猪uroplakinⅡ启动子和使用所述启动子生产有用蛋白质的方法

摘要

本发明涉及猪uroplakin II基因启动子、含该启动子的表达载体和使用该载体生成有用蛋白质的方法。本发明的启动子高效促进目的蛋白的膀胱特异性表达。使用本发明启动子转化以表达目的蛋白质的动物在其尿中分泌高浓度的目的蛋白，所生成的蛋白质表现出比相同类型现有蛋白质更好的生理活性。因此，本发明的启动子、使用该启动子的表达载体和转基因动物能够有利地用在有医药价值的有用蛋白质的生产领域。

说明书

技术领域

本发明涉及猪uroplakin II基因启动子和使用该启动子生产有用蛋白质的方法。

发明背景

在医药领域，作为最大化生产蛋白质如具有经济增长值的EPO的方法，主要采用利用细胞培养技术的大规模生产方法。但是，在该方法中，由于使用动物血液作为培养基，生产成本增加，并且需要对培养具有专业知识。另外，由于不可能将新生成的EPO和含在培养基中的动物EPO完全分离，因此最终制成的EPO具有低纯度和低活性的问题。

另一方面，在使用转基因动物生产有用蛋白质的方法中，目的蛋白包含在动物所分泌的体液中，因此，与现有的细胞培养技术相比，目的蛋白易于分离和纯化，并保留更好的活性。由于这种原因，该方法正迅速引起人们的关注。

在至今建立的转基因动物技术中，主要使用已知表现出高蛋白质表达的乳腺作为生产目的蛋白的器官。但是，动物试验结果表明：通过在乳汁中的表达基本不可能产生几种重要的目的蛋白，如EPO，这是因为它们在乳腺之外的其他组织中也表达。另外，由于诸如白蛋白的各种蛋白质也大量含在乳汁中，所得的目的蛋白质难以纯化。

为了克服这些问题，最近提出了使用膀胱来生产有用蛋白质的方法。

不论动物的性别如何，膀胱在整个动物生命周期中生成尿，并且尿仅含有5-25mg/l非常小量的蛋白质和脂肪组分。因此，使用膀胱使目的蛋白的分离和纯化非常容易。

但是，发展至今用膀胱特异性启动子转化的动物的蛋白质生产效率仍处于低水平。

因此，迫切需要开发一种高效促进目的蛋白表达的启动子。

发明内容

因此，本发明的一个目的是分离促进目的蛋白膀胱特异性表达的猪uroplakin II基因启动子，并提供能使用该启动子大量生产有用蛋白质的方法。

在一个实施方案中，本发明提供了猪uroplakin II基因启动子。

猪uroplakin II启动子优选具有SEQ ID NO：1的碱基序列。

[SEQ ID NO：1]：

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另外，本发明的猪uroplakin II启动子可以选自具有SEQ ID NO：1碱基序列中一处或多处断裂(disruption)突变、缺失突变、插入突变、点突变、替换突变、无义突变、错义突变、多态性突变或重排突变的功能等价物。

在另一个实施方案中，本发明提供了含启动子全部或部分的表达载体。

本发明的表达载体优选包含启动子和在启动子3’端编码目的蛋白的碱基序列。

在另一个实施方案中，本发明提供了用导入了表达载体的受精卵转化的动物。

在另一个实施方案中，本发明提供了大规模生产有用蛋白质的方法，其包括从转基因动物收集尿，分离并纯化表达在尿中的目的蛋白。

本发明的启动子位于猪uroplakin II基因的5’端，调控猪uroplakin II基因的表达。

本发明的启动子可以通过以下述方式筛选猪基因组文库来分离。

为了获得猪uroplakin II基因的部分碱基序列用作筛选探针，将具有已知碱基序列的其他动物的uroplakin II碱基序列相互比较，参照物种之间高度保守的部分构建引物组(正向引物：SEQ ID NO：2和反向引物SEQ ID NO：3)。然后，使用猪膀胱的总RNA作为模板，用引物组进行RT-PCR。

通过RT-PCR反应获得部分uroplakin II片段后，使用获得的部分作为探针筛选猪基因组文库。如图2所示，用于本发明的探针是两个探针，由含uroplakin II基因中外显子2-5部分的探针A和含uroplakin II基因中外显子1-2部分的探针B组成。

如图2所示，文库筛选获得了含uroplakinII基因或启动子的克隆。通过比较克隆之间的碱基序列，最终确定启动子的碱基序列，从而获得猪uroplakin II启动子的全碱基序列。

这样获得的启动子全长为8847bp，在碱基序列中表现出高的G+C含量，管家基因的特征，并含有各种Sp1元件，包括AP2和GATA盒。

在各种猪组织中，本发明的启动子只在膀胱组织中特异性地表达目的蛋白。对于猪uroplakin II基因来说，其表达在8-14％的总膀胱细胞中，活跃增殖，尤其是在膀胱上皮上基部细胞中，并在片段化(segmented)的伞形细胞中表现出高表达水平。

因此，由于本发明的启动子高效诱导蛋白质的膀胱特异性表达，使用本发明的启动子允许生成以膀胱特异性方式表达外源性目的蛋白的表达载体。

在生成本发明的表达载体时，将本发明的启动子插入到用于蛋白质表达的现有载体中作为基本骨架，将编码目的蛋白的碱基序列插入到启动子的3’端，从而生产本发明的载体。

在本发明表达载体的生成中可以用作基本骨架的载体可以是选自常用表达载体的合适载体，其例子包括具有多个克隆位点的pBluescript SK载体和逆转录载体，如pLNCX。

本发明的表达载体可以表达用作医疗药物活性成分的所有蛋白质，这些蛋白质的例子包括红细胞生成素(EPO)、醛固酮、肾上腺-促肾上腺皮质激素(adreno-corticotropin)、凝血因子、促性腺激素、胰岛素、催乳素和加压素。

如果需要，本发明的表达载体还可以含有调控子(regulator)，如另一种启动子、增强子、选择标记、非翻译区(5’-UTR)、3’-UTR、多聚腺苷酸化信号、核糖体结合序列、能插入到基因组特定位点中的碱基序列和适当位置处的内含子。

本发明提供了能够在猪uroplakin II启动子的调控下表达人EPO的表达载体pUP2/hEPO(图3)。表达载体pUP2/hEPO是含uroplakin II启动子的表达载体的优选例子。

在本发明的表达载体pUP2/hEPO中，pBluescript SK(-)载体用作基本骨架，编码人EPO的基因(Lin F.K.et al.，Proc.Natl Acad.Sci，USA，Clonging and expression of thehuman erythropoietin gene，82：7580-7584，1985；SEQ ID NO：4)融合到本发明uroplakinII启动子的3’端。表达载体pUP2/hEPO于2002年10月17日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 10352BP。

如果需要，本发明的表达载体pUP2/hEPO还可以含有新霉素抗性基因、绝缘子或旱獭肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，从而使转基因细胞系的建立易于进行，将目的蛋白的表达水平最大化，保证目的蛋白表达的稳定性。

新霉素抗性基因是对细胞系建立中所用的G418试剂表现出抗性的基因，在建立在UPII启动子的控制下表达蛋白质的动物细胞系时可以充当有效的选择性标记。新霉素抗性基因具有SEQ ID NO：5碱基序列。

[SEQ ID NO：5]：

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绝缘子是促进与启动子相邻的调控子效应的因子，还促进位点依赖性表达，使得目的蛋白在UPII启动子的控制下稳定表达。绝缘子具有SEQ ID NO：6碱基序列。

[SEQ ID NO：6]：

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WPRE是赋予mRNA稳定性从而增加目的蛋白合成的调控子，能够使目的蛋白在UPII启动子的调控下大量表达。WPRE具有SEQ ID NO：7碱基序列。

[SEQ ID NO：7]：

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本发明提供了I/pUP2/hEPO载体、pUP2/hEPO(WPRE)载体和I/pUP2/hEPO(WPRE)载体，作为还含有调控子的表达载体的优选例子。

通过将新霉素抗性基因插入到本发明的pUP2/hEPO载体中，然后将WPRE插入到EPO基因的3’端或将绝缘子插入到UPII启动子的5’端来生成这种载体。

举例来说，可以转化本发明的表达载体的动物包括所有排尿的动物，如猪、小鼠、牛、家禽、绵羊和山羊动物。

使用本发明的表达载体产生转基因动物的方法根据常规方法进行。也就是说，从要转化的动物的健康个体收集受精卵，将本发明的表达载体导入到受精卵中。然后使用切除输精管的小鼠获得假孕小鼠，将受精卵植入到作为替身母亲的假孕小鼠的输卵管中。然后对从替身母亲获得的后代中筛选转化的个体。

