在诊断性杂交测试中同时降低序列变异和基线增加的影响的方法、进行这种方法的测试和用于所述测试的探针

摘要

本发明涉及探针或分子信标探针在诊断杂交测试中的用途，所述探针用于降低：核酸分析物中序列变异的影响和/或IBL效应，所述IBL效应是通过酶(所述扩增物中的污染物)使分子信标的茎－环结构可能打开而造成的，所述测试包括步骤：将引物组与包含所述核酸分析物的样品接触以扩增所述分析物并且通过探针检测扩增的分析物或其互补序列，其中所述探针或分子信标探针包含一个或多个具有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷类似物。本发明也涉及这样的探针和分子信标探针和涉及使用这样的探针和分子信标探针进行诊断测试的试剂盒。

说明书

本发明涉及用于在诊断杂交测试中降低序列变异影响的方法，所述测试使用核酸探针去检测扩增的核酸分析物。本发明也涉及用于降低不合需要的IBL(基线增加)效应的方法，所述IBL效应限制分子信标在诊断杂交测试中使用。本发明进一步涉及由此得到的测试方法和用于所述测试的探针，即诊断测试和用于这两个方法中至少其一的探针，所述方法用于减少诊断结果中的不利结果。许多诊断测试是基于在有引物的帮助下对核酸分子或其部分进行扩增以及通过探针检测扩增产物。在合适的反应条件下，引物与要检测的分析物杂交并启动目的序列的扩增。这将导致扩增子的产生。

与此同时已经发展了各种扩增技术，例如PCR、LCR、NASBA、TMA、RCR、3SR和SDA，并且如今本领域技术人员对这些技术非常熟悉。这些技术的相关信息可在各种文献中查到：

●PCR(聚合酶链式反应)，于专利US-A-4,683,195，US-A-4,683,202等US-A-4,800,159中有描述，并且它的衍生方法RT-PCR(反转录PCR)，可对RNA进行扩增，具体公开于EP-B-0.569.272。

●LCR(连接酶链式反应)，公开于EP-A-0.201.184，

●NASBA(基于核酸序列的扩增)，描述于WO-A-91/02818，等

●TMA(转录介导的扩增)公开于专利US-A-5,399,491。

●RCR(修复链式反应)公开于申请WO-A-90/01069，

●3SR(自持续序列复制)详细解释于申请WO-A-90/06995。

在扩增分析物或其部分期间或之后，应该检测生成的复制子的存在或量。可以用各种已知的技术例如用凝胶分离样品，随后利用印迹和探针检测来进行所述检测。这种检测只能在扩增完成后才能进行。

在相似的方法中，不用分离所述反应组份就可进行扩增和检测。复制子可以在复制期间进行检测。于是，可对复制子的生成进行实时监控并且因此所得的数据可以用来确定复制子的存在或缺失或量。一种在这种相似的技术中非常有用的探针是分子信标(MB)。

分子信标是拥有茎-环结构的单链寡核苷酸。环状部分包含与目的核酸(DNA或RNA)互补的序列。茎由于序列的3’端与5’端互补杂交而形成。茎可以与目的序列无关并且是双链的。茎的一条臂上标记有荧光染料(荧光团)，而另一条臂结合有猝灭分子。在茎-环状态下，探针不产生荧光，因为荧光团的能量转移到猝灭分子上了。当分子信标与目的序列杂交时，茎-环结构消失并且猝灭分子与荧光团分开。在这个阶段由荧光团发射的荧光就能被检测和定量。最近在开发使用MB’s检测目的序列的测试方法过程中，申请者观察到商业购买的通常在扩增过程中使用的酶的质量(例如T7RNA聚合酶(T7))存在不同。这导致发现甚至来自同一供货商的，拥有同样特异性活性和体积活性的不同批次的T7拥有不同程度的不利的MB打开(IBL效应)，如果这些MB由天然脱氧核糖核苷酸组成。于是甚至在所检测的生物样品中缺少特异性目的序列时荧光信号仍然出现，产生可能错误的阳性结果。

