶段(ii)，将样品悬浮到营养液中。当需要时，然后可以将另外的营养液加入到凹坑中。营养液可以是商业上可获得的营养液，例如R2肉汤(商业上可获得的，例如，Difco)或从过程中取出的、灭过菌的且优选的补充了营养物的生产溶液。

在所述的实验中，优选地，还研究了一种或多种上述的基于植物的抗生物膜试剂对生物膜形成菌、特别是对嗜热的初级粘附微生物的作用，以发现适用于所述过程的这样的植物来源的试剂和/或其浓度。因而，将不含有任何抗生物膜试剂(＝0样品)和含有每种要测试的抗生物膜试剂的在阶段(iii)悬浮的样品置于培养装置的凹坑中，例如以2至5ml的量，例如2至3ml。如果需要，还可以用抗生物膜试剂的混合物进行处理。抗生物膜试剂优选地以溶液形式、以适于所述试剂的浓度应用，该浓度当然可以根据试剂而显著地变化。优选地根据已知的实践在各种浓度测试抗生物膜试剂，即作为一系列的稀释，以确定适用于目标过程的添加量。而且，除了基于植物的抗生物膜试剂外，还可以测试其它的试剂，以与根据本发明的基于植物的试剂一起使用。

培养温度可以是从环境温度至65℃，优选35至65℃，更优选40至60℃，最优选接近从其中取样的过程的温度，通常在40至60℃的范围内。根据本领域的通常实践进行摇动，例如在摇动器中，以100至300rpm、优选150至260rpm的速度，在上述的温度，进行上述的时间段。

在摇动器中培养(iv)后，从凹坑中除去溶液和任何与溶液游离的物质，例如任何浮游生长和任何未充分粘附的生物膜细菌。当需要时，还可以检测溶液中是否存在已经从样品(例如从聚结团块)脱离下来的浮游生长，和/或抗生物膜试剂对该生长的影响。

除去溶液后，典型地洗涤凹坑，例如用无菌水，并根据已知的实践用染色剂对粘附到壁上的微生物组分进行染色。因而可以使用下述物质进行染色：(i)染料，例如结晶紫或藏红，其指示总生物量，(ii)染料，例如吖啶橙、溴化乙锭、DAPI、SYTO16或其它的核酸颜料，其指示微生物中的细胞数目，(iii)染料，例如LIVE/DEAD^TM、CTC或不同的四氮唑化合物，其指示微生物细胞的活力，或(iv)特异性的酶底物，其指示酶活性，并在生物膜具有例如淀粉降解活性、几丁质酶活性、酯酶活性、脂类酯降解活性或磷酸酶活性时转变成荧光化合物。冲洗任何多余的染色剂，定性地(例如在视觉上)和/或定量地(例如，将染色剂溶解到例如乙醇中并使用本领域熟知的装置(例如带孔平板的吸光度读数仪)通过分光光度法或通过荧光计检测颜色的强度)检测染色的微生物造成的颜色变化和强度。

基于得到的结果，可以确定应用抗生物膜试剂的必要性和有效的抗生物膜试剂的类型以及对样品有效，因而对过程中存在的粘附微生物有效的浓度。

根据本发明的测试方法能快速检测造纸工业的工艺过程中粘附细菌的存在和对所述细菌有效的抗生物膜试剂(加入的必要性和加入量)，由此取样和检测问题与克服问题的措施的起点之间的延迟比常规测试变短，后者需要几天，且是基于纯培养物，而且，其经常只能确定对浮游微生物的生长的预防。

本发明还提供了组合包，其用于确定添加抗生物膜试剂的必要性。该包包含：

a)预处理装置，例如带帽的塑料试管，用于取样和从样品中除去任何游离的无机物质和/或有机物质，

b)任选地，混合器，例如涡旋混合器，用于悬浮/均质化样品，

c)具有多个单独分开的凹坑的培养装置，每个凹坑的体积是至少2ml，优选至少3ml，还大于添加到凹坑中的样品剂量的体积，其包含量为至少1.5ml、优选2至10ml、更优选2至5ml的悬浮样品和任选地抗生物膜试剂，例如抗生物膜试剂的溶液，和/或另外的营养液，

d)摇动器，优选热摇动器，以摇动培养装置，使得形成生物膜，

e)试剂，其包括

a.至少一种抗生物膜试剂，例如抗生物膜试剂的溶液，任选地作为一系列稀释液，用于在摇动过程中处理悬浮的样品，

b.无菌的营养液，和

c.染色剂的溶液，用于对粘附到凹坑上的微生物进行染色。

根据在该方法中使用的样品剂量的体积自然地选择培养装置，使其凹坑容纳理想剂量的悬浮样品和任选地抗生物膜试剂溶液和/或另外添加的营养液，定量添加的溶液在摇动时保留在凹坑中。作为实例，可以提及商业上可获得的6-或12-孔的带孔平板。