随后，从证实转化了的筛选个体中收集尿，从收集的尿中分离和纯化目的蛋白，从而生产有用的蛋白质。

在生产有用蛋白质的本发明方法中，可以通过常规技术如过滤或层析来进行尿的分离和纯化工艺。

如上所述产生的本发明转基因动物以膀胱特异性的方式表达目的蛋白，并且以远高于现有方法的浓度在尿中表达目的蛋白。

例如，转化有本发明表达载体pUP2/hEPO的小鼠表现出0.5-1mg/ml的高EPO表达水平。虽然EPO是难以表达的蛋白质，因为它导致胚胎的早期死亡，但是本发明的动物中EPO的表达水平比使用现有uroplakin启动子的尿中蛋白质的表达水平高至少1,000倍。

另外，从本发明转基因动物生产的蛋白质表现出比相同类型市售蛋白质更好的生理活性。

例如，从转化本发明表达载体pUP2/hEPO的小鼠中获得的EPO以比市售EPO更高的水平维持EPO依赖性肝细胞系的存活率。

因此，本发明的启动子和使用该启动子的表达载体和转基因动物可以有利地用在难以大量生产的有用蛋白质的生产领域。

附图说明

图1说明用于分离本发明的猪uroplakin II启动子的探针结构，和通过探针获得的克隆；

图2说明本发明中表达载体pUP2/hEPO的结构；

图3说明猪uroplakin II mRNA的膀胱特异性表达；

图4说明猪uroplakin II蛋白的膀胱上皮特异性表达；

图5说明膀胱细胞中猪uroplakin II蛋白的表达水平和该蛋白质的伞状细胞特异性表达；

图6说明转化有本发明表达载体pUP2/hEPO的小鼠中EPO mRNA的膀胱特异性表达；

图7说明转化有本发明表达载体pUP2/hEPO的小鼠中EPO蛋白的表达；

图8说明本发明表达载体pUP2/hEPO的结构；

图9说明本发明表达载体pUP2/hEPO的结构；

图10说明本发明表达载体pUP2/hEPO的结构；

图11说明本发明表达载体的EPO基因表达水平之间的比较；

图12说明本发明表达载体的EPO基因表达水平之间的比较。

最佳实施方式

下面将通过实施例更详细地描述本发明。应该认识到本发明并不局限于实施例或受实施例的限制。

实施例1：分离本发明的猪uroplakinII启动子

为了分离本发明的猪uroplakinII启动子，进行下列试验。

1)通过RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应)制备探针

由于猪uroplakin II基因的碱基序列是未知的，将碱基序列已知的小鼠和牛uroplakin II cDNA进行相互比较。参照两物种间高度保守的部分，生成用于扩增猪uroplakin II cDNA的兼并引物组。正向和反向引物的碱基序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

使用引物组，用MuMLV逆转录酶对猪膀胱的总RNA进行RT反应，使用Taq聚合酶对所得的cDNA进行PCR。扩增的DNA碱基序列的读取表明扩增的DNA是uroplakin II基因的组成部分。用pGEM T-easy载体克隆扩增的DNA。

为了生成用于分离uroplakin II启动子的探针，将50μg克隆的DNA煮沸3分钟，然后在冰中冷却使之变性。将变性的DNA加入到含引物、dNTP、[α-³²P]dCTP(3000Ci/nmol，NEN)的反应缓冲液中，然后向溶液中加入Klenow片段，于37℃反应1小时。获得的探针由包含uroplakin II基因的外显子2-5中一部分的探针A和包含uroplakin II基因的外显子1-2中一部分的探针B组成(图1)。

然后，使用Sephadex G-50柱对反应溶液进行纯化，从而制备³²P标记的、用于猪uroplakin II启动子探测的DNA探针A和探针B。

2)文库筛选

为了分离猪uroplakin II启动子，对猪基因组文库进行了筛选。在该实施例中，使用了已经插入到λFix II噬菌体载体(Stratagene)中的猪基因组文库。

如下所述制备转导有文库的宿主细菌。

使含0.2％麦芽糖的5ml LB培养基接种一个细菌菌落，并于37℃培养过夜。将1％的培养物培养基转移到50ml含0.2％麦芽糖的新鲜LB培养基中，并培养2.5小时。当600nm处的吸光度达到约0.5时，将培养物溶液以2,500rpm离心10分钟。将所得的细胞沉淀悬浮于10ml的无菌硫酸镁溶液中，至终浓度为1×10¹⁰细胞/ml，并于4℃保存待用。

为了测定滴度，将文库以不同浓度系列稀释到SM溶液中。将含固体LB培养基的平板于37℃孵箱中保温，将顶层琼脂溶解，并置于保持在48℃的水浴中。将10μl以不同浓度稀释的各噬菌体溶液与100μl上述制备的宿主细菌混合，于37℃用噬菌体感染宿主细菌。

将感染了噬菌体的宿主细菌加入到顶层琼脂中，摇匀，并倒到上述准备好的LB培养基上。15分钟后，使板面朝下于37℃的孵箱中培养过夜。在培养过夜的平板培养基上形成噬菌斑，用于后续步骤，将板于4℃冷却至少1小时，所述的噬菌斑说明文库DNA在宿主细菌中繁殖后噬菌体将宿主细菌裂解。

提供具有序号的NC滤膜，将上述制备的文库DNA平板以一定的方式用滤膜覆盖，以使滤膜的中部首先接触。用针以垂直于滤膜的方向对滤膜扎孔，以标记位置，1分钟后，小心将滤膜和培养基相分离。

将每张滤膜连续浸在变性液、中和液和2×SSC溶液中，每种溶液1分钟，然后置于80℃烤箱中2小时，从而使转移的文库DNA完全固定在滤膜上。

使每张固定的滤膜漂浮在2×SSC溶液中使之湿润，然后在含预杂交液的培养皿中预杂交，于68℃缓慢摇晃1小时。预杂交后，每张滤膜加入实施例1的第1)部分中制备的探针，于68℃缓慢摇晃18小时进行杂交。杂交后，在含0.1％SDS的2×SSC溶液中浸泡、于65℃摇晃10分钟洗滤膜的过程重复两次。洗涤后，将滤膜风干并进行放射自显影。

通过在放射自显影结果和平板之间进行比较，挑取表现出阳性迹象的噬菌斑。将噬菌斑置于500μl SM溶液中，并且加入一滴氯仿且与该溶液充分混合，将混合物保存于4℃。这种筛选过程重复3次，最终获得表现出阳性迹象的克隆。使用Qiagenlambda mini试剂盒纯化含在每个克隆中的DNA。

使用ABI 377 DNA测序仪(Applied Biosystem)进行DNA碱基序列的读取，使用CAP2序列集合(assembly)系统加工测序结果，使用BLAST、SMART、PROSITE等进行序列比较，使用Clustal W程序进行基序分析。

结果，当用探针A进行筛选时，获得了图1所示的克隆A和B。当探针B用于筛选时，获得了图1所示的克隆C和D。因为每个这种克隆都在3’端含有猪uroplakinII基因或结构基因，克隆之间的比较提供猪uroplakin II启动子的完整碱基序列。

本发明的猪uroplakin II启动子的总长度为8847bp，其碱基序列示于SEQ IDNO：1。

3)验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质的表达模式

为了验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质的表达模式，猪uroplakin II的表达验证如下。

3-1)验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质的膀胱特异性表达

为了验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质是否以膀胱特异性方式表达，进行了Northern分析。

使用实施例1第2)部分中获得的猪uroplakin II cDNA作为探针，同时提供以恒定水平表达在所有组织中的肌动蛋白探针作为对照组。为了使用探针证实猪uroplakin II mRNA的表达是否存在于各种猪身体的组织中，如下所述对包括膀胱、心脏、肝脏、肺、子宫和脾的组织的总RNA进行电泳。

