法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-05-30
授权
授权
2006-01-18
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-11-30
公开
公开
关于政府
本项发明在政府支持下进行，卫生与公众服务部授权号AI31338。政府对该项发明拥有某些权力。
发明领域
概括地说，本发明所涉及的免疫原组合物来自于重组减毒细胞内病原菌。更为确切地说，本发明所涉及的免疫原组合物包含重组减毒分枝杆菌，此种分枝杆菌能过量表达和分泌主要细胞外蛋白。而且，本发明的免疫原组合物也包含营养缺陷型菌株在内的重组减毒分枝杆菌。本发明的免疫原组合物可用于诱导宿主中的免疫反应。
发明背景
人们很早就认识到寄生微生物具有感染动物的能力，因此引起疾病并经常导致死亡。在历史上病原体是死亡的主要原因，并仍带来巨大的痛苦。在过去的一百年里，虽然在很多传染病的预防和治疗方面已经取得巨大的进展，但复杂的寄主-寄生物相互作用仍然限制治疗措施的普遍有效性。结核病等各种疾病的重现以及许多抗药菌株和毒株的出现证明了在对抗病原生物体展示的复杂入侵机制方面的困难。
流行病学分析主要相关的那些病原体中，已经证明治疗或者预防细胞内的细菌时特别困难。细胞内细菌，包含分枝杆菌属，在宿主有机体细胞内而不是在细胞外完成它们全部或部分的生存周期。在全世界范围，细胞内的细菌是造成无数苦难和每年数百万死亡的原因。在世界范围内，结核病是单一病原体而致人死亡的首要原因，每年就能产生1000万新病例，导致290万人死亡。另外，细胞内的细菌也是造成数百万麻风病例的原因。细胞内病原体传播的其它导致衰弱的疾病包括皮肤和内脏利什曼病、美国锥虫病(查格斯病)、李斯特菌病、弓形体病、组织胞浆菌病、沙眼、鹦鹉热、Q热和军团病等。
目前认为，每年大约三分之一的世界人口受到结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的感染，导致数百万肺结核病例。更为确切地说，主要由结核分枝杆菌引起的人类肺结核病是发展中国家中死亡的主要原因。结核分枝杆菌能在巨噬细胞和单核细胞内生存，可能造成慢性细胞内的感染。通过将其自身隐藏在主要负责探测异物和随即激活免疫系统的细胞内，结核分枝杆菌能够相对成功地逃避寄主生物体的正常防御。而且，许多用于治疗结核病的一线化疗药物治疗细胞内生物体的活性比治疗细胞外生物体的活性要低。迄今为止，这些相同的病原体特性已经限制了免疫治疗药物或免疫原组合物在治疗结核传染病时的有效性。
最近，美国50个州中的36个州报导了耐一种或多种药物的结核病。在纽约，全部测试病例的1/3对一种或多种药物有耐药性。虽然无耐药性结核病经过长期使用抗生素可以治愈，但是有关耐药菌株的前景黯淡。感染了对两种或更多主要抗生素耐药的菌株的病人，其死亡率大约为50％。因此，迫切需要安全有效的抗各种结核分枝杆菌的免疫原组合物。
由于病原体能够在潮湿或者干燥的痰中存活数周或者数月，结核分枝杆菌首次感染几乎都是通过吸入气溶胶化粒子而发生的。虽然感染的主要部位是肺部，该生物体也能引起几乎所有器官的感染，包括但不限于骨骼、脾脏、肾、脑膜和皮肤。感染和相应的组织损害可能较小也可能很大，这取决于具体菌株的毒性和宿主的抵抗力。就人而论，在大多数暴露于该细菌强毒株的个体中首次感染受到控制。首次感染之后的获得性免疫能够减少细菌繁殖，从而促使损害处愈合，使患者症状大体消失。
当受感染者控制不住结核分枝杆菌时，往往会导致肺组织的广泛退化。当结核分枝杆菌在肺泡或者肺巨噬细胞内繁殖时，会对易感染个体产生损害。当那些生物体增殖时，它们可通过淋巴系统扩展至远端淋巴结，通过血液流扩散到肺尖、骨髓、肾和大脑周围的脑膜。首先，作为细胞介导超敏性反应的结果，按感染严重程度产生特征性肉芽损伤或者结核结节。这些损伤由以单核细胞、淋巴细胞和成纤维细胞为边缘的上皮样细胞组成。在大多数情况下损伤或者结核结节会最终坏死并且经历干酪状坏死(受感染的组织转换为一种柔软的于酪状物质)。
尽管结核分枝杆菌是一类重要的病原体，但其它分枝杆菌种类也能引起动物(包含人类在内)患病，这一点显然在本发明范围内。例如，牛结核分枝杆菌(M.Bovis)与结核分枝杆菌密切相关，是造成家畜(例如牛、猪、绵羊、马、狗和猫)的结核性传染病的原因。甚至，牛结核分枝杆菌可以通过肠道感染人，最典型的是通过食用鲜奶。局部的肠道感染最终扩散到呼吸道并且不久后出现结核病的典型症状。另一种重要的分枝杆菌属病原细菌是麻风分枝杆菌(M.leprae)，它曾造成数百万古老的麻风病病例。本属其它引起动物和人类疾病的种类包含堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、细胞内鸟结核分枝杆菌(M.avium)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、海鱼分枝杆菌(M.marianum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)和瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)等。致病性分枝杆菌种类经常在他们各自的DNA和相应蛋白序列方面表现出高同源性，某些种类如结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌等是高度相关的。
由于明显的现实和道德原因，早期在人体中测定关于这种疾病的实验组合物效能是不现实的。因此，在任何药物和免疫原组合物的早期开发中，出于对安全和成本的考虑，使用适当的动物模式是标准方法。如果抗原决定簇经常在不同种类的宿主里有活性，可以预测使用实验动物模型的成功。因此，某一物种如啮齿类动物或者豚鼠中的抗原决定簇，一般在不同物种例如在人类中具有免疫活性。只有在适当的动物模型充分发展后，才能进行人体临床试验，以进一步证明免疫原组合物在人体的安全性和有效性。
关于结核分枝杆菌对肺泡或者肺部的感染，在许多方面，豚鼠模型与人的病理学表现相近。因此，本领域技术人员非常明白，把本疾病的豚鼠模型外推到人类和其它哺乳动物是可行的。像人一样，低剂量气溶胶化人类病原体结核分枝杆菌容易使豚鼠感染结核。与人首次感染通常得到控制不同，豚鼠一旦暴露于气溶胶化病原体，会持续地发展传播疾病，使随后的分析变得容易。甚至，豚鼠和人都会显示出皮肤迟发型超敏反应，特征为皮试部位致密单核细胞硬化或者硬化区的产生。最后，人与豚鼠的特征性结核损伤表现出相似的形态学，包含朗格汉斯巨细胞的出现。因为与人相比豚鼠对疾病的首次感染和进展更加敏感，使用这种动物模型的实验中任何提供的保护都明显地表明，在人或者其它较不易受影响的哺乳动物中可产生相同的保护性免疫。因此，仅为解释的目的而不是为了限制，主要用豚鼠作为哺乳动物宿主，对本发明进行举例说明。本领域技术人员将会理解，可以用包含人和家畜在内的其它哺乳动物宿主实施本发明。
Calmetre和Guérin在法国里尔的巴斯德研究所成功地使牛分枝杆菌强毒株减毒之后，在1921年人们开始尝试利用免疫原组合物根除结核病。这种减毒牛分枝杆菌被称作卡介苗(BCG)。大约80年以后，由卡介苗衍生的免疫原组合物仍是目前用于预防性治疗结核病的唯一药物。实际上，今天所有市售的卡介苗免疫原组合物都是由Calmette和GUERIN在巴斯德研究所最初开发的牛分枝杆菌衍生而来。
世界卫生组织认为卡介苗免疫原组合物是在全世界减少结核病的必要因素之一，特别是在发展中国家。在理论上，卡介苗免疫原组合物带来抗减毒分枝杆菌的细胞介导免疫，这种减毒分枝杆菌与结核分枝杆菌是免疫相关的。所得的免疫反应能够抑制原发性结核病。因此，如果原发性结核病得到抑制，潜在的传染病就不会发生，疾病重现也可得以避免。
当前的卡介苗免疫原组合物是作为冻干培养物提供的，用无菌稀释液溶解后立即给药。在进行卡介苗防疫的国家里，包含发展中国家和发达国家，卡介苗免疫原组合物是在出生时期、婴儿期或者在幼儿期使用的。到发病地区旅游的成年游客可能会暴露于高剂量传染性分枝杆菌，如果他们皮试无反应性，可以接受卡介苗进行预防。免疫原组合物的不良反应较少，一般仅局限于皮肤注射部位附近的皮肤溃疡和淋巴腺炎。尽管有这些少见的不良反应，卡介苗免疫原组合物有空前的安全史，从1930年起其全球使用量已经超过30亿剂。
不过，传统BCG免疫原组合物无比的安全性正经受增多的考验，并且已经给健康从业者带来了矛盾。最容易受分枝杆菌传染病感染的人群是免疫抑制人群。早期或晚期HIV患者对感染特别敏感。令人遗憾的是，很多人在HIV感染早期还没有意识到他们的免疫状况。有可能这些人自愿经受使用减毒活体免疫原组合物(例如卡介苗)进行免疫，而没有得到其特殊危险的预先警报。而且，为避免分枝杆菌疾病，其它轻微免疫抑制的个体也可在不知情中用卡介苗进行免疫。因此，更安全、更有效卡介苗和卡介苗类免疫原组合物是合乎人们需要的。
最近，人们把注意力明显集中在使用转化的卡介苗(BCG)菌株制造免疫原组合物，该免疫原组合物能够表达各种细胞相关抗原。例如，C.K.Stover等人报道了用重组卡介苗(rBCG)制造的Lyme氏疏螺旋体病免疫原组合物，该重组卡介苗(rBCG)能够表达伯氏疏螺旋菌(Borrelia burgdorferi)膜结合脂蛋白OspA。类似地，该作者也已经制造出表达肺炎链球菌表面蛋白(PsPA)的重组卡介苗免疫原组合物(Stover，C.K.，G.P.Bansal，S.Langerman，和M.S.Hanson.1994.Protective Immunity Elicited by rBCG Immunogenic compositions.In：Brown F.(ed)：Recombinant Vectors in Immunogenic compositionDevelopment.Dev Biol Stand.Dasel，Karger，Vol.82，163-170.)。
授予B.R.Bloom等人的美国专利(USPN)5,504,005(″005″专利)和美国专利5,854,055(″055″专利)公开了一种理论重组卡介苗载体，此种载体能表达来自很多种类微生物的范围很广的细胞相关融合蛋白。在这些专利中所描述的理论载体针对细胞相关融合蛋白，其与细胞外非融合蛋白抗原相反，和/或重组卡介苗假想表达来自远缘物种的融合蛋白。而且，这些模型中表达的重组细胞相关融合蛋白在DNA上编码，整合到宿主基因组中并且处于热激启动子的控制之下。因此，所表达的抗原是融合蛋白，表达水平局限于约等于或小于载体天然蛋白的水平。
而且，″005″和″055″专利都没有公开模拟人类疾病的动物系统中动物模型安全测试、免疫反应的发生或者保护性免疫。另外，″005″和″055″专利仅公开了表达结核分枝杆菌融合蛋白的理论重组卡介苗载体，没有实际的免疫原组合物。公开的用于结核分枝杆菌免疫原组合物模型针对细胞相关热激融合蛋白，而不是细胞外非融合蛋白。
美国专利5,830,475(″475″专利)也公开了一种表达融合蛋白的理论分枝杆菌免疫原组合物。编码这些融合蛋白的DNA存在于染色体外质粒中，在分枝杆菌热激蛋白和应激蛋白启动子的控制下。所公开的免疫原组合物是为了在非人动物里诱导免疫反应从而生产抗体，但没有表现出能够预防哺乳动物细胞内的病原体疾病。而且，475专利没有公开使用蛋白特异性启动子表达细胞外非融合蛋白的重组免疫原组合物。
本发明人的美国专利6,467,967要求保护一种免疫原组合物，该免疫原组合物包含重组卡介苗，该卡介苗具有染色体外核酸序列，该染色体外核酸序列包含编码结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的基因，其中所述结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白被过量表达和分泌。而且，本发明人提出部分继续申请(2002年9月30日申请，美国专利申请号10/261981)，要求保护另外的能够过量表达其它结核分枝杆菌主要细胞外蛋白的重组卡介苗。
因此，还存在对重组细胞内病原体免疫原组合物的需求，该免疫原组合物能够表达与免疫原组合物密切相关的细胞内病原体的主要细胞外非融合蛋白。而且，还存在对重组细胞内病原体免疫原组合物的需求，该病原体免疫原组合物能够靠染色体外DNA过量表达重组细胞外非融合蛋白，该染色体外DNA具有非热激基因启动子或非应激蛋白基因启动子。
具体地说，迫切需求对细胞内病原体免疫原组合物的生产，该病原体免疫原组合物给受者所提供的抗病保护，优于卡介苗免疫原组合物提供给受者的保护。而且，还急需为发达和发展中国家提供结核病和其它细胞内的病原体疾病的合算的免疫治疗和预防性治疗。
另外，还需要能够安全给予免疫抑制或者部分免疫抑制人群的细胞内病原体免疫原组合物。
因此，本发明的目的是提供用于诊断、治疗、预防、抑制或者缓解细胞内病原体疾病的免疫原组合物。
本发明的另一目的是，利用细胞内病原体提供用于诊断、治疗、预防、抑制或者缓解细胞内病原体疾病的免疫原组合物，所用的细胞内病原体经转化可表达同一细胞内病原体或另一细胞内病原体或两种细胞内病原体的主要重组免疫原抗原。
本发明的又一目的是，利用表达致病分枝杆菌细胞外蛋白的重组卡介苗，提供用于诊断、治疗、预防、抑制或者缓解分枝杆菌疾病的免疫原组合物。
本发明的另一目的是，利用表达和分泌一种或多种结核分枝杆菌主要细胞外蛋白的重组卡介苗菌株，提供用于诊断、治疗、预防、抑制或者缓解结核病的免疫原组合物。
本发明的又一目的是，以可安全地给予免疫抑制或者部分免疫抑制人群的形式提供上述免疫原组合物。
发明概述