如果技术人员已经将IBL效应与T7自身联系起来，那我们的观察无意中显示产生这种现象的不是T7而是很可能在T7中存在至少一种未知污染物，所述污染物每批可能都不相同。与涉及用于在诊断杂交测试中降低序列变化效应的方法的公开文献相一致，本领域技术人员已经总结出使用只由2’-氧-甲基衍生物组成的MB以克服IBL效应。本申请者意外地发现，在MB中引入较少量的2’-氧-甲基基团会更加用效，并且取代所有天然存在的脱氧核糖核苷酸会导致无或较少功能的MB。

关于诊断杂交测试中序列变异的影响，可以对扩增反应中产生的扩增子进行定量或定性检测。在前一种情况下对生成的复制子的量进行测定。在定性测试中只对分析物的存在或缺失进行确定。

分析物中序列变异(多态性)导致其数量低估。同样在定性测试中序列变异会造成假的阴性结果。通常假设这是由于分析物和用来扩增分析物的引物之间的错配或由于所述分析物的结构造成的，所述结构导致引物不能与分析物结合。

已知病毒例如对分析物HIV、CMV、HSV等存在各种多态性病原株系。这些多态性株系相互之间有一个或多个核苷酸不同。当引物与分析物不同时它们就不会很好地配合就会导致扩增减少。当分析物不是线性并拥有特殊的结构时，引物就较少接近它，这样反过来也导致扩增的减少。

此外，分析物的扩增目标序列和用于检测的探针之间的序列差异进一步降低检测的效果。于是具有多态性的分析物就不如与探针的一致序列完全匹配的分析物好检测。然而，检测通常在低于扩增的温度下进行，所以探针和目的序列之间错配的负面效果期望远比引物和分析物之间差异造成的小。

可以优化探针来适合已知的多态性。然而，在未知的多态性情况下这是不可能的。这尤其是个问题，因为新的、未知的多态性是连续产生的，它妨碍可靠的检测或定量，尤其是对HIV。

在导致本发明的研究中，现在发现：在具有未知多态性的HIV病毒(临床)样品的NASBA扩增反应中没有信号或很低的信号在分子信标检测系统中生成。然而，当对分子信标探针进行修饰，例如增加探针与分析物间的熔解温度可以检测到令人惊奇的扩增子。这导致意外的结论：扩增子确实产生了，但没有或仅部分被检测到。

关于IBL效应，申请者也观察到当分子信标探针的茎经修饰而使茎的核苷酸部分地被2’-氧-甲基衍生物取代时，可以降低所述IBL效应，所述效应因存在于酶(例如在NASBA扩增中使用的酶(AMV-RT，T7RNA聚合酶和RNase H))的批次中的污染物所造成的所述茎的不合需要的打开而造成。

对构成探针并且尤其是分子信标探针的核苷酸的修饰是个普遍的技术，可以从下面提到的文献中获得。

例如在申请WO-A-00/66604中，公开了L-ribo-LNA苷核酸在构建寡聚核苷酸中的应用。L-ribo-LNA可以用作增加探针亲和力和/或特异性并且也平衡不同寡核苷酸对它们的互补序列的亲和力的方法。与短探针结合的这种LNA的特殊形式也可以用来区分RNA和DNA探针。这个可以通过用L-ribo-LNA替换寡核苷酸中所选的核苷酸以改善诊断和分子生物学方法来实现。

Majlessi等人的文献(vol.26，no.9，1998，2224-2229页(XP002241700))描述了只包含2’-氧-甲基寡核苷酸的线性探针。这篇文献的目的限于比较2’-氧-甲基探针和正常2’-脱氧探针，以显示修饰的探针提高了的Tm和更快的杂交动力学。他们得出结论：对于2’-氧-甲基探针配对和错配的双螺旋间的Tm值变化要比对应于2’-脱氧探针的大得多。对所有检查的探针长度(8-26个核苷酸)来说这个断言是正确的并且当探针长度为16个碱基或更短时Tm的差异是最明显的。

另一篇Tsourkas等人的文献(vol.30，no.23，12月1日，2002，5168-5174页(XP002241701))建议减少核酸酶降解分子信标。为了这个目的，他们通过用2’-氧-甲基寡核苷酸替代分子信标中的所有2’-脱氧核苷酸以保护MB和同时增强探针和RNA问的亲和力。