将0.7g琼脂糖置于250ml Erlenmeyer烧瓶中，加入58ml的蒸馏水，使之在电子水浴(electronic rang)中完全溶解，并在60℃保温的水浴中冷却。当琼脂糖凝胶的温度调至60℃时，小心加入7ml 10×跑胶缓冲液，同时摇晃，再加入11.9ml的甲醛以制备1×甲醛跑胶缓冲液。将溶液置于预先设定的电泳系统中，静置20分钟使生成凝胶。

将6μl RNA、2.5μl 10×跑胶缓冲液、4μl甲醛和12.5μl甲酰胺充分混合到离心管中，于65℃加热5分钟，然后在冰上冷却。加入2.5μl凝胶上样缓冲液，并与样品充分混合，加到已经以5V预电泳5分钟的凝胶上。将所得的物质在1×跑胶缓冲液中以120V/cm电泳。电泳后，将凝胶置于0.05N的氢氧化钠溶液中约10分钟，部分切下RNA，使后续的转移过程的效率增加。

将凝胶置于0.1M Tris溶液(pH 7.5)中30分钟，然后置于20×SSC溶液(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠，pH 7.3)中约30分钟，然后使用带正电荷的膜将RNA转移到凝胶上。为了进行RNA固定，将转移的膜于80℃静置2小时。

将膜置于含有能完全浸没膜的最小体积杂交液的乙烯袋中。然后，将袋子68℃振荡孵箱中保存至少1小时，然后将溶液取出，换为15ml含探针的杂交液，于68℃振荡孵箱中过夜。

杂交后，用洗涤溶液1(2×SSC，0.1％SDS)于室温下洗涤30分钟，更换洗涤溶液，然后用洗涤溶液2(0.2×SSC，0.1％SDS)于55℃洗涤30分钟，更换洗涤溶液2。使膜于室温下完全干燥后，对其放射自显影，以验证是否表达了猪uroplakin IImRNA。结果如图3所示。

如图3a所示，作为内部对照组的肌动蛋白mRNA在所有组织中表达一致。另一方面，如图3b所示，在本发明启动子调控下表达的uroplakin II mRNA仅特异性地表达在猪膀胱中(图3b)。

结果可见本发明的启动子以膀胱特异性方式表达蛋白质。

3-2)验证在本发明启动子的调控下表达的蛋白质的膀胱上皮特异性表达

其间，为了验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质是否在膀胱组织的任意细胞中表达，如下所述进行了免疫组化染色。

提供了猪膀胱组织的石蜡切片(fragment)，在Histoclear溶液中保留10分钟以除去石蜡。将切片浸到浓度逐渐降低的含水乙醇溶液中以进行脱水，并浸到含3％氢氧化钠的甲醇和含0.1％胃蛋白酶的0.05N盐酸中，以防止切片的非特异性染色。

用TBS缓冲液(0.05MTris，pH 7.4，0.85％氯化钠)两次洗涤5分钟，然后在用正常马血清以1∶5比例稀释的TBS中进行封闭反应。

将封闭的切片在用一抗以1∶500比例稀释的TBS中浸泡过夜，此时，使用可以与猪uroplakin II蛋白特异性结合的多克隆抗体作为一抗，使用ABC试剂盒中的一滴马血清作为阴性对照组。

将已经进行了一抗反应的切片用TBS洗涤5次，每次5分钟，以除去过量的抗体，然后使之与结合生物素的二抗反应30分钟。然后，将切片用TBS洗涤3次，并与ABC试剂反应30分钟。将切片用TBS再次洗涤，用含1％Triton-X 100的PBS洗30秒，然后与含0.5％二氨基联苯胺(DAB)和0.01％过氧化氢的0.05M Tris缓冲液(pH 7.6)反应显色。

显色反应后，将切片用水洗涤，并放置到光学显微镜下观察其显色部分。结果如图4所示。

如图4a所示，对照组不表现出任何阳性信号。但是，如图4b所示，抗体和uroplakin II蛋白的膀胱组织反应显示：本发明的启动子调控uroplakin II蛋白，从而使该蛋白质仅在猪膀胱上皮中特异性表达，尤其是在上基部细胞的胞浆中表达。3-3)验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质的表达水平

因为膀胱上皮细胞已知比活跃发生蛋白质合成的乳腺具有更低的蛋白质合成能力，以下列方式通过激光扫描细胞术(下文中称作“LSC”)验证在本发明启动子调控下表达的蛋白质的实际表达水平。

细致地分离猪膀胱组织，加入到含1mg/ml I型胶原酶(Sigma)、0.51mg/ml透明质酸酶(Sigma)和50μg/ml庆大霉素的DMEM/F12培养基(Gibco)中，于37℃进行消化反应1小时。

所得的物质用PBS洗涤后，使用60μm尼龙膜(Milipore)过滤掉大量物质，使悬浮的单细胞结合到包被有0.1％明胶的Lab-Tek载玻片(chamber slide，Nunc)中。结合到载玻片上的细胞用冷的PBS洗涤，并在冷的甲醇中固定15分钟，然后在0.1％Triton-X 100溶液中处理10分钟。

固定的细胞在含1％BSA的PBS中封闭1小时，并和实施例1第3-2)部分中制备的uroplakin II多克隆抗体的1∶100溶液于室温反应2小时。用PBS洗后，细胞与结合FITC的抗小鼠IgG二抗(Cappel Laboratories)反应。此时，制备仅和二抗反应的组作为阴性对照组。

细胞用含0.1％Tween-20的PBS洗三次后，用50μg/ml碘化丙锭(PI)染色，从而测定细胞总数。在LSC分析时，用488nm的氩激光器发射荧光，对FITC使用530nm滤光片、对PI使用570nm滤光片观察荧光表达。结果如图5所示。对阴性对照组的分析结果如图5a所示，对膀胱细胞中表达uroplakinII的细胞进行分析的结果如图5a所示，对表达uroplakin II的膀胱细胞的免疫表型进行分析的结果如图5c所示。

从图5b可见所有膀胱细胞中约8-14％的细胞表达uroplakin II。从图5c可见大多数细胞是活跃增殖并分裂(cleaved)的伞状细胞。考虑到尿中蛋白质水平通常为5-25mg/l的非常低水平，上述uroplakin II的表达水平是非常高的。另外，还认为使用膀胱组织能够使蛋白质以比使用乳腺组织更高的效率得以分离和纯化。

结果可见本发明的启动子能够使目的蛋白在膀胱中高效表达。

实施例2：生成本发明表达载体pUP2/hEPO

使用实施例1中分离的本发明启动子，通过下列方法生成在该启动子的调控下表达EPO的载体。

选择pBluescript SK(-)作为基本骨架载体，插入实施例1第2)部分中分离的本发明启动子。然后，将编码人EPO的基因(SEQ ID NO：4)插入到启动子的3’端。

所得的表达载体具有图2所示结构，在本发明uroplakin II启动子的调控下表达EPO。该载体称作“pUP2/hEPO”，于2002年10月17日保藏在韩国生物科学和生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC 10352BP。

实施例3：生成导入有本发明表达载体pUP2/hEPO的受精卵细胞

如下所述产生导入有实施例2中生成的本发明表达载体pUP2/hEPO的受精卵细胞。

1)收集受精卵

在收集受精卵之前3天时，将PMSG施用到雌性小鼠的腹腔中，两天后，下午5点钟向雌性小鼠施用hCG，然后与雄性小鼠交配受精。在交配受精的第二天早晨，观察雌性小鼠中是否已经生成塞(plug)，以验证雌性小鼠是否怀孕。

将证实怀孕了的小鼠引颈处死，用手术剪剪开腹腔，分离子宫的结缔组织部分。将输卵管和子宫之间的部分用镊子撕开，然后将卵巢和输卵管之间的部分用剪子剪下。然后，切下用镊子撕开部分子宫壁，并分离输卵管。

将分离的输卵管置于M2培养基中，并放置在绝缘板上，以防止其温度下降。在显微镜下用1ml针头将输卵管壶状体剖开，收集胚胎。将收集的胚胎置于已经暴露于室温的透明质酸酶溶液中，静置到卵丘细胞分散。

将所得的溶液用M2培养基洗2-3次，以13,000rpm离心5min，并再用M2培养基洗2-3次。将筛选的受精卵在覆盖石蜡油的M16培养基中洗2-3次，然后转移并保存于37℃孵箱中。

