公开/公告号CN1723281A
专利类型发明专利
公开/公告日2006-01-18
原文格式PDF
申请/专利权人 味之素株式会社;
申请/专利号CN200380105550.X
申请日2003-12-09
分类号C12N15/09(20060101);C12N1/15(20060101);C12N1/19(20060101);C12N1/21(20060101);C12N5/10(20060101);C12N9/10(20060101);C12P13/04(20060101);
代理机构72001 中国专利代理(香港)有限公司;
代理人郭文洁;王景朝
地址 日本东京都
入库时间 2023-12-17 16:50:55
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-02-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/09 授权公告日:20120815 终止日期:20151209 申请日:20031209
专利权的终止
2012-08-15
授权
授权
2006-03-15
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-01-18
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种用于生产旋光性谷氨酸衍生物的D-氨基转移酶，特别涉及以氨基酸取代的方式使野生型D-氨基转移酶突变所获得的突变D-氨基转移酶，其可自monatin前体有效生产(2R，4R)-monatin。本发明还涉及一种使用突变D-氨基转移酶生产谷氨酸衍生物，如monatin的(2R，4R)异构体的方法。
背景技术
由下列结构式(3)表示的4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸(3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)-吲哚)(下文称作“monatin”)存在于植物Schlerochitom ilicifolius的根中，而且因为它甜度非常高，是一种特别有前途的低-卡路里甜味剂(JP 64-25757 A)：
4(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-谷氨酸
Monatin在第2和4位具有2个不对称，且已经报道过天然的立体异构体是(2S，4S)异构体。已经合成制备出其它立体异构体，而且已经鉴定了3个立体异构体。已经证实了它们中任何一个都具有比蔗糖高几十-几千倍的甜度(表1)。
表1 monatin异构体的甜度
如表1所示，不仅是天然存在的(2S，4S)-monatin，所有其它立体异构体均具有较高标度因子的甜度。特别是，(2R，4R)-monatin具有非常高的甜度，其比蔗糖甜度要高2,700倍且最有利地被预期为甜味剂或甜味剂成分(代糖)。因此，希望研究出一种有效生产具有较高含量(2R，4R)-monatin的monatin的方法。
已经报道过5个monatin生产方法的实例。其具体内容在下列现有技术参考文献的(1)和(3)-(6)中描述。
(1)美国专利号US5,994,559
(2)欧洲专利公开号EP0736604 A
(3)Tetrahedron Letters，Vol.42，No.39，pages 6793-6796，2001
(4)Organic Letters，Vol.2，No.19，pages 2967-2970，2000
(5)Synthetic Communication，Vol.24，No.22，pages3197-3211，1994
(6)Synthetic Communication，Vol.23，No.18，pages2511-2526，1993
(7)Taylor等人，Journal of Bacteriology，Vol.180，No.16，pages 4319，1998
然而，上述参考文献中还没有一篇提到任何用于生产(2R，4R)-monatin的立体选择方法。此外，所有公开的方法都需要多个步骤，阻碍了工业化规模的实际生产。
在这种情况下，本发明人提出了一种新的利用下列通式(4)所示酶反应自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(下文称作IHOG)生产monatin的方法。
该新方法利用可催化monatin前体(IHOG)第2位的胺化反应的酶，由此自IHOG生产monatin。氨基转移酶是一种催化IHOG胺化反应的酶。使用D-氨基转移酶可选择性生产2R-monatin，而使用L-氨基转移酶可选择性生产2S-monatin。即，使用D-氨基转移酶作为催化该反应的酶可选择性生产2R异构体，即，非常甜的异构体，这是由于氨基从作为氨基供体的D-氨基酸转移到IHOG的第2位。
本发明人的研究揭示了催化底物IHOG反应，从而产生2R-monatin的D-氨基转移酶存在于属于芽孢杆菌属或类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的微生物中。然而，甚至在使用来源于这些微生物的D-氨基转移酶时，也很难有效生产含有较高比例(2R，4R)-monatin的monatin。
不能有效生产(2R，4R)-monatin的其中一个原因似乎是来源于这些微生物的D-氨基转移酶不好识别IHOG第4位的不对称。即，当来源于属于芽孢杆菌属或Paenibacillus属微生物的D-氨基转移酶作用于消旋混合物的第4位时(下文有时缩写为4R，S-IHOG)，它同时作用于4R-IHOG和4S-IHOG并产生几乎相等比例的(2R，4R)-monatin和(2R，4S)-monatin。因此，甚至当使用来源于这些微生物的D-氨基转移酶时，不可能产生第4位具有旋光性的monatin。
另一原因可能是用于生产monatin的物质IHOG、在一定pH下不稳定。为了试验IHOG在IHOG胺化反应中的稳定性，本发明人测量了在没有加入微生物细胞的IHOG胺化反应溶液中，IHOG浓度随时间的变化。该反应是通过在37℃下，振摇含1ml反应溶液的试管达40小时进行的，该反应溶液是由100mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)、300mM4R，S-IHOG、600mM DL-Ala和1mM 5′-磷酸吡哆醛组成的。结果，4R，S-IHOG的残余比例分别在16小时后降至81％，在24小时后降至70％并在40小时后降至57％。人们发现IHOG随时间流逝而分解。推测该现象是由于在转化成monatin前，其中IHOG分解成3-吲哚-丙酮酸和丙酮酸的分解反应，和消耗反应溶液中IHOG的IHOG环化反应。即，由来源于芽孢杆菌属或Paenibacillus属微生物的D-氨基转移酶催化的反应不够快速，且由于胺化前的分解和环化，使得一部分IHOG不能胺化。这被认为是为什么不能有效生产(2R，4R)monatin的其中一个原因。
因此，希望研究出一种有效生产在monatin异构体中具有最高甜度的(2R，4R)-monatin的方法。
本发明完成的任务是提供一种能够有效生产谷氨酸衍生物，如monatin的(2R，4R)异构体及其类似物的D-氨基转移酶。
发明内容
作为完成上述任务的广泛研究的结果，本发明人已经发现来源于淀粉芽孢杆菌(Bacillus maceraus)的D-氨基转移酶和来源于球形芽孢杆菌(Bacillius sphaericus)的D-氨基转移酶的氨基酸序列中的特定位置涉及(2R，4R)monatin的有效生产，且该特定位置的氨基酸残基取代提供能够有效生产(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶。本发明人以这些发现为基础完成了本发明。
在涉及有效生产(2R，4R)-monatin的位置中，本发明进一步详细说明了以4R-选择性方式作用于monatin前体(IHOG)的位置，和涉及提高D-氨基转移酶的氨基转移活性的位置。
即，本发明的D-氨基转移酶是突变的氨基转移酶，其通过取代野生型D-氨基转移酶中某些氨基酸残基而被修饰，从而能够有效生产(2R，4R)-monatin。
野生型D-氨基转移酶相对于IHOG第4位的不对称没有旋光选择性，且因此同时作用于4R-IHOG和4S-IHOG，产生几乎相等比例的(2R，4R)-monatin和(2R，4S)-monatin。根据本发明，然而，野生型D-氨基转移酶中特定氨基酸残基的取代可改变野生型D-氨基转移酶的底物特异性。这种突变产生4R-IHOG的选择性反应，导致自4R，S-IHOG到(2R，4R)-monatin的选择性转化，并因此有效生产(2R，4R)-monatin。
野生型D-氨基转移酶没有足够的D-氨基转移酶活性。因此，由于胺化前的分解反应和环化反应使得一部分IHOG不能胺化，导致不能有效生产(2R，4R)-monatin。然而，在本发明中，野生型D-氨基转移酶的特定氨基酸残基被取代，由此提高了D-氨基转移酶活性。这种取代可提高IHOG胺化速率相对于其分解和环化速率的比，有效生产(2R，4R)-monatin。
来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶，其是本发明另一方面，是一种具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的野生型D-氨基转移酶。还没有关于来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶氨基酸序列的报道。本发明人已经分离并纯化了该酶，并首次鉴定了其氨基酸序列及核苷酸序列。可适当使用来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶用于生产2R-monatin。
即，本发明如下：
[1]一种包含选自下列(A)和(B)的氨基酸序列的蛋白：
(A)SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列；和
(B)在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性。
[2]一种包含选自下列(A)和(B)的氨基酸序列的蛋白：
(A)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中选自第100、180-183、243和244位的至少一个位置处具有氨基酸残基取代的氨基酸序列；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第100、180-183、243和244位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，且其中用所述蛋白自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸生产的(2R，4R)-monatin的量高于用具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白生产的量。
[3]一种包含选自下列(A)和(B)的氨基酸序列的蛋白：
(A)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中具有选自下列(a)-(e)的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：
(a)用另一氨基酸残基取代第181位的丝氨酸残基；
(b)用另一氨基酸残基取代第182位的丙氨酸残基；
(c)用另一氨基酸残基取代第183位的天门冬酰胺残基；
(d)用另一氨基酸残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(e)用另一氨基酸残基取代第244位的丝氨酸残基；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第181-183、243和244位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，从而选择性作用于4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的4R异构体，产生(2R，4R)-monatin。
[4]根据[3]所述的蛋白，其中所述选自(a)-(e)的取代是下列取代(a’)-(e’)中的任何一个：
(a′)用天门冬酰胺残基取代第181位的丝氨酸残基；
(b′)用赖氨酸或丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基；
(c′)用丝氨酸残基取代第183位的天门冬酰胺残基；
(d′)用谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺或谷酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(e′)用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基。
[5]一种包含选自下列(A)和(B)的氨基酸序列的蛋白：
(A)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中具有选自下列(a)-(c)的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：
(a)用另一氨基酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基；
(b)用另一氨基酸残基取代第181位的丝氨酸残基；和
(c)用另一氨基酸残基取代第182位的丙氨酸残基；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第100、181和182位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，且其中所述蛋白自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸生产2R-monat in的D氨基转移酶活性要高于具有SFQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白。
[6]根据权利要求[5]所述的蛋白，其中所述选自(a)-(c)的取代是下列取代(a’)-(c’)中的任何一个：
(a′)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基；
(b′)用丙氨酸残基取代第181位的丝氨酸残基；和
(c′)用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基。
[7]一种包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中具有选自下列(i)-(vii)中任何一个取代的氨基酸序列的蛋白：
(i)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；
(ii)用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基；
(iii)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；
(iv)用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基；
(v)用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基；
(vi)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(vii)用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基。
[8]一种包含选自下列(A)和(B)的氨基酸序列的蛋白：
(A)在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中具有选自下列(a)和(b)的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：
(a)用另一氨基酸残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(b)用另一氨基酸残基取代第244位的丝氨酸残基；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第243和244位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，从而选择性作用于4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的4R异构体，产生(2R，4R)-monatin。
[9]根据[8]所述的蛋白，其中所述选自(a)和(b)的取代是下列取代(a’)和(b’)中的任何一个：
(a′)用赖氨酸或天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(b′)用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基。