在Brown-Driver等人的文献中(vol.9，no.2，4月1999(1999-04)，145-154页(XP009008881))，建议使用与HCV RNA互补的经修饰的反义寡核苷酸代替未修饰的寡核苷酸以抑制HCV的翻译。其中一个修饰的寡核苷酸(是其它当中好的候选者)是2’-氧-甲基寡核苷酸。如上述二篇文献中所陈列的，每一个修饰的反义寡核苷酸的所有核苷酸都是由2’-氧-甲基核苷酸组成。这种结构的结果是增加了目标序列和修饰的寡核苷酸之间的亲和力并且然后是两者之间强的结合。

与此处上面提到的现有技术相反，本发明显示仅在每个探针中整合少数2’-氧-甲基核苷酸{(杂交的26个核苷酸中6到15个之间)即整合23％到58％之间}的分子信标探针可用于对RNA目的序列的检测并且甚至比完全由2’-氧-甲基核苷酸取代的寡核苷酸更有效。

关于序列变异在诊断杂交测试中的影响，LNA类似物也是达到本发明最终结果的好的候选者：用LNA部分修饰的分子信标成为在诊断测试中用于降低对目标序列变异依赖性的非常通用的工具。

同样地，当这些分子信标探针部分地用2’-氧-甲基核苷酸修饰时可以降低由存在于扩增酶混合物中的污染引起的所述分子信标的茎环结构的可能打开造成的IBL效应。这将导致意外的结论：当具有这种改善的结构时，分子信标探针拥有更好的稳定性并且在酶(扩增中的污染物)存在时不会自发打开。

因此本发明的目的是通过控制探针和分析物之间的亲和力降低杂交测试中序列多态性的影响。根据本发明，这个目的可以通过引入一个或多个核苷酸和/或核苷酸类似物到探针中导致分析物和所述探针之间的亲和力增加来实现。

于是本发明涉及探针在诊断杂交测试中降低核酸分析物中序列变异影响的应用，所述探针可以是分子信标，所述测试包括步骤：将一组引物与含核酸分析物的样品接触以扩增所述分析物并且通过探针检测所述扩增分析物或其互补序列，其中所述探针包含一个或多个拥有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物并且所述诊断测试用于评估存在于样品中的分析物的量。

本发明也涉及探针在诊断杂交测试中降低核酸分析物中序列变异影响的应用，所述探针可以是分子信标，所述测试包括步骤：将一组引物与含核酸分析物的样品接触以扩增所述分析物并且通过探针检测所述扩增分析物或其互补序列，其中所述探针包含一个或多个拥有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，即在恒定的杂交温度下，与未修饰的探针和任何分析物的多态性序列间的熔解温度相比，所述探针和任何可能的分析物的多态性序列间的熔解温度增加了并且所述诊断测试用于估计样品中所述分析物的存在。

本发明涉及分子信标探针用于在诊断杂交测试中降低IBL效应的应用，所述IBL效应是由存在于扩增酶混合物中的至少一种污染物引起的所述分子信标茎的可能打开所造成的，所述检测包括步骤：将一组引物与含核酸分析物的样品接触以扩增所述分析物并且通过探针检测所述扩增分析物或其互补序列，其中所述探针的茎包括：

●一个或多个具有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，特别是2’-氧-甲基核苷酸，和

●一个或多个未修饰的核苷酸。

本发明也涉及探针在诊断杂交测试中的应用，所述探针用于降低：

●序列变异在核酸分析物中的影响，和/或

●因为污染的酶引起的分子信标茎-环结构的可能打开而造成的IBL效应，

所述测试包括步骤：将一组引物与含核酸分析物的样品接触以扩增所述分析物并且通过探针检测所述扩增分析物或其互补序列，其中所述探针的环包含：

●一个或多个具有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物，和

●一个或多个未修饰的核苷酸。和/或所述探针的茎包括：

●一个或多个具有亲和力增强修饰的2’-氧-甲基核苷酸，特别是2’-氧-甲基核苷酸，和

●一个和多个未修饰的核苷酸。

关于降低核酸测试中序列变异的影响，探针和目的序列之间的结合是一方面未结合的目的序列和未结合的探针间与另一方面两者间形成的双螺旋之间的平衡。

这种平衡通过双螺旋的熔解温度(Tm)来描述，此处定义Tm为当50％的探针与目的核酸结合时的温度。通过增加熔解温度可以使平衡移向双螺旋方向。在测试中这将导致完全匹配的分析物的等量定量，更好的(即更高的)对在与所述探针互补的序列中含多态性的分析物的定量和改善的对非常少量的(多态性)分析物的检测。