本发明通过提供一类新型免疫原组合物和免疫治疗剂和方法，对哺乳动物细胞内病原体疾病进行诊断、治疗、预防、抑制或者缓解，从而达到上面所述的目的和其它目的。在历史上，细胞内病原体免疫原组合物和免疫治疗剂由细胞内病原体自身或者近缘物种制备。这些旧的免疫原组合物模型是由完整微生物或者它们的亚单位组成。例如，最初的也是目前仅有的治疗结核病的免疫原组合物，是减毒的活体免疫原组合物，由近缘细胞内病原体牛结核分枝杆菌制成。最近，本发明人已经发现，被分泌到生长培养基中的细胞内病原体的特异细胞外产物，作为单独亚单位或亚单位的组合，可用于在哺乳动物内诱发潜在的免疫反应。不过，还没有证明这些亚单位免疫原组合物优于传统的由牛分枝杆菌衍生的减毒免疫原组合物。
本发明详述了由重组减毒细胞内病原体构成的免疫原组合物和免疫治疗剂，该减毒细胞内病原体已被转化用来表达另一种或者同一种细胞内病原体的细胞外蛋白(重组免疫原抗原)。在一个实施方案中，本发明的免疫原组合物是用卡介苗重组菌株制造的。在该实施方案中，所用重组卡介苗表达致病分枝杆菌主要细胞外蛋白，所述致病分枝杆菌包括但不限于结核分枝杆菌、麻风杆菌和牛分枝杆菌等，此处不再详述。
重组卡介苗表达的主要细胞外蛋白包括但不限于分枝杆菌的12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32A kDa、32B kDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa和110kDa蛋白及其各自的类似物、同源蛋白和亚单位，包括重组非融合蛋白、融合蛋白及其衍生物。过去常常用作鉴定分枝杆菌和其它细胞内病原体主要细胞外蛋白的分子量，只能看作近似值，这点对本领域的技术人员是显而易见的。重组技术和分子生物学领域的技术人员将会意识到，用另外的氨基酸、多肽和蛋白共表达(共翻译)这些蛋白是可能的，如同用截短的行式表达这些蛋白也是可能的。所得的修饰蛋白仍然被认为在本发明范围之内，不论其名称是天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、杂合蛋白或者嵌合蛋白。为了本发明的目的，融合蛋白被定义为包括但不限于两个或者更多不同基因编码序列的产物，所述基因被克隆在一起，翻译后形成单一多肽序列。
本发明也描述重组减毒细胞内病原体免疫原组合物，该免疫原组合物过量表达来自至少一种其它细胞内病原体的非融合蛋白。通过使用染色体外的核酸表达至少一种重组免疫原抗原基因，并将该基因置于非热激基因启动子或非应激蛋白基因启动子的控制下(优选受蛋白特异启动子序列控制)，从而得到该免疫原组合物。因而，可获得具有非融合重组免疫原抗原的免疫原组合物，其表达量比编码重组免疫原抗原的基因稳定地整合到免疫原组合物的基因组DNA中时的产量要高。因此，获得了特异性和效价显著优于现有亚单位或减毒细胞内病原体免疫原组合物的细胞内病原体免疫原组合物。
而且本发明描述了使用本发明的免疫原组合物治疗和预防由细胞内病原体所引起哺乳动物疾病的方法。很多细可以用作减毒生物体和/或重组免疫原抗原来源的胞内病原体的部分目录包括但不限于：牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、麻风杆菌、堪萨斯分枝杆菌、鸟分枝杆菌、分枝杆菌(Mycobacterium sp)、嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)、长滩军团菌(L.Longbeachae)、博氏军团菌(L.Bozemanii)、军团菌(Legionella sp)、立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、立克次体(Rickettsiasp.)、恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、嗜噬胞埃里希氏体属组(Ehrlichia phagocytophila geno group)、埃里希氏体(Ehrlichia sp)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、利什曼原虫(Leishmania sp)、刚地弓型体(Toxpolasma gondii)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、衣原体(Chlamydia sp)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、利斯特氏菌(Listeria sp)和组织胞浆菌(Histopiasma sp)。
可以理解，本发明的免疫原组合物以任何会导致适当免疫反应的途径给药，包括但不限于：真皮内皮下、肌肉内、鼻内、腹膜内、口服或者吸入。合适接种期后，用传染性结核分枝杆菌气溶胶攻击哺乳动物。接种本发明免疫原组合物的哺乳动物与单独接种卡介苗、主要细胞外蛋白或其任何组合物的哺乳动物相比较，明显不受疾病的影响。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种包含重组卡介苗的免疫原组合物，该重组卡介苗有染色体外的核酸序列和编码至少一种分枝杆菌细胞外蛋白的基因，其中分枝杆菌主要细胞外蛋白被过量表达和分泌，因此能够诱发动物体内免疫反应。
在另一实施方案中，提供了包含重组卡介苗的免疫原组合物，该重组卡介苗具有染色体外的核酸序列，该核酸序列包含编码结核分枝杆菌23.5kDa主要细胞外非融合蛋白的基因，并且该基因处于启动子的控制之下，其中所述启动子不是热激基因启动子或者应激蛋白启动子，其中23.5kDa主要细胞外非融合蛋白被过量表达和分泌，因此能够诱发动物体内免疫反应。
在本发明的又一实施方案中，提供了包含重组卡介苗的免疫原组合物，该重组卡介苗有染色体外的核酸序列，该核酸序列又包含编码结核分枝杆菌32A kDa主要细胞外非融合蛋白的基因，并且该基因处于启动子的控制之下，其中启动子不是热激启动子或者应激蛋白启动子，其中32A kDa主要细胞外非融合蛋白被过量表达和分泌，因此在能够动物体内诱发免疫反应。
在本发明的另一实施方案中，提供了包含重组卡介苗的免疫原组合物，该重组卡介苗具有染色体外的核酸序列，该核酸序列又包含遗传构建体，该遗传构建体具有至少一种编码结核分枝杆菌(Mtb)30kDa主要细胞外蛋白和Mtb 23.5kDa主要细胞外非融合蛋白的基因，其中Mtb 30kDa主要细胞外蛋白和Mtb 23.5kDa主要细胞外非融合蛋白被过量表达和分泌，因此能够诱发动物体内免疫反应。
在另一示例性实施方案中，公开了包含重组卡介苗的免疫原组合物，该重组卡介苗有染色体外的核酸，该核酸又包含编码牛分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的基因，并且该基因处于启动子的控制之下，其中所述启动子不是热激启动子或者应激蛋白启动子，其中牛分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白被所述重组BCG过量表达和分泌，因此能够诱发动物体内体液和细胞免疫反应。
本发明的又一实施方案公开了免疫原组合物，它包含重组卡介苗，该重组卡介苗有染色体外的核酸序列，该序列又包含编码麻风杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的基因，并且该基因处于启动子的控制之下，其中所述启动子不是热激启动子或者应激蛋白启动子，其中麻风杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白被所述重组BCG过量表达和分泌，因此能够诱发动物体内体液和细胞免疫反应。
本发明的其它实施方案包含免疫原组合物，其中减毒细胞内病原体(如重组卡介苗)是生长可调节营养缺陷型生物体。本文所用“生长可调节”是指在提供特殊养分的情况下生长的营养缺陷型生物体。特殊养分或者与免疫原组合物一起给予，或者随后提供给免疫原组合物接受者。
在一个实施方案中，生长可调节营养缺陷型生物体是重组卡介苗，该重组卡介苗被转化用于过量表达和分泌至少一种结核分枝杆菌主要细胞外蛋白。
在本发明的另一实施方案中，调节生长可调节营养缺陷型生物体生长所必需的特殊养分是氨基酸。
本发明的另一实施方案包含减毒重组卡介苗(Tice株)，其中硝酸还原酶α亚基基因(narG基因)通过等位交换被破坏。然后，这种高度减毒的narG卡介苗用至少一种异源核酸转化，该核酸编码至少一种主要细胞外结核分枝杆菌蛋白。产生的这种高度减毒narG突变转化体在免疫抑制哺乳动物中用作免疫原组合物。
考虑到下述对本发明优选示例性实施方案的详细描述以及首先被简明描述附图，本发明的其它目的、特征和优势对本领域技术人员来说是显而易见的。
附图简述
图1描述标为1a和1b的考马斯蓝染色凝胶，该凝胶说明得自培养基滤液中的由BCG转化菌株表达的结核分枝杆菌重组30kDa蛋白的分泌。
图2图示标为2a和2b的两组实验结果，两组实验的设计目的是用重组卡介苗免疫原组合物(表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白)、单独用卡介苗、单独用重组30kDa蛋白或者假免疫原组合物对豚鼠进行接种，对豚鼠的皮试结果进行比较。
图3图示在用结核分枝杆菌进行免疫攻击后标为3a和3b的豚鼠的体重变化。
图4a图示在用结核分枝杆菌对豚鼠进行免疫攻击后从豚鼠肺中回收的感染性结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)。
图4b图示在用结核分枝杆菌对豚鼠进行免疫攻击后从豚鼠脾中回收的感染性结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)。
图5图示豚鼠对假免疫原组合物、单独卡介苗和同时给予结核分枝杆菌重组30kDa蛋白和卡介苗的皮试反应。
图6图示纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)、32A kD主要细胞外蛋白(r32A)和23.5kDa主要细胞外蛋白(r23.5)的抗体滴度。
术语的简短定义
参考下列的定义有助于更好地理解以下的详述、实施例和所附权力要求。这些定义在性质上是非限制性的，仅仅给读者提供方便。
营养缺陷体或者营养缺陷型：本文所用“营养缺陷体”指的是有特殊营养需求的微生物，而此类特殊营养是野生型有机体不需要的。如果缺乏所需的特殊养分，营养缺陷体将不生长而野生型有机体将茁壮生长。
基因：本文所用“基因”指遗传构建体的最小部分，该遗传构建体具有启动子，和/或其它遗传构建体所需的或改变遗传构建体表达所需的调节序列。
遗传构建体：本文所用“遗传构建体”是指编码至少一种主要细胞外蛋白(来自至少一种细胞外病原体)的核酸序列。在本发明的一个实施方案中，所用的遗传构建体是染色体外的DNA。
生长可调节：本文所用术语“生长可调节”指的是本发明的免疫原组合物的营养缺陷型。通过给予足以诱导其生长的浓度的生长必需养分来调节营养缺陷体的生长。
宿主：本文所用“宿主”指的是本免疫原组合物的受者。示例性宿主是哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、啮齿动物、牛、马、狗、猫、绵羊、山羊和猪。在本发明的一个实施方案中所述宿主是人。
免疫原：本文所用术语“免疫原”指任何在宿主里能引起免疫反应的物质。本发明的免疫原包括但不限于从细胞内病原体(例如但不限于分枝杆菌)衍生而来的主要细胞外蛋白、它们的重组体形式。
免疫原组合物：本文所用“免疫原组合物”包含带有或不带有佐剂的重组载体，例如细胞内病原体，它在体内表达和/或分泌引起宿主免疫反应的免疫原。本文公开的免疫原组合物可包括或不包括作为转化体的营养缺陷型生物体。
核酸序列：本文所用术语“核酸序列”是指核酸的任何连续序列。
转化体：本文所用的“转化体”是指用至少一种异源核酸转化的微生物，该核酸编码的多肽被表达和/或分泌。在本发明的一个实施方案中所用的转化体是卡介苗。
发明详述
本发明一般来讲针对包含减毒或者无毒的重组细胞内病原体免疫原组合物，该细胞内病原体表达和/或分泌同种或者异种的重组免疫原抗原。在本发明的另一实施方案中，减毒细胞内病原体是生长可调节的营养缺陷体。在本发明的又一实施方案中，减毒细胞内病原体是通过等位交换而减毒的。本发明的示例性实施方案基于减毒或者无毒重组卡介苗。不过，本发明并不限于重组卡介苗。
免疫原组合物是通过一种或多种途径给药，包括但不限于皮下、肌肉、鼻内、腹膜内、皮层内、口服或者吸入等途径。本发明的免疫原组合物存活在宿主内，并在原位表达和分泌免疫原。使用营养缺陷型菌株时，免疫原组合物基本上保持免疫惰性，直到把足够量的适当养分提供给宿主。一旦提供了必须的养分，营养缺陷型免疫原组合物(营养缺陷体)开始表达和分泌免疫原。然后，如果需要，停止必须的养分就能停止营养缺陷体的原位生长和抗原表达。
在本发明的免疫原组合物在利用营养缺陷型转化体表达免疫原时，可以在给予免疫原组合物之前、之中或不久后给予启动营养缺陷体在宿主体内生长所必需的养分。延迟必要养分的给予(在给予免疫原组合物之后数天或者甚至数周)也在本发明范围之内。而且，在给予免疫原组合物后可以随时停止必要养分的给予，以停止营养缺陷型转化体的繁殖。
本发明可用于制备抵抗多种细胞内病原体的免疫原组合物，所述病原体包括但不限于过量表达结核分枝杆菌、牛分枝杆菌或麻风分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白的卡介苗菌株。根据本发明制备的免疫原组合物，可用于在宿主内引起免疫反应。所引起的免疫反应可为体液(基于抗体)的或者细胞的，可用于诊断、预防或者缓解疾病。