[10]一种用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，包括在有权利要求2-9任何一项的蛋白和氨基供体存在的条件下，使由下列通式(1)表示的酮酸反应：
产生由下列通式(2)表示的所述谷氨酸衍生物的(2R，4R)异构体或其盐：
其中通式(1)和(2)中的R是芳环或杂环，且所述芳环或杂环还可具有一个或多个选自卤素原子、羟基、具有多达3个碳原子的烷基、具有多达3个碳原子的烷氧基、和氨基的取代基。
[11]根据[10]所述用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述R是苯基或吲哚基。
[12]根据[10]所述用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述氨基供体是氨基酸。
[13]根据[12]所述用于生产旋光性谷氨酸衍生物的方法，其中所述反应是在反应系统中进行的，该反应系统还含有酶，该酶具有催化用于将L-氨基酸转化成D-氨基酸的反应的活性，或该反应系统还含有具有这种酶活性的微生物。
[14]一种包含选自下列(A)和(B)核苷酸序列的DNA：
(A)SEQ ID NO：1描述的核苷酸序列；和
(B)在严格条件下与另一DNA杂交的核苷酸序列，该另一DNA由与SEQ ID NO：1描述的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成；
其中所述DNA编码具有D-氨基转移酶活性的蛋白。
[15]一种编码具有选自下列(A)和(B)氨基酸序列的蛋白的DNA：
(A)SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列；和
(B)在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性。
[16]一种编码具有选自下列(A)和(B)氨基酸序列的蛋白的DNA：
(A)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列选自第100、180-183、243和244位的至少一个位置处具有氨基酸残基取代的氨基酸序列；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第100、180-183、243和244位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，且其中用所述蛋白自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸生产的(2R，4R)-monatin的量高于用具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白生产的量。
[17]一种编码具有选自下列(A)和(B)氨基酸序列的蛋白的DNA：
(A)在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中具有选自下列(a)和(b)的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列：
(a)用另一氨基酸残基取代第243位的丝氨酸残基；和
(b)用另一氨基酸残基取代第244位的丝氨酸残基；和
(B)在除了氨基酸序列(A)第243和244位外的位置处具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列；
其中所述蛋白具有D-氨基转移酶活性，从而选择性作用于4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸的4R异构体，产生(2R，4R)-monatin。
[18]一种通过将[14]-[17]任何一项的DNA与载体DNA连接获得的重组DNA。
[19]一种用[18]的重组DNA转化的细胞。
[20]一种用于生产具有D-氨基转移酶活性的蛋白的方法，包括在培养基中培养[19]的细胞并在所述培养基和/或所述细胞中积聚具有所述D-氨基转移酶活性的蛋白。
进行本发明的优选实施方案
本发明人已经确定了来源于芽孢杆菌属的D-氨基转移酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其可催化反应从而自IHOG生产2R-monatin。作为进一步研究的结果，本发明人发现SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第100、180-183、243和244位涉及(2R，4R)-monatin的有效生产。
作为其它若干研究的结果，他们证实了，在涉及(2R，4R)-monatin有效生产的位点中，第181-183位和第243-244位的区涉及IHOG中第4位的立体识别，且第100、181和182位涉及提高D-氨基转移酶的活性。此外，他们证实了第180位的取代联合涉及4R异构体选择性的氨基酸残基的取代可抑制D-氨基转移酶活性的降低。
以下列顺序详细描述本发明：
[A]突变的D-氨基转移酶
[I]突变的D-氨基转移酶的氨基酸序列
(i)来源于淀粉芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶
(ii)来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶
[II]用于生产突变D-氨基转移酶的方法
(i)获得野生型D-氨基转移酶基因
(ii)突变D-氨基转移酶基因的制备
(iii)产生突变D-氨基转移酶的细菌的生产和培养
[B]使用突变D-氨基转移酶生产(2R，4R)-谷氨酸衍生物的方法
[I]D-氨基转移酶
[II]底物酮酸
[III]氨基供体
[IV]反应条件
[A]突变的D-氨基转移酶
本发明的突变D-氨基转移酶是一种通过取代来源于芽孢杆菌属的D-氨基转移酶的一部分氨基酸残基获得的D-氨基转移酶，其催化反应从而自由下列通式(5)表示的IHOG生产2R-monatin。本发明突变D-氨基转移酶的特征在于一部分野生型D-氨基转移酶的氨基酸残基被取代，从而有效生产(2R，4R)-monatin。
此处所用“D-氨基转移酶”是指通过将作为氨基供体的D-氨基酸的氨基转化成IHOG而生产2R-monatin的酶。
本发明的D-氨基转移酶是一种修饰产物，可有效生产(2R，4R)monatin，且被广义分成(1)被修饰以选择性作用于4R-IHOG的那些和(2)被修饰以提高D-氨基转移酶活性的那些。已被修饰从而选择性作用于4R-IHOG和提高D-氨基转移酶活性的突变D-氨基转移酶当然也落在本发明的范围内。
上述(1)类定义中的“选择性作用于4R-”是指由于用4R，S-IHOG作为底物生产monatin，以所产生的monatin总量为基础，以超过53％的比例生产出4R-monatin。“4R-选择性”是指选择性作用于4R-的性质。以monatin生产总量为基础的4R-monatin比例优选不少于55％、更优选不少于60％、更优选不少于80％、且特别优选不少于90％。
在某些情况下，本发明的突变D-氨基转移酶不仅对monatin前体(IHOG)而且对由下列通式(1)表示的酮酸的4R-异构体也具有选择性：
其中R是芳环或杂环，且芳环或杂环还可具有一个或多个选自卤素原子、羟基、具有多达3个碳原子的烷基、具有多达3个碳原子的烷氧基和氨基的取代基。
因为野生型D-氨基转移酶不能区别monatin前体IHOG的旋光异构现象，因此同时作用于4S和4R异构体，产生相等比例的(2R，4R)-monatin和(2R，4S)-monatin。然而，突变D-氨基转移酶(1)是一种通过取代野生型D-氨基转移酶一部分氨基酸残基获得的修饰产物，可改变其底物特异性。因此，突变D-氨基转移酶(1)选择性作用于4R-IHOG，其能够自IHOG选择性生产(2R，4R)-monatin。
上述(2)类中的定义“提高D-氨基转移酶活性”是指与野生型D-氨基转移酶的相比，D-氨基转移酶活性提高，其导致自IHOG生产的2R-monatin的量增加。特别是在与SEQ ID NO：2蛋白反应的实施例中，如果自4R，S-IHOG生产的2R-monatin的量高于用来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶生产的量，则满足要求。2R-monatin产生的量优选比在相同反应条件下，使用SEQ ID NO：2所示来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶获得的量高1.1倍、更优选1.2倍、更优选1.5倍且特别优选2倍或更高。
在绝大多数酶反应中，酶活性的提高仅加速反应速率但不改变产物量。然而，IHOG、monatin的原料，如上所述是一种不稳定的化合物。IHOG向3-吲哚-丙酮酸和丙酮酸的分解反应和IHOG的环化反应在反应液中进行。D-氨基转移酶活性的提高可相对于IHOG的分解和环化，加速胺化的相对速率，因此有效生产(2R，4R)-monatin。适宜测量D-氨基转移酶胺化反应速率的方法的实施例可包括用D-Ala和α-酮戊二酸作为底物测量氨基转移活性。这种测量可使用乳酸脱氢酶，通过酶分析反应继续进行所产生的酮酸而进行。
[I]突变D-氨基转移酶的氨基酸序列
衍生本发明突变D-氨基转移酶的野生型D-氨基转移酶可以是来源于芽孢杆菌属的D-氨基转移酶，其催化自IHOG产生2R-monatin的反应。这种D-氨基转移酶的例子可包括来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶和来源于球形芽孢杆菌的D-氨基转移酶。
下面将本发明的突变D-氨基转移酶分成来源于淀粉芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶和来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶，且分别描述其氨基酸序列。
(I-1)来源于淀粉芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶
来源于淀粉芽孢杆菌AJ1617的野生型D-氨基转移酶具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。
(1)涉及4R-选择性的位置处的氨基酸取代
SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中第181-183位的区和第243-244位的区是涉及IHOG中第4位立体识别的位点。
即，可通过在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中用另一氨基酸残基取代第181-183位和第243-244位至少一个的氨基酸残基来修饰来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶，从而选择性作用于4R-IHOG。涉及4R-选择性的位置处的氨基酸取代可在一个或两个或更多位置处进行。
当用氨基酸残基取代第181位的丝氨酸残基时，优选用天门冬酰胺取代该残基。当用氨基酸残基取代第182位的丙氨酸残基时，优选用赖氨酸或丝氨酸残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第183位的天门冬酰胺残基时，优选用丝氨酸残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第243位的丝氨酸残基时，优选用谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸、天门冬酰胺或谷酰胺残基，特别是用天门冬酰胺残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第244位的丝氨酸残基时，优选用赖氨酸残基取代该残基。
在涉及4R-选择性的位置处的取代中，第243或244位的氨基酸取代是特别优选的，这是因为常可有效提高4R-选择性。第243和244位氨基酸的氨基酸取代更优选，这是因为4R-选择性可进一步提高。
如上所述，可通过在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第181-183和243-244位至少一个的氨基酸残基而提供对IHOG的4R-选择性。然而，甚至在除了涉及4R-选择性的位置，即除了第181-183和243-244位外的位置处，所述氨基酸序列具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位时，该蛋白仍然落在本发明突变D-氨基转移酶的范围内，只要该蛋白具有D-氨基转移酶活性，选择性作用于4R-IHOG而产生(2R，4R)-monatin。
此处所用“一个或若干”落在其中蛋白的三维结构、D-氨基转移酶活性和对IHOG的4R-选择性没有被相关氨基酸残基取代损害的范围内，且特别是1-50、优选1-30、更优选1-20、且特别优选1-10。然而，在包括SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中的一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列的情况下，优选具有该序列的蛋白在30℃和pH8.0的条件下仍然保留D-氨基转移酶活性，与具有SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，该活性不少于3％、优选不少于10％、更优选不少于30％、更优选不少于50％且特别优选不少于70％。
(2)涉及D-氨基转移酶活性提高的位置处的取代
SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中的第100、181和182位是涉及D-氨基转移酶活性提高的位置。
即，可通过在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第100、181和182位至少一个的氨基酸残基来修饰来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶，从而提高D-氨基转移酶活性。涉及D-氨基转移酶活性提高的位置处的氨基酸取代可在一个或两个或更多位置处进行。
当用氨基酸残基取代第100位的天门冬酰胺时，优选用丙氨酸残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第181位的丝氨酸残基时，优选用丙氨酸残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第182位的丙氨酸残基时，优选用丝氨酸残基取代该残基。
在涉及D-氨基转移酶活性提高的位置中，两个或多个位置处结合的取代是更优选的，因为可进一步提高D-氨基转移酶活性。
如上所述，可通过SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第100、181和182位至少一个处的氨基酸残基而提高D-氨基转移酶活性。然而，甚至在除了涉及D-氨基转移酶活性提高的位置，即除了第100、181和182位外的位置处，所述氨基酸序列具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位时，该蛋白仍然落在本发明突变D-氨基转移酶的范围内，只要该蛋白比SEQ IDNO：2所示的来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶具有更高的D-氨基转移酶活性，从而自IHOG产生2R-monatin。
此处所用“一个或若干”落在其中蛋白的三维结构、D-氨基转移酶活性和对IHOG的4R-选择性没有被适当氨基酸残基取代损害的范围内，且特别是1-50、优选1-30、更优选1-20、且特别优选1-10。然而，在包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列中，希望具有该序列的蛋白在30℃和pH 8.0的条件下仍然保留D-氨基转移酶活性，与具有SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，活性超过100％、优选不少于110％、更优选不少于120％、更优选不少于150％且特别优选不少于200％。
(3)能够有效产生(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶
在本发明中，优选能够自IHOG产生更大量(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶是通过取代上面(1)描述的涉及4R-选择性的位置和上面(2)描述的涉及D-氨基转移酶活性提高的位置中至少一个处的氨基酸残基而制备的。
“自IHOG生产更大量(2R，4R)-monatin”是指与使用野生型D-氨基转移酶相比，自IHOG产生的(2R，4R)-monatin量提高。特别是在与SEQ ID NO：2的蛋白反应的实施例中，如果在相同条件下，自4R，S-IHOG产生的(2R，4R)-monatin量大于用来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶产生的量，则满足该要求。(2R，4R)-monatin产生的量优选比使用SEQ ID NO：2所示的来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶获得的量高1.1倍、更优选1.2倍、更优选1.5倍且特别优选2倍或更高。