组合包还可以包括检测装置，例如上述的一种，用于定性地和/或定量地检测染色的粘附微生物；用于洗涤样品的无菌水，计量装置例如吸管，用于添加悬浮的样品和洗涤液、营养液和/或抗生物膜试剂溶液。

而且，包中的试剂可以处在多剂量或单剂量包装中，或者一些试剂(例如抗生物膜试剂和/其它营养液)可以预填充到培养装置(例如带孔平板)的孔中，例如用可去除的膜密封孔。

下面，参考实验室研究和实施例详细描述本发明。

进行的研究

1.纯物质阻止粘附细菌形成生物膜的能力

使用96-孔平板实验(聚苯乙烯的带孔平板，细胞培养级，亲水的)，研究了纯物质对从造纸机分离的粘附细菌形成生物膜的影响，例如Deinococcus geothermalis E50051，洋葱伯克霍尔德菌F28L1，Thermomonas sp.11306和Meiothermus silvanus R2A-50-3。24小时前，已经将细菌从培养皿中接种到营养液管中，在振荡下在45℃生长。开始时，以2个不同浓度将2.5μl纯物质稀释液(溶解于二甲基亚砜，DMSO)吸移入孔中。此后，加入细菌悬浮液，其已经用R2营养肉汤(pH7)250μl/孔稀释至约2％。R2肉汤是合成培养基，它非常适用于培养造纸机的粘附菌。纯物质在带孔平板的孔中的终浓度是25μmol L^-1或250μmol L^-1。将平板在160rpm振荡下、在45℃孵育17至18小时。

培养后，倒空带孔平板，小心地用自来水冲洗，以280μl/孔的量将0.1％SDS溶液(一种阴离子表面活性剂)加入孔中。将平板再置于摇动器中1小时。由此，结果显示出两类试剂，一类能阻止生物膜形成，另一类导致形成结构松散的生物膜，其在一般不会影响目标粘附细菌的生物膜的洗涤中会脱落。用SDS洗涤后，用自来水冲洗平板。用结晶紫溶液对生物膜染色，并再次冲洗。为了读取结果，将附着到生物膜上的颜料溶解到96％乙醇中，用ELISA读数仪在595nm的波长测定孔中的溶液的吸光度。通过将结果与仅仅用DMSO处理的孔进行对比，可以计算每种纯物质的生物膜抑制百分比。

实施例1

共研究了110种纯物质。表1表明，9种纯物质对不止一种粘附细菌菌株具有强烈的抗生物膜作用(对不止一种测试的菌株的生物膜的减少大于50％)。

3种纯物质(没食子酸月桂酯，没食子酸辛酯和去甲二氢愈创木酸)具有广谱抗生物膜作用，因为它们以250μmol L^-1的浓度减少了所有4种不同的粘附细菌的生物膜形成。没食子酸酯、特别是没食子酸月桂酯在25μmol L^-1的含量也是有效的。没食子酸月桂酯的分子量是338.45g mol^-1，即该物质在8.5mg L^-1(＝8.5ppm)的含量具有广谱的抗生物膜效力。没食子酸辛酯和没食子酸月桂酯将在贫营养液中的生物膜细菌向表面的粘附最多降低了超过90％(对Deinococcusgeothermalis和洋葱伯克霍尔德菌的含量为250μM)。

发现许多纯物质在250μM的含量时具有明显的抑制作用，但是观察到在25μM的低含量时反而会增加生物膜形成(例如，表1中的香豆素102、黄酮和去甲二氢愈创木酸)。这可以解释为，在25μM的含量时，这些物质仍不具有足够高的活性成分含量以防止生物膜形成，但是足以对自由游动形式的生长不利，因而可能有助于细菌移向生物膜。