本发明的每种免疫原组合物，能表达特异性对应于具体细胞内病原体的各种分子量免疫原中的至少一种。例如，本发明人前面已经鉴定的结核分枝杆菌免疫原，其包括但不限于主要细胞外蛋白12kDa、14kDa、16kDa、23kDa、23.5kDa、30kDa、32A kDa、32B kDa、45kDa、58kDa、71kDa、80kDa、110kDa及其各自的相似物、同源蛋白、亚单位和变性变异体，其中还包含其重组非融合蛋白、融合蛋白和衍生物。(参见待审的美国专利申请序列号08/156,358,09/157,689、09/175,598、09/226,539以及09/322,116，其全部内容通过引用结合到本文中)。对本领域技术人员显而易见的是，过去常常用来鉴定分枝杆菌和其它细胞内病原体主要细胞外蛋白的分子量只能看作近似值。重组技术和分子生物学领域的技术人员将会意识到，用另外的氨基酸、多肽和蛋白共表达(共翻译)这些蛋白是可能的，因而以截短形式表达这些蛋白也是可能的。所得的修饰蛋白仍然被认为属于本发明范围之内，不论其名称是天然蛋白、非融合蛋白、融合蛋白、杂合蛋白或者嵌合蛋白。对于本发明的目的，融合蛋白被定义为包括但不限于两条或更多不同基因编码序列的产物，所述基因被克隆在一起，翻译后形成单一多肽序列。
当编码重组非融合蛋白的基因位于一种或者多种质粒(染色体外DNA)上并受其控制，而不是整合到宿主的基因组时，抗原(包含细胞外蛋白)的表达一般能得到加强。而且，受具体蛋白特异性启动子序列驱动的蛋白表达，能够增强非融合蛋白抗原的表达，并且能改善该蛋白的折叠和加工。因此，本发明提供在染色体外DNA上编码的重组非融合蛋白，在非热激启动子或非应激蛋白启动子、优选是蛋白特异性启动子序列的控制下。
本发明提供重组减毒细胞内病原体免疫组合物，例如重组卡介苗，该组合物除了表达与自己近缘和/或其它细胞内病原体重组细胞外非融合蛋白之外，还表达它们本身内源细胞外蛋白。不过，从80年研究来看，单独的卡介苗内源细胞外蛋白不对全部接受者提供完全保护。而且，本发明人已经证明，仅仅一起注射结核分枝杆菌细胞外蛋白和传统的卡介苗也不产生优于单独使用卡介苗时的免疫原组合物，这些将在下面进一步详细解释。
在本发明的一个实施方案中，免疫原组合物包括重组卡介苗免疫原组合物，并且该卡介苗免疫原组合物只表达免疫原，例如但不限于结核分枝杆菌23.5kDa、30kDa或者32kDa主要细胞外蛋白。在本发明的另一实施方案中，重组卡介苗可以表达两种或更多种免疫原，例如结核分枝杆菌23.5kDa和30kDa主要细胞外蛋白。作为预防哺乳动物疾病的免疫原组合物，后一种实施方案特别有效。本发明人已经提出的非限制性理论，认为利用重组卡介苗同时过量表达结核分枝杆菌23.5kDa和30kDa主要细胞外蛋白可以发挥协同作用，提高哺乳动物对本发明细胞内病原体的免疫反应。这个理论部分是基于下列观察的基础上：野生型和重组卡介苗是牛结核分枝杆菌的缺失型突变体，不能天然地表达它们本身的23.5kDa主要细胞外蛋白。
不过，利用卡介苗作为转化体的免疫原组合物，在爱滋病患者等免疫受损人群中能够导致散播性疾病。在稀有的病例中，散播性疾病可能是致命的。因此，在本发明另一实施方案中，开发了重组卡介苗菌株，该菌株使用卡介菌Tice作为野生型母体，预期可以安全用于在免疫受损的宿主中引起免疫反应。在这些菌株中，4种是营养缺陷体，因此它们只能在过量营养缺陷型所需氨基酸的存在下进行繁殖。在本发明一个实施方案中，非限制性示例性实施例包括卡介苗色氨酸或者谷氨酰胺营养缺陷体。因此，它们的生长是通过宿主调节的，这将在下面另行讨论。适用于免疫抑制或者部分免疫抑制哺乳动物的另两个卡介苗菌株不是营养缺陷体，因此它们不是生长可调节的菌株。这些非营养缺陷的卡介苗菌株是等位交换的突变体，并且预期在免疫受损的宿主中是减毒的。
但是，如前所述，本发明不限于转化体的营养缺陷菌株。本发明人预测营养缺陷体可能不适用于所有本发明免疫原组合物所需用途。例如，当营养缺陷体应用于体内调节转化体的生长时，它要求适时给予第二组分，并且始终确保宿主产生所需的免疫反应。这需要对给予人、宿主和宿主护理人加强警惕。因此，当危险散播性免疫原组合物相关的疾病极少时，引入的非营养缺陷型转化体是更合乎需要的。因此，下列关于实施本发明不同实施方案的描述，包括基因构建体、质粒和药用组合物，均同样适用于营养缺陷型以及非营养缺陷型转化体。
微生物学领域的普通技术人员将容易理解，下列生长条件、培养基、温度和时间等对营养缺陷体和非营养缺陷体一般都是一样的，除了营养缺陷体的生长需要必须的养分外。而且，免疫学领域的普通技术人员也能理解，把免疫原组合物给予宿主对营养缺陷组分和非营养缺陷组分是一样的。
在本发明的一个示例性实施方案中，重组卡介苗免疫原组合物利用质粒pNBV1和紧邻谷氨酰胺合成酶基因(glnA1)上游区的启动子，表达结核分枝杆菌主要细胞外蛋白。在另一种示例性实施方案中，重组卡介苗免疫原组合物利用质粒pNBV1和紧邻细胞外蛋白编码基因上游区的启动子，表达结核分枝杆菌主要细胞外蛋白。在本发明的又一个示例性实施方案中，重组卡介苗免疫原组合物利用质粒pNBV1和紧邻30kDa细胞外蛋白编码基因上游区的启动子，表达牛分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白。在另一种示例性实施方案中，重组卡介苗免疫原组合物利用质粒pNBV1和紧邻30kDa细胞外蛋白编码基因上游区的启动子，表达麻风分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白。
简短起见，并且由于接着将进行非常复杂的描述，而不是作为限制的意图，通过使用重组卡介苗(rBCG)作为接种试剂以及以下作为本发明示例性实施方案的物质，更明确地描述本发明，其中所述物质为结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌细胞外非融合蛋白，具体而言，为结核分枝杆菌23.5kDa、30kDa和32A kDa主要细胞外非融合蛋白以及牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白。而且，作为多种异种抗原过量表达和分泌的实例，结核分枝杆菌23.5kDa和30kDa主要细胞外非融合蛋白在重组卡介苗中共表达和分泌。
可以理解，任何重组免疫原抗原可以被任何重组减毒细胞内病原体表达。此外，本发明免疫原组合物不限于重组卡介苗(rBCG)作为免疫原组合物。而且，免疫原也不限于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌的主要细胞外非融合蛋白。
为了确定免疫原组合物菌株变异的影响，用不同的卡介苗菌株来制备本发明的各种实施方案：BCG Tice和BCG Connaught。野生型牛分枝杆菌BCG Tice购自Organon，野生型牛分枝杆菌BCGConnaught获自加拿大多伦多Connaught Laboratories。菌株维持在7H9培养基中，处于37℃，pH 6.7(Difco)，5％ CO2-95％空气环境中，以此作为非振荡培养物。每周一次或者两次在超声水浴中对培养基超声5分钟，以减少细菌团集。
在非免疫受损的宿主中适用的免疫原组合物
A.重组BCG Tice(rBCG30 Tice)
重组BCG Tice(rBCG30 Tice)可表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白，其制备过程如下。质粒pMTB30，大肠杆菌/分枝杆穿梭质粒pSMT3按照本发明人在Harth，G.，B.-Y.Lee和M.A.Horwitz.1997.High-level heterologous expression and secretion inrapidly growing nonpathogenic mycobacteria of four majorMycobacterium tuberculosis extracellular proteins considered to beleading immunogenic composition candidates and drug targets.Infect.Immun：65：2321-2328，中的描述方法制备。其全部内容通过引用结合到本文中。
B.重组BCG30 Tice II(pNBV1-pglnA-MTB30)
重组BCG30 Tice II(pNBV1-pglnA-MTB30)过量表达结核分枝杆菌30kDa细胞外非融合蛋白，其制备过程如下。通过扩增结核分枝杆菌30kDa基因的编码区(包括在起始密码子的NdeI限制性位点和紧邻终止密码子下游的HindIII限制性位点)，并将该PCR产物克隆到pNBV1-BFRB中结核分枝杆菌glnA1启动子下游处NdeI→HindIII位点中，构建质粒pNBV1-pglnA1-MTB30(Tullius，M.，G.Harth，and M.A.Horwitz.2001.The high extracellular levels of Mycobacteriumtuberculosis glutamin synthetase and superoxide dismutase are primarilydue to high expression and extracellular stability rather than to a proteinspecific export mechanism.Infect.Immun.69：6348-6363)。通过限制性分析确认质粒是正确的之后，质粒被电穿孔进入牛分枝杆菌BCG Tice中，并且在含50μg mL-1的潮霉素的7H11琼脂上选择转化体。随机挑选某些单个潮霉素抗性克隆，培养在含有50μg mL-1潮霉素的培养基7H9中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高度特异性兔抗30kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa蛋白的表达和输出。发现rBCG30 Tice II产生出的30kDa抗原比只含有载体(pNBV1)的BCG Tice产生出的30kDa抗原每毫升培养液中高24倍。
C.重组BCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB23.5)
重组BCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB23.5)可过量表达结核分枝杆菌23.5kDa基因细胞外非融合蛋白，其制备方法如下。通过扩增结核分枝杆菌23.5kDa基因的编码区(包括在起始密码子的NdeI限制性位点和紧邻终止密码子下游的BamHI和HindIII限制性位点)，并将该PCR产物克隆到pNBV1-BFRB结核分枝杆菌glnA1启动子下游的NdeI→HindIII位点中，构建质粒pNBV1-pglnA1-MTB23.5(Tullius，M.，G.Harth，and M.A.Horwitz.2001.The high extracellular levels ofMycobacterium tuberculosis glutamin synthetase and superoxidedismutase are primarily due to high expression and extracellular stabilityrather than to a protein specific export mechanism.Infect.Immun.69：6348-6363)。通过限制性分析确认质粒是正确的之后，质粒被电穿孔进入牛分枝杆菌BCG Tice中，并且在含50μg mL-1的潮霉素的7H11琼脂上选择转化体。随机挑选某些单个潮霉素抗性克隆培养在含有50μg mL-1潮霉素的培养基7H9中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高度特异性兔抗23.5kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌23.5kDa蛋白的表达和输出。rBCG23.5 TiceI制造23.5kDa蛋白的水平很高，与rBCG30 Tice II制造重组30kD蛋白的量相等或者比它稍微要高。因为卡介苗没有编码23.5kDa蛋白的基因，不能像对30kD蛋白一样与母体菌株进行比较。(BCG Tice不表达23.5kDa蛋白，是因为RD2基因组缺失约11.5kb，其中包含相对应的结核分枝杆菌基因Rv1978到Rv1988[23.5kDa蛋白基因＝Rv1980]；缺失发生在1931之前，从野生型牛分枝杆菌生成卡介苗菌株期间)。
D.重组BCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB30/23.5)