适宜测量D-氨基转移酶胺化反应速率的方法的实施例可包括用D-Ala和α-酮戊二酸作为底物测量氨基转移活性。这种测量可使用乳酸脱氢酶，通过酶分析反应继续进行所产生的酮酸而进行。
为了生产能够有效产生(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶，优选上面(1)所述涉及4R-选择性位置处的氨基酸取代与上面(2)所述涉及D-氨基转移酶活性提高位置处的氨基酸取代联合进行。
如果仅仅在上面(1)所述涉及4R-选择性的位置和上面(2)所述涉及D-氨基转移酶活性提高的位置的其中一个处引入氨基酸取代，则在某些情况下，这些酶活性的平衡变差。即，当仅在涉及4R-选择性的位置处引入氨基酸取代，则4R-选择性可提高但D-氨基转移酶活性可能降低(2R-monatin的产率可能降低)。相反，当仅在涉及D-氨基转移酶活性提高的位置处引入氨基酸取代，则4R-选择性有时可能降低。然而，通过适当结合这些取代，可以整体平衡较好的方式生产具有4R-选择性和D-氨基转移酶活性的D-氨基转移酶。
特别是，优选将第100或182位与第243位的取代结合。这种取代可产生具有极佳4-R选择性和D-氨基转移酶活性的突变D-氨基转移酶。
第180位的取代联合涉及4R-选择性的位置处的氨基酸取代也是优选的，这是因为由此可抑制D-氨基转移酶活性的降低。在这种情况下，优选用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基。当与涉及4R-选择性的位置处的氨基酸取代结合时，在第180位引入突变可提高monatin产率。特别是，优选将第243和/或244位的氨基酸取代与第180位的氨基酸取代结合。
如上所述，能够有效生产(2R，4R)-monatin的突变D-氨基转移酶可通过在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第100、180-183、243和244位至少一个的氨基酸残基而获得。然而，甚至在除了涉及有效生产(2R，4R)-monatin的突变位置，即除了第100、180-183、243和244位外的位置处，所述氨基酸序列具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位时，该蛋白仍然落在本发明突变D-氨基转移酶的范围内，只要该蛋白比SEQIDNO：2所示来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶具有更高的D-氨基转移酶活性，从而自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸产生(2R，4R)-monatin。
此处所用“一个或若干”落在其中蛋白的三维结构、D-氨基转移酶活性和对IHOG的4R-选择性没有被适当氨基酸残基的取代损害的范围内，且特别是1-50、优选1-30、更优选1-20、且特别优选1-10。然而，在包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列的情况下，希望在30℃和pH8.0的条件下，与具有SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，自4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸产生(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶活性超过100％、优选不少于110％、更优选不少于120％、更优选不少于150％且特别优选不少于200％。
(I-2)来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶
来源于球形芽孢杆菌ATCC 10208的野生型D-氨基转移酶具有由SEQ ID NO：4表示的氨基酸序列。来源于球形芽孢杆菌的D-氨基转移酶基因已在专利文献(2)和非-专利文献(5)中报道。如上所述，已经预测了来源于球形芽孢杆菌ATCC10208的D-氨基转移酶具有涉及4R-选择性的位置，即第243和244位与来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶相同。
即，可通过在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第243和244位至少一个的氨基酸残基来修饰D-氨基转移酶，从而选择性作用于4R-IHOG。涉及4R-选择性的位置处的氨基酸取代可在一个或两个或更多位置处进行。
当用氨基酸残基取代第243位的丝氨酸时，优选用赖氨酸或天门冬酰胺残基取代该残基。当用氨基酸残基取代第244位的丝氨酸残基时，优选用赖氨酸残基取代该残基。
如上所述，本发明来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶所具有的氨基酸残基取代为在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中，用另一氨基酸残基取代第243和244位至少一个的氨基酸残基，由此获得对IHOG的4R-选择性。然而，甚至在除了涉及来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶4R-选择性的位置(如第243和244位)外的位置处，所述氨基酸序列具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位时，该蛋白仍然落在本发明突变D-氨基转移酶的范围内，只要该蛋白比具有D-氨基转移酶活性，选择性作用于4R-IHOG，产生(2R，4R)-monatin。
此处所用“一个或若干”落在其中蛋白的三维结构、D-氨基转移酶活性和对IHOG的4R-选择性没有被适当氨基酸残基的取代损害的范围内，且特别是1-50、优选1-30、更优选1-20、且特别优选1-10。然而，在由SEQ ID NO：4描述的氨基酸序列中包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的氨基酸序列的情况下，优选在30℃和pH8.0的条件下，与具有SEQ ID NO：4描述的氨基酸序列的蛋白相比，具有该序列的蛋白仍然保留D-氨基转移酶活性且不少于3％、更优选不少于10％、更优选不少于30％、更优选不少于50％且特别优选不少于70％。
如上所述，本发明的突变D-氨基转移酶分成来源于淀粉芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶和来源于球形芽孢杆菌的突变D-氨基转移酶，且已经分别描述了每一类。然而，本发明不限于此。即，可催化自IHOG产生2R-monatin的属于芽孢杆菌属其它种的修饰D-氨基转移酶可落在本发明突变D-氨基转移酶的范围内，只要所述突变是在像淀粉芽孢杆菌和球形芽孢杆菌所述那样，与涉及有效生产(2R，4R)-monatin的位置相应的位置处(即，第100、180-183、243-244位)的氨基酸取代，从而有效自IHOG生产(2R，4R)-monatin。
[II]用于生产突变D-氨基转移酶的方法
本发明的突变D-氨基转移酶可通过获得编码野生型D-氨基转移酶的基因，其中该D-氨基转移酶催化自IHOG产生2R-monatin的反应；向其中引入突变，这样涉及有效生产(2R，4R)-monatin位置处的氨基酸残基被取代，由此制备突变D-氨基转移酶基因；并在适宜宿主中表达突变基因获得。
所述生产还可通过获得来源于突变株的突变D-氨基转移酶基因，其中所述突变株产生突变D-氨基转移酶，并在适宜宿主中表达该基因而进行。
(II-1)获得野生型D-氨基转移酶基因
从具有D-氨基转移酶活性的微生物细胞中克隆含有结构基因的DNA片段，所述结构基因编码具有D-氨基转移酶活性的蛋白，所述D-氨基转移酶可催化自IHOG产生2R-monatin的反应。
具有可催化自IHOG生产2R-monatin的反应的D-氨基转移酶活性的细菌包括属于芽孢杆菌属的细菌，且可具体包括下列细菌菌株：
淀粉芽孢杆菌AJ1617，
球形芽孢杆菌ATCC 10208，
尘埃芽孢杆菌AJ1327，
缓慢芽孢杆菌AJ12699和
缓慢芽孢杆菌ATCC 1840。
已经保藏了淀粉芽孢杆菌AJ1617，如下。
(i)保藏机构的名称和地址
名称：独立行政法人产业技术综合研究所 特许生物寄托中心
地址：Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefecture，305-8566，日本
(ii)保藏日期：2001年12月13日
(iii)登记号：FERM BP-8243(从2001年12月13日保藏的FERMP-18653，于2002年11月22日转为国际保藏)
在它们之中，淀粉芽孢杆菌和球形芽孢杆菌是优选的，且特别是淀粉芽孢杆菌AJ1617和球形芽孢杆菌ATCC 10208是优选的。
编码来源于淀粉芽孢杆菌AJ1617株的D-氨基转移酶的DNA在SEQ ID NO：1中表示。编码来源于球形芽孢杆菌ATCC 10208株的D-氨基转移酶的DNA在SEQ ID NO：3中表示。
来源于淀粉芽孢杆菌AJ1617株的D-氨基转移酶基因与来源于球形芽孢杆菌ATCC 10208株的D-氨基转移酶基因在氨基酸序列及核苷酸序列方面分别具有91％和83.6％的同源性，与来源于芽孢杆菌YM-1株的D-氨基转移酶基因的氨基酸序列具有66％同源性，且与来源于地衣形芽孢杆菌ATCC 10716株的D-氨基转移酶基因的氨基酸序列具有42％同源性(这些同源性是用具有缺省参数的基因分析软件“genetyxver.6”(Genetyx)计算的)。
编码来源于淀粉芽孢杆菌AJ1617株的D-氨基转移酶的DNA在SEQ ID NO：1中描述，本发明人已首次鉴定了它的核苷酸序列，也属于本发明。在严格条件下杂交并编码具有D-氨基转移酶活性的蛋白的DNA也属于本发明，其中与其杂交的DNA由与SEQIDNO：1描述的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成。此处所用“严格条件”是指形成所谓特异性杂种而没有形成非-特异性杂种的条件。虽然很难用数字图形清楚地表示该条件，但该条件的其中一个例子可以是其中具有较高同源性，例如，高于85％、优选高于90％且特别优选95％或更高同源性的一对DNA序列杂交，而与之相比具有较低同源性的DNA序列没有杂交的条件(此处所指同源性是根据序列对比计算的值，以使对比序列之间匹配的核苷酸数达到最大)。其另一个例子可以是普通DNA杂交的洗涤条件，即，在等于37℃，0.1xSSC和0.1％SDS、优选60℃，0.1xSSC和0.1％SDS、更优选65℃，0.1xSSC和0.1％SDS的盐浓度下杂交。然而，就在严格条件下杂交的核苷酸序列而言，其中该核苷酸序列与和SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，希望在30℃和pH8.0的条件下，所编码的蛋白仍保留D-氨基转移酶活性，与具有SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，不低于10％、优选不低于30％、更优选不低于50％且更优选不低于70％。
来源于淀粉芽孢杆菌AJ 1617株的D-氨基转移酶的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中表示，其由SEQ ID NO：1的核苷酸序列编码。SEQ ID NO：2是D-氨基转移酶的氨基酸序列，该D-氨基转移酶由SEQ ID NO：1描述的核苷酸序列中的核苷酸数630-1481的核苷酸序列编码。本发明人首次鉴定了来源于淀粉芽孢杆菌AJ 1617株的D-氨基转移酶的氨基酸序列，其也属于本发明。甚至在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中，所述氨基酸序列具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位时，该蛋白也落在本发明来源于淀粉芽孢杆菌的D-氨基转移酶的范围内，只要该蛋白具有D-氨基转移酶活性。此处所用“一个或若干”落在其中蛋白的三维结构和D-氨基转移酶活性没有被适当氨基酸残基的取代损害的范围内，且特别是1-20、优选1-10、更优选1-5。此处所用“D-氨基转移酶活性”是指通过将作为氨基供体的D-氨基酸的氨基转移给IHOG而产生2R-monatin的活性。在SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列中，所述氨基酸序列包括一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位的情况下，希望具有该序列的蛋白仍保留有D-氨基转移酶活性，在30℃和pH8.0的条件下，与具有SEQIDNO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，不少于10％、更优选不少于30％、更优选不少于50％且更优选不少于70％。
随后，描述自细菌获得编码野生型D-氨基转移酶的DNA的方法，该细菌产生D-氨基转移酶。
首先，测定纯化D-氨基转移酶的氨基酸序列。氨基酸序列的测定可使用Edman方法进行(Edman，P.，ActaChem.Scad.，4：227,1950)。氨基酸序列还可用Applied Biosystems提供的测序仪测定。
以所测的氨基酸序列为基础，推断编码该氨基酸序列的核苷酸序列。为了推断DNA核苷酸序列，可使用通用密码子。
根据推断的核苷酸序列，合成约30个核苷酸对的DNA分子。用于合成DNA分子的方法在Tetrahedron Letters，22：p1859，1981中公开。DNA分子还可使用Applied Biosystems提供的合成仪合成。当从产生D-氨基转移酶的细菌染色体基因库中分离出编码D-氨基转移酶的全长DNA时，利用该DNA分子作为探针。当利用PCR方法扩增编码本发明D-氨基转移酶的DNA时，也可利用该分子作为引物。然而，用PCR方法扩增的DNA不包括编码D-氨基转移酶的全长DNA。因此，使用PCR方法扩增的DNA作为探针，可从产生D-氨基转移酶的细菌染色体基因库中分离出编码D-氨基转移酶的全长DNA。
PCR方法在White，T.J.etal.，Trend Genet.，5：p185，1989中描述。制备染色体DNA的方法和使用DNA分子作为探针，从基因库中分离出靶DNA分子的方法在Molecular Cloning，第2版(ColdSpring Harbor Press，1989)中描述。
测定编码D-氨基转移酶的DNA的分离核苷酸序列的方法在APractical Guide to Molecular Cloning(John Wily&Sons，Inc.，1985)中描述。核苷酸序列还可用Applied Biosystems提供的DNA测序仪测定。
(II-2)突变D-氨基转移酶基因的制备
从产生D-氨基转移酶的细菌获得的野生型D-氨基转移酶不能区别monatin前体IHOG的旋光异构现象，且作用于IHOG的4S和4R-异构体，产生几乎等量的(2R，4R)-monatin和(2R，4S)-monatin。此外，相对于IHOG的分解和环化反应速率而言，胺化反应速率不够快。因此，通过在涉及有效生产(2R，4R)-monatin的位置处诱导人工突变而对D-氨基转移酶进行修饰，可自IHOG有效生产(2R，4R)-monatin。
用于在DNA靶位置诱导所需突变的位置-特异性诱变方法的例子可包括利用PCR的方法(Higuchi，R.，in PCR Technology 61；Erlich，H.A.，Eds.，Stockton Press，1989；Carter，P.，Methods inEnzymology，154：382，1987)、使用噬菌体的方法(Kramer，W.&Frits，H.J.，Methods in Enzymology，154：350，1987；Kunkel，T.A.et al.，Methods in Enzymology，154：367，1987)。
修饰D-氨基转移酶DNA，从而自IHOG有效生产(2R，4R)-monatin的具体例子可包括编码具有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列：
(1)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基的氨基酸序列
(2)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用天门冬酰胺残基取代第181位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(3)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用赖氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基的氨基酸序列
(4)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基的氨基酸序列
(5)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丝氨酸残基取代第183位的天门冬酰胺残基的氨基酸序列