            表1.抑制粘附细菌形成生物膜的纯物质

  纯物质  含量μM  生物膜形成的减少百分比¹  粘附细菌  Deinococcus  geothermalis  洋葱伯克霍  尔德菌  Meiothermus  silvanus  Thermomonas  sp.  香豆素102  250  25  97  49  -19  -20  87  -38  86  -57  香豆素106  250  25  99  -16  -85  -11  95  82  91  14  (-)-表儿茶素没食子  酸酯  250  25  -11  -93  69  18  66  79  -16  -27  黄酮  250  25  24  24  -33  -6  90  -164  84  -56  没食子酸月桂酯  250  25  95  97  96  64  78  82  77  81  2′-甲氧基-α-萘酚黄  酮  250  25  75  11  -41  -38  89  53  32  3  去甲二氢愈创木酸  250  25  85  -23  20  -68  89  92  44  7  没食子酸辛酯  250  25  94  96  99  -20  85  63  71  73  Silybine  (水飞蓟素)  250  25  89  18  -121  -44  93  80  -98  -9

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比

实施例2

通过在实验中包含几种菌株并进行没有SDS洗涤的测试，对实施例1的最好的抗生物膜试剂进行了进一步的研究。

包括了从造纸机分离出的且尚未鉴定的粘附细菌菌株E-1vk-R2A-1和E-jv-CTYE3和烟曲霉霉菌G3.1。使用的参考物质是常用的生物杀灭剂Fennosan M9，其有效成分是亚甲基双硫氰酸酯(9％)。结果如表2所示。

还证实了没食子酸酯对新的粘附菌也是有效的。它们在没有SDS洗涤的情况下也是有效的，这得出了结论，即这些物质的影响机理包括抑制生物膜形成。甚至在25μM的含量，没食子酸月桂酯和没食子酸辛酯对大多数测试微生物都是有活性的。它们对难以控制的洋葱伯克霍尔德菌和Thermomonas生物膜也有效。令人惊奇的是，低含量的没食子酸月桂酯在R2肉汤实验中的作用比高含量的更好。这可能是该物质在R2肉汤中的溶解度较差的结果。含量为25μM(8.5ppm)的没食子酸月桂酯的作用几乎处在用作参考物的亚甲基双硫氰酸酯(10ppm)的水平上。

表2：最好的纯物质(在DMSO中)在R2肉汤中没有SDS洗涤时的抗生物膜作用

                        生物膜形成的减少百分比¹

                            粘附细菌和霉菌

  D.geothermalis  洋葱伯  克霍尔  德菌 Thermomonas sp.M.silvanus  E-1vk-R2A-1  E-jv-CTYE3  G 3.1.

                        纯物质含量(μM)

纯物质  250  25 250  25  250  25  250 25  250  25  250 25  250 25没食子酸月桂酯  24   91 46   84  53   95  33  94  -125 92  87  98  25 55没食子酸辛酯  77   69 93   -49  79   90  87  96  63   90  96  98  97 57去甲二氢愈创木酸  77   -8 91   -45  86   -6  93  95  86   57  98  78  55 -11香豆素102  93   -15 -147 -33  98   -12  98  18  91   -96  97  34  80 -112′-甲氧基-α-萘酚-黄酮  4    2 -31  46  42   56  98  56  90   -101  99  76  61 59

                                生物杀灭剂含量(ppm²)

  30  20  10  30  20  10  30  20  10  30   20   10  30   20   10  30  20  10  30   20   10  M9  99  99  98  93  93  91  98  99  99  100  99   99  100  100  100  98  98  98  100  100  100

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比

²活性成分亚甲基双硫氰酸酯的含量

实施例3

还在造纸机水培养(白水，添加了1g/L的淀粉和300mg/L的酵母提取物，灭菌，250μl/杯，pH 7，接种2％，生长48小时，45℃，160rpm)中研究了实施例1的最有效的纯物质的抗生物膜作用。结果如表3所示。没食子酸辛酯和没食子酸月桂酯在灭菌的白水中将生物膜微生物向表面的粘附最多降低了超过90％(对Meiothermus silvanus和粘附细菌E-jv-CTYE 3，以25μM的含量)。为了使粘附细菌在造纸机水中形成生物膜，需要更长的培养时间。纯物质和M9的作用均较小，可能是由于较长的培养时间。在造纸机环境中，该问题不存在，因为将活性成分每隔一定时间加入到过程中。

表3：最好的纯物质(在DMSO中)在白水中、没有SDS洗涤时的抗生物膜作用

                    生物膜形成的减少百分比¹

                        粘附细菌和霉菌

  D.geothermalis  洋葱伯克  霍尔德菌 Thermomonas sp.  M.  silvanus  E-1vk-R2A-1  E-jv-CTYE3  G 3.1.