重组BCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglnA-MTB30/23.5)，可过量表达结核分枝杆菌23.5kDa和30kDa细胞外非融合蛋白，其制备方法如下。通过将pNBV1-pglnA1-MTB23.5(其包含结核分枝杆菌glnA1启动子和23.5kDa全部编码区)的1kb BamHI基因片段克隆进入pNBV1-pglnA1-MTB30中唯一的BamHI位点中，构建质粒pNBV1-pglnA1-MTB30/23.5。在质粒上，编码这两个蛋白的基因是同向的，编码23.5kDa的基因处于编码30kDa基因的上游。通过限制性分析确认质粒是正确的之后，质粒被电穿孔进入牛分枝杆菌BCG Tice中，并且在含50μg mL-1的潮霉素的7H11琼脂上选择转化体。随机挑选一些潮霉素抗性单克隆培养在含有50μg mL-1潮霉素的培养基7H9中。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa蛋白和抗23.5kDa免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa蛋白和23.5kDa蛋白的表达和输出。可以发现，每毫升培养液中，rBCG30/23.5 Tice I制造出比只含有载体(pNBV1)的BCG Tice高24倍的30kDa抗原。这种菌株制造23.5kDa蛋白的水平也很高，比重组30kDa蛋白的量稍高。因为卡介苗没有编码23.5kDa蛋白的基因，不能像对30kD蛋白一样与母体菌株进行比较。
E.重组BCG30 Tice III(pNBV-1-MTB30)
重组BCG30 Tice III(pNBV-1-MTB30)可过量表达结核分枝杆菌30kDa细胞外蛋白，其制备方法如下。重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和两侧为Clal和BamHI限制性位点的约1.5千碱基对的结核分枝杆菌Erdman DNA，含有30kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组30kDa蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用30kDa蛋白特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(在分析开始为野生型本底水平的14.4倍，分析结束时为11.5倍)。在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为2.5×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
F.重组BCG23.5 Tice II(pNBV-1-MTB23.5)
重组BCG23.5 Tice II(pNBV-1-MTB23.5)可过量表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白，制备方法如下。重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和约1.4千碱基对两侧为PstI和BamHI限制性位点的结核分枝杆菌Erdman DNA，含有23.5kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组23.5kDa蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用23.5kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(在分析开始为16.2mg/L，分析结束时为15.1mg/L)。因为卡介苗没有编码23.5kDa蛋白的基因，不能像对30kD蛋白一样与母体菌株进行比较。2001年8月24日在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为3×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
G.重组BCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)
重组BCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)(本文用在后面的″↑↑″指的是编码多种主要细胞外蛋白的遗传构建体，其中编码每种蛋白的核酸序列[基因]与有关遗传构建体5′末端方向相同)可以过量表达结核分枝杆菌30kDa和23.5kDa主要细胞外蛋白。编码两种蛋白的基因同向。重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCGTice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和约1.5千碱基和约1.4千碱基对的两条结核分枝杆菌Erdman DNA，其中Erdman DNA两侧为ClaI和NdeI(30kD蛋白基因和启动子)及NdeI和NdeI-BamHI(23.5kD蛋白基因和启动子)，包含30kDa和23.5kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻每个编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组30kDa和23.5蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用30kDa和23.5kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(对于30kDa蛋白，在分析开始其表达是BCG Tice野生型本底水平的23.3倍，分析结束后是16.5倍；对于23.5kDa蛋白，在分析开始其表达是18.7mg/L，分析结束时是12.2mg/L)。如上所述，重组23.5kDa蛋白的表达是用绝对项进行测量的，因为BCG Tice不表达23.5kDa蛋白。在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为3×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
H.重组BCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.51↑↓)
重组BCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)(本文用在后面的″↑↓″指的是编码多种主要细胞外蛋白的遗传构建体，其中，编码每种蛋白的核酸序列[基因]与有关遗传构建体5′末端的方向相反)可以过量表达两种结核分枝杆菌30kDa和23.5kDa主要细胞外蛋白。编码两种蛋白的基因在质粒上是反向的。重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock#2)而产生的，该质粒包含载体骨架以及约1.5千碱基对和约1.4千碱基对的两条结核分枝杆菌Erdman DNA，其中Erdman DNA两侧为ClaI和NdeI(30kD蛋白基因和启动子)限制性位点及NdeI和NdeI-BamHI(23.5kD蛋白基因和启动子)限制性位点，含有30kDa和23.5kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。与上面所述的菌株(rBCG30/23.5 TiceIIA)相比，携带23.5kDa蛋白编码区和启动子区的NdeI限制性片段的方向是倒转的。该菌株稳定地保有重组质粒，重组30kDa和23.5蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用30kDa和23.5kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(对于30kDa蛋白，在分析开始其表达是BCG Tice野生型本底水平的25.7倍，分析结束后是21.1倍；对于23.5kDa蛋白，在分析开始其表达是16.6mg/L，分析结束后是12.8mg/L)。如上所述，重组23.5kDa蛋白的表达是用绝对项进行测量的，因为BCG Tice不表达23.5kDa蛋白。在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为3×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
I.重组BCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)
重组BCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)可过量表达结核分枝杆菌32kDa细胞外蛋白(a.K.a.抗原85A)，其制备方法如下。本重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和约1.5千碱基对的结核分枝杆菌Erdman DNA(两侧为ClaI和BamHI限制性位点)，含有32A kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组32A kDa蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用32A kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(在分析开始其表达水平是野生型BCG Tice背景水平的10.5倍，分析结束时为其8.1倍)。在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为3×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
J.重组BCG(MB)30 Tice(pNBV1-MB30)
重组BCG(MB)30 Tice(pNBV1-MB30)可过量表达牛分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白，其制备方法如下。本重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和约1.5千碱基对的牛分枝杆菌野生型(ATCC#19210)DNA(两侧为ClaI和BamHI限制性位点)，含有30kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组30kDa kDa蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用30kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(在分析开始其表达水平是野生型BCG Tice背景水平的9.7倍，分析结束时为其7.8倍)。在10％的甘油中建立了原种(Stock#2)，浓度为2.5×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
K.重组BCG(MB)30 Tice(pNBV1-ML30)
重组BCG(MB)30 Tice(pNBV1-ML30)可过量表达麻风分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白，其制备方法如下。本重组菌株是通过将重组质粒pNBV1电穿孔进入BCG Tice细菌(Stock #2)而产生的，该质粒包含载体骨架和约1.3千碱基对的麻风分枝杆菌DNA(两侧为ClaI和BamHI限制性位点)，还包含30kDa主要细胞外蛋白编码区和紧邻编码区上游的启动子区。该菌株稳定地保有重组质粒，重组30kDa蛋白的表达水平能够在没有抗生素的情况下12个月保持几乎恒定，其水平可以用30kDa特异抗血清的免疫印迹试验进行证实(在分析开始其表达水平是野生型BCG Tice背景水平的9.7倍，分析结束时为其9.3倍)。在10％的甘油中建立了原种(Stock #1)，浓度为3×108颗粒/毫升，在-80℃储存。
适用于免疫受损的宿主的免疫原组合物
I生长可调节卡介苗(营养缺陷型)的开发
A.BCG Tice glhA1
利用质粒pEX1-Mtb-glnA1∷Kmr通过等位交换破坏BCG TiceglnA1基因，在以前我们常用该质粒制造结核分枝杆菌glnA1突变体，(Tullius，M.V.，G.Harth，和M.A.Horwitz.2003.Glutamin Synthetase(GInA1)is essential for growth of Mycobacterium tuberculosis in humanmacrophages and in guinea pigs.Infect.Immun.Vol.71：7)。pEX1-Mtb-glnA1∷Kmr由热敏感sacB载体pPR27衍生而来的，并且包含hygr基因和一个1.8kb的基因片段，该基因片段包含结核分枝杆菌glnA1座，其中Kmr基因盒插入靠近glnA1编码区中间的特殊位点。(Pelicic，V.，M.Jackson，J.M.Reyrat，W.R.Jacobs，Jr.，B.Gicquel，和C.Guilhot.1997.Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis inMycobacterium tuberculosis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：10955-10960.)。pEX1-Mtb-glnA1∷Kmr电穿孔进入BCG Tice中，并在含有50μg mL-1潮霉素的7H11上选择转化体。开始在许可温度(32℃)下保存平板六天，然后在限制性温度(39℃)下孵育46天。单一转化体在含50μg mL-1卡那霉素和20mM左旋谷氨酰胺7H9-10％-OADC-0.05％吐温80肉汤培养基中，在限制温度下生长大约25代，然后置于含有2％(w/v)蔗糖、20mM左旋谷氨酰胺盐和50μg mL-1卡那霉素的7H11平板上，挑选经历了第二次同源重组的克隆。35个随机选择的Kmr克隆中，发现有12个具有正确的表型(即Hygs和谷氨酰胺营养缺陷体)。为了确保纯培养，我们在低浓度下平板培养了12个克隆中的1个，且重新分离了单菌落。本菌株最初的冷冻原种就是从重新分离的克隆中制备的。通过DNA印迹确定突变体正确的基因型。