(6)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用谷氨酸残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(7)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用亮氨酸残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(8)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用赖氨酸残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(9)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(10)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用谷酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(11)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(12)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(13)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丙氨酸残基取代第180位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(14)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基并用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(15)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用丙氨酸残基取代第181位的丝氨酸残基
(16)用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基
(17)用丙氨酸残基取代第181位的丝氨酸残基并用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基
(18)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丙氨酸残基取代第100位的天门冬酰胺残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(19)在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中，用丝氨酸残基取代第182位的丙氨酸残基并用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(20)在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中，用赖氨酸残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(21)在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中，用天门冬酰胺残基取代第243位的丝氨酸残基的氨基酸序列
(22)在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列中，用赖氨酸残基取代第244位的丝氨酸残基的氨基酸序列
为了推断编码基于上述序列(1)-(22)的氨基酸序列的DNA，可使用DNA核苷酸序列的通用密码子。
DNA的例子还包括编码下列突变D-氨基转移酶的那些，该突变D-氨基转移酶的氨基酸序列在除了涉及这些突变D-氨基转移酶的4R-选择性的位置，即，除了(1)-(22)中规定的取代位置外，还具有一个或若干氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加和/或倒位，且具有能够有效生产(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶活性。“一个或若干”的定义与部分[I]突变D-氨基转移酶的氨基酸序列中的相同。
DNA的例子还可包括在严格条件下杂交、与其杂交的DNA由与编码具有(1)-(22)氨基酸序列的蛋白的DNA互补的核苷酸序列组成，且编码具有自IHOG有效生产(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶活性的突变D-氨基转移酶的那些。此处所用“严格条件”是指形成所谓特异性杂种而没有形成非-特异性杂种的条件。虽然很难用数字图形清楚地表示该条件，但该条件的其中一个例子可以是其中具有较高同源性，例如，高于85％、优选高于90％且特别优选95％或更高同源性的一对DNA序列杂交，而与之相比具有较低同源性的DNA序列没有杂交的条件(此处所指同源性是根据序列对比计算的值，以使对比序列之间匹配的核苷酸数达到最大)。其另一个例子可以是普通DNA杂交的洗涤条件，即，在等于37℃，0.1xSSC和0.1％SDS、优选60℃，0.1xSSC和0.1％SDS、更优选65℃，0.1xSSC和0.1％SDS的盐浓度下杂交。然而，就在严格条件下杂交的核苷酸序列而言，其中该核苷酸序列与和SEQIDNO：1所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交，希望在30℃和pH8.0的条件下，所得蛋白仍保留D-氨基转移酶活性，与具有SEQIDNO：2描述的氨基酸序列的蛋白相比，不低于3％、优选不低于10％、优选不低于30％、更优选不低于50％且更优选不低于70％。
因此，核苷酸的取代可通过上述定点诱变方法，在野生型基因的特定位置进行，从而编码这些突变D-氨基转移酶。
[II-3]产生突变D-氨基转移酶的细菌的生产和培养
表达突变D-氨基转移酶的重组细菌可通过向适宜的载体中插入含有编码上面获得的突变D-氨基转移酶的基因的DNA片段并引入到宿主细胞中获得。
已经报道过利用重组DNA技术生产有用蛋白，如酶和生理活性物质的若干实施例。利用重组DNA技术，可大规模生产以微量天然存在的有用蛋白。掺入的基因可包括部分(ii)突变D-氨基转移酶基因的制备中描述的基因。
使用重组DNA技术大规模生产蛋白时，转化的宿主细胞可包括微生物细胞、放线菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞和动物细胞。它们之中，有关重组DNA操作的发现已经集中于微生物如芽孢杆菌属、假单胞菌属、短颈细菌属、棒状杆菌属、链霉菌属和大肠杆菌。通常，有很多使用肠道细菌大规模生产蛋白的技术的发现，且因此可使用肠道细菌，优选大肠杆菌。
使用载体，如携带它们的质粒和噬菌体可将靶氨基转移酶基因引入到这些微生物中，或利用同源重组将靶基因掺入到微生物细胞的染色体中。优选，可使用多个拷贝类型的质粒载体。大肠杆菌载体的例子可包括具有来源于Col E1的复制源的质粒，例如，pUC型质粒和pBR322型质粒或其衍生物。作为在这些载体中表达靶氨基转移酶基因的启动子，可使用通常用于在大肠杆菌中生产蛋白的启动子。其例子可包括强启动子如T7启动子、trp启动子、lac启动子、tac启动子和PL启动子。为了增加产量，优选将转录终止序列的终止子与蛋白基因的下游连接。该终止子可包括T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素抗性基因终止子、大肠杆菌trpA基因终止子等。为了选择转化体，优选载体具有标记基因如氨苄西林抗性基因。就这种质粒而言，例如，具有强启动子的表达载体如pUC型(由Takara ShuzoCo.，Ltd.提供)、pPRO型(由Clontech提供)和pKK233-2(由Clontech提供)可商业得到。
本发明的突变D-氨基转移酶可通过表达突变基因获得，突变基因可通过如上所述使编码D-氨基转移酶的基因直接突变获得。本发明的突变D-氨基转移酶还可通过用紫外线辐射或使用人工诱变用的普通诱变剂，如N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(NTG)处理产生D-氨基转移酶的微生物(例如，芽孢杆菌属)，得到可自IHOG有效生产(2R，4R)异构体的突变D-氨基转移酶的突变株，并培养该突变株而获得。
接下来，描述培养本发明微生物的方法。此处所用术语“微生物”是指表达本发明突变D-氨基转移酶的基因重组细胞的培养物和生产突变D-氨基转移酶的突变株的培养物。此处所述培养条件可用于使微生物生产突变D-氨基转移酶，用于获得它们的培养，以及其中培养微生物以生产突变D-氨基转移酶，而产生谷氨酸衍生物的反应同时进行的培养。
培养本发明微生物的方法可使用本领域通常所用的培养基进行，即，含有碳源、氮源、无机盐、微量金属盐、维生素等的培养基。根据微生物类型和培养条件的不同，还可通过向培养基中加入氨基化合物，如约0.1-1.0g/dl的氨基酸而促进氨基转移反应的活性。
培养基因重组细胞时，可根据载体的选择标记适当加入药剂如氨苄西林、卡那霉素、新霉素和氯霉素。根据载体中装载的启动子，通过适当加入诱导剂可增加重组基因的表达。例如，当通过将靶基因与1ac启动子下游连接而构建载体时，可以0.1mM-5mM的终浓度适当加入异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)。可选择性地，代替它，还可以0.1-5g/dl，优选0.5-2g/dl的终浓度适当加入半乳糖。
培养可在微生物通常生长的温度范围内进行，即10-45℃、优选20-40℃、且更优选25-37℃。培养基的pH值可控制在优选2-12、更优选3-10、且更优选4-8。通风条件可设置为适于所用微生物生长的条件，且优选需氧条件。培养周期通常为12-120小时，且优选约24-96小时。
[B]使用突变D-氨基转移酶生产(2R，4R)-谷氨酸衍生物的方法
在有具有D-氨基转移酶活性从而作用于IHOG产生(2R，4R)-monatin的蛋白和氨基供体存在的条件下，生产本发明旋光性谷氨酸衍生物的方法特征在于使下列通式(1)表示的酮酸反应：
(在通式(1)中，R是芳环或杂环，且芳环或杂环还可具有一个或多个选自卤素原子、羟基、具有多达3个碳原子的烷基、具有多达3个碳原子的烷氧基和氨基的取代基)，产生由下列通式(2)表示的谷氨酸衍生物的(2R，4R)异构体或其盐：
(在通式(2)中，R代表与通式(1)中R相同的基团)。
[I]D-氨基转移酶
在生产本发明旋光性谷氨酸衍生物的方法中，可将部分[A]突变D-氨基转移酶中描述的本发明突变D-氨基转移酶用作“具有作用于IHOG产生(2R，4R)-monatin的D-氨基转移酶活性的蛋白”。
在生产本发明旋光性谷氨酸衍生物的方法中，当使用酮酸的SR异构体作为底物时，可有效生产谷氨酸衍生物的(2R，4R)异构体，因为该反应在有D-氨基转移酶存在的条件下进行。
此处所用“在有D-氨基转移酶存在的条件下”是指D-氨基转移酶存在于反应系统中，其中可从由通式(1)表示的酮酸生产由通式(2)表示的谷氨酸衍生物。即，D-氨基转移酶可以任何形式存在于反应系统中，只要由通式(1)表示的酮酸可转化成通式(2)表示的谷氨酸衍生物。例如，可将D-氨基转移酶单独加入到反应系统中，或可将具有相关酶活性的微生物(用重组DNA转化的细胞或突变株)、微生物的培养物(液体培养物、固体培养物等)、培养基(除去其中的微生物细胞)、或培养物的处理产物加入到反应系统中。使用微生物培养物时，可在培养微生物时进行反应，或使用先前制备用于获得酶的培养物进行反应。此处“处理”是指自微生物细胞收集酶进行的处理，且可包括，例如，超声破裂、用玻璃珠处理、French压碎和冷冻干燥，及用溶菌酶、有机溶剂或表面活性剂处理。可通过标准方法进一步处理经过这些处理的物质(液相色谱、硫酸铵分离等)以制备酶或纯化酶的粗分离部分，只要它具有所需性质即可使用。
例如，当使用由重组DNA转化的细胞生产谷氨酸衍生物时，可将底物直接加入到培养基中，同时培养细胞。可选择性地，可使用从培养基除去的微生物细胞或洗涤过的微生物细胞。可将微生物细胞破裂或溶解成处理产物，其也可使用。从处理过的微生物细胞中收集的D-氨基转移酶也可用作粗酶溶液。此外，可纯化该酶用于进一步使用。
此外，可在包裹在交叉菜胶和聚丙烯酰胺中或固定在聚醚砜或再生纤维素薄膜上后，使用上述培养或处理过的产物。
[II]底物酮酸
在本发明中，将通式(1)的酮酸用作底物。
其中R是芳环或杂环，且芳环或杂环还可具有一个或多个选自卤素原子、羟基、具有多达3个碳原子的烷基、具有多达3个碳原子的烷氧基和氨基的取代基。
特别是，优选通式中的R是苯基或吲哚基。当R是吲哚基时，(2R，4R)-monatin可作为通式(2)的谷氨酸衍生物生产。当R是苯基时，4-苯甲基-4-羟基-谷氨酸(PHG)的(2R，4R)异构体，其是monatin的类似物，可作为通式(2)的谷氨酸衍生物获得。
对合成上面通式(1)所示酮酸的方法没有特别限制，且可使用任一化学反应系统或酶系统。将以单独的方式，从化学反应系统和酶系统描述合成通式(1)酮酸的方法。合成通式(1)酮酸的方法当然不限于此。
(II-1)化学反应系统
利用化学反应系统合成通式(1)的酮酸可通过使用下面所示方法和下述参照实施例很容易地进行。
例如，可通过使下列通式(6)所示的取代酮酸和草酰乙酸或丙酮酸经过交叉羟醛反应和除去碳酸的反应而生产。由上述羟醛反应产生的化合物在反应系统中形成，是一种重要的中间体。有意省略化合物的分离步骤，反应继续进行至除去碳酸的反应，即，下一步。
例如当R是吲哚基时，当把吲哚-3-丙酮酸用作取代丙酮酸时，可生产IHOG(或其盐)，其对于生产monatin而言是一种重要的中间体。例如，当R是苯基时，即，当苯基丙酮酸用作取代丙酮酸时，可生产4-苯甲基-4-羟基-2-氧代戊二酸(下文称作PHOG)(或其盐)，其是与monatin类似物4-苯甲基-4-羟基谷氨酸(下文称作PHG)相应的中间体酮酸。
确定羟醛反应的条件并不难。反应在无机碱或有机碱存在的条件下，仅通过使取代的丙酮酸和草酰乙酸或丙酮酸在适宜的溶剂中反应就可很容易进行。
对所用溶剂的类型没有特别限制，只要溶剂在反应中是惰性的。
本领域的技术人员可适当选择反应温度、所用碱量、反应时间和在不会损害到本发明进行的范围内加入起始物质的方式。
溶剂的例子可优选包括极性溶剂如水、甲醇、乙腈和二甲基甲酰胺。
使用时，碱的例子可优选包括无机碱如碱金属或碱土金属的氢氧化物和碳酸盐，如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾和碳酸钙，以及有机碱如三乙胺。
反应温度可优选约-20-100℃且更优选约0-60℃。
与作为底物的取代丙酮酸和草酰乙酸进行羟醛缩聚后，脱羧作用可通过缩聚物的自发脱羧进行。然而，更有效的脱羧作用可通过向反应液中加入酸或金属离子或两者而进行。为此所用酸的例子可包括盐酸、硫酸、磷酸、醋酸、对甲苯磺酸酸和固体酸如离子交换树脂。金属离子的例子可包括过渡金属离子如镍离子、铜离子和铁离子。反应温度可优选约-10-100℃且更优选约0-60℃。
(II-2)酶系统
当使用酶系统时，可利用催化反应、自上面通式(6)所示取代丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)生产通式(1)所示酮酸的酶(醛缩酶)不费力地生产通式(1)所示底物酮酸。
催化上述反应的醛缩酶的来源微生物的例子可包括属于假单胞菌属、欧文氏菌属、产黄菌属和黄单胞菌属的微生物。
在属于假单胞菌属、欧文氏菌属、产黄菌属和黄单胞菌属的微生物中，任何微生物都可用于本发明，只要该微生物可产生醛缩酶，催化反应而自吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸(或草酰乙酸)合成前体酮酸(IHOG)。然而，更优选腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)ATCC4683、燕麦晕斑假单胞菌(Pseudomonas coronafaciens)AJ2791、解链条假单胞菌(Pseudomonas desmolytica)AJ1582，欧文氏菌(Erwinia sp.)AJ2917、柑桔黄单胞菌(Xanthomonas citri)AJ2797、和莱菌黄杆菌(Flavobacterium rhenanum)AJ2468。它们之中，特别优选腐臭假单胞菌ATCC 4683和燕麦晕斑假单胞菌AJ2791。这些微生物的详细保藏在下面给出。
(1)燕麦晕斑假单胞菌AJ2791株
(i)登记号：FERM BP-8246(从2002年6月10日保藏的FERMP-1881，于2002年11月22日转为国际保藏)
(ii)保藏日期：2002年6月10日
(iii)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Central No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefecture，日本)
(2)解链条假单胞菌AJ1582株
(i)登记号：FERM BP-8247(从2002年6月10日保藏的FERMP-1882，于2002年11月22日转为国际保藏)
(ii)保藏日期：2002年6月10日