                        纯物质含量(μM)

  纯物质  250  25  250  25  250 25  250  25  250  25  250  25  250  25  没食子酸月桂酯  83   90  48   -5  71  -1  81   95  28   54  81   91  -18  26  没食子酸辛酯  84   1  46   -12  53  8  84   98  37   85  86   87  9    42  去甲二氢愈创木  酸  91   -36  -19  -25  32  -23  90   72  58   82  92   1  -19  12  香豆素102  99   -9  -8   -7  79  22  98   40  91   -28  98   13  68   29  2′-甲氧基-α-  萘酚-黄酮  -2   -2  76   5  28  18  90   70  90   -16  95   66  62   54

                            生物杀灭剂含量(ppm²)

  30  20  10  30  20  10  30  20  10  30  20  10  30  20  10  30  20  10  30   20  10  M9  100 100  99  57  53  58  68  72  66  96  98  95  93  99  96  98  100  99  100  100  100

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比

²活性成分亚甲基双硫氰酸酯的含量

2.植物提取物预防粘附细菌形成生物膜的能力

使用上述的96-孔平板实验(聚苯乙烯的杯形平板，细胞培养级，亲水的，R2液250μl/孔，pH 7，160rpm振荡，45℃，17至18小时)作为测试方法。研究的造纸机的粘附细菌包括Deinococcusgeothermalis E50051，洋葱伯克霍尔德菌F28L1，Thermomonas sp.11306和Meiothermus silvanus R2A-50-3。植物提取物(用甲醇提取的)在孔中的终含量是20或200mg L^-1。培养后，用0.1％SDS(一种阴离子表面活性剂)在120rpm振荡下冲洗和洗涤平板1小时。用自来水冲洗平板的孔，并用结晶紫染色。为了读取结果，将附着到生物膜上的颜料溶解到96％乙醇中，用ELISA读数仪在595nm的波长检测孔溶液的吸光度。

实施例4

采用上述的实验方法来研究92种植物提取物对粘附细菌的生物膜形成的预防作用。表4仅仅显示阻止了超过一种细菌的用甲醇制备的植物提取物(18种样品)。最好的植物提取物是酸模的花、黄色珍珠菜的花、小花多毛柳叶菜的叶、小花多毛柳叶菜的花、大花荨麻的根、蔷薇的叶、蔷薇的茎、蔷薇花瓣和鼠尾草的叶。

一些最令人感兴趣的植物包括蔷薇、小花多毛柳叶菜和鼠尾草，它们都具有广谱的抗生物膜作用。而且，研究的蔷薇和小花多毛柳叶菜的全部气生部分都表现出抗生物膜作用。由蔷薇制成的提取物是唯一的还对洋葱伯克霍尔德菌生物膜有作用的提取物，证实所述菌的生物膜是最难控制的一种。关于发现有效的植物，蔷薇和鼠尾草也是最容易生长的。

表4对在R2肉汤中培养的粘附细菌表现出抗生物膜作用的甲醇提取物(现在在DMSO中)