2)DNA向受精卵中的微注射

使用显微操作，将本发明的表达载体pUP2/hEPO注射到上述收集的受精卵中。

实施例4：制备在本发明启动子调控下生成人EPO的转基因小鼠

使用实施例3中生成的受精卵，以下述方式生成在本发明启动子调控下生成人EPO的转基因小鼠。

1)制备切除输精管的小鼠

用于导致替身母亲假孕的切除输精管的小鼠产生如下。

选择并麻醉6周龄的ICR小鼠，然后使用镊子和剪刀，沿耻骨剪下距离耻骨上方约1.5cm处的约1cm的表皮。靠左或靠右放置以防止剪切口重叠，剪开肌层，将阴囊下方的睾丸移到腹腔中。用镊子将睾丸、附睾和输精管彼此分开，用镊子分离输精管(speraduct)周围的膜，用加热的镊子切下输精管。确认已经分离了输精管后，将肌层缝合，将小鼠置于温室中，直到苏醒。

2)产生作为替身母亲的假孕小鼠

在测试日之前，将已经证实具有动情期的ICR雌性小鼠和实施例3第1)部分中产生的切除输精管的小鼠交配受精。在测试日早上，观察雌性小鼠中是否已生成塞，以验证雌性小鼠假孕。

3)胚胎转移到输卵管中

使实施例2第2)部分中制备的受精卵在微量移液器中排列。轻微切割作为替身母亲的麻醉雌性小鼠的表皮和肌层，用镊子将卵巢、输卵管和子宫角的上部从体内取出。以一定方式定位卵巢，使透过卵巢囊暴露的部分面朝上。然后，使用止血装置插入脂肪组织以固定卵巢。在立体显微镜下，除去卵巢囊的膜，然后取出输卵管和卵巢以观察纤毛(fimbrae)。然后，移植移液器的前部尖端插入到输卵管中2-3mm，将受精卵连同培养基小心移植到输卵管中。观察移液器中两个气泡中作为标记物的第一个气泡是否插入到了输卵管中，以验证受精卵确实移植到了输卵管中。

从替身母鼠中获得了后代。为了从中筛选转基因小鼠，使用EPO的外显子1和2作为探针进行Northern分析，分析结果表明76只小鼠中有12只得以转化。

验证了转基因小鼠中EPO蛋白的表达模式，结果表明EPO蛋白以膀胱特异性方式表达。

实施例6：从本发明的转基因小鼠生成人EPO

1)验证本发明转基因小鼠尿中EPO的表达水平，尿从转基因小鼠获得，过滤并进行HPLC分析。为了验证每个级分的蛋白质组成，进行电泳和western分析，结果如图7所示。

从图7a中的电泳结果和图7b中的Western分析结果明显可见：从转基因小鼠获得的尿含有高浓度的EPO。

尿中EPO的浓度计算为0.5-1mg/ml的表达水平，其明显高于从现有转基因动物乳汁中的蛋白质表达水平。

因此，使用本发明启动子产生的转基因动物可以在尿中高效生成目的蛋白。

2)验证从本发明转基因小鼠获得的EPO的生理活性

为了验证从本发明转基因小鼠获得的EPO的生理活性，将实施例3第1)部分中获得的EPO加入到EPO依赖性肝细胞中并加以培养。此时，对照组加入市售的EPO。在培养后24、48和72小时的每个时间点测定细胞的存活率，结果如表1所示。

表1：

培养时间  DMEM/F12(％)    FBS    FBS+市售    EPO FBS+本发明 EPO    24    38.5±6.8    54.9±4.3    58.2±6.6    72.1±4.7    48    21.6±7.4    39.9±2.9    50.0±2.4    60.4±7.5    72    10.0±4.6    20.8±11.7    39.6±3.8    53.9±4.0

如表1所示，可见所有时间段中从本发明转基因小鼠尿中分离的EPO都表现出比市售EPO更高的生理活性。

因此，使用本发明启动子产生的转基因动物能够产生生理活性远高于现有方法所获得蛋白质的蛋白质。

实施例6：生成含调控子的本发明表达载体并验证其效率

1)构建含有调控子的表达载体

为了建立能使本发明UPII启动子调控下的EPO生成最大化的载体系统，将选择标记和调控子以下述方式引入pUP2/hEPO载体中，以产生一系列的改进载体。1-1)构建pUPII/hEPO-Neo载体

在建立能在UPII启动子的调控下表达蛋白质的细胞系时，为了将有效的选择标记插入到载体中，以下列方式引入新霉素抗性基因以产生pUP2/hEPO-Neo载体。

为了获得新霉素抗性基因，使用pEGFP-N1载体(Clontech)作为模板，以及正向引物(SEQ ID NO：8)和反向引物(SEQ ID NO：9)进行PCR反应。

5’-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3’(sEQ ID NO：8)

5’-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3’(sEQ ID NO：9)

将所得的1.9-kb PCR产物插入到pGEM T-easy载体中，并用NotI限制酶消化，以制备用于克隆的新霉素抗性基因部分。

通过用NotI和SalI限制酶消化来除去本发明pUP2/hEPO载体中的氨苄青霉素抗性基因位点，以制备用于克隆的载体。

将上述制备的新霉素抗性基因克隆到载体中，从而产生新霉素抗性基因插入到了现有pUP2/hEPO载体中的pUP2/hEPO-Neo载体。

1-2)构建I/pUP2/hEPO载体

为了获得能够稳定表达UPII启动子调控下的蛋白质的表达载体，以下述方式将绝缘子基因导入到pUP2/hEPO-Neo载体中，从而产生I/pUP2/hEPO载体。

为了获得绝缘子基因，使用含鸡B-珠蛋白绝缘子基因的pBC1载体(Invitrogen)作为模板，以及正向引物(SEQ ID NO：10)和反向引物(SEQ ID NO：11)进行PCR反应。为了增加PCR效率，扩增了两个拷贝。

5’-TCGACTCTAGAGGGACAG-3’(SEQ ID NO：10)

5’-CTCACTGACTCCGTTCCT-3’(SEQ ID NO：11)

将所得的2.4-kb PCR产物插入到pGEM T-easy载体中，并用NotI限制酶消化，以制备用于克隆的绝缘子基因。

将上述制备的绝缘子基因和上面第1-1)部分的载体通过NotI位点彼此连接，从而产生I/pUP2/hEPO载体(图8)。

1-3)构建pUP2/hEPO(WPRE)载体

为了获得能在UPII启动子的控制下大量表达蛋白质的表达载体，以下列方式将WPRE基因引入到pUP2/hEPO-Neo载体中，以产生pUP2/hEPO(WPRE)载体。

为了克隆WPRE基因，使用正向引物(SEQ ID NO：12)和反向引物(SEQ IDNO：13)进行PCR反应。

5’-ACCAGGTTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC-3’(SEQ ID NO：12)

5’-CTCGAGGAGCCCGAGGCGAAACAGGCG-3’(SEQ ID NO：13)

将所得的0.6-kb PCR产物插入到pGEM T-easy载体中，并插入到本实施例1-1)部分中产生的pUP2/hEPO-Neo的NcoI限制位点中。将所得载体用BspHI限制酶消化，以制备用于克隆的WPRE基因。

其间，将本发明pUP2/hEPO载体中EPO基因的后部用NcoI限制酶消化，以制备用于克隆的载体。

将上述制备的WPRE基因克隆到载体中，以产生pUP2/hEPO(WPRE)载体(图9)。

1-4)构建I/pUP2/hEPO(WPRE)载体

为了产生能满足表达水平、表达稳定性和建立在UPII启动子调控下的有效细胞系全都最大化的表达载体，以下列方式产生了I/pUP2/hEPO(WPRE)载体。

将本实施例1-2)部分制备的绝缘子基因通过NotI位点与本实施例1-3)部分中的载体连接，从而产生I/pUP2/hEPO载体(图10)。

2)验证本发明表达载体的效率

以下列方式验证实施例6中所产生的表达载体的效率。

2-1)对本发明表达载体进行PCR分析

为了验证本发明表达载体所致的EPO基因的表达水平，实时PCR进行如下。

使用转染试剂盒(Effectene，Qiagen)将实施例6中产生的四个本发明表达载体导入到膀胱细胞系RT4中，并亚培养以建立稳定的细胞系。从每个所得的细胞系提取基因组DNA，并进行PCR，以验证是否正确进行了转染。

为了验证EPO基因的表达水平，从四个细胞系中提取总RNA，并进行RT-PCR以扩增cDNA。使用上述cDNA作为模板、以及能扩增EPO外显子区域的正向和反向引物进行PCR。