(iii)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所 特许生物寄托中心(Central No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefec ture，日本)
(3)欧文氏菌AJ2917株
(i)登记号：FERM BP-8245(从2002年6月10日保藏的FERM P-18880，于2002年11月22日转为国际保藏)
(ii)保藏日期：2002年6月10日
(iii)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Central No.6，1-1-1Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefecture，日本)
(4)莱菌黄杆菌AJ2468株
(i)登记号：FERM BP-1862
(ii)保藏日期：1985年9月30日
(iii)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所 特许生物寄托中心(Central No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefecture，日本)
(5)柑桔黄单胞菌AJ2797株
(i)登记号：FERM BP-8250(从1985年9月30日保藏的FERM P-8462，于2002年11月27日转为国际保藏)
(ii)保藏日期：1985年9月30日
(iii)保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(Central No.6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，IbarakiPrefecture，日本)
所述醛缩酶可通过培养上述产生醛缩酶的微生物，由此产生并积聚醛缩酶而获得。因此，产生醛缩酶的转化体可通过重组DNA技术制备，然后培养该转化体，产生并积聚醛缩酶。
有醛缩酶存在条件下的反应可在反应液中进行，该反应液含有醛缩酶、通式(6)所示取代丙酮酸及草酰乙酸和丙酮酸中至少一种，其可被调节至20-50℃的适宜温度，并维持，保持pH6-12，振摇或搅拌30分钟-5天。
反应速率还可通过向反应液中加入二价阳离子如Mg2+、Mn2+、Ni2+和Co2+而加速。在某些情况下，考虑到成本，优选使用Mg2+。
可以任何盐形式将这些二价阳离子加入到反应液中，只要它们不会抑制反应，但优选使用MgCl2、MgSO4、MnSO4。所加入这些二价阳离子的浓度可由本领域技术人员通过简单的初步检测确定，且可以为0.01-10mM、优选0.1-5mM且更优选0.1-1mM。
进行反应的优选条件的例子可如下：可将10％(w/v)洗涤过的表达醛缩酶的大肠杆菌微生物细胞作为酶催化剂加入到反应液中，该反应液由100mM缓冲液、50mM吲哚-3-丙酮酸、250mM丙酮酸、1mM MgCl2和1％(V/v)甲苯组成，且反应可通过在3 3℃振摇该混合物4小时而进行，由此获得4-(吲哚-3-基甲基)-4-羟基-2-氧代戊二酸(IHOG)。
通过本领域已知的技术分离并纯化所产生的通式(1)的酮酸。该方法的例子可以是通过使它们与离子交换树脂接触而吸收碱性氨基酸，然后洗脱，随后结晶。该方法的另一实施例可以是在洗脱后利用活性炭脱色并过滤，然后结晶。
[III]氨基供体
在本发明中，因为使用D-氨基转移酶，因此也将D-氨基酸用作氨基供体。此处所称氨基供体包括氨基化合物，如天然存在和非-天然存在的D-氨基酸。即，D-谷氨酸、D-天门冬氨酸、D-丙氨酸、D-色氨酸、D-苯丙氨酸、D-异亮氨酸、D-亮氨酸、D-酪氨酸、D-缬氨酸、D-精氨酸、D-天门冬酰胺、D-谷酰胺、D-甲硫氨酸、D-鸟氨酸、D-丝氨酸、D-半胱氨酸、D-组氨酸、D-赖氨酸等可作为氨基酸的例子。可在反应中加入单独的氨基供体或多种供体的混合物。还可使用便宜的DL-氨基酸。
所述供体还可通过在反应溶液中加入L-氨基酸或DL-氨基酸并使催化反应、使氨基酸消旋的酶共存，由此将它们转化成作为供体的D-氨基酸。这种消旋酶的优选例子可包括丙氨酸消旋酶、谷氨酸消旋酶、天门冬氨酸消旋酶、和苯丙氨酸消旋酶。在这种情况下，可在生产谷氨酸衍生物的过程中，向反应溶液中加入L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天门冬氨酸或上述任何一种L-氨基酸的消旋混合物。
[IV]反应条件
在生产本发明旋光性谷氨酸衍生物的方法中，谷氨酸衍生物的(2R，4R)异构体是在D-氨基转移酶和氨基供体存在的条件下，自通式(1)的底物酮酸有效生产的。
如上所述，可将D-氨基转移酶以任何方式加入到反应系统中，只要它具有酶活性。例如，当利用由重组DNA转化的细胞生产谷氨酸衍生物时，可在培养细胞的同时将底物酮酸和氨基供体直接加入到培养基中，构成反应液。可选择性地，可将从培养基中分离出来微生物细胞或纯化酶、底物酮酸和氨基供体加入到溶剂中，构成反应液。
当使用微生物细胞作为具有D-氨基转移酶活性的催化剂时，即，当使用培养基或洗涤过的微生物细胞时，还可使用表面活性剂如Triton X和Tween或有机溶剂如甲苯或二甲苯，从而增加底物酮酸在微生物细胞中的渗透性。还可向上述培养基中加入作为反应促进物质的辅酶如5-磷酸吡哆醛。用作上述培养基成分的具体物质包括下列：碳源，对其没有限制只有它们可为所用的微生物所利用，且其例子可包括葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油和醋酸等及其混合物。所用氮源的例子可包括硫酸铵、氯化铵、脲、酵母提取物、肉类提取物、玉米浆、水解酪蛋白及其混合物。具体培养基组成的例子可以是下列培养基，它含有0.5g/dl富马酸、1g/dl酵母提取物、1g/dl胨、0.3g/dl硫酸铵、0.3g/dl K2HPO4、0.1g/dl KH2PO4、1mg/dl FeSO4·7H2O和1mg/dlMnSO4·4H2O(pH7.0)。
当以顺序方式，单独进行生产酶的培养步骤和生产谷氨酸衍生物的步骤时，生产谷氨酸衍生物步骤中的反应不是必须在需氧空气中进行。相反可在厌氧空气下进行该反应。还可在下列系统中进行该反应，其中通过氮气取代、氩气取代、加入亚硫酸钠等除去反应液中溶解的氧。
反应温度通常落在所用酶具有活性的范围内，即10-50℃、更优选20-40℃且更优选25-37℃。可将反应溶液的pH值调节至通常2-12、优选6-11、且更优选7-9的范围。当pH高时，作为monatin原料的IHOG可很容易自发分解成3-吲哚-丙酮酸和丙酮酸，而当pH低时，并非优选的，因为IHOG很容易环化且不能用于胺化。为了有效抑制作为monatin原料的IHOG的分解反应和环化反应，有时优选将反应溶液保持在8-8.5的pH范围。反应时间通常约1-120小时、优选1-72小时、且更优选1-24小时。
反应液中谷氨酸衍生物或底物酮酸的量化可使用熟知方法快速进行。即，适宜的方法可以是利用由Merck&Co.，Inc提供的“Silicagel60F254”的薄层色谱。为了获得更高的分析准确度，可使用高效液相色谱(HPLC)，其中利用光学分辨柱如GL Sciences Inc.提供的“Inertsil ODS-80A”和Daicel Chemical Industries Ltd提供的“CROWNPAK CR(+)”。可通过标准方法从反应液中收集在反应液中积聚的谷氨酸衍生物，其用于进一步使用。自反应液收集产物可通过本领域中通常用于这种目的的熟知方法进行。其实施例可包括操作如过滤、离心、真空浓缩、离子交换色谱、吸收色谱和结晶，如果需要可联合使用。
目标谷氨酸衍生物可以游离形式获得，但如果需要也可以盐的形式获得。盐的形式可以是碱加成盐。其例子可包括无机碱如氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化钙，以及有机碱如氨水和各种胺。
实施例
参考下列实施例更详细举例说明本发明。然而，本发明不限于此。
在下列实施例中，monatin和4-苯甲基-4-羟基-谷氨酸(下文缩写为“PHG”)的定量分析是利用GL Sciences Inc提供的“InertsilODS-80A”(5μm，6×150mm)通过高效液相色谱进行的。分析条件如下。
流动相：12％(v/v)乙腈/0.05％(v/v)三氟醋酸的水溶液
流速：1.5mL/分
柱温度：30℃
检测：UV 210nm
根据上述条件，在12.1分的保留时间洗脱下(2S，4S)-monatin和(2R，4R)-monatin，在9.7分洗脱下(2S，4R)-monatin和(2R，4S)-monatin，在7.2分洗脱下(2S，4S)-PHG和(2R，4R)-PHG，并在6.0分洗脱下(2S，4R)-PHG和(2R，4S)-PHG。
需要时，还利用Daicel Chemical Industries Ltd.提供的光学分辨柱“CROWNPAK CR(+)”(4.6×150mm)进行高效液相色谱分析。分析条件如下。
(monatin的分析)
流动相：高氯酸(pH1.5)/10％(v/v)甲醇的水溶液
流速：0.5mL/分
柱温：30℃
检测：UV210nm
根据上述条件，分别在42、57、64和125分的保留时间以(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)和(2S，4S)的顺序洗脱下monatin的旋光异构体。
(PHG的分析)
流动相：高氯酸的水溶液(pH1.5)
流速：1mL/分
柱温：30℃
检测：UV 210nm
根据上述条件，分别在20、28、31和46分的保留时间，以(2R，4S)、(2R，4R)、(2S，4R)和(2S，4S)的顺序洗脱下PHG的旋光异构体。
实施例1：筛选用于PHOG胺化的具有D-氨基转移酶活性的微生物
将所试微生物菌株接种在肉汤琼脂平板(Eiken ChemicalCo.，Ltd.)中，30℃培养24小时。然后以约5％(w/v)将细胞接种在1ml反应液中，该反应液由100mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM PHOG、100mMD-谷氨酸、100mMD-丙氨酸、1mM 5’-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯组成。然后在30℃培养该反应液16小时。反应完成后，分析产生的PHG。结果，自PHOG生产2R-PHG的活性在表2所示微生物中发现。因此，(2R，4S)-PHG和(2R，4R)-PHG是从PHOG生产的。
表2
*：FERM BP-8243
实施例2：源于淀粉芽孢杆菌AJ1617株的dat基因(bmdat)的克隆及表达-质粒的构建
(1)染色体DNA的制备
使用50mL肉汤培养基，30℃过夜培养淀粉芽孢杆菌AJ1617株(预培养)。将5mL该培养基接种在由50mL肉汤培养基组成的主要培养物中。培养直至对数生长晚期后，将50mL培养肉汤离心(12000xg、4℃、15分)以采集细胞。按照标准方法，自由此获得的细胞制备染色体DNA。
(2)自基因文库分离bmdat基因
将1U限制酶EcoRI加入到30μg来源于淀粉芽孢杆菌AJ1617的染色体DNA中。随后，利用琼脂凝胶电泳自该部分消化的DNA中收集3-6kbp的片段。使这些DNA片段与1μgEcoRI-消化的质粒pUC118片段(已经用BAP处理，由Takara Shuzo Co.，Ltd.提供)连接，并用其转化大肠杆菌JM109以制备基因文库。将由此转化的大肠杆菌细胞接种在含0.1mg/mL氨苄西林的LB培养基中(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠、2％琼脂、pH7.0)。将出现的每个菌落接种在1mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM异丁基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB液体培养基中。然后37℃培养该液体培养基过夜。将200-400μL培养基离心以采集细胞。然后洗涤所收集的细胞。将由此获得细胞重混悬于200μL含100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM丙酮酸钠、100mMD-谷氨酸、1mM5′-磷酸吡哆醛和和1％(v/v)甲苯的反应液中。30℃培养反应液30分钟，然后离心。将5微升所得上清液加入到96-孔微量滴定平板中，其中每个孔含有200μL溶液用于丙酮酸盐的定量分析。该溶液含有100mM Tris-HCl(pH7.6)、1.5mMNADH、5mMMgCl2、16U/mL乳酸脱氢酶(由Oriental Yeast Co.，Ltd.提供)。30℃培养10分钟后，使用平板读出器(Spectra Max 190，由Molecular device提供)测量340nm处的反应溶液吸光度。以0.2-1mM终浓度加入丙酮酸钠进行相同的反应。使用它们作为标准品，定量分析上述反应溶液中丙酮酸的减少量，检测D-氨基转移酶活性(DAT)。
通过上述具有DTA活性的克隆的筛选过程，得到具有DTA活性的转化体。自该转化体制备含D-氨基转移酶基因的质粒，并命名为pUCBMDAT。用EcoRI消化质粒pUCBMDAT并经过琼脂凝胶电泳。因此，估计插入片段的长度约为3.3kbp。
(3)插入片段的核苷酸序列
通过双脱氧方法测定质粒pUCBMDAT的插入片段的核苷酸序列。结果，在SEQ ID NO：1中发现了一个与630th-1481st序列相应的由约850bp组成的ORF。同源性检索显示ORF与来源于球形芽孢杆菌ATCC10208的D-氨基转移酶基因的氨基酸序列91％同源，与来源于芽孢杆菌YM-1株的D-氨基转移酶基因的氨基酸序列66％同源，且与来源于地衣形芽孢杆菌ATCC 10716的D-氨基转移酶基因的氨基酸序列42％同源。此处的同源性是指使用具有缺省参数的基因分析软件“genetyxver.6”(Genetyx)计算的值。根据这些结果已经发现该ORF编码D-氨基转移酶基因。
实施例3：用表达来源于淀粉芽孢杆菌(BMDAT)的D-氨基转移酶的大肠杆菌使IHOG向2R-monatin转化和PHOG向2R-PHG转化
(1)表达BMDAT的大肠杆菌的制备
将具有pUCBMDAT的大肠杆菌转化体接种在3mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基中(1g/dL bacto胰蛋白胨、0.5g/dL酵母提取物和1g/dL NaCl)。然后在37℃下振摇培养该培养基16小时。自培养基收集细胞并洗涤，以制备表达BMDAT的大肠杆菌细胞。
(2)与洗涤过的表达BMDAT的大肠杆菌微生物细胞的反应
将在上面(1)制备的微生物细胞以2％(w/v)混悬于1mL反应液中，该反应液由100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM IHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯组成。然后在33℃下振摇培养该混悬液16小时，测定由此产生的2R-monatin的量。结果，产生16.4mM(2R，4S)-monatin和17.0mM(2R，4R)-monatin。
反应也在由100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM PHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5’-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯组成的反应液中进行。培养之后测定由此产生的2R-PHG的量。结果，产生17.1mM(2R，4S)-PHG和19.2mM(2R，4R)-PHG。
实施例4：突变BMDAT的制备
(1)突变质粒的构建
为了通过定点诱变构建表达突变BMDAT的质粒，使用由Stratagene提供的QuikChange定点诱变试剂盒。首先，合成寡DNA引物(一对两个)。设计这些引物以引入靶核苷酸取代并与双链DNA的每个链互补。由此制备的突变酶的名称和用于定点诱变的合成寡DNA引物的序列在表3中列出。
每个突变酶的名称顺序如下“野生型酶中的氨基酸残基、残基数、和取代的氨基酸残基”。如，S243N突变酶是指野生型酶第243位的Ser(S)残基被Asn(N)残基取代。
表3
根据制造商的说明，使用实施例2中制备的表达野生型BMDAT的质粒pUCBMDAT作为模板构建突变质粒。例如，构建pS243N后，使用pUCBMDAT作为模板和引物S24 3N-S及S243N-AS，且在下列条件下扩增表达突变BMDAT的质粒：(95℃30秒，56℃1分钟和68℃8分钟)x18次循环。
通过用识别并裂解甲基化DNA的限制酶DpnI处理而消化模板pUCBMDAT。使用所得反应液，转化大肠杆菌JM109。自该转化体制备质粒，并测定其核苷酸序列以证实已经引入预定的核苷酸取代。
以和上述相同的方式，使用一个表达突变基因的质粒作为模板，制造表达双-突变酶的质粒。具体而言，使用pS243N作为模板，和引物S180A-S及S180A-AS制备pS243N/S180A。使用pS244K作为模板，和引物S180A-S及S180A-AS制备pS244K/S180A。使用pS244K作为模板，和引物S243NS244K-S及S243NS244K-AS制备pS243N/S244K。
(2)表达突变BMDAT的大肠杆菌的制备