BCG Tice glnA1菌株是谷氨酰胺营养缺陷体。当不给予左旋谷氨酰胺时，观察不到在7H11培养基平皿上的生长。而且，当人体巨噬细胞在含有0.2mM左旋谷氨酰胺的组织培养基中培养(在此条件下，野生型菌株能够正常生长)时，glnA1突变体在人体巨噬细胞里几乎不生长或不生长。不过，可以通过在组织培养基中给予过量的左旋谷氨酰胺(10mM)获得类似于野生型菌株的细胞内生长。通过用含有结核分枝杆菌glnA1基因(pNBV1-MtbGS)或者鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)glnA基因(pNBV1-StGS)的质粒转化BCG Tice glnA1，进行互补分析。两种质粒使突变体恢复了的野生型生长表型。
这种BCG glnA1营养缺陷体的左旋谷氨酰胺需求预计非常类似于结核分枝杆菌glnA1菌株，对于后者，本发明人在以前曾非常详细地鉴定。(Tullius，M.V.，G.Harth，和M.A.Horwitz.2003.GlutaminSynthetase(GInA1)is essential for growth of Mycobacterium tuberculosisin human macrophages and in guinea pigs.Infect.Immun.Vol.71：7)。对于结核分枝杆菌glnA1菌株，在固体培养基中突变体正常生长需要高水平的左旋谷氨酰胺(10-20mM)。在液体培养基中，在≥1mM左旋谷氨酰胺下，结核分枝杆菌glnA1突变体能以正常的速度生长。虽然在1-2mM左旋谷氨酰胺中最初生长是正常的，但这些培养物并没有达到与包含5mM和20mM左旋谷氨酰胺的培养基一样高的密度，并且它们在对数期后不久在生存力方面急剧下降。当结核分枝杆菌glnA1菌株稀释到缺乏左旋谷氨酰胺的培养基中时，它的生存力急剧下降。当人体巨噬细胞在含有0.2mM左旋谷氨酰胺的组织培养基中培养(在此条件下，野生型菌株能够正常生长)时，结核分枝杆菌glnA1突变体在人体巨噬细胞里不生长。当人体巨噬细胞在含有2mM左旋谷氨酰胺的标准组织培养基中培养时，结核分枝杆菌glnA1突变体在人体巨噬细胞中的生长很差。不过，可以通过在组织培养基中给予大量过量的左旋谷氨酰胺(10mM)获得类似于野生型菌株的细胞内生长。在患有肺结核的豚鼠模型中，结核分枝杆菌glnA1突变体被高度地减毒。
B.BCG Tice trpD
BCG Tice trpD基因通过等位交换被破坏。等位交换底物是利用聚合酶链反应方法制备的，其中制造出了具有588bp缺失的BCGTice trpD位点，并且把Kmr盒插入到缺失位置。这种突变的等位基因被克隆进等位交换载体pEX2(pEX1的衍生物，其中编码绿荧光蛋白的gfpuv基因被编码胞嘧啶脱酰胺酶的大肠杆菌codBA操纵子替换)中，生成pEX2 ΔtrpD∷Kmr(Tullius，M.V.，G.Harth，和M.A.Horwitz.2003.Glutamin Synthetase(GInA1)is essential for growth ofMycobacterium tuberculosis in human macrophages and in guinea pigs.Infect.Immun.Vol.71：7)。
把pEX2 ΔtrpD∷Kmr经电穿孔引入BCG Tice中，在许可温度(32℃)下，在含有50μg mL-1潮霉素的7H11上选择转化体。在许可温度下，合并的转化体，用10μg mL-1卡那霉素和50μg mL-1的左旋色氨酸的7H9-10％-OADC-0.05％吐温80肉汤培养基中培育大约10代，然后在限制温度(39℃)下，在含有2％(w/v)蔗糖、50μg mL-1卡那霉素和50μgmL-1的左旋色氨酸的7H10里挑选经历同源重组的克隆。10个随机选择的Kmr克隆中，发现有4个具有正确的表型(即Hygs和谷氨酰胺营养缺陷体)。为了确保得到纯培养物，在低浓度下培养4个克隆中的1个，且对单菌落进行了重新分离。本菌株最初的冷冻原种就是从这些重新分离的克隆中制备的。通过DNA印迹法确定突变体正确的基因型。
BCG Tice trpD菌株是色氨酸营养缺陷体。当不给予L-色氨酸时，观察不到在7H11培养基平皿上的生长。在肉汤培养基中，在L-色氨酸浓度≥10μg mL-1时，BCG Tice trpD菌株以与野生型菌株相似的速度生长。在L-色氨酸浓度为3μg mL-1时，生长速度降低接近一半，并且当菌株被稀释到缺少左旋色氨酸的培养基中时，它们失去了生存力。而且，当人体巨噬细胞在含有5μg mL-1色氨酸的标准组织培养基中培养(在此条件下，野生型菌株能够正常生长)时，trpD突变体在人体巨噬细胞里几乎不或不生长。不过，可以通过在组织培养基中加入额外的100μg mL-1左旋色氨酸获得类似于野生型菌株的细胞内生长。通过用含有BCG Tice trpD基因的质粒(pNBV1-TRPD)转化BCG Tice trpD，进行互补分析。该质粒使突变体恢复了野生型生长表型。
II.过量表达结核分枝杆菌30kDa主分泌蛋白的生长可调节卡介苗
A.BCG Tice glhA1 pSMT3-MTB30
把质粒pSMT3-MTB30通过电穿孔进入BCG Tice glnA1，并且在含50μg mL-1潮霉素、50μg mL-1卡那霉素和20mM的左旋谷氨酰胺的7H11琼脂上选择转化体。随机地选择两个单独的潮霉素和卡那霉素抗性克隆，培养在含有50μg mL-1潮霉素、50μg mL-1卡那霉素和20mM左旋谷氨酰胺的7H9培养基里。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa蛋白的表达和输出。可以发现，每毫升培养基中，BCG Tice glnA1 pSMT3-MTB30制造出比BCG TiceglnA1高10-20倍的30kDa抗原。像它的母体菌株BCG Tice glnA1一样，BCG Tice glnA1 pSMT3-MTB30是谷氨酰胺营养缺陷体。
B.BCG Tice trpD pSMT3-MTB30
把质粒pSMT3-MTB30通过电穿孔进入BCG Tice trpD，并且在含50μg mL-1潮霉素、50μg mL-1卡那霉素和50μg mL-1L-色氨酸的7H11琼脂上选择转化体。随机地选择10个单独的潮霉素和卡那霉素抗性克隆，培养在含有50μg mL-1潮霉素、50μg mL-1卡那霉素和50μg mL-1L-色氨酸的7H9-10％-OADC-0.05％吐温80肉汤培养基。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa蛋白的表达和输出。可以发现，每毫升培养基中，BCG Tice trpD pSMT3-MTB30制造出比对照BCG Tice菌株高10-20倍的30kDa抗原。
III.减毒BCG(非营养缺陷型)BCG Tice narG：
BCG Tice narG基因(编码硝酸还原酶α亚基)是通过等位交换进行破坏的。等位交换底物是利用聚合酶链反应策略制备的，其中制造了具有2952bp缺失的BCG Tice narG基因座，并且把Kmr盒插入到缺失位置。这种突变的等位基因被克隆进等位交换载体pEX2(一种pEX1的衍生物，其中gfpuv基因被大肠杆菌codBA操纵子替换)中，生成pEX2 ΔnarG∷Kmr(Tullius，M.V.，G.Harth，和M.A.Horwitz.2003.Glutamin Synthetase(GInA1)is essential for growth of Mycobacteriumtuberculosis in human macrophages and in guinea pigs.Infect.Immun.Vol.71：7)。
把pEX2 ΔnarG∷Kmr经电穿孔引入BCG Tice中(12-13-2001)，在许可温度(32℃)下，在含有50μg mL-1的潮霉素和50μg mL-1卡那霉素的7H11琼脂上选择转化体。合并转化体，在许可温度下在含10μg mL-1卡那霉素的7H9-10％-OADC-0.05％吐温80肉汤培养基中培育大约30代，然后在限制温度(39℃)下，在含有2％(w/v)蔗糖和10μg mL-1卡那霉素的7H10琼脂上挑选经历同源重组的克隆。8个随机选择的Kmr克隆中，8个发现具有正确的表型(即Hygs)。为了确保得到纯培养基，在低浓度下平板培养4个克隆中的1个，且对单菌落进行了重新分离。本菌株最初的冷冻原种就是从这些重新分离的克隆中制备的。通过DNA印迹法证明突变株的正确表型，表明突变体缺少全长narG。
narG突变体在正常生长在平板上、肉培养基中和细胞内巨噬细胞内。但是，据报道其它地方生产的BCG narG突变体，在免疫缺陷(SCID)的小鼠模型中，与亲本卡介苗菌株相比，是高度减毒的。(Weber，I.，Fritz，C.，Ruttkowski.S.，Kreft，A.，和F.C.Bang.2000.Anaerobicnitrate reductase(narGHJI)activity of Mycobacterium bovis BCG in vitroand its contribution to virulence in immunodeficient mice.Mol.Microbiol.35(5)：1017-1025)。因此，可以预期narG突变株将类似地在SCID的小鼠里是减毒的，此外，在免疫受损的人群中也会是减毒的。
IV.过量表达结核分枝杆菌30kD主要分泌蛋白的减毒卡介苗(非营养缺陷体)
BCG Tice narG PSMT3-MTB30
把质粒pSMT3-MTB30通过电穿孔引入BCG Tice narG，并且在含50μg mL-1潮霉素和10μg mL-1卡那霉素的7H11琼脂上选择转化体。随机地选择5个单独的潮霉素和卡那霉素抗性克隆，培养在含50μgmL-1潮霉素的7H9-10％OADC-0.05％吐温80肉汤培养基里。
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa蛋白的表达。可以发现，每毫升培养基中，BCG Tice narG pSMT3-MTB30可制造出比对照BCG Tice菌株高10-20倍的30kDa抗原。
可以理解，利用上述方法，结合重组DNA技术领域的技术人员所知的方法，可以制备表达结核分枝杆菌32(A)kDa主要细胞外非融合蛋白、16kDa主要细胞外非融合蛋白、23.5kDa主要细胞外非融合蛋白和其它结核分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白的重组卡介苗菌株(营养缺陷体和非营养缺陷体)。而且，可以用类似的方法制备表达麻风分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白的重组卡介苗菌株，被表达的麻风分枝杆菌蛋白包括但不限于：结合分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的麻风分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白同源蛋白(a.k.a.抗原85B)、麻风分枝杆菌32(A)kDa主要细胞外非融合蛋白的麻风分枝杆菌32(A)kDa主要细胞外非融合蛋白同源蛋白(a.k.a.抗原85A)和其它麻风分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白。另外，相似方法学也能用来制备表达牛分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白的重组牛分枝杆菌卡介苗菌株，被表达的牛分枝杆菌蛋白包含牛分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的牛分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白同源蛋白(a.k.a.抗原85B)、牛分枝杆菌32(A)kDa主要细胞外非融合蛋白的牛分枝杆菌32(A)kDa主要细胞外非融合蛋白同源蛋白(a.k.a.抗原85A)和其它牛分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白。
质粒和转化体制备的典型方法