此处使用的术语“探针”倾向于包含一段与目的序列杂交的核苷酸。优选的杂交部分是10-50个，更优选15-35个，最优选15-30个核苷酸的片段。

术语“亲和力增强”是指相比于分析物和未修饰探针之间的熔解温度，包含亲和力增强修饰的探针与分析物之间的双螺旋的熔解温度增加。

具有增强包含修饰的探针与目的DNA或RNA的亲和力的核苷酸或核苷酸类似物优选地选自由2’-氧-衍生的核苷酸、锁定的核酸(lockednucleic acids(LNA))和肽核酸(PNA)。在2’-氧-衍生的核苷酸中优选的是2’-氧-甲基核苷酸。

根据本发明的探针优选地是所谓的分子信标(MB)。这些探针比线性探针更特异地识别它们的目的分析物并且能容易地区分相互之间只有单个核苷酸不同的目的分析物。通过更特别在分子信标的环中引入具有亲和力增强修饰的一个或多个核苷酸和/或核苷酸类似物降低了对多态性的敏感性，因为探针对多态性分析物的亲和力增强且在测试中获得更精确的结果。于是，修饰的分子信标成为降低在同源分析中对目的分析物序列变异依赖性的非常通用的工具。

关于IBL效应，术语“分子信标”探针是指包含属于探针3’端的与所述探针5’端互补序列杂交的序列的一段核苷酸。优选地杂交部分是4-15个，更优选地5-10个，最优选地6-8个核苷酸的片段。

修饰的核苷酸可用来合成整个探针或用来制备只有部分核苷酸被修饰的核苷酸取代的嵌合探针。

消除错配的所必需的最小的修饰量取决于分析物的一致序列与要检测的分析物序列之间的差异量。通常，可以说修饰的量应当可以使探针与要检测的分析物之间的双螺旋的熔解温度高于检测温度，即进行检测时的温度。

探针中修饰的核苷酸的量也取决于所使用的修饰类型。与单个2’-氧-甲基核苷酸的效果相比在探针中引入单个LNA核苷酸后Tm(探针与它的目的分析物的熔解温度)增加的值要高得多。例如在实施例中证明在探针中引入2个LNA核苷酸使Tm增加15℃，而要获得同样的Tm增加值需要12个2’-氧-甲基核苷酸。

要检测的分析物，例如HIV，可能含有易于突变然后导致多态性的所谓“热点”。当这些热点的位置或分析物和探针间其它错配的位置已知时，例如在已知的分离物的情况下，优选在多态性位置周围安排具有亲和力增加修饰的核苷酸或核苷酸类似物，优选地在保守位置上。

本发明进一步涉及使用核酸探针检测核酸分析物的杂交测试，其中所述探针包含一个或多个具有亲和力增加修饰的核苷酸或核苷酸类似物。用于探针的修饰核苷酸和/或其类似物如上面所定义。

本发明的所述杂交测试可以是任何类型的其中用核酸探针检测核酸分析物的测试。这种测试可能基于检测扩增的分析物，例如基于PCR、TMA或NASBA的测试。然而，探针也可用于测试中。本发明既可以用于定量诊断测试又可以用于定性诊断测试，在所述的测试中目的序列的多态性影响测试的可靠性。

得益于本发明的诊断测试是例如用来检测病毒、细菌和其它生物标记，例如HIV、HBV、HCB、HSV、CMV、Ebola、军团杆菌(Legionella)、支原体(Mycoplasma)、衣原体(Chlamydia)、博德特氏菌(Bordetella)、RSV、MRSA、HSV、TNF-α、EF-α的测试，只要这些诊断测试的特征在于它们利用目的分析物和修饰的寡核苷酸之间杂交的这种方式。

本发明也涉及包含一个或多个具有亲和力增强修饰的核苷酸和/或核苷酸类似物的探针。所述探针优选地是分子信标。

在本申请中术语“分析物”、“扩增子”和“目的物”或“目的序列”可以相互交换使用。

分析物是要检测的原始核酸分子。目的序列是通过引物扩增的分析物的一部分。扩增导致扩增子的形成，所述扩增子是物理上通过与探针杂交被检测的核酸分子。扩增子的序列与分析物中的目的序列相同或互补。