为了验证每个细胞系中的表达水平，使用在细胞中以恒定水平表达的管家基因GAPDH作为对照组重复3次该过程。测试结果用SAS程序进行统计处理，示于图11中(pUP2＝pUP2/hEPO载体；IUP2＝I/pUP2/hEPO载体；PW＝pUP2/hEPO(WPRE)载体；IW＝I/pUP2/hEPO(WPRE)载体)。

如图11所示，本发明表达载体的EPO基因表达水平以pUP2/hEPO载体、I/pUP2/hEPO载体、pUP2/hEPO(WPRE)载体和I/pUP2/hEPO(WPRE)载体次序逐渐增高。

具体地，含WPRE和绝缘子的I/pUP2/hEPO(WPRE)载体表现出比不含隔离绝缘子的pUP2/hEPO高约50倍的表达水平(图11b)。

因此，包括I/pUP2/hEPO(WPRE)载体的本发明载体可以有利地用于生成EPO。

2-2)本发明表达载体的Western分析

为了验证本发明表达载体所致的EPO蛋白的表达水平，如下所述进行Western分析。

将通过导入实施例6的2-1)部分中的本发明各表达载体而建立的细胞系置于含NP-40的裂解缓冲液中，超声处理，以从细胞系中提取蛋白质。

将各40μl蛋白质在SDS-PAGE凝胶上经电泳，转移到PVDF膜上，并用EPO抗体处理以验证IPO蛋白的表达水平。为了定量EPO蛋白的表达水平，使用肌动蛋白的抗体作为对照组重复两次该过程。结果用SAS程序处理，示于图12中(pUP2＝pUP2/hEPO载体；IUP2＝I/pUP2/hEPO载体；PW＝pUP2/hEPO(WPRE)载体；IW＝I/pUP2/hEPO(WPRE)载体)。

如图12所示，本发明表达载体的EPO蛋白表达水平以pUP2/hEPO载体、I/pUP2/hEPO载体、pUP2/hEPO(WPRE)载体和I/pUP2/hEPO(WPRE)载体次序逐渐增高。

该结果和实施例7中1)部分所示结果一致。

因此，包括I/pUP2/hEPO(WPRE)载体的本发明载体可以有利地用于生成EPO。

工业应用

如上所述，本发明的启动子诱导目的蛋白的膀胱特异性表达，在尿中以远高于现有方法的浓度表达目的蛋白。

由本发明启动子和受该启动子调控的目的蛋白组成的表达载体转化的动物以比现有转基因动物更高的效率分泌目的蛋白。另外，从本发明转基因动物获得的蛋白质表现出比相同类型的现有蛋白质更好的生理活性。

因此，本发明的启动子、使用该启动子的表达载体和转基因动物可以有利地用于有医药价值的有用蛋白质的生产领域。

                   序列表

<110>CHO-A PHARM CO.，LTD.

     KIM，Jin Hoi

<120>猪uroplakin II启动子和使用所述启动子生

     产有用蛋白质的方法

<130>03PP181

<150>KR 10-2002-0067856

<151>2002-11-04

<150>KR 10-2003-0077256

<151>2003-11-03

<160>13

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>8847

<212>DNA

<213>猪

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(8847)