简要地讲，质粒pMTB30是设计用从它的启动子(或任何非热激和非应激蛋白基因启动子)出发，来表达结核分枝杆菌Erdman 30kDa主要细胞外非融合蛋白，通过利用重组DNA技术领域技术人员所熟知的方法，把含有30kD非融合蛋白外加侧翼DNA序列的染色体组DNA限制大片断插入质粒的多克隆位点，设计制造质粒pMTB30。质粒首先被引入到E.coli DH5α中，以获得大量的重组质粒。在250μgmL-1潮霉素的存在下，培植不能表达结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的重组大肠杆菌(E.coli)菌株，并且确定质粒插入DNA序列的完整性。在6.25kV/cm、25μF和1000mΩ条件下，通过电穿孔把质粒引入耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)中制造大量的阳性转化体。通过在50μg/mL潮霉素的存在下的生长，本发明人证实了重组质粒的存在，通过利用重组DNA技术领域专业人员所熟知的方法—聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证了重组30kDa蛋白的组成型表达和输出。另外，本发明人证实了重组结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的正确表达和加工，N-端氨基酸测序与其天然蛋白没有区别。
利用6.25kV/cm、25μF和200mΩ作为最佳电穿孔条件，随后把重组质粒pSMT3和pMTB30引入到牛分枝杆菌BCG Tice中。在补充2％葡萄糖的7H9培养基中，在37℃的空气摇床中孵育转化体4小时，然后置于含20μg/ml潮霉素的7H11琼脂平板上。当转化体在新的培养基中进行次培养时，逐渐增加潮霉素的浓度到50μg/ml。除了含有50μg/ml潮霉素7H9培养基外，重组BCG Tice的培养物保持在与野生型相同的条件下。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以及使用多价高特异性兔抗30kDa非融合蛋白免疫球蛋白的免疫印迹试验，验证重组结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白的表达和输出。通常，在10个转化体中有1个比其他的转化体表达和输出显著更大量的重组非融合蛋白；选择了2个这种菌株，制备了大量的这种转化体，并在-70℃下冷冻在含有10％甘油的7H9培养基里。用这些转化体在豚鼠上进行免疫原组合物功效研究。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验和免疫印迹试验，图1a显示了重组BCG Tice对结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的表达。在考马斯蓝染色的凝胶和免疫印迹上，重组菌株比野生型的菌株表达更多的结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白。
其次，按类似于上述制备重组BCG Tice(rBCG30 Tice)的方法，采用上述pMTB30质粒，制备表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的牛分枝杆菌BCG Connaught菌株(rBCG Conn)。在与重组BCG Tice相同的条件下，把它维持在含有50μg mL-1潮霉素的培养基中。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验和免疫印迹试验，图1b显示了重组BCG Connaught对结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的表达。在考马斯蓝染色的凝胶和免疫印迹上，重组菌株比野生型的菌株表达更多的结核分枝杆菌30kDa非融合蛋白。
另外，在rBCG菌株中，利用质粒pNBV1和紧邻谷氨酰胺合成酶基因glnA1或者编码细胞外蛋白基因的上游区的启动子，对主要细胞外非融合蛋白进行了相对表达，并将其表达与亲本卡介苗菌株进行了比较。用CreoScitex EverSmart Jazz扫描仪对每种重组菌株的每种重组蛋白的免疫印迹进行了数字化，利用NIH图像软件1.62程序测定面积，对蛋白条带进行光密度分析。在表8中给出了这些重组蛋白的表达水平。
对卡介苗重组菌株的质粒稳定性进行了生物化学评定。生物化学分析证明，在潮霉素存在的情况下，超过3个月的生长期中重组卡介苗菌株的肉汤培养物能维持重组非融合蛋白表达的稳定水平。在没有潮霉素的情况下，相同的培养物表现出非融合蛋白表达的轻微下降(在每个细胞的基础上)，表明重组质粒保持稳定，在没有选择压力的细菌生长中丢失趋势非常平缓(图1a和图1b，道3)。
对本发明中各种重组卡介苗菌株的稳定性进行了检测，所述菌株利用质粒pNBV1和紧邻谷氨酰胺合成酶glnA1上游区的启动子表达结核分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白。对于在含有潮霉素的供质粒阳性选择的培养基中连续培养，rBCG30 Tice II、rBCG23.5 Tice I和rBCG30/23.5 Tice I对30kDa和/或23.5kDa蛋白的表达可以稳定进行至少3个月(大约30代)。另外，在缺少潮霉素的培养基中，培养菌株一个月(大约10代)不会造成表达水平的降低。不过，在没有潮霉素的培养基中连续培养6个月(大约60代)后，rBCG30 Tice II对30kDa蛋白的表达水平大大地降低，并且rBCG30/23.5 Tice I对30kDa和23.5kDa蛋白的表达水平降低到无法检测的水平。只有rBCG23.5 Tice I对23.5kDa蛋白的表达保持较高水平。可以证实，两种菌株表达的减少是由于培养物中丢失质粒的细胞比例高(通过在有或没有潮霉素的7H11培养基平皿上对菌株进行平板培养来检测)。rBCG23.5 Tice I没有表现出质粒的丢失(大约100％的细胞是抗潮霉素的)，这与在缺少潮霉素时培养6个月后仍能保持高的表达相一致。
另外，对新的重组卡介苗菌株的稳定性也进行了检查，这些卡介苗能够利用质粒pNBV1和紧邻编码细胞外蛋白的基因上游区的启动子表达结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和麻风分枝杆菌主要细胞外蛋白。在含有或者缺少潮霉素(质粒pNBV1的阳性选择标记)的培养基中连续培养，重组蛋白即结核分枝杆菌30、23.5和32A kDa主要细胞外蛋白和牛分枝杆菌及麻风分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的表达可以稳定进行至少12个月(大约120代)。没有检测到质粒的丢失。
这些实验显示，各种重组菌株展示出重组蛋白表达水平的广谱稳定性。通常，包含重组蛋白的编码DNA序列(与它们内源启动子区融合)的质粒能够相当稳定地表达重组蛋白至少12个月，虽然水平随着时间慢慢地下降，很可能是使重组蛋白的表达及分泌与细菌细胞新陈代谢状态和相应内源蛋白的表达平衡。相反，含有异源glnA1启动子驱动重组蛋白表达的质粒的菌株其表达稳定性随时间表现出非常大的变化。应当指出的是，重组蛋白与从上述菌株表达所得到的蛋白相同。因此，很显然表达过程中的变化性是启动子序列的函数。
用于测试本发明免疫组合物安全性和有效性的典型方法
随着成功的免疫原组合物的产生，利用动物模型测试对本发明免疫原组合物的安全性和有效性进行了测试。因为豚鼠模型在临床、免疫学和病理学上与人体结核病尤其相关，所以利用豚鼠进行研究。与小鼠和大鼠不同而和人相似，豚鼠：a)对低剂量的气溶胶化结核分枝杆菌敏感；b)对结核菌素显示强烈的皮肤迟发型超敏反应(DTH)；c)在肺部损害处产生朗格汉斯巨细胞和干酪化。但是，虽然只有大约10％具免疫能力的人在一生中发展为活动性疾病(一半在暴露的早期，一半在潜伏期之后)，感染的豚鼠通常产生早期活动性疾病。虽然豚鼠在这方面不同于人类，但是感染结核分枝杆菌之后它们所产生的活动性疾病与任一致，这是免疫组合物有效性测试中的优势条件。
依照本发明的方法制备的免疫接种物制备自从对数生长的野生型或者重组卡介苗培养物(细菌)取出的等分试样。在3,500×g条件下离心15分钟，使细菌的每个等分试样沉淀，然后用1×磷酸缓冲盐溶液进行洗涤(1×PBS，50mM磷酸钠pH 7、150mM氯化钠)。然后把免疫接种物重悬在1×磷酸缓冲盐溶液里，最终浓度为每毫升1×104菌落形成单位，每100μl包含1000个活的细菌。
从Charles River Breeding Laboratories购买的不含特异病原体的250-300克重的远交雄性Hartley品系豚鼠，9只一组，用下列方法的一种进行皮内免疫：1)BCG Connaught[103菌落形成单位(CFU)]，仅一次(第0周)；2)rBCG30 Connaught(103 CFU)仅一次(第0周)；3)纯化的重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白(r30)，100μlSyntex佐剂制剂(SAF)中含100μg，三次，分三周(第0、3和6周)；SAF由多聚醇L121、角鲨烷和吐温80组成，在第一次免疫接种时还包含丙氨酰胞壁酰二肽；4)只用SAF(100μl)(假免疫)，三次，隔三周(第0、3和6周)；另外一组的三只动物只用SAF(100μl)做假免疫，用作皮试对照。这些和其它3到6个假免疫动物在攻击实验中作为未感染对照。
在唯一一次免疫接种(BCG和rBCG30组)后或者第一次免疫接种(r30组和假免疫皮试组)之后的第九周，把豚鼠的背部刮净，皮内注射100μl磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白(r30)。24小时后，测量红疹和硬化的直径。(用于皮试的假免疫动物与用于攻击研究的组分离。用于攻击研究的假免疫动物不进行皮试，用来排除皮试本身影响结果的可能性)。
在第一次免疫接种或者唯一一次的免疫接种后的第九周，用包含1×105结核分枝杆菌菌落形成单位(CFU)的10ml单细胞悬液产生的气溶胶攻击动物。把结核分枝杆菌Erdman株(ATCC 35801)通过远交豚鼠传代维持其毒性，培养在7H11琼脂上，对其进行温和的超声，获得单细胞悬浮液，然后在-70℃冷冻保存，供动物攻击试验使用。该攻击气溶胶可传播约40活体细菌进入每个动物的肺部。之所以采用传染的空气传播途径，是因为它是结核病的自然传播途径。本实验中使用大剂量结核分枝杆菌的目的是能够在相对短的时间期限内(10周)，在100％的对照动物内引起可检测的临床疾病。此后，把每个豚鼠养在层流生物危害安全限内区的不锈钢笼子里，可允许它们自由饮食标准实验室食物和水。每周观察动物的疾病并称重，进行10周，然后无痛处死。把每个动物的右肺和脾取出，培养结核分枝杆菌CFU。
两个实验的每个实验中，在用重组30kDa结核分枝杆菌主要细胞外非融合蛋白(r30)对假免疫动物和野生型卡介苗免疫动物进行测试时，它们都显示几乎没有或没有红疹和硬化。相比之下，用r30或者rBCG30免疫的动物则显示出显著的红疹和硬化，明显高于假免疫动物或者野生型卡介苗免疫的动物(表1和图2)。
两个实验的每个实验中，未感染对照动物与用rBCG30或者野生型卡介苗免疫的动物一样，在攻击后能够正常地增加体重(图3)。这3组中的动物，重量增加的确没有显著差别。相反，假免疫的动物和使用较小量的r30进行免疫的动物，在整个实验过程中展示出重量增加减小的趋势(表2和图3)。因此用结核分枝杆菌攻击后，BCG和rBCG30都能保护动物完全免受重量减轻，这是人体内结核病的主要体征，也是患有这种慢性传染疾病的豚鼠模型体内结核的特点。
两个实验的每个实验中，在10周观察期末，让豚鼠安乐死，然后把每个动物的右肺和脾脏进行无菌摘除，用作结核分枝杆菌的CFU分析。可以发现假免疫的动物在肺和脾脏里有最高的细菌含量(表3和图4a和图4b)。与假免疫的动物相比，用r30免疫的动物在肺和脾脏内有较少的生物体；BCG免疫的动物比r30免疫的动物具有较少的生物体；并且非常显著的是，rBCG30免疫的动物比BCG免疫的动物具有更少的生物体。使用方差法的双向因子分析比较平均值，统计测试证明，在实验1中，四个“治疗”组(假免疫、r30、BCG和rBCG30)的平均值与实验2中4个治疗组的平均值并没有显著差异，所以把两个实验中的数据合并是合适的。合并的数据列于表4和图3。最令人感兴趣并最重要的是，与BCG免疫的动物相比，rBCG30免疫的动物在肺中少了0.5数量级的生物体，在脾脏内少了接近1数量级的生物体。根据统计分析，利用方差法分析比较平均值和Tukey-Fisher最低有效差分(LSD)标准，以此来评定统计显著性，四组肺和脾脏中任一组的平均值与其它组中任一组的平均值显著不同(表4)。在rBCG30免疫的动物和BCG免疫的动物之间的差别，在肺中p＝0.02时，在脾脏中p＝0.001时有显著性。根据总体检查，平行于肺中CFU的差别，rBCG30免疫的动物比BCG免疫的动物有较少肺部损坏。(20±4％对35±5％，平均值标±准偏差)。
因此，在肺结核的高度敏感豚鼠模型里，给予表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的重组卡介苗诱导了抗结核分枝杆菌气溶胶攻击的高水平保护。相反，如下面的实施例所述，给予卡介苗结合佐剂中的相同分枝杆菌细胞外非融合蛋白(结核分枝杆菌重组30kDa主要细胞外非融合蛋白)，并没有引起抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护；给予表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌也没有；给予微球中的结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白(大小与卡介苗一样、象卡介苗一样能缓慢释放蛋白60-90天)也没有；给予包在脂质体中的结核分枝杆菌30kDa主要细胞外非融合蛋白也没有。