                    生物膜形成的减少百分比¹

                        粘附细菌

  Deinococcus  geothermalis E50051  洋葱伯克霍尔德菌  F28 L1  Meiothermus silvanus  R2A-50-3  Thermomonas sp.  11306  植物提取物  植物提取物含量(mg L-1)  200  20  200  20  200  20  200  20  大蒜茎，有机的  -39  3  -127  -36  40  30  58  51  大蒜茎  -29  9  -105  -52  27  26  56  52  酸模，花  76  -4  2  -5  86  2  61  -133  洋葱，有机的  -3  18  -34  7  9  26  50  52  寻常的柳穿鱼，叶子  -10  2  -5  -3  56  -35  23  27  黄色珍珠菜，花  98  17  30  -10  90  64  80  欧洲蕨，叶子  -35  19  -17  -14  95  25  -95  -9  野艾，叶子  89  -5  -16  -14  97  85  -32  -7  小花多毛柳叶菜，叶子  89  74  -17  42  96  95  44  -44  羽衣甘蓝，有机的  -31  0  -91  -7  23  22  51  56  小花多毛柳叶菜，花  98  51  -12  51  97  95  -12  -21  大花荨麻，根  96  52  1  59  95  92  45  -71  甘蓝，有机的  -51  -1  -114  -33  19  28  52  42  蔷薇，叶子  79  29  75  61  94  91  73  -87  蔷薇，茎  96  31  43  -5  31  -142  -95  秋胡萝卜  -15  -12  12  14  19  18  56  49  鼠尾草，叶子  96  -21  -62  -16  99  66  84  13  蔷薇，花瓣  99  22  58  36  67  -56  17  -84

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比(％)

实施例5

为了确保活性，通过对蔷薇、小花多毛柳叶菜和鼠尾草(以干燥形式保藏了2年)进行重复的提取和实验，继续研究。另外，决定提取和测试它们的近缘植物夹竹桃柳叶菜(叶子、花和根)和绣线菊(叶子、花和根)。同源植物经常含有类似的化合物，因此估计它们的提取物也是有活性的。小花多毛柳叶菜是相对罕见的植物；因此，我们期望明显更常见的夹竹桃柳叶菜也是有活性的。在有和没有SDS洗涤的情况下均进行了实验；因此，结果表明了提取物的影响机理(H＝削弱生物膜，没有SDS洗涤时未观察到对生物膜的抑制，E＝阻止生物膜形成，SDS洗涤没有表现出作用)。

结果如表5所示。所研究的植物提取物中最好的(蔷薇、夹竹桃柳叶菜、绣线菊和鼠尾草)阻止了各种粘附细菌粘附到表面上，特别是D.geothermalis和M.silvanus。基于该结果，新的蔷薇提取物也是有活性的，尽管不完全与原始提取物一样有活性。这可以通过下述事实解释：该植物收集后已经过了2年，活性成分的含量在储存过程中可能已经降低。小花多毛柳叶菜也是如此。前者的近缘植物夹竹桃柳叶菜和绣线菊显示为新的和令人感兴趣的植物。新的鼠尾草提取物大致跟旧的一样有效。在重复研究中，证实了Thermomonas sp.是最难以预防的粘附细菌：在研究的提取物中，只有鼠尾草阻止了其生长。

表5蔷薇、小花多毛柳叶菜和鼠尾草以及它们的近缘植物的新提取物(甲醇提取物，现在在DMSO中)在R2肉汤中的抗生物膜作用。所述植物在提取前已经以干燥形式保藏了2年。

               生物膜形成的减少百分比¹

                    粘附细菌

  Deinococcus geothermalis  洋葱伯克霍尔德菌  Thermomonas sp.  Meiothermus silvanus  植物提取物  植物提取物含量(mg L^-1)  200  20  200  20  200  20  200  20  绣线菊，根  0  -31  66(E)  39  -88  -127  94(E)  67  夹竹桃柳叶菜，叶子  91(E)  -13  60(H)  50  -123  -104  96(E)  79  夹竹桃柳叶菜，花  92(E)  -18  55(E)  33  -89  -62  95(E)  74  绣线菊，花  90(E)  -30  72(E)  36  -75  -57  94(E)  74  蔷薇，花的其它部分  59(E)  -23  64(H)  22  -101  -115  94(E)  72  小花多毛柳叶菜，叶子  92(E)  -21  15(H)  21  -91  -59  95(E)  73  绣线菊，叶子  92(E)  -28  -3  -1  -135  -24  95(E)  74  夹竹桃柳叶菜，根  66(E)  -28  49(H)  10  -102  -54  95(E)  70  蔷薇，叶子  93(E)  -17  11(H)  -8  -133  1  93(E)  64  蔷薇，花瓣  92(E)  -19  64(H)  17  -86  -16  93(E)  68  蔷薇，茎  85(E)  -15  76(H)  39  -100  -114  94(E)  62  鼠尾草，叶子  81(E)  -37  -76  -33  66(E)  -10  99(E)  83

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比(％)