<223>猪uroplakin II启动子

<400>1

gggctaggag tggaatcaga gctggcctat gccacagcaa cgcagaatcc aaaccacatc    60

tccgacctac accagaccgt caccataaca caggatcctt aacccactga gcaaggtcag    120

ggatcaaacc caaatcctca tggatactag tcgggttctt aacccgctga gccacagtgg    180

gcactcctgt ttttgtttgt gtcttcgttt tttggctgca tctgcagcat acagaagttc    240

ctgggttaag gattgaaccc atgccacagc agcaacccga gccacagcag tgacaacagc    300

ctgatcctta actgctagac caccagggaa cgccccctca acttttcatg cattggaaac    360

cctgagtcag tacaacctga caatngnttt tttttttttt tttttttgcc ttttctaggg    420

ccacttcccg cggcatgtgg agattcgcag gctanaggtc taatcggagc tgtagccacc    480

ggcctacacc agagccatag caacgaggga tccgagccga gtctgcaacc tacactacag    540

ctcatggcaa caccggatcg ttaacccact gagcaaggcc aggggatcga acccgcaacc    600

tcatggttcc tagtcagatt cgctaaccac tgcaccatga caggaactcc caacctgaca    660

attttatcat ttctgcaccc tagttgttga gtaatttgaa aaattcccaa gatgtcaagg    720

tcagtgtgat ggttaatttt atgtgtcaac ctgactaggc catgttgccc ggatgtggag    780

tcattgttat tctggatgtt actgtgaaga tatgttttgg atgaaattaa catttaaatc    840

agtgggggga aaaaaagaag ttctcgttct ggtgcatcag aaacaaatcc gactaggaaa    900

caagcggttg caggttcgat ccctggcctc acttagtgga gtcaggatct ggcgttgccg    960

tgagctgtgg tacaggtggc agatgcagct cggatctagc attgctgtgg ctgtggtgta    1020

ggccagcagc tgtagctctg attaaacccc aagtctggga acctccatat gccgtgggtg    1080

tggcccgaaa aagcaaaaaa taaataaata aataaattta aaccagggga ttttgagcaa    1140

agcagattac cccataatat gggtgggtct catcaagttc attgtaggcc ctagtggaac    1200

aaagaccgac ctccaccttc tccccatgag aaggaaagaa ttctgccaaa agaccgcctt    1260

nggacntaaa ctgcaactct ttcctgagtt tccagcatgt tggcctcccc catcagactt    1320

tggacttgcc aagcctccgc aattgcatga gccaattcct taaaataaat ccgtctatat    1380

atacacatcc tgttggttct gtttctccag agaaccctga ctaacgcagt ctgcacccct    1440

gaagaccagt ggtccccaca ctcagctggg tgtcacctcc aaacactcag ccttcctcaa    1500

ggctctttct agctgtgtcc tcctctcccc acaacagctg tttcaaactc tcacccctct    1560

tcagggcgca atcccttctc ctccctgagt ttcctacttc ccagagaaag cagagacctt    1620

caggagtgtg ctgccttaac ttacttcctt catccctcag ccttgcaaaa gtataagctt    1680

tctctgcacc actgccccat tcttctctct gcagacaggg tcattcctaa agccaaacgc    1740

taatgcctcc acctctgatc tgagtcccat cttttccctc ctccagaagc ttcctcataa    1800

attctacccc cttttcttcc ttatctttat ctttgaaaac aaaatggaag acagccttcc    1860

cgttgtggtg cagcggaaac agtggtgcct tggaagcgct gggacgcagg ttcgacccct    1920

ggcccagcat agtaggttaa ggatccagtg ttgccacagt tttggcttag attgaaactg    1980

cagctcagat ctggtccctg gcctgggaac ttcatacgcc acaggacggc ccaaaaagaa    2040

aagaaagaaa aaataaaaaa caaaacagaa aagcctttcc tgtaccccca attccctcca    2100

gttatctctc tctttccctt cccagccaag ctctgcaaag agcggtctgc acagttctaa    2160

ctctacctcc tcccagttgg ccctggactt tctcagtctg gcttctaccc ccctcacccg    2220

taggaatctg ctctgaagga cacgcacccc tcacgatcct tggcccaggg acattttttg    2280

taccagcctt tcaatcctga ccttcatatc atccgacacc tcctttgtga aaccctccat    2340

ccactttctc ctggttcccc tcctaagacc cattccgcct tcttcagccc cctccctcca    2400

tctgtccttt agatgccgca tttcctagta tcctgtcctg cgcggnctcg tccttccctt    2460

ccacaactct cttcaaggac tcttttctcc atgtgcgatt ttgcccatgg cccaccttcc    2520

ctctctttac ccagactttc ccccggtgct ccagactcat agactcaatt atgaaaacat    2580

agttttcatc tgatttgccc aagatatttg cattagttat tactgtataa cagcttatcc    2640

cccaatttag tggcttataa aataaacact tattctgaga atcagaaacc taggcaggac    2700

atagttgggg tctcatgaag ttgcactgaa aatgtccccc tgggctaatc atacggagga    2760

ctgaccaggg ctggaggatc tgttccaagc tcattcattc acatggccgt aggtgggaga    2820

cagctcttct ctggatcttg gcaggagcct caattccttg tcacgtggac ctccccttgg    2880

agggggtccc atgtcctcca tggtgagtaa tccatgagag caaggtggaa ggtgccatgc    2940

catttaggac ctagcctcag gagggaccta cgtcacttct gttgtagtct gttggccaca    3000

cagactaacc ctgacacaat gcacccatcc atgacctgct gccagtccat tctccacact    3060

gtttccagaa tgatatttac ataagtaaaa ctcctcaaag gcttttgaga ttttttttcc    3120

cattatagtt gatttataac ctcagaggct tttgttttct tcagcataaa aaccaagttc    3180

cttaacatag catgtaaccc actggccacc ctgccagtgg ctagaactct caccatgtcc    3240

atccttgaat actgctttct agccaagagc tattgtttgc agttcccaga atgtgtcggg    3300

ataactcaca tctctgagcc ttttcatgtg ctgttccctc actttggaat atccccttcc    3360

atttaggaag gctaatgtcc attcattntc caaaactcag aagcaaattt tttttttttt    3420

tttttttttt tttttttgct ttttagggcc gaactctcag catatggagg ttcccaggtt    3480

agccatcaaa ttggaattgt agctgctggc ctacaccaca gccatagcaa caccagaccc    3540

aagtcacatc tgcaacctac atcacagatc atggcaatac tggatcctta acccactgag    3600

tgagcccagg gatcaaacac aaattctcat ggatactcgc caggttcatt accactgagc    3660

cacaacagga actcctctcc tttttatggt cacacctgca gcatatggaa gttcctgggc    3720

cagggattga atctgagtgg cagctgtgac aatgccgtat cctttaattc actgtgctgg    3780

gctgaggggn taaantgccc ctcctaaaaa acctgagctg ctgcagttgg attcttaatc    3840

cactgcacca caagggggaa ggtcaagaac tgtcttgcca tctctgtatc ttatcaccta    3900

gcatagtacc caccatagag aagttgctca acaaatgttt actgaatgaa taaatgcatg    3960

agctggagtt cccattgcgg ctcagcagta acaaacctga ctagcattca taagaacttg    4020

ggttcgatcc ctagcctcag tgggttaagg atgcagcatt gctgtgagct gtggtgtagg    4080

tcgcagacga cactcagatc ccacattgct gtcactgtgg cgcaggccgg cctctgtagc    4140

tctgattcga ctcctagcct gggaacgtcc atatgccaca ggtgaggccc taaaaagaaa    4200

taaataagca agcaagtaag caagcaggca gtttcttggt gccttgtacc cctgtggcct    4260

gtgtggtata caagtaacag ctgatccatg tctcagtcat gtttccccct cagactacct    4320

ttcctgcccc atctctccct ttgacataat tggaaaaaca aattcagaat tttgtcccac    4380

tacctttctt gctagctctg tggccttggg aaagctattt attgcctctg agcctctaat    4440

tttcatctgc accaaggatt aataaaaagg agaggataag atgaattact tatattaata    4500

tttattgaac cagatactgt gctaggcact cttaaataaa ttagcttgag tgatagtcat    4560

agtatcctgg tgagacagat tttttttttc cttttatggt tgcacgtgca acatatggaa    4620

gttcctgggc tggggtcgaa ttggagctgc aggtgcttgc ctatgccaca gccatggcaa    4680

catcatatac aaaccgcacc tgtgacctac accacagatt gcagcaacgc tggatccttc    4740

acccaaggag caaggccagg aatcaaatgt gcatcctcac aaacactatg tccggttttt    4800

aacccgctga gccacaccag gaactccatg gcgagacaga ttttatactc tgtctacaga    4860

agaggaaagt gaagctcaga atggttaggt aggtaacttg gccaagatca aaaaattcaa    4920

agaagatttg gggcaagtgg tgatatcatg gcagcattag aaaaaataaa gaagcatcca    4980

cttgttttcc aacactgaac aactgagatt ttcttactct cacagctttt tccagcttca    5040

tatccaagga cagacgctct gccattttcc catcagacca atatttgctg aacactgcac    5100

ctttactttt aggtccaagt caccaggggt tttcccagtt tgctcctaca gattctgaca    5160

ctatctccac attttttttg cacctttatt ttaaagcatt tttatacctg tcataccttg    5220

ctagataaat gggaaggaat gaatcttccc atttataggt gagaaaattg aggttcaaag    5280

tgactcacca aaagtcatat agcatcactc ctcaacagga ggacagcagt ccccaccaga    5340

gggtaacatg tccatggagc ctagtggaca catttttcta actgactggg aagcagcaga    5400

gtggtattgt gaagggggaa tcataggtat atcaaacaga cttaggttct gatccgagct    5460

attctgcttg caaacaacca tagttcaatt taaaaaaaaa aaagaaagaa agaaagaaag    5520

aaaggagccc ccatcctggt gcagtggaaa caaattcaac taggaactgt gaggttgtgg    5580

gttcgatccc tggccttgct cagtgggtta aggatctggc gttgccatga gccgtggtgt    5640

aggttgcaga ctcaactcag atctggcgtt gctgtgactg tggctgtgat gtaggctggc    5700

agctgtaact ccggttagac cccagcctgg gaacctccat atgcaacctc catatgcggt    5760

gggtgtggcc ctaaaaagaa aaaaaaaaaa aaaagaggaa ttcccttatg gctcagcagg    5820

ttaaggatct ggtattgtca ctgctgtggc tctagttaca gccatagtgc aggttcaatc    5880

cctggcccag gaacgtctgc atcccacagg tgtggccaaa aaagaaagaa aggaaggagt    5940

tctgttgtgg cacaatagga ttggcaacat cttaggagta ctgggacaca ggttcaatcc    6000

ctggcccagc acagtgggta aggagccagt gttgctggtc aaaaaagaaa agaaaaagta    6060