本发明非常惊人的一个方面是，即使野生型卡介苗能够表达和分泌内源高度同源的30kDa主要细胞外蛋白，rBCG30菌株诱导的保护仍然优于野生型卡介苗(参见图1)。编码次代BCG Connaught 30kDa蛋白的基因并没有被测序。但是，从这些次代卡介苗克隆基因的编码序列推断，其它两种次代卡介苗的30kDa蛋白序列与结核分枝杆菌蛋白的差别也仅仅在于一个氨基酸(BCG Paris 1173 P2)或包含2个附加氨基酸在内的5个氨基酸(BCG Tokyo)。(见3041-3042页，Harth，G.，B.-Y.Lee，J.Wang，D.L.Clemens和M.A.Horwitz.1996.Novelinsights into the genetics，biochemistry，和immunocytochemistry of the30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis.Infect.Immun.64：3038-3047，其全部内容通过引用结合到本文中)。因此，重组菌株的改善保护不大可能是由于重组蛋白和内源蛋白之间小的氨基酸差别。更可能的是由于重组非融合蛋白比内源蛋白的表达更强。如果这样，那么通过利用高拷贝数质粒获得的大量表达很可能是重组免疫原组合物成功的重要因素。
在第3个实验中，从Chatles River Breeding Laboratories购买的不含特异病原体的250-300克重的远交雄性Hartley品系豚鼠，9只一组，用103CFU的下列菌株中的一种进行皮内免疫：
组A：BCG Tice亲本对照
组B：rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)
组C：rBCG30 Tice II(pNBV1-pglnA1-MTB30)
组D：rBCG23.5 Tice I(pNBV1-pglnA1-MTB23.5)
组E：rBCG30/23.5 Tice I(pNBV1-pglhA1-MTB30/23.5)
组F：rBCG30 Tice II(pNBV1-pglnA1-MTB30)和rBCG23.5 TiceI(pNBV1-pglnA1-MTB23.5)
(每个菌株5×102)。
另外，按如下方法，用缓冲液对18只动物进行假免疫：
组G：12只假免疫动物(仅用于随后的攻击)和H组：6只假免疫动物(仅用于皮试)。
在免疫9周之后，把上面A-F组中每组9只豚鼠和假H组的6只动物的背部刮净，然后皮内注射100μl磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)。对用表达r23.5的菌株(组A、D、E、F)免疫的动物和H组的6只假免疫动物，用100μl磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌23.5kDa主要细胞外蛋白(r30)进行附加的皮试。24小时后，测量红疹和硬化的直径。(用作皮试的假免疫动物组与攻击研究的组分离。用于攻击研究的假免疫动物不进行皮试，用来排除皮试本身对试验结果影响的可能性)。
如表格9总结的那样，从试验结果可以看出，用母体BCG Tice菌株免疫的动物(A组)和假免疫的动物(H组)在用r30或者r23.5测试时，它们都显示几乎没有或者没有红疹和硬化。相比之下，用表达r30的重组卡介苗菌株免疫的动物，则表现出由r30引起的明显红疹和硬化，其程度明显高于BCG Tice免疫的动物和假免疫动物。与此类似，用表达r23.5的重组卡介苗菌株免疫的动物，则表现出由r23.5引起的明显红疹和硬化，其程度明显高于BCG Tice免疫的动物和假免疫动物。而且，用表达r30和r23.5的重组卡介苗菌株免疫的动物显示出由r30和r23.5引起的明显红疹和硬化，其程度明显高于BCGTice免疫的动物和假免疫动物。最后，同时用重组卡介苗的2种不同菌株(一种表达r30，另一种表达r23.5)对动物进行免疫，该动物显示出这两种蛋白引起的明显红疹和硬化，其程度明显高于BCG Tice免疫的动物和假免疫动物。
有趣的是，用新的重组卡介苗菌株(该菌株利用结核分枝杆菌glnA1基因上游区衍生来的启动子表达重组蛋白)免疫的动物(C、D、E和F组)，与用rBCG30 Tice I菌株(该菌株利用来源于结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白编码基因上游区的启动子表达r30)免疫的动物相比，它们不具有更多的红疹和硬化。
在免疫接种九周后或者皮试之后立即用10ml单细胞悬浮液产生的气溶胶攻击A-G组的所有动物，其中单细胞悬浮液含有5×104菌落形成单位(CFU)的结核分枝杆菌。(在攻击之前，把进攻菌株即结核分枝杆菌Erdman菌株[ATCC 35801]通过远交豚鼠传代并维持毒性，然后培养在7H11琼脂上，对它进行温和的超声，从而获得单细胞悬浮液，然后在-70℃冷冻保存)。这种气溶胶能够释放约20活体细菌进入每个动物的肺部。之所以采用传染大空气传播途径，是因为它是结核病的自然传播途径。在本实验中使用大剂量的目的是能够在相对短的时间期限内(10周)，在100％的对照动物中引起可测量的临床疾病。然后，把豚鼠圈养在层流生物危害安全限内区的不锈钢笼子里，并允许它们自由饮食标准实验室食物和水。随后每周观察动物的疾病并称重，进行10周，无痛处死。最后把每个动物的右肺和脾取出，在37℃、5％CO2-95％空气环境下，在Middlebrook 7H11琼脂上培养2周，获得结核分枝杆菌到CFU。
肺和脾脏里的CFU化验结果如表10所示。这些结果显示，与假免疫的动物相比，用卡介苗或者任何重组卡介苗菌株免疫的动物在肺和脾脏内有较少的CFU。重要的是，用任何重组卡介苗菌株免疫的动物比用母体BCG Tice菌株免疫的动物在肺和脾脏内具有较少的CFU。然而，在本试验中所测试的重组菌株均不优于rBCG30 TiceI。
在第4个实验里，从Charles River Breeding Laboratories购买的不含特异病原体的250-300克重的远交雄性Hartley品系豚鼠，6个一组，用103CFU的下列菌株中的一种进行皮内接种：
组I：BCG Tice亲本对照
组J：rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)
组K：rBCG30 Tice III(pNBV1-MTB30)
组L：rBCG23.5 Tice II(pNBV1-pMTB23.5)
组M：rBCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)
组N：rBCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)
组O：rBCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)。
组P仅用缓冲液进行假免疫(6个动物)。
在免疫注射之后9周，把上面I-P组中的豚鼠背部刮净。把100μl磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)，皮内注入用表达r30的菌株免疫的豚鼠(J、K、M和N组)和P组中的6个假免疫动物中。用表达r23.5的菌株(组L、M、N)免疫的动物和P组中的6个假免疫动物用100μl磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌23.5kDa主要细胞外非融合蛋白进行皮试。注入表达r32A的菌株地动物(O组)和P组中的6个假免疫动物，然后用100μl的磷酸缓冲盐溶液中的10μg纯化重组结核分枝杆菌32AkDa主要细胞外蛋白进行皮试。24小时后，测量红疹和硬化的直径。
如表11总结，试验结果显示，用母体BCG Tice菌株免疫的动物(A组)在用r30测试时，没有出现红疹和硬化，而用表达重组30kDa蛋白的菌株免疫的动物(J、K、M、N组)则具有显著的红疹和硬化。用菌株(该菌株比rBCG30 Tice I表达更多r30，利用30kDa蛋白基因上游区衍生来的启动子表达r30)免疫的动物(K、M和N组)，与用rBCG30 Tice I菌株免疫的动物相比，具有较多的硬化，这也是比红疹更可靠的皮肤迟发型超敏反应指征。用重组卡介苗菌株(该菌株表达r23.5，是母体菌株内缺少的蛋白)免疫的动物(L、K和M组)，具有由r23.5引起的显著的红疹和硬化，而假免疫具有由r23.5引起的红疹几乎没有，而且没有硬化。用重组卡介苗菌株(过量表达r32A)免疫的动物(O组)与假免疫动物相比，具有更多由32A kDa蛋白引起的红疹和硬化。
另外，免疫接种十周后，从I-P组中的几个豚鼠取血，测定对纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)、32A kDa主要细胞外蛋白(r32A)和23.5kDa主要细胞外蛋白(r23.5)的血清抗体滴度。通过酶联免疫吸附测定法测定抗体滴度，从而测定每个动物相互的抗体滴度。图6图示了这些结果。
第5个实验是用来证明最免疫的哺乳动物中对传染的保护作用，在这个实验中，从Charles River Breeding Laboratories购买的不合特异病原体的250-300克重的远交雄性Hartley品系豚鼠，6只一组，用103CFU的下列菌株中的一种进行皮内免疫：
组I：BCG Tice亲本对照
组J：rBCG30 Tice I(pSMT3-MTB30)
组K：rBCG30 Tice III(pNBV1-MTB30)
组L：rBCG23.5 Tice II(pNBV1-pMTB23.5)
组M：rBCG30/23.5 Tice IIA(pNBV1-MTB30/23.5↑↑)
组N：rBCG30/23.5 Tice IIB(pNBV1-MTB30/23.5↑↓)
组O：rBCG32A Tice I(pNBV1-MTB32A)
组P：12个用无抗原缓冲液免疫的假免疫动物。
在免疫接种九周后或者皮试之后立即用10ml单细胞悬浮液产生的气溶胶攻击I-P组中的所有动物，其中单细胞悬浮液包含5×104菌落形成单位(CFU)的结核分枝杆菌。(在攻击之前，把进攻菌株即结核分枝杆菌Erdman菌株[ATCC 35801]通过远交豚鼠传代以维持毒性，然后培养在7H11琼脂上，对它进行温和的超声，从而获得单细胞悬浮液，然后在-70℃冷冻保存)。这种气溶胶释放约20的活体细菌进入每个动物的肺部。之所以采用传染对空气传播途径，是因为它是结核病的自然传播途径。在本实验中使用大剂量菌株的目的是能够在相对短的时间期限内(10周)，在100％的对照动物中引起可测量的临床疾病。然后，把豚鼠圈养在层流生物危害安全限内区的不锈钢笼子里，并允许它们自由饮食标准实验室食物和水。每周观察动物的疾病并称重，进行10周，然后使它们安乐死。把每个动物的右肺和脾取出，培养以获得结核分枝杆菌CFU。实验结果列于下面的表12中。
表1
对结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的皮肤迟发型超敏反应
表2
用毒性结核分枝杆菌Erdman菌株气溶胶攻击后的净重量增加
表3
用结核分枝杆菌Erdman菌株气溶胶攻击后动物肺和脾内
结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)
合并实验1和试验2
表4
统计分析概要(ANOVA)
肺和脾内肺菌落形成单位
合并实验1和试验2
表5
用结核分枝杆菌Erdman菌株气溶胶攻击动物肺和脾内
结核分枝杆菌的菌落形成单位(CFU)：
用卡介苗或者卡介苗加佐剂中的重组结核分枝杆菌30kDa蛋白免疫
的动物或者假免疫的动物
表6
用结核分枝杆菌Erdman菌株气溶胶攻击后动物肺和脾中的
菌落形成单位(CFU)：
用表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的活重组耻垢分枝杆菌
免疫的动物(重组耻垢分枝杆菌30)
表7
用结核分枝杆菌Erdman菌株气溶胶攻击后动物肺和脾中的
菌落形成单位(CFU)： 用大小与卡介苗一样、象卡介苗一样能缓慢释放结核分枝杆菌30kDa
主要细胞外蛋白(r30)的微球体免疫的动物 用含结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)的脂质体免疫的动物
表8
BCG Tice重组菌株对重组蛋白的表达
表9
对纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)和23.5kDa主
要细胞外蛋白(r23.5)的皮肤迟发型超敏反应(DTH)
表10
对气溶胶攻击的保护性免疫：肺和脾中的CFU
表11
对纯化重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)和23.5kDa主
要细胞外蛋白(r23.5)的皮肤迟发型超敏反应(DTH)
表12
对气溶胶攻击的保护性免疫：肺和脾中的CFU
下列的实施例可用于说明本发明的新颖性方面。每个实施例用密切相关但不同于本发明免疫原组合物的技术，说明本发明免疫原的递药方法。具体地说，实施例1证明：当把本发明的免疫原与卡介苗一起给予，而不是在体内由BCG表达，就得不到高水平的保护性免疫。