²参考数字后的字母的解释：H＝削弱生物膜，没有SDS洗涤时未观察到对生物膜的抑制，E＝阻止生物膜形成，SDS洗涤没有表现出作用

实施例6

还在造纸机水(白水，添加了1g/L的淀粉和300mg/L，灭菌)中测试了在R2肉汤中测试过的最有效的提取物。在实验中包括在更多的微生物菌株(从造纸机分离出的且未鉴定的细菌菌株E-1vk-R2A-1和E-jv-CTYE3，以及烟曲霉霉菌G 3.1)。测试方法与孔平板实验相同(聚苯乙烯的带孔平板，细胞培养级，亲水的，造纸机水250μl/杯，pH 7，45℃，160rpm，48小时)。由于细菌不能象在R2肉汤中那么快地在造纸机水中形成生物膜，所以需要更长的培养时间。结果如表6所示，它表明提取物的作用比在R2肉汤中低，可能是因为更长的培养时间。在造纸机环境中，这可以通过定期添加活性成分来纠正。

根据进行的实验，用于抑制造纸机和纸板机中的有害生物膜的最可行的植物提取物是蔷薇、绣线菊、夹竹桃柳叶菜和鼠尾草的提取物。小花多毛柳叶菜的提取物也是有效的，但是由于它们的稀少而难以获得。

表6最有效的植物提取物在白水中的抗生物膜作用(甲醇提取物，现在在DMSO中)

                    生物膜形成的减少百分比¹

                      粘附细菌和霉菌

D.geothermalisThermomonas sp.M.silvanus E-1vk-R2A-1 E-jv-CTYE3 G 3.1.    植物提取物    植物提取物含量(mg L^-1)  200  20  200  20  200  20  200  20  200  20  200  20  夹竹桃柳叶菜，叶子  1  -2  -42  -41  76  57  63  -11  89  60  20  29  夹竹桃柳叶菜，花  -3  -6  -33  22  36  57  61  -2  89  53  39  49  绣线菊，花  -4  -3  -7  27  50  49  76  2  92  51  30  37  小花多毛柳叶菜，叶子  -1  -4  -37  0  65  68  37  -6  84  74  -53   -50  绣线菊，叶子  97  -1  -10  18  49  53  89  -33  98  49  43  30  蔷薇，叶子  98  2  -12  25  63  56  89  -42  99  27  -30  47  蔷薇，花瓣  -2  -2  -8  -10  65  34  88  -8  97  37  -16  47  蔷薇，茎  -3  -2  -12  19  44  31  78  -18  94  34  18  55  鼠尾草，叶子  98  3  95  15  96  69  98  73  99  -16  -220  -121

¹从A₅₉₅值计算，并与仅用DMSO处理的孔进行对比(％)

3.监视能形成生物膜的粘附细菌的存在和检测抗生物膜试剂的作用

实施例7

从造纸机(圆盘过滤器)的表面取下沉淀物样品，放入样品容器中。向粘泥样品中加入无菌水，通过涡旋混合器进行强烈混合。使样品沉积，去除上清。重复该操作，共洗涤10次。最后，在R2营养液(Difco)中稀释样品，得到1∶10-1∶40的稀释液，并均质化。将2ml这样得到的悬浮液应用到12孔的带孔平板(N-150628 F1212-孔平板，Nunc)中。部分孔只含有样品悬浮液，向其它部分的孔中还加入了抗生物膜试剂：1)含有戊二醛的商业产品和2)含有DBNPA的商业产品，二者都有2个浓度100ppm和300ppm，每种物质/浓度在单独分开的孔中，以研究抗生物膜试剂处理的效果。将杯形平板置于商业恒温摇动器中，在44℃、以160rpm或250rpm的摇动速度振荡24小时。通过检测溶液的浊度，评估自由漂浮的浮游生长的量。

溶液在其中添加了Fennosan GL10抗生物膜试剂的杯中是澄清的，表明该物质也影响浮游生长。此后，从杯中去除溶液；用自来水冲洗杯子，并装满safran颜料，让其工作5分钟。去除染料溶液，冲洗杯子数次(4x)，然后将杯子装满乙醇，使染料溶解到乙醇中1小时，此后通过Fluoroscan装置检测荧光油墨的量。基于该实验，在样品的位置存在粘附细菌，另外，使用的2种抗生物膜试剂也都能降低粘附细菌向杯子表面的粘附。