现在本发明将以后随的实施例和附图加以描述并且所述的实施例和附图并不表示以任何方式限制本发明。接着本发明将进一步对附加的附图进行说明：

●图1：允许检测军团杆菌的分子信标的示意图说明，根据本领域的表述，此后称为军团杆菌。

●图2：根据本发明既允许检测相同的军团杆菌又能降低IBL效应的改进的分子信标的示意图说明，此后称为Leg-met1。

●图3：允许检测支原体的分子信标的示意图说明，根据本领域的表述，此后称为支原体。

●图4：根据本发明既允许检测相同的支原体细菌又能降低IBL效应的改进的分子信标的第一个实施方案的示意图说明，此后称为Myco-met。

●图5：允许检测衣原体的分子信标的示意图说明，根据本领域的表述，此后称为衣原体。

●图6：根据本发明既允许检测相同的衣原体又能降低IBL效应的改进的分子信标的示意图说明，此后称为Chlam-met。

●图7：允许检测野生型肠球菌(Enterococci)的分子信标的示意图说明，根据本领域的表述，此后称为WT Entero。

●图8：根据本发明既允许检测相同的野生型肠球菌又能降低IBL效应的改进的分子信标的示意图说明，此后称为WT Entero-met。

●图9：允许检测HIV的分子信标的示意图说明，根据本领域的说明，既没有在茎部也没有在环部整合入2’-氧-甲基核苷酸，此后称为参照MB。

●图10-19：允许检测HIV的一系列分子信标的示意图说明，根据本领域表述此后称为MB1到MB10。每一个分子信标拥有不同的含有2’-氧-甲基衍生物的茎。

●图20：表示不同T7酶批次对于IBL效应影响的条形图。

●图21：表示最优化的茎结构对不同酶批次的变化的IBL效应的作用效果条形图，和表示与测试中使用的不同分子信标(即一方面是未修饰的分子信标而另一方面是修饰的分子信标)相关联的IBL效应的比较研究的条形图。

在图20和21中，所述修饰的分子信标将2’-氧-甲基核苷酸整合入茎部。

在图1-8和10-19中，所述修饰的核苷酸用相应的字母表示，主要地以加粗、斜体和下划线的形式标出的G表示鸟嘌呤或A表示腺嘌呤。

              实施例实验细节的总体描述

除非在实施例中另外声明，下面所描述的实施例使用下面提到的条件和方法。

在使用扩增的RNA材料的实验中，这个材料通过RNA模板(病毒溶解产物)的扩增获得，通过使用标准分离方法和在NASBA扩增条件提取和扩增所述所述模板RNA。

在每个实施例中除了使用的探针类型变化外反应条件都保持一致。

作为确定改进的亚型活性的模式系统，使用一组特征清楚的代表绝大多数不同亚型HIV-1的病毒溶解产物。

如果扩增反应用来产生定量结果，使用已知量的内标与目的分析物进行共扩增，所述内标在分离物之前加入反应体系。这个内标通过使用带有不同颜色的另外的分子信标进行检测。根据实时扩增曲线和使用特殊开发的软件就可能精确地确定存在的材料的量。目的分析物和分子信标之间的熔解温度(Tm)可通过测量作为温度增加量函数的混合物的荧光密度来确定。根据这些熔解曲线可以确定Tm。如果过剩的目的分析物是扩增子(RNA)，则Tm就称作Tm环RNA。如果目的分析物是过剩的合成DNA，则Tm就称作Tm环DNA。后者通过使用与分子信标互补的合成的DNA链来确定。在这个序列中我们已经引入2个对应于次黄嘌呤核苷的C。在RNA目的分析物(扩增子)中这些位点包含2个T。

实施例1

在探针中用2’-氧-甲基衍生物取代核苷酸对双螺旋Tm的影响

表1描述了3个新的和一个参照MB的杂交部分的序列。表1也显示了对于合成DNA和扩增材料(RNA)已测量的不同分子信标的Tm值。

                                    表1

  名  称  Tm环  DNA  Tm环  DNA                                                                                 位置  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  Ref.  58.6  48.6  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A  I  G  C  T  G  C  A  G  A  I  T  G  G  G  A  Me-1  54.7  53.8  A  T  C A A  T  G A  G  G A  I  G  C  T  G  C A  G A  I  T  G  G  G  A  Me-2  58.7  62.1  A  T  C A A  T G  A G G A  I G  C  T G  C  A G A  I  T G G  G  A  Me-7  59.4  ＞65  A  T  C A A  T G  A G G A  I G  C  T G  C A G A  I  T G G G  A