实施例2证明：利用与卡介苗密切相关但不能在哺乳动物宿主中复制的分枝杆菌体内表达本发明免疫原，不能诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护。实施例3和4证明：通过人工合成的免疫原组合物微载体缓慢释放本发明免疫原，也不能诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护。
实施例5提供了一种典型的给予本发明营养缺陷体实施方案的方法。与此类似，实施例6也详述了本发明非营养缺陷减毒菌株的使用方法。
实施例
因此，下列的实施例用于突出本发明的细胞内免疫原组合物在传染病免疫学领域中惊人的和显著的进展。但这些实施例只以说明为目的，不能视为对本发明的限制。
实施例1
用卡介苗加重组结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)对豚鼠进行免疫并不能够诱导出抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护。
过去，我们把卡介苗加r30置于强力佐剂中(Syntex佐剂，SAF)，将豚鼠免疫。在豚鼠皮内给予r30蛋白(每次免疫100μg)三次。这样诱导对r30的强烈皮肤迟发型超敏反应(C-DTH)(图5)。的确，这种皮肤迟发型超敏反应(C-DTH)比得上用重组卡介苗(表达r30)诱导的皮肤迟发型超敏反应。虽然如此，但用卡介苗和r30进行的免疫并不能诱导出对抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表5)。与单独用卡介苗免疫的动物相比较，用卡介苗和r30免疫的动物在肺和脾中并没有低水平的菌落形成单位。这个结果与如上所述结果(当用结核分枝杆菌攻击时，用表达r30的重组卡介苗免疫的动物显示出高水平的保护)形成直接对比。
实施例2
使用表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)的活体重组耻垢分枝杆菌，以与其天然形式难以区别的形式对豚鼠免疫，没有引起抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护。
在用卡介苗免疫动物的同类实验中，我们用表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)的活体重组耻垢分枝杆菌，以与其天然形式难区别的形式对豚鼠进行免疫。与表达和分泌结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的重组卡介苗相比，耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的表达和分泌的程度与之相等或者比其更高。而且，重组耻垢分枝杆菌的剂量(109细菌)非常大，是重组卡介苗剂量(103细菌)的100万倍，比补偿动物宿主体内耻垢分枝杆菌繁殖不良所需的甚至更高。为了更进一步补偿，皮内给予重组耻垢分枝杆菌三次，然而在皮内给予重组卡介苗只一次。用表达r30蛋白的耻垢分枝杆菌进行的免疫接种引起了强烈对r30的皮肤迟发型超敏反应(C-DTH)。的确，该皮肤迟发型超敏反应比得上或者大于表达r30的重组卡介苗所引起的皮肤迟发型超敏反应。虽然如此，用表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的活体重组耻垢分枝杆菌免疫动物，并不能诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表6)。并且与单独用卡介苗免疫的动物相比较，用表达结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的活体重组耻垢分枝杆菌进行免疫的动物在肺和脾中并没有较少的菌落形成单位。这个结果与上述结果(当用结核分枝杆菌攻击时，用表达r30的重组卡介苗免疫的动物显示出高水平的保护)形成直接对比。
实施例3
用微球体对豚鼠进行的免疫接种，没有引起抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护，该微球体大小与卡介苗一样、象卡介苗一样能缓慢释放结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)60-90天。
在用rBCG30和卡介苗BCG免疫接种动物的同类实验之中，我们用微球体对豚鼠进行免疫接种，该微球体大小与卡介苗一样、象卡介苗一样能缓慢释放结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)60-90天。用包含10毫克r30的微球体对一批动物进行免疫接种一次。用包含3.3毫克r30的微球体对另一批动物进行免疫接种三次。计算微球体的用量使它大大超过重组卡介苗菌株所表达的r30蛋白的量。使用任何一种微球体的免疫方案都会产生强烈的皮肤迟发型超敏反应(C-DTH)。的确，微球体引起的皮肤迟发型超敏反应比得上表达r30的重组卡介苗引起的皮肤迟发型超敏反应。然而，用大小与卡介苗一样、象卡介苗一样能缓慢释放结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白(r30)的微球体进行免疫，并不能诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表7)。与单独用卡介苗免疫的动物相比较，用微球体进行免疫的动物在肺和脾中并没有较低水平的菌落形成单位。这个结果与上述结果(当用结核分枝杆菌攻击时，用表达r30的重组卡介苗免疫的动物显示出高水平的保护)形成直接对比。
实施例4
用含有结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的脂质体对豚鼠进行的免疫接种，并没有诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护。
在与实施例3相同的实验中，我们用脂质体对豚鼠进行免疫接种，该脂质体含有结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白。用含有50μgr30的脂质体对这些动物进行免疫接种三次。这种免疫接种可引起中等强度对r30的皮肤迟发型超敏反应(C-DTH)。该C-DTH大于卡介苗和对照脂质体引起的C-DTH，但小于表达r30的重组卡介苗引起的C-DTH。然而，用含结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的脂质体所进行的免疫接种并不能诱导抗结核分枝杆菌攻击的高水平保护(表7)。与单独用卡介苗免疫的动物相比较，用此种含有结核分枝杆菌30kDa主要细胞外蛋白的脂质体进行免疫的动物在肺和脾中并没有较低水平的菌落形成单位。这个结果与上述结果(当用结核分枝杆菌攻击时，用表达r30的重组卡介苗免疫的动物显示出高水平的保护)形成直接对比。
实施例5
生长可调节营养缺陷型菌株的使用
使用生长可调节营养缺陷型疫苗的方法如下。用疫苗，例如色氨酸营养缺陷型卡介苗菌株对免疫受损的人进行免疫。这些人应立即开始用足够量色氨酸补充他或者她的饮食，以便使养缺陷型体能够以正常水平繁殖，引起对肺结核的高水平保护性免疫。在大多数人中，重组卡介苗的繁殖不会引起健康问题。生物体在组织里繁殖到适度的水平，然后被免疫系统清除掉。不过在某些免疫受损的人群中，可产生细菌过度繁殖引起的散播性疾病或者其他问题。于是这些人应立即停止饮食补充。在缺乏饮食补充的情况下，营养缺陷体将迅速消失并且停止引起健康问题。
在不易获得医疗护理的发展中国家里，这种方法特别有用。如果一个人的免疫接种引起不利结果，他不需要到医疗保健系统或者使用抗菌素，这样可能昂贵和/或不易得到。这些人只需要停止饮食补充即可，这是一种被动而不是主动的干涉。
实施例6
非营养缺陷型减毒菌株的使用
按照卡介苗通常的给药方法，即没有任何饮食补充，把这些菌株给予免疫受损的人。
本发明的免疫原组合物代表了引起抗细胞内病原体的免疫反应的全新方法。通过一系列周密设计的实验和深思熟虑的分析，本发明人已经完全证明了，只有根据本发明所提供的方法，转化精确选择的细胞内病原体或者近缘种类，使其表达相同或者不同细胞内病原体的重组细胞外蛋白，才能获得保护性免疫。
本发明也能同时用来对多种细胞内病原体提供诊断、预防和治疗益处。例如，重组减毒细胞内免疫原组合物如牛分枝杆菌，可以同时被设计为表达抵抗结核分枝杆菌和军团菌的免疫保护性免疫原。因此，可高效递送免疫原组合物。表达结核分枝杆菌主要细胞外蛋白的重组卡介苗的非限制性实施例不仅可以作为本发明完全可实施的实施方案，而且代表了医学和全人类的重大发展。
除非另作说明，本说明书和权利要求书中使用的表示成分量、性质(如分子量)和反应条件等等的所有数字应当被理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非标明与之相反，下列说明书和所附的权利要求书中列出的数字参数都是近似值，这些近似值可随本发明设法得到的所需性质的变化而变化。至少，并且不是试图限制等效学说应用于权利要求的范围，每个数字参数至少应根据所给出的有效位并通过常规的四舍五入法进行解释。尽管表示本发明广大范围的数字范围和参数是近似值，但在具体实施例中提出的数值是尽量精确的。但是，任何数值都固有包含误差，该误差是存在于它们各自测量法中的标准偏差所必然导致的。
在描述本发明的上下文里(特别是在下面权利要求书中)，使用术语“一”和“该”和类似的指示物都将被解释为包含单数形式和复数形式，除非另作说明或者通过上下文明显存在矛盾。本文数值范围的列举仅仅作为简略表达方法，分别指范围之内每个单独的数值。除非本文另作说明，每个个体值都被结合到本说明书中，如同它们是分别被本文引用一样。本文描述的全部方法可以按任何适当的顺序执行，除非本文另作说明或者上下文明显存在矛盾。本文提供的任一和全部实施例或者示例性语言(如″例如″)，其应用仅仅为了更好地阐述本发明，而不是对本发明范围进行限制。本说明书中的任何语言不应被解释为表示任何未要求保护的本发明应用所必须的要素。
本文公开的本发明可选因素和实施方案的分组不能解释为限制性的。每个组成员可以个别地，或者与本组其它成员或与本文存在的其它因素任意结合，提出和要求保护。可以预料，根据方便和/或可授予专利的原因，一个组可以包含一个组中的一个或者多个成员，也可以删除一个或多个成员。当任何这样的包含或者删除发生时，说明书被认为是包含修改的组，因此完成了用于所附权利要求书的全部Markush组的书面说明。
本文描述了本发明的最佳实施方案，包含本发明人已知的完成发明的最佳方式。当然，通过阅读上述说明书，对最优方案的变化对于本领域的普通技术员是显而易见的。本发明人预计到技术人员可适当使用这些变化，本发明人认为本发明可用本文具体描述以外的方式实施。相应地，如可适用法律所允许的，本发明包含附于本文后权利要求书中列举主题的全部修改方案和等效方案。而且，除非本文另作说明或者上下文明显存在矛盾，本发明还包含上述因素的所有可能变化的任何组合。
而且，整个说明书中提到了许多专利和印刷出版物。每个上述引用的参考文献和印刷出版物通过引用整体结合到本文中。
在结尾，应理解的是，本文公开的本发明实施方案是本发明原理的体现。其它可使用的修改也在本发明范围内。因此，以举例说明的方式，而不是以限制的方式，可根据本文的教导利用本发明其它形式。相应地，本发明不限于所明确表示和描述的形式。
通过引用结合到本文的附加参考文献
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2.Colditz，G.A.T.F.Brewer，C.S.Berkey，M.E.Wilson，E.Burdick，H.V.，Fineberg，and F.Mosteller.1994.Efficacy of BCG vaccinein the prevention of tuberculosis.Meta-analysis of the published literature.JAMA 271：698-702.
3.Horwitz，M.A.，G.Harth，B.J.Dillon，and S.Malesa-Galic.2000.Recombinant BCG vaccines expressing the Mycobacterium tuberculosis30kDa major secretory protein induce greater protective immunity againsttuberculosis than conventional BCG vaccines in a highly susceptibleanimal model.Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)97：13853-13858.
4.Horwitz，M.A.，B.-W.E.Lee，B.J.Dillon，and G.Harth.1995.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination withmajor EXTRACELLULAR proteins of Mycobacterium tuberculosis.Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92：1530-1534.
机译： 重组细胞内病原体免疫原性组合物和使用方法
机译： 免疫刺激重组细胞内病原体免疫原性组合物和使用方法
机译： 重组细胞内病原体免疫原性组合物和使用方法