将包含具有突变BMDAT基因或pUCBMDAT的各质粒的大肠杆菌转化体接种在3mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基(1g/dL bacto胰蛋白胨、0.5g/dL酵母提取物和1g/dL NaCl)中。然后在37℃下振摇培养该培养基16小时。自培养基采集细胞并洗涤。使用SDS-PAGE证实各突变BMDAT的表达。将自250μL培养肉汤中采集的细胞重混悬于500μL SDS-PAGE样品缓冲液中，并煮沸10分钟用于细胞溶解和变性。使通过离心(10,000xg、10分钟)获得的5-10μL上清液经过SDS-PAGE。结果，在已经引入表达野生型和突变型BMDAT的质粒的所有菌株中均观察到在大约32kDa的位置处特异性出现谱带，由此证实了野生型和突变型BMDAT的表达。
实施例5：使用表达突变BMDAT的大肠杆菌使IHOG向2R-monatin转化并使PHOG向2R-PHG转化
使用实施例4中制备的一系列表达突变BMDAT的大肠杆菌菌株作为催化剂，自4R，S-IHOG生产2R-monatin，并自4R，S-PHOG生产2R-PHG。将通过离心400μL培养基收集的微生物细胞混悬于具有下列组成的反应溶液中。
IHOG的反应溶液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM 4R，S-IHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯
PHOG的反应溶液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM 4R，S-PHOG、200mMD-丙氨酸、1mM5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯
30℃培养该混悬液16小时，然后测定由此产生的2R-monatin和2R-PHG的量。结果在表4中表示。
表4
结果，就其中已经在S181、A182、N183、S243和S244处引入突变的突变BMDAT而言，发现4R-选择性提高。此处的4R-选择性是指(2R，4R)异构体占总2R-PHG或2R-monatin产物的比例。特别是利用S243N，产生12.9mM(2R，4R)-monatin和1.0mM(2R，4S)-monatin，且4R-选择性由此提高至93％。利用S244K，产生12.0mM(2R，4R)-monatin和5.5mM(2R，4S)-monatin，且4R-选择性由此提高至69％。
制备将突变体S180A进一步引入到这些突变DTA中的双-突变酶。利用S243N/S180A，产生17.5mM(2R，4R)-monatin和1.9mM(2R，4S)-monatin(4R-选择性：90％)。虽然4R-选择性稍稍降低，但是与S243N相比，由此产生的(2R，4R)-monatin的量增加了。利用S244K/S180A，产生15.0mM(2R，4R)-monatin和6.6mM(2R，4S)-monatin(4R-选择性：79％)。与S244K相比，由此产生的(2R，4R)-monatin的量增加了。即，已经发现在4R-选择性提高的突变BMDAT中引入突变S180A可导致(2R，4R)-monatin产生的量进一步增加。
还检测了具有双突变S243N/S244K的酶。因此，产生11.0mM(2R，4R)-monatin和0.2mM(2R，4S)-monatin，且4R-选择性由此提高至高达98％。
实施例6：生产表达来源于球形芽孢杆菌(BSDAT)的D-氨基转移酶的大肠杆菌和利用洗涤过的微生物细胞反应生产2R-monatin
(1)表达质粒的构建
为了在大肠杆菌中表达来源于球形芽孢杆菌的D-氨基转移酶(下文缩写为“bsdat”)，如下构建其中bsdat基因与pUC18的1ac启动子下游连接的质粒pUCBSDAT。首先，使用球形芽孢杆菌ATCC 10208株的染色体DNA作为模板并使用下列表5所示的寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增该基因。由此扩增与欧洲专利公开EP 0736604的SEQIDNO：2中描述的dat核苷酸序列的8th-1275th序列相对应的DNA片段。用BamHI和PstI处理该片段，与已经用BamHI和PstI消化的pUC18连接，然后引入到大肠杆菌JM109中。在氨苄西林抗性株中选择含目标质粒的菌株，由此构建表达质粒，pUCBSDAT。
表5用于BSDAT克隆的引物序列
(2)表达BSDAT的大肠杆菌的制备
37℃下，在含0.1mg/mL氨苄西林的LB培养基(1g/dL bacto胰蛋白胨、0.5g/dL酵母提取物和1g/dL NaCl)中培养含pUCBSDAT的大肠杆菌转化体16小时。随后，将1mL由此获得的肉汤加到500mL含50mL LB培养基的Sakaguchi烧瓶中，37℃进行主要培养。培养2.5小时后，向其中加入1mM终浓度的异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)，再培养4小时。自培养基采集细胞并洗涤，制备表达BSDAT的大肠杆菌细胞。
(3)与洗涤过的表达BSDAT的大肠杆菌微生物细胞反应
将在上面(2)中制备的微生物细胞以5％(w/v)混悬于1mL由100mMTris-HCl(pH7.6)、50mM IHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯组成的反应液中。然后将1ml混悬液转移到10mL试管中，30℃振摇培养18小时。培养后，测定由此产生的2R-monatin的量。结果，自IHOG产生13.8mM(2R，4R)-monatin和12.7mM(2R，4S)-monatin。
实施例7：突变BSDAT的制备
(1)突变质粒的构建
为了通过定点诱变构建表达突变BSDAT的质粒，使用由Stratagene提供的QuikChange定点诱变试剂盒。首先，合成寡DNA引物(一对两个)。设计这些引物，以引入靶核苷酸取代并与双链DNA的各链互补。由此制备的各突变酶的名称及用于引入突变的合成寡DNA引物在表6中表示。各突变酶名称顺序为“野生型酶中的氨基酸残基、残基数、和取代的氨基酸残基”。例如，S243N突变酶是指野生型酶第243位Ser(S)残基被Asn(N)残基取代。
表6：用于BSDAT定点诱变的引物序列
根据制造商的说明，使用实施例6中制备的表达野生型BSDAT的质粒pUCBSDAT作为模板构建突变质粒。例如，生产pBS-S243N后，使用pUCBSDAT作为模板和引物BS-243N-S及BS-S24 3N-AS，且在下列条件下扩增表达突变BSDAT的质粒：(95℃30秒，56℃1分钟和68℃8分钟)x18次循环。
用识别并裂解甲基化DNA的限制酶DpnI消化模板pUCBSDAT。使用所得反应液，转化大肠杆菌JM109。自该转化体制备质粒，并测定其核苷酸序列以证实已经引入预定的核苷酸取代。
(2)表达突变BSDAT的大肠杆菌的产生
将包含具有突变BSDAT基因或pUCBSDAT的各质粒的大肠杆菌转化体接种在3mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB培养基(1g/dL bacto胰蛋白胨、0.5g/dL酵母提取物和1g/dL NaCl)中。然后在37℃下振摇培养该培养基16小时。自培养基采集细胞并洗涤，以制备表达BSDAT的大肠杆菌。使用SDS-PAGE证实各突变BSDAT的表达。将自250μL培养基中采集的细胞重混悬于500μL SDS-PAGE样品缓冲液中，并煮沸10分钟用于细胞溶解和变性，使通过离心(10,000xg、10分钟)获得的5-10μL上清液经过SDS-PAGE。结果，在已经引入表达野生型和突变型BSDAT的质粒的所有菌株中均观察到在大约32kDa的位置处特异性出现谱带，由此证实了野生型和突变型BSDAT的表达。
实施例8：使用表达突变BSDAT的大肠杆菌使IHOG向2R-monatin转化
使用实施例7中制备的一系列表达突变BSDAT的大肠杆菌菌株，自4R，S-IHOG生产2R-monatin。将通过离心400μL培养基收集的微生物细胞混悬于具有下列组成的反应溶液中。
IHOG的反应溶液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM 4R，S-IHOG、200mMD-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯
30℃培养该混悬液16小时，然后测定由此产生的2R-monatin的量。结果在表7中表示。
表7：用突变BSDAT生产的2R-monatin的量
结果，就其中已经在S243和S244处引入突变的突变BSDAT而言，发现4R-选择性提高了。此处的4R-选择性是指(2R，4R)异构体占总2R-monatin产物的比例。特别是利用S243N，产生9.9mM(2R，4R)-monatin和1.0mM(2R，4S)-monatin，且4R-选择性由此提高至92％。利用S244K，产生12.7mM(2R，4R)-monatin和6.1mM(2R，4S)-monatin，且4R-选择性由此提高至68％。
根据这些结果，已经发现通过在与BMDAT中位置相对应的特定位置处引入突变，可提高与BMDAT同源的DTA(作为其中一个例子，BSDAT)的4R-选择性，在BMDAT中引入突变还可导致monatin的4R-异构体(作为例子，S243、S244)的选择性产生。
实施例9：突变BMDAT的构建
按照与实施例4相同的方式制备表达突变BMDAT的质粒。用于引入突变的合成寡DNA引物的序列在表8中表示。
表8：用于BMDAT定点诱变的引物序列
实施例10：利用表达突变BMDAT的大肠杆菌使IHOG转化成2R-monatin并使PHOG转化成2R-PHG
使用实施例9中制备的一系列表达突变BMDAT的大肠杆菌菌株，自4R，S-IHOG生产2R-monatin，并自4R，S-PHOG生产2R-PHG。将通过离心400μL培养基收集的微生物细胞混悬于具有下列组成的反应溶液中。
IHOG的反应溶液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM 4R，S-IHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯
PHOG的反应溶液：100mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM 4R，S-PHOG、200mM D-丙氨酸、1mM 5′-磷酸吡哆醛和0.5％(v/v)甲苯
30℃培养该混悬液16小时，然后测定由此产生的2R-monatin和2R-PHG的量。结果在表9中表示。
结果，发现与野生型酶相比，就A182S、S243N/N100A、S243N/A182S、N100A/S181A和N100A/A182S的突变BMDAT而言，由此产生的(2R，4R)-monatin的量增加。特别是，就S243N/N100A和S243N/A182S的突变BMDAT而言，发现由此产生的(2R，4R)-monatin的量增加，同时4R-选择性保持在80％或更高。
表9
实施例11：用突变BMDAT测量胺化反应速率
将包含具有突变BMDAT基因或pUCBMDAT的各质粒的大肠杆菌转化体接种在3mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM IPTG的酪蛋白氨基酸培养基(0.5g/dL硫酸铵、0.14g/dL KH2PO4、0.23g/dL柠檬酸盐2Na·3H2O、0.1g/dLMgSO4·7H2O、2mg/dL FeSO4、2mg/dL MnSO4、2mg/dL盐酸吡哆辛、0.1mg/dL硫胺、1g/dL酪蛋白氨基酸、0.3g/dL甘油，pH 7.5)中。然后37℃振摇培养该培养基16小时。自1mL培养基中采集细胞、洗涤、混悬于1mL 20mM Tris-HCl(pH 7.6)中，并在4℃下超声破裂30分钟。15,000rpm离心该超声处理产物5分钟，将其上清液用作酶催化剂。就D-氨基转移酶活性(下文成为DAT活性)的测量而言，通过分析由于反应继续进行而自D-丙氨酸产生的丙酮酸而酶法测量作为氨基供体的D-丙氨酸至α-酮戊二酸的氨基转移酶活性。结果在表10中表示。
反应条件：100mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2mM NADH、0.1mM 5′-磷酸吡哆醛、5U/mL乳酸脱氢酶、10mM D-丙氨酸、10mMα-酮戊二酸，30℃。测量340nm处吸光度的减少。
结果，发现与野生型酶相比，在N100A、S181A、A182S、N100A/S181A、N100A/S182S、S181A/A182S、S243N/N100A和S243N/A182S的突变BMDAT中，DAT活性增加。
表10：突变BMDAT的DAT活性
实施例12：使用S243N/A182S突变BMDAT使4R，S-IHOG转化成2R-monatin
(1)微生物细胞的制备
将含pS243N/A182S的大肠杆菌转化体接种在3mL含0.1mg/mL氨苄西林的LB培养基中(1g/dL of bacto胰蛋白胨、0.5g/dL酵母提取物、1g/dL NaCl)，37℃培养16小时。随后，将2.5mL由此获得的肉汤加入到500mL Sakaguchi烧瓶中，该烧瓶中包含50mL含0.1mg/mL氨苄西林和0.1mM IPTG的酪蛋白氨基酸培养基(0.5g/dL硫酸铵、0.14g/dL KH2PO4、0.23g/dL柠檬酸盐2Na·3H2O、0.1g/dL MgSO4·7H2O、2mg/dL FeSO4、2mg/dL MnSO4、2mg/dL盐酸吡哆辛、0.1mg/dL硫胺、1g/dL酪蛋白氨基酸、0.3g/dL甘油，pH 7.5)，然后37℃振摇培养18小时。自培养基采集细胞，并洗涤以制备表达S243N/A182S突变BMDAT-的大肠杆菌。
(2)IHOG胺化反应
将上面(1)中自240mL培养基采集并洗涤的微生物细胞混悬于120mL反应液中，该反应液由100mM磷酸钾缓冲液(pH8.3)、244mM4R，S-IHOG、600mM DL-丙氨酸、和1mM 5′-磷酸吡哆醛组成，并在37℃下搅拌24小时。为防止pH在反应过程中降低，用1N KOH将pH控制在pH8.4±0.1。结果，24小时内，在反应液中积聚了79.2mM(2R，4R)-monatin(摩尔产率/4R-IHOG为65％)。5,000rpm离心所得反应液10分钟得到上清液。
(3)(2R，4R)-monatin自酶反应液的纯化
使121.84g酶反应液(含2.72wt％(2R，4R)-monatin)通过用600mL合成吸收剂(Diaion-SP207，由Mitsubishi ChemicalCorporation提供)填装的树脂柱(直径：4cm)。然后使净化水以7.5/分钟的流速通过，共3小时。然后使15％2-丙醇的水溶液以7.5/分钟的流速通过，共3小时。通过收集2.6-3.5(洗脱液量/树脂量(L/L-R))，(2R，4R)-monatin几乎完全分离。
将由此所得处理过的液体浓缩至13.3g。向浓缩液中加入64mL2-丙醇。10℃搅拌混合溶液16小时。滤出所出现的结晶，将由此所得3.0g湿结晶溶于10mL水中。35℃下向其中加入30mL2-丙醇，并在35℃下，再滴加30mL 2-丙醇共2小时。将所得溶液冷却至室温。滤出所出现的结晶，并减压干燥，得到2.59g(2R，4R)-monatin钾盐(区域纯度：97.4％)。
<参照实施例1>IHOG的合成
将18.91g(286.5mmol，85重量％含量)氢氧化钾溶于64.45mL水中。向该溶液中加入7.50g(35.8mmol，97.0重量％含量)吲哚-3-丙酮酸盐和14.18g(107.4mmol)草酰乙酸并溶于其中。35℃搅拌该混合溶液24小时。
又，向其中加入40.0mL3N盐酸用于中和(pH＝7.0)，获得153.5g反应中和溶液。在该反应中和溶液中，含有5.55g IHOG，且产率(/吲哚-3-丙酮酸盐)为53.3％。
向该反应中和溶液中加水至其体积为168mL。之后，使该混合物通过用840mL合成吸收剂(Diaion-SP207，由Mitsubishi ChemicalCorporation提供)填装的树脂柱(直径：4.8cm)。然后使净化水以23.5mL/分钟的流速通过，并收集1.73-2.55(L/L-R)的部分，由此获得含3.04g高纯度IHOG的水溶液，产率54.7％(/树脂上粗产物的量)。
(NMR测量)
1H-NMR(400MHz，D2O)：3.03(d，1H，J＝14.6Hz)，3.11(d，1H，J＝14.6 Hz)，3.21(d，1H，J＝18.1Hz)，3.40(d，1H，J＝18.1Hz)，7.06-7.15(m，3H)，7.39(d，1H，J＝7.8Hz)，7.66(d，1H，J＝7.8Hz).
13C-NMR(100MHz，D2O)：35.43，47.91，77.28，109.49，112.05，119.44，119.67，121.91，125.42，128.41，136.21,169.78，181.43，203.58
<参照实施例2>PHOG的合成
将13.8g氢氧化钾(纯度：85％)溶于25mL水中。向该溶液中加入5.0g(30.5mmol)苯基丙酮酸盐和12.1g(91.4mmol)草酰乙酸，混合物在室温下反应72小时。使用浓盐酸，将反应液pH值调至2.2，并用醋酸乙酯萃取。用饱和盐水洗涤有机层，在无水硫酸镁上干燥，并浓缩得到残留物质。该残渣自醋酸乙酯和甲苯中重结晶，得到2.8g(11.3mmol)PHOG结晶。
