肝细胞癌相关的蛋白质分子标记异种核糖核蛋白K的筛选及其应用

摘要

本发明公开了一种新的与肝细胞癌相关的蛋白质分子标记异种核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K蛋白)及其在诊断肝细胞癌疾病等方面的用途。与正常肝细胞相比，在肝癌细胞中hnRNP K蛋白的明显高表达，因此可作为检测肝癌的有效标志物。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种肝细胞癌相关的蛋白质分子标记-异种核糖核蛋白K(hnRNP K蛋白)及其用途。

背景技术

肝癌是一种严重危害人类的疾病。西方发达国家肝癌的发病率较低，国际上对肝癌的基础研究仍较为薄弱，而我国是肝癌高发国家，发病率和死亡率呈现上升趋势，且发病年龄构成年轻化，每年用于肝癌治疗的医疗支出大为增加，肝癌成了严重危害我国人民生命财产安全的头号敌人，并且是影响社会经济发展的一个重要因素，加大力度进行我国肝癌的基础研究具有战略意义，而分离和鉴定新的肝癌相关基因是目前肝癌基础研究中的前沿课题。

到目前为止，已有不下20种的基因异常表达被确定与肝癌的发生发展有关，但已确定的肝癌相关基因在肝癌中的异常表达率并不高，肝癌的发病机制至今仍未阐明，肝癌的早期诊断率仍有待提高。此外，传统的肝癌手术加化疗以及近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肝癌患者的生存率，因而寻找新的肝癌相关基因尤其是肝癌高表达基因对于探讨肝癌的发病机制具有重要意义。

异种核糖核蛋白K(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K)的Genebank登录号为gi|13384620，NCBI的登录号为NP_079555。其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中ORF位于210-1604位，编码长度为464个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：2)。hnRNP K是一种RNA、DNA结合蛋白质，包含若干个潜在的磷酸化位点(例如，Ser 302是PKCδ的作用位点(Schullery，D.S.；Ostrowski，J.；Denisenko，O.N.；Stempka，L.；Shnyreva，M.；Suzuki，H.；Gschwendt，M.；Bomsztyk，K.Regulated interaction of protein kinase Cdeltawith the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K protein.J.Biol.Chem.1999，274，15101-15109.))和三个KH结构域，参与序列特异RNA或DNA的结合、转录、翻译、RNA加工、核质运输、信号转导、基因表达调控等重要的生物学过程。hnRNP K与表皮生长因子家族(Epidermal growth factor family，EGFfamily)、非受体酪氨酸激酶pp60(c-src)等均有相互作用关系(Ritchie，S.A.；Pasha，M.K.；Batten，D.J.；Sharma，R.K.；Olson，D.J.；Ross，A.R.；Bonham，K.Identification of the SRC pyrimidine-binding protein(SPy)as hnRNP K；implications in the regulation of SRC1A transcription.Nucleic Acids Res.2003，31，1502-1513；Mandal，M.；Vadlamudi，R.；Nguyen，D.；Wang，R.A.；Costa，L.；Bagheri-Yarmand，R.；Mendelsohn，J.；Kumar，R.Growth factorsregulate heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K expression andfunction.J.Biol.Chem.2001，276，9699-9704；Ostareck-Lederer，A.；Ostareck，D.H.；Cans，C.；Neubauer，G.；Bomsztyk，K.；Superti-Furga，G.；Hentze，M.W.c-Src-mediated phosphorylation of hnRNP K drivestranslational activation of specifically silenced mRNAs.Mol.Cell Biol.2002，22，4535-4543；Bomsztyk，K.；Van，S.，I；Suzuki，H.；Denisenko，O.；Ostrowski，J.Diverse