A，G分别＝A和G的2’-氧-甲基核苷酸

从表1的数据可以看出，2’-氧-甲基衍生物的引入导致目的RNA和分子信标的环之间的亲和力增强(更高的Tm环RNA)。正如预期的，这个增加不如对DNA-分子信标复合物的明显，因为已知2’-氧-甲基衍生物与RNA结合比DNA目的分析物结合强。

实施例2

在探针中用LNA取代核苷酸对双螺旋Tm的影响

在表2中显示2个新的MB以及参照MB的杂交序列。所述新的MB分别包含2个和3个LNA构建块。也已测量了互补的DNA和扩增的材料(RNA)的Tm值并且在表中描述了测量结果。从这个表中可以看到LNA核苷酸同时增加DNA和RNA复合物的Tm。还可以看出与2’-氧-甲基核苷酸相比每一个LNA修饰对Tm的影响会更高。

                                   表2

  名  称  Tm环  DNA  Tm环  DNA                                                                               位置  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  Ref2.  45.8  57.6  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A  A  G  C  T  G  C  A  G  A  A  T  G  G  G  A  LNA1  47.1  62.8 a  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A  A  G  C t  G  C  A  G  A  A  T  G  G  G  A  LNA2  57.5  ＞65 a  T  C  A  A  T  G  A  G  G a  A  G  C t  G  C  A  G  A  A  T  G  G  G  A

a LNA核苷酸

实施例3

用修饰的分子信标检测不同HIV-1分离物

表3显示已选出的研究目的RNA序列中5个序列多态性影响的用作模式系统的HIV分离物。这些材料以已知浓度的病毒溶解物可获得并且已和实施例1和2中的分子信标应用于NASBA扩增反应。

                                       表3

  名称                                                                               位置  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  Ref，  分子信标  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A  I  G  C  T  G  C  A  G  A  I  T  G  G  G  A  亚型A  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A A  G  C  T  G  C  A  G  A A  T  G  G  G  A  亚型G1  A  T T  A  A  T  G  A A  G  A A  G  C  T  G  C  A  G  A G  T  G  G  G  A  亚型N  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A A  G  C A  G  C  A  G  A C  T  G  G  G  A  亚型01  A  T  C  A  A  T  G  A T  G  A A  G  C A  G  C  A  G  A T  T  G  G  G  A  亚型03  A  T  C  A  A  T  G  A  G  G  A A  G  C G  G  C  A  G  A T  T  G  G  G  A

表4显示了从样品获得的定量结果，所述样品包含每种亚型等量的目的分析物，其中三种分子信标与我们的参照分子信标作比较。

表4

  亚类  Ref MB  LNA2  Me-2  Me-7  A  6.5  6.5  6.5  6.5  G  4.7  5.9  6.4  6.6  N  4.3  4.6  5.2  5.3  01  3.3  4.9  5.4  5.9  03  4.9  5.8  6.3  6.2

因为A亚型和所有4种分子信标完全符合，因此基于这个亚型对所有定量数据进行标准化。由于其它亚型显示与分子信标的环状结合区域有序列变异(见表3)因此已被选择出来。可以看出，对于所有5种亚型已观察到最高的定量是具有Me-7的分子信标衍生物。

为研究在较好的定量与不同分子信标的Tm环RNA值(℃)之间的关系，对分子信标衍生物与NASBA扩增子之间的双螺旋体确定Tm环RNA值。结果示于表5。

表5：使用几种MB扩增材料(RNA)的Tm环RNA值(℃)

  亚类  ref  MB  LNA2  Me-2  Me-7  A  48  65  62  65  G  45  52  58  65  N  42  55  53  60  01  27  44  44  53  03  40  52  54  60

从表4和表5可以看出在更高的Tm环状RNA(复制子和分子信标之间)和更高的定量之间可以观察到明确的相关性。

实施例4

茎结构对IBL减小的影响

对一系列对HIV目的分析物拥有一致的杂交序列的MB进行比较。MB之间的茎部序列和在茎部的2’-氧-甲基衍生物的内容及位置不相同。图10-19描述了所研究的结构。图9显示用作参照物并且没有包含2’-氧-甲基衍生物的分子信标。