(NMR测量)
1H-NMR(D2O)δ：2.48(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.60(d，J＝14.4Hz，0.18H)，2.85-3.30(m，3.64H)，7.17-7.36(m，5H)
(分子量测量)
ESI-MS理论值C12H12O6＝252.23；analyzed value 251.22(MH-)
工业实用性
根据本发明，可利用酶反应有效生产被预期作为甜味剂且其甜度范围在monatin异构体中最高的(2R，4R)-monatin，且因此，本发明在工业上是十分有用的，特别是在食品领域中。
序列表
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<120>突变的D-氨基转移酶和使用它们生产旋光性谷氨酸衍生物的方法
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Tatsuki；Suzuki Eiichiro
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<221>CDS
<222>(630)..(1481)
<223>BMDAT
<400>1
tacatcaggt agcgccatgc atgacagaaa gggatcatga gcgttatctg ctgcgtttac 60
aacagagtga cgactgagtc agagcaattg tcgactttat cgcagaggtt tttatcagga 120
tcattatgcc atcagcttga gttgcaattc gaggatgcca tgtctggtca gacaacatta 180
aatccaggca ttgttagcta tgatgtcagt aaaggtggca gtttagtgat tagtatgcgc 240
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tattatctac aggtggtgga acgtatgcac gtgtgctgaa aaaaggcgtg gcctttggca 480
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aacataaaga cgaaaaggat gaacggaaa atg gca tat tca tta tgg aat gat 653
Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp
1 5
caa att gtt gaa gaa gga tct att gca atc tca cca gaa gac aga ggt 701
Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile Ala Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly
10 15 20
tat cag ttt ggt gac ggt att tat gaa gta att aaa gtt tat aac gga 749
Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly
25 30 35 40
aat atg ttt aca gca caa gag cac att gat cgt ttc tat gcg agc gcc 797
Asn Met Phe Thr Ala Gln Glu His Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala
45 50 55
gaa aaa att cgc ctt gtt atc cct tat aca aaa gat gtt tta cac aag 845
Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys
60 65 70
tta cta cat gag cta att gaa aag aat aat cta gaa aca gga cat gtt 893
Leu Leu His Glu Leu Ile Glu Lys Asn Asn Leu Glu Thr Gly His Val
75 80 85
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Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala Asn Ser Arg Asn His Val Phe Pro
90 95 100
gat gca agt att cct gct gta tta act gga aat gta aaa gcg ggt gaa 989
Asp Ala Ser Ile Pro Ala Val Leu Thr Gly Asn Val Lys Ala Gly Glu
105 110 115 120
cgt gca tat gaa aac ttt gaa aaa ggt gtt aaa gcc act ttt gtt gag 1037
Arg Ala Tyr Glu Asn Phe Glu Lys Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu
125 130 135
gat att cgt tgg ttg cgt tgt gac att aaa tct tta aac ttg ctt ggt 1085
Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly
140 145 150
gca gta tta gca aaa caa gaa gct gcg gag aaa ggt tgt tat gaa gcg 1133
Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala Ala Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala
155 160 165
atc tta cat cgc gga gat atc gtg aca gaa tgc tct tca gct aat gtt 1181
Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Val Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val
170 175 180
tac gga att aaa gat gga aaa ctt tat aca cat cca gct aat aat ttc 1229
Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe
185 190 195 200
atc tta aat ggt att aca cgt caa gtc att tta aaa tgt gcg gaa gaa 1277
Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln Val Ile Leu Lys Cys Ala Glu Glu
205 210 215
att aat tta cca gta atc gaa gag cca atg acg aaa gct gat tta cta 1325
Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu Pro Met Thr Lys Ala Asp Leu Leu
220 225 230
aca atg gat gaa atc att gtg tcg tct gta tct tct gag gtt acg cca 1373
Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro
235 240 245
gtc att gat gtg gac ggc aac caa att ggg gct gga gtt ccc ggt gaa 1421
Val Ile Asp Val Asp Gly Asn Gln Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu
250 255 260
tgg act cgt caa tta cag caa tca ttt gaa gcg aaa tta cca ctt tca 1469
Trp Thr Arg Gln Leu Gln Gln Ser Phe Glu Ala Lys Leu Pro Leu Ser
265 270 275 280
atg aat acc aaa taaaagaacc ttgtagagaa ctatctgtat ggatagttct 1521
Met Asn Thr Lys
ctttatttat gggtgtaatg ttgggtctcg tcatgtaaaa taaaaaggat agtagaataa 1581
tcttacagat tgaaatttgt agagcaatgt cgatgtaatg aatacataag aatgcataga 1641
ctctttttac aaaggggatc gagaaaaaag agaactaaag agatggtaag taagaatgga 1701
gtgacctt
<210>2
<211>284
<212>PRT
<213>淀粉芽孢杆菌
<400>2
Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile
1 5 10 15
Ala Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr
20 25 30
Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly Asn Met Phe Thr Ala Gln Glu His
35 40 45
Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro
50 55 60
Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Glu Leu Ile Glu Lys
65 70 75 80
Asn Asn Leu Glu Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Ala
85 90 95
Asn Ser Arg Asn His Val Phe Pro Asp Ala Ser Ile Pro Ala Val Leu
100 105 110
Thr Gly Asn Val Lys Ala Gly Glu Arg Ala Tyr Glu Asn Phe Glu Lys
115 120 125
Gly Val Lys Ala Thr Phe Val Glu Asp Ile Arg Trp Leu Arg Cys Asp
130 135 140
Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala
145 150 155 160
Ala Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Val
165 170 175
Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu
180 185 190
Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Phe Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln
195 200 205
Val Ile Leu Lys Cys Ala Glu Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu
210 215 220
Pro Met Thr Lys Ala Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser
225 230 235 240
Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Asn Gln
245 250 255
Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Gln Leu Gln Gln Ser
260 265 270
Phe Glu Ala Lys Leu Pro Leu Ser Met Asn Thr Lys
275 280
<210>3
<211>1424
<212>DNA
<213>球形芽孢杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(427)..(1275)
<223>BSDAT
<400>3
acaaggagga tccgttaatc caaacgttag ctggtgttta tcgccgacaa acgggcgata 60
acgaaacacc tttactttca acaggcggtg gaacgtatgc acgcgtcttg aaaaaaggtg 120
tggcattcgg catgcttttc cctggtgatc cagatgtcat gcatcgtgcg gatgaatatg 180
taattgttga taaattagta caagctgctg ctatttatgc agaagccatt gcagaactgg 240
ctgggaagta agtgtcatta agagcgtaat gttttcttgc caaagagatc acgaagcttc 300
acacgccaag cacttcactg aaaaatctac tttgatttac tgcatctggt cttacttgat 360
cgtctagtgg gaatcattgt acttaaaaat gtgaaaataa cttaaaaatg aaaaggatgt 420
ata aac atg gca tac tca tta tgg aat gac caa atc gtt gaa gaa gga 468
Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly
1 5 10
tct att aca att tca cca gaa gac cgt ggt tat caa ttt ggt gat ggt 516
Ser Ile Thr Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly
15 20 25 30
att tac gaa gta atc aaa gta tat aac ggg cat atg ttt aca gca caa 564
Ile Tyr Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly His Met Phe Thr Ala Gln
35 40 45
gag cac atc gat cgt ttc tat gct agt gcc gaa aaa att cgc ctt gtt 612
Glu His Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val
50 55 60
att cct tat aca aaa gat gta tta cac aaa tta ttg cat gat tta atc 660
Ile Pro Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Asp Leu Ile
65 70 75
gaa aaa aat aat tta aat aca ggt cat gtt tac ttc caa att aca cgt 708
Glu Lys Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg
80 85 90
gga aca act tct cgt aac cac att ttc ccg gat gca agc gta cca gca 756
Gly Thr Thr Ser Arg Asn His Ile Phe Pro Asp Ala Ser Val Pro Ala
95 100 105 110
gtg cta aca ggt aat gtt aaa act ggt gaa cgt tca att gaa aat ttc 804
Val Leu Thr Gly Asn Val Lys Thr Gly Glu Arg Ser Ile Glu Asn Phe
115 120 125
gaa aaa ggc gta aaa gcg aca ttg gtt gaa gat gtt cgt tgg tta cgt 852
Glu Lys Gly Val Lys Ala Thr Leu Val Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg
130 135 140