ccatagttag agtaaatctg ttttaggagc tattctttgg ggcagaacag agagatcagg    6120

agctccttga gagcagaaac ttacctttac atccctcgtg cctagcacgg ttctaggggc    6180

atacctggta tttaataaat atagccaact ggatagggga ttggaaggaa agagcagggg    6240

agggaacttg agtgagttga aaaattgaga atccaaaggg gagacagcct agaaagagta    6300

ggtccaagaa agagatccca ggcatttgtg gccctggttc cctttttcca agccatgagg    6360

aaatcctcag aggaacagag tgctgtggct ttaaatgact tcagcgttgt caatgaatct    6420

gctcggctaa aagagttatc ctcttgctcc ttcgcttgtc ctccccctcc tctcagctcc    6480

ccaaaccctt ctcggctgct gtgatgggat aattagatgc gagagctcag cacagatgat    6540

gctccagttg cctagcaact aatggtttcc atggagaccg caaagcacag cctccagagc    6600

agccagtgag cagctcggca gggcagggag aagacgcaac tctcagctcc tccagaaacc    6660

tggggagggc caggagtggg gaagaagggg gggatcggag ggcttaaagg cacaggcccc    6720

tcttatcctc ttaaaatctg gtcagagctc tgccctcccc tcccctactc tgtcccactc    6780

ataatttcag atggagttgg gggcttagga gtggacccaa cacaacctac cctgcaataa    6840

acccaacctt ctttctgctt ctggtttgtg gctgaaaatg gnaaaagaaa tctcccaagt    6900

gcaagtgtaa acancntcct gggttggcaa tgggatctga agagtactaa gatccctcag    6960

acctggaatt ccaccattta gtctttccct ctctccaaag ttctcaatgt gcaaaagatc    7020

ctctttcagt ttgcagagca atgataggat cttctaaaag gagacaaaag ccaaggtgca    7080

ggaaaaatag aattcagttc ttcacccaaa ggcagcctgt cctgggagac aggggtgaaa    7140

cacttggtcc tgatctccat cagaggatcc agagtgtgtg tgtttgttgc tggggagggg    7200

gacacaatat agagcatctg gtgactcaaa gtatgtgcct cccagagtag catcaatcaa    7260

tgttacctgg aagcttgtta gaaatgcaga atttcaggct tcacctcaga cccactgaat    7320

cagaaactgc atcttaacaa gatccctcat gattcatacg cacattaaat ttggagaagc    7380

gctgacctga gaccctcctc ctctctgctt gggcccatag ttctaccttt attgtcacct    7440

cgtctcacct cgtgctcata ccccaggctt tgagcctacc cttcccccca tggggaaagg    7500

acacaaggcc accagcccct cacttcccta ccaggaccct ggccctcctc tgggactgga    7560

gaaggacaaa gaggaccccc tctgtggagg tctacgacct ctcctgacca agtagtccac    7620

tcaccacaag tggctctacc tctctgagtc tcagtttcca catccacaaa aggtggccaa    7680

tgctatctgc cacccagaat ggctgtgagg gtggagcagg caaagcctct gtgccatcag    7740

agaaattgtg tctctttttc attttctccc agtgggtttc tttctcgtct ttattctttt    7800

tttttttttt ttttcctgtc tgttgtattt ttagggccgt gcctgtggca tacggaagtt    7860

cccagggtag gggtccaatg ggagctgtag ccccgggcct acgccacagc cacagcaatg    7920

tgggatctga gccacgtctg caacctacac cacagctcac ggcaacacca gatccttaac    7980

ccactgagca aggccaggga tcgagcccac gtcctcatgg atgctagttg ggttcgttaa    8040

ccgctgagcc atgatgataa ctcctctttc tattctttag tcacaaacag tcaacaaagg    8100

ttgctgacca aggctgatcg tgcccacccc ccagcccccc agactgggcc agtgcccacc    8160

ccttgggtct ctctggaaat cctgcccagc atcaattggc tccactctcc aggaggatgg    8220

gaagccctgt ggcccctggg actcacaccc ctctgcatct cccagagtgc aggacctggt    8280

cttcaggaga caccaagaac tggctccccc ggctctgctg cccccacccc ctactaccag    8340

tttctctccc attcctgccc agtccaggcc ccctggggtt actctcctct ctctgtacac    8400

cagtgcaacc tcagaacctg cttccctcct gggaacaccc actaccacgt gggagaaggg    8460

gtcgtctagg ggttgggccc cagatacact tgtaagcagg aacacacgag cccttacatg    8520

tgggtgtccc ggaagaaggg ggttttccac cccccgcttt agtcaccctg cccctctgca    8580

gctgcctgag ccaccaagac ccagccaagg tctcctgcct tctggcctga gggccagctc    8640

cccatcctga aaaacctgtc tgggggcctc ccctgaggct gtagggccca aggcctcccc    8700

tgaggctgta gggcccaagg ggcaggttga acaggattcc cctctggccc ctcctacccc    8760

caggacaaaa ccagagcccc aggacagggc ctcacttgcc tcaggaaacc acagcttgcc    8820

agcacccagc ccagcaccag cccagct                                        8847

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增猪uroplakin II基因的正向引物

<400>2

gatcctgatt ctgctggctb                                               20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增猪uroplakin II基因的正向引物

<400>3

atggtggtca tcacrgtgct                                               20

<210>4

<211>3602

<212>DNA

<213>人类

<300>

<301>Lin，F.K.

Suggs，S.

Lin，C.H.

Browne，J.K.

Sma11ing，R.

Egrie，J.C.

Chen，K.K.

Fox，G.M.

Martin，F.

Stabinaky，z.

<302>人红细胞生成素的克隆和表达

<303>Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

<304>82

<305>22

<306>7580-7584

<313>1-3602

<400>4

aagcttctgg gcttccagac ccagctactt tgcggaactc agcaacccag gcatctctga    60

gtctccgccc aagaccggga tgccccccag gggaggtgtc cgggagccca gcctttccca    120

gatagcacgc tccgccagtc ccaagggtgc gcaaccggct gcactcccct cccgcgaccc    180

agggcccggg agcagccccc atgacccaca cgcacgtctg cagcagcccc gctcacgccc    240

cggcgagcct caacccaggc gtcctgcccc tgctctgacc ccgggtggcc cctacccctg    300

gcgacccctc acgcacacag cctctccccc acccccaccc gcgcacgcac acatgcagat    360

aacagccccg acccccggcc agagccgcag agtccctggg ccaccccggc cgctcgctgc    420

gctgcgccgc accgcgctgt cctcccggag ccggaccggg gccaccgcgc ccgctctgct    480

ccgacaccgc gccccctgga cagccgccct ctcctctagg cccgtggggc tggccctgca    540

ccgccgagct tcccgggatg agggcccccg gtgtggtcac ccggcgcgcc ccaggtcgct    600

gagggacccc ggccaggcgc ggagatgggg gtgcacggtg agtactcgcg ggctgggcgc    660

tcccgccgcc cgggtccctg tttgagcggg gatttagcgc cccggctatt ggccaggagg    720

tggctgggtt caaggaccgg cgacttgtca aggaccccgg aagggggagg ggggtggggc    780

agcctccacg tgccagcggg gacttggggg agtccttggg gatggcaaaa acctgacctg    840

tgaaggggac acagtttggg ggttgagggg aagaaggttt gggggttctg ctgtgccagt    900

ggagaggaag ctgataagct gataacctgg gcgctggagc caccacttat ctgccagagg    960

ggaagcctct gtcacaccag gattgaagtt tggccggaga agtggatgct ggtagctggg    1020

ggtggggtgt gcacacggca gcaggattga atgaaggcca gggaggcagc acctgagtgc    1080

ttgcatggtt ggggacagga aggacgagct ggggcagaga cgtggggatg aaggaagctg    1140

tccttccaca gccacccttc tccctccccg cctgactctc agcctggcta tctgttctag    1200

aatgtcctgc ctggctgtgg cttctcctgt ccctgctgtc gctccctctg ggcctcccag    1260

tcctgggcgc cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt cctggagagg tacctcttgg    1320

aggccaagga ggccgagaat atcacggtga gaccccttcc ccagcacatt ccacagaact    1380

cacgctcagg gcttcaggga actcctccca gatccaggaa cctggcactt ggtttggggt    1440

ggagttggga agctagacac tgccccccta cataagaata agtctggtgg ccccaaacca    1500

tacctggaaa ctaggcaagg agcaaagcca gcagatccta cggcctgtgg gccagggcca    1560

gagccttcag ggacccttga ctccccgggc tgtgtgcatt tcagacgggc tgtgctgaac    1620

actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc cagacaccaa agttaatttc tatgcctgga    1680

agaggatgga ggtgagttcc tttttttttt tttttccttt cttttggaga atctcatttg    1740

cgagcctgat tttggatgaa agggagaatg atcgggggaa aggtaaaatg gagcagcaga    1800

gatgaggctg cctgggcgca gaggctcacg tctataatcc caggctgaga tggccgagat    1860

gggagaattg cttgagccct ggagtttcag accaacctag gcagcatagt gagatccccc    1920

atctctacaa acatttaaaa aaattagtca ggtgaagtgg tgcatggtgg tagtcccaga    1980

tatttggaag gctgaggcgg gaggatcgct tgagcccagg aatttgaggc tgcagtgagc    2040

tgtgatcaca ccactgcact ccagcctcag tgacagagtg aggccctgtc tcaaaaaaga    2100

aaagaaaaaa gaaaaataat gagggctgta tggaatacat tcattattca ttcactcact    2160

cactcactca ttcattcatt cattcattca acaagtctta ttgcatacct tctgtttgct    2220

cagcttggtg cttggggctg ctgaggggca ggagggagag ggtgacatgg gtcagctgac    2280

tcccagagtc cactccctgt aggtcgggca gcaggccgta gaagtctggc agggcctggc    2340

cctgctgtcg gaagctgtcc tgcggggcca ggccctgttg gtcaactctt cccagccgtg    2400

ggagcccctg cagctgcatg tggataaagc cgtcagtggc cttcgcagcc tcaccactct    2460

gcttcgggct ctgggagccc aggtgagtag gagcggacac ttctgcttgc cctttctgta    2520

agaaggggag aagggtcttg ctaaggagta caggaactgt ccgtattcct tccctttctg    2580

tggcactgca gcgacctcct gttttctcct tggcagaagg aagccatctc ccctccagat    2640

gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc actgctgaca ctttccgcaa actcttccga    2700

gtctactcca atttcctccg gggaaagctg aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca    2760