将下面描述的实验中的所有MB在在缺少目的分析物存在的情况下提供给标准NASBA扩增条件(无模板反应)，所述目的分析物可用这些MB检测。测量作为时间函数存在于MB中的荧光信号。从这些数据中可以得到作为在60分钟时间段里信号增量的IBL效应。IBL的百分比是与起始信号相比的增量。

            表6

  MB 编号  IBL  百分比  参照MB  7％  MB1  6％  MB2  5％  MB3  3％  MB4  9％  MB5  5％  MB6  4％  MB7  5％  MB8  1.5％  MB9  0.5％  MB10  10％

从这个表可以得出：在MB的3’或5’端包含连续的2’-氧-甲氧基核苷酸段的MB4和MB10不是作用最优的。还可以从这些数据看出，对于MB8和MB9，设计的具有低IBL效应的茎具有出人意外低的IBL效应。

实施例5

不同T7酶批次对IBL效应的影响

将为肠道病毒设计的MB(图7)与包含相同杂交序列但茎结构基于来自前面实施例中的MB8(参见图17)的MB相比较。图8描述了为肠道病毒设计的修饰MB。

在下述的实验中研究两个MB。将它们在缺少目的分析物存在的情况下提供给标准NASBA扩增条件(无模板反应)，所述目的分析物可用这些MB检测。对两个MB反应条件保持一致并且所研究的变化是：

1)在探针中引入新的茎的效应和

2)3个批次的T7酶在Nasba反应中的影响。

所述三个批次的酶从相同的供应商购得并且拥有相同的特异性活性。它们在所观察到的IBL效应(根据IBL效应区分的正常、中等、差(差表示存在大量不合需要的所述MB的打开))不同。测量作为时间函数的存在于MB中的荧光信号。从这些数据中可得出作为120分钟时间段里信号增量的IBL效应。IBL的百分比是与起始信号相比较的增量。

从图20可以看出对于所有包含正常脱氧核糖核苷酸的MB，所谓的“野生型肠”(WT Entero)，不合需要的分子信标的打开产生了显著增加的IBL效应，所述IBL效应产生于中间和差的T7酶批次的使用之中。然而，在茎部包含有2’-氧-甲氧基修饰的MB(图8)显示几乎对T7批次的质量没有任何影响。这就清楚地表明是T7的质量(例如至少会存在一种T7的污染物)而不是T7本身决定IBL效应。

实施例6

最优化的茎结构对不同酶批次的变化的IBL效应的影响

将为不同目的分析物(军团杆菌(图1)、衣原体(图3)、支原体(图5))设计的第二个系列的MB与包含相同杂交序列但茎结构基于来自前面实施例(分别为军团杆菌(图2)和衣原体(图6))中的MB8(参见图17)的MB相比较。对于支原体目的分析物这是不可能的，因此与MB8相比在茎结构上制造了小的偏差，并且获得对这个目的分析物具有特异性的修饰的分子信标(图4)。

在下面描述的实验中对MB成对进行研究(对每个目的分析物)。将它们在缺少目的分析物存在的情况下提供给标准NASBA扩增条件(无模板反应)，所述目的分析物可用这些MB检测。每套MB中的反应条件保持一致并且所研究的变化是给探针引入新的茎，以及第二个变化是在Nasba反应中的使用2个批次的T7酶。已知第一个批次(称为T7)是好的，而且已知第二个批次(来自相同供货商并且拥有相同的特异活性)产生更多的不合需要的分子信标的打开，所述信号分子能产生显著增加的IBL效应。测量作为时间函数存在于MB中的荧光信号。根据这些数据，可得出作为在60分钟时间段内信号增量的IBL效应。IBL的百分比是与起始信号相比较的增量。

从图21可以看出对于包含正常脱氧核糖核苷酸的所有MB，所述差的T7导致较高的不合需要的IBL效应。然而，在茎部含有2’-氧-甲氧基的修饰MB显示对T7的质量几乎无任何影响。换句话说，甲氧基衍生物在茎结构中的应用使MB较少地受到酶质量的损害。