tgt gat att aaa tct tta aat tta ctt ggc gcg gta ctt gcg aaa caa 900
Cys Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln
145 150 155
gaa gca tct gaa aaa ggt tgt tac gaa gcc att tta cac cgt gga gat 948
Glu Ala Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp
160 165 170
att atc aca gaa tgt tct tct gct aat gtc tat ggt att aaa gat ggt 996
Ile Ile Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly
175 180 185 190
aaa ctt tat acg cac cca gca aat aac tac atc tta aat ggt att aca 1044
Lys Leu Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Tyr Ile Leu Asn Gly Ile Thr
195 200 205
cgc caa gtt ata tta aaa tgt gcc gct gaa ata aat tta cca gtg att 1092
Arg Gln Val Ile Leu Lys Cys Ala Ala Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile
210 215 220
gaa gag ccg atg aca aaa ggc gat tta tta aca atg gat gaa att att 1140
Glu Glu Pro Met Thr Lys Gly Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile
225 230 235
gtg tct tct gtt tca tct gaa gtg aca ccg gtt atc gat gtg gat ggt 1188
Val Ser Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly
240 245 250
cag caa att ggt gca ggt gtt cct ggt gaa tgg act cgt aaa ttg caa 1236
Gln Gln Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln
255 260 265 270
aaa gca ttt gag gca aaa tta cca att tca att aat gcc taatctgtat 1285
Lys Ala Phe Glu Ala Lys Leu Pro Ile Ser Ile Asn Ala
275 280
aaatgattaa aaagagctac ctaaaacttg gttattcgcc aagttaggag ggtagctctt 1345
ttttatagaa caaaatatgc atgtattctc ctgaaacgtc atgtaaaata aaaaagatag 1405
cgcctttagt cgatatcac 1424
<210>4
<211>283
<212>PRT
<213>球形芽孢杆菌
<400>4
Met Ala Tyr Ser Leu Trp Asn Asp Gln Ile Val Glu Glu Gly Ser Ile
1 5 10 15
Thr Ile Ser Pro Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Ile Tyr
20 25 30
Glu Val Ile Lys Val Tyr Asn Gly His Met Phe Thr Ala Gln Glu His
35 40 45
Ile Asp Arg Phe Tyr Ala Ser Ala Glu Lys Ile Arg Leu Val Ile Pro
50 55 60
Tyr Thr Lys Asp Val Leu His Lys Leu Leu His Asp Leu Ile Glu Lys
65 70 75 80
Asn Asn Leu Asn Thr Gly His Val Tyr Phe Gln Ile Thr Arg Gly Thr
85 90 95
Thr Ser Arg Asn His Ile Phe Pro Asp Ala Ser Val Pro Ala Val Leu
100 105 110
Thr Gly Asn Val Lys Thr Gly Glu Arg Ser Ile Glu Asn Phe Glu Lys
115 120 125
Gly Val Lys Ala Thr Leu Val Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys Asp
130 135 140
Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Ala Val Leu Ala Lys Gln Glu Ala
145 150 155 160
Ser Glu Lys Gly Cys Tyr Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Asp Ile Ile
165 170 175
Thr Glu Cys Ser Ser Ala Asn Val Tyr Gly Ile Lys Asp Gly Lys Leu
180 185 190
Tyr Thr His Pro Ala Asn Asn Tyr Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg Gln
195 200 205
Val Ile Leu Lys Cys Ala Ala Glu Ile Asn Leu Pro Val Ile Glu Glu
210 215 220
Pro Met Thr Lys Gly Asp Leu Leu Thr Met Asp Glu Ile Ile Val Ser
225 230 235 240
Ser Val Ser Ser Glu Val Thr Pro Val Ile Asp Val Asp Gly Gln Gln
245 250 255
Ile Gly Ala Gly Val Pro Gly Glu Trp Thr Arg Lys Leu Gln Lys Ala
260 265 270
Phe Glu Ala Lys Leu Pro Ile Ser Ile Asn Ala
275 280
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S180A-S
<400>5
gatatcgtga cagaatgcgc ttcagctaat gtttacgg 38
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S180A-AS
<400>6
ccgtaaacat tagctgaagc gcattctgtc acgatatc 38
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181D-S
<400>7
gatatcgtga cagaatgctc tgacgctaat gtttacgg 38
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181D-AS
<400>8
ccgtaaacat tagcgtcaga gcattctgtc acgatatc 38
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：A182K-S
<400>9
cagaatgctc ttcaaagaat gtttacggaa ttaaag 36
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：A182K-AS
<400>10
ctttaattcc gtaaacattc tttgaagagc attctg 36
<210>11
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：N183S-S
<400>11
gtgacagaat gctcttcagc tagtgtttac ggaattaaag 40
<210>12
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：N183S-AS
<400>12
ctttaattcc gtaaacacta gctgaagagc attctgtcac 40
<210>13
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243E-S
<400>13
gaaatcattg tgtcgtctgt agagtctgag gttacg 36
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243E-AS
<400>14
cgtaacctca gactctacag acgacacaat gatttc 36
<210>15
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243L-S
<400>15
gaaatcattg tgtcgtctgt attgtctgag gttacg 36
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243L-AS
<400>16
cgtaacctca gacaatacag acgacacaat gatttc 36
<210>17
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243K-S
<400>17
gatgaaatca ttgtgtcgtc tgtaaaatct gaggttacgc cagtc 45
<210>18
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243K-AS
<400>18
gactggcgta acctcagatt ttacagacga cacaatgatt tcatc 45
<210>19
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243N-S
<400>19
gaaatcattg thgtcgtctgt aaattctgag gttacgccag 40
<210>20
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243N-AS
<400>20
ctggcgtaac ctcagaattt acagacgaca caatgatttc 40
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243Q-S
<400>21
gaaatcattg tgtcgtctgt acagtctgag gttacgccag 40
<210>22
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243Q-AS
<400>22
ctggcgtaac ctcagactgt acagacgaca caatgatttc 40
<210>23
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S244K-S
<400>23
cattgtgtcg tctgtatcta aagaggttac gccagtcatt g 41
<210>24
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S244K-AS
<400>24
caatgactgg cgtaacctct ttagatacag acgacacaat g 41
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243NS244K-S
<400>25
gaaatcattg tgtcgtctgt aaataaagag gttacgccag 40
<210>26
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S243NS244K-AS
<400>26
ctggcgtaac ctctttattt acagacgaca caatgatttc 40
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BSDAT-1
<400>27
ccgggattcg ttaatccaaa cgttagctg 29
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BSDAT-2
<400>28
ggcctgcagt taggcattaa ttgaaattgg 30
<210>29
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S243K-S
<400>29
gaaattattg tgtcttctgt taaatctgaa gtgacaccg 39
<210>30
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S243K-AS
<400>30
cggtgtcact tcagatttaa cagaagacac aataatttc 39
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S243N-S
<400>31
gaaattattg tgtcttctgt taactctgaa gtgacaccg 39
<210>32
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S243N-AS
<400>32
cggtgtcact tcagagttaa cagaagacac aataatttc 39
<210>33
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S244K-S
<400>33
gtgtcttctg tttcaaaaga agtgacaccg gttatc 36
<210>34
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：BS-S244K-AS
<400>34
gataaccggt gtcacttctt ttgaaacaga agacac 36
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
ggggctaatt cacgtgctca cgttttcccg gatgc 35
<210>36
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：N100A-AS
<400>36
gcatccggga aaacgtgagc acgtgaatta gcccc 35
<210>37
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181A-S
<400>37
gtgacagaat gctctgcagc taatgtttac gg 32
<210>38
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181A-AS
<400>38
ccgtaaacat tagctgcaga gcattctgtc ac 32
<210>39
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：A182S-S
<400>39
gtgacagaat gctcttcatc taatgtttac ggaattaaag 40
<210>40
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：A182S-AS
<400>40
ctttaattcc gtaaacatta gatgaagagc attctgtcac 40
<210>41
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181A/A182S-S
<400>41
gatatcgtga cagaatgctc tgcatctaat gtttacgg 38
<210>42
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：S181A/A182S-AS
<400>42
ccgtaaacat tagatgcaga gcattctgtc acgatatc 38
机译： 使用该方法生产突变体D-氨基转移酶和旋光性谷氨酸衍生物的方法
机译： 使用该方法生产突变体D-氨基转移酶和旋光性谷氨酸衍生物的方法
机译： 突变的d-氨基转移酶和使用其生产旋光性谷氨酸衍生物的方法