ggggacagat gaccaggtgt gtccacctgg gcatatccac cacctccctc accaacattg    2820

cttgtgccac accctccccc gccactcctg aaccccgtcg aggggctctc agctcagcgc    2880

cagcctgtcc catggacact ccagtgccag caatgacatc tcaggggcca gaggaactgt    2940

ccagagagca actctgagat ctaaggatgt cacagggcca acttgagggc ccagagcagg    3000

aagcattcag agagcagctt taaactcagg gacagagcca tgctgggaag acgcctgagc    3060

tcactcggca ccctgcaaaa tttgatgcca ggacacgctt tggaggcgat ttacctgttt    3120

tcgcacctac catcagggac aggatgacct ggagaactta ggtggcaagc tgtgacttct    3180

ccaggtctca cgggcatggg cactcccttg gtggcaagag cccccttgac accggggtgg    3240

tgggaaccat gaagacagga tgggggctgg cctctggctc tcatggggtc caagttttgt    3300

gtattcttca acctcattga caagaactga aaccaccaat atgactcttg gcttttctgt    3360

tttctgggaa cctccaaatc ccctggctct gtcccactcc tggcagcagt gcagcaggtc    3420

caggtccggg aaatgagggg tggagggggc tgggccctac gtgctgtctc acacagcctg    3480

tctgacctct cgacctaccg gcctaggcca caagctctgc ctacgctggt caataaggtg    3540

tctccattca aggcctcacc gcagtaaggc agctgccaac cctgcccagg gcaaggctgc    3600

ag                                                                   3602

<210>5

<211>1916

<212>DNA

<213>红原鸡

<220>

<22b>misc_信号

<222>(1)..(1916)

<223>β-珠蛋白绝缘子

<400>5

gcggccgcgc gcgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt    60

atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct    120

tcaataatat tgaaaaagga agagtcctga ggcggaaaga accagctgtg gaatgtgtgt    180

cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat    240

ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg    300

caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg    360

cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt    420

tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt    480

tttggaggcc taggcttttg caaagatcga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat    540

gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg    600

ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc    660

gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca    720

agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct    780

cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga    840

tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg    900

gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat    960

cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga    1020

gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg    1080

cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg    1140

ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat    1200

agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct    1260

cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc gcagcgcatc gccttctatc gccttcttga    1320

cgagttcttc tgagcgggac tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac gcccaacctg    1380

ccatcacgag atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt    1440

ttccgggacg ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc    1500

caccctaggg ggaggctaac tgaaacacgg aaggagacaa taccggaagg aacccgcgct    1560

atgacggcaa taaaaagaca gaataaaacg cacggtgttg ggtcgtttgt tcataaacgc    1620

ggggttcggt cccagggctg gcactctgtc gataccccac cgagacccca ttggggccaa    1680

tacgcccgcg tttcttcctt ttccccaccc caccccccaa gttcgggtga aggcccaggg    1740

ctcgcagcca acgtcggggc ggcaggccct gccatagcct caggttactc atatatactt    1800

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat    1860

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc cgatcg        1916

<210>6

<211>2254

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆载体pEGFP-N1，全序列，增强的绿色荧光蛋白(egfp)和新霉素磷酸转移酶基因

<400>6

tcgactctag agggacagcc cccccccaaa gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc    60

cgctaggggc agcagcgagc cgcccggggc tccgctccgg tccggcgctc cccccgcatc    120

cccgagccgg cagcgtgcgg ggacagcccg ggcacgggga aggtggcacg ggatcgcttt    180

cctctgaacg cttctcgctg ctctttgagc ctgcagacac ctggggggat acggggaaaa    240

agctttaggc tgaaagagag atttagaatg acagaatcat agaacggcct gggttgcaaa    300

ggagcacagt gctcatccag atccaacccc ctgctatgtg cagggtcatc aaccagcagc    360

ccaggctgcc cagagccaca tccagcctgg ccttgaatgc ctgcagggat ggggcatcca    420

cagcctcctt gggcaacctg ttcagtgcgt caccaccctc tgggggaaaa actgcctcct    480

catatccaac ccaaacctcc cctgtctcag tgtaaagcca ttcccccttg tcctatcaag    540

ggggagtttg ctgtgacatt gttggtctgg ggtgacacat gtttgccaat tcagtgcatc    600

acggagaggc agatcttggg gataaggaag tgcaggacag catggacgtg ggacatgcag    660

gtgttgaggg ctctgggaca ctctccaagt cacagcgttc agaacagcct taaggataag    720

aagataggat agaaggacaa agagcaagtt aaaacccagc atggagagga gcacaaaaag    780

gccacagaca ctgctggtcc ctgtgtctga gcctgcatgt ttgatggtgt ctggatgcaa    840

gcagaagggg tggaagagct tgcctggaga gatacagctg ggtcagtagg actgggacag    900

gcagctggag aattgccatg tagatgttca tacaatcgtc aaatcatgaa ggctggaaag    960

cctccaagat ccccaagacc aaccccaacc cacccaccgt gcccactggc catgtccctc    1020

agtgccacat ccccacagtt cttcatcacc tccagggacg gtgacccccc cacctccgtg    1080

ggcagctgtg ccactgcagc accgctcttt ggagaaggta aatcttgcta aatccagccc    1140

gaccctcccc tggcacaacg taaggccatt atctctcatc caactccagg acggagtcag    1200

tgaggatggg gctctagagg gacagccccc ccccaaagcc cccagggatg taattacgtc    126O

cctcccccgc taggggcagc agcgagccgc ccggggctcc gctccggtcc ggcgctcccc    1320

ccgcatcccc gagccggcag cgtgcgggga cagcccgggc acggggaagg tggcacggga    1380

tcgctttcct ctgaacgctt ctcgctgctc tttgagcctg cagacacctg gggggatacg    1440

gggaaaaagc tttaggctga aagagagatt tagaatgaca gaatcataga acggcctggg    1500

ttgcaaagga gcacagtgct catccagatc caaccccctg ctatgtgcag ggtcatcaac    1560

cagcagccca ggctgcccag agccacatcc agcctggcct tgaatgcctg cagggatggg    1620

gcatccacag cctccttggg caacctgttc agtgcgtcac caccctctgg gggaaaaact    1680

gcctcctcat atccaaccca aacctcccct gtctcagtgt aaagccattc ccccttgtcc    1740

tatcaagggg gagtttgctg tgacattgtt ggtctggggt gacacatgtt tgccaattca    1800

gtgcatcacg gagaggcaga tcttggggat aaggaagtgc aggacagcat ggacgtggga    1860

catgcaggtg ttgagggctc tgggacactc tccaagtcac agcgttcaga acagccttaa    1920

ggataagaag ataggataga aggacaaaga gcaagttaaa acccagcatg gagaggagca    1980

caaaaaggcc acagacactg ctggtccctg tgtctgagcc tgcatgtttg atggtgtctg    2040

gatgcaagca gaaggggtcc atgtccctca gtgccacatc cccacagttc ttcatcacct    2100

ccagggacgg tgaccccccc acctccgtgg gcagctgtgc cactgcagca ccgctctttg    2160

gagaaggtaa atcttgctaa atccagcccg accctcccct ggcacaacgt aaggccatta    2220

tctctcatcc aactccagga acggagtcag tgag                                2254

<210>7

<211>632

<212>DNA

<213>旱獭乙肝病毒

<220>

<221>misc_信号

<222>(1)..(632)

<223>旱獭肝炎病毒转录后调控元件

<400>7

accaggttct gttcctgtta atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg    60

tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta    120

tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct    180

gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt    240

tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac    300

tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg    360

ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac    420

gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg    480

ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct    540

gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc    600

ctccccgcct gtttcgcctc gggctcctcg ag                                  632

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增新霉素抗性基因的正向引物

<400>8

 gcggccgcgc gcgtcaggtg gcac                                          24

<210>9

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增新霉素抗性基因的反向引物

<400>9

cgatcggacg ctcagtggaa cgaaaactc                                      29

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增鸡B-珠蛋白绝缘子的正向引物

<400>10

tcgactctag agggacag                                                  18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增鸡B-珠蛋白绝缘子的正向引物

<400>11

ctcactgact ccgttcct                                                  18

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增旱獭肝炎病毒转录后调控元件的正向引物

<400>12

accaggttct gttcctgtta atcaacctc                                      29

<210>13

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增旱獭肝炎病毒转录后调控元件的反向引物

<400>13

ctcgaggagc ccgaggcgaa acaggcg                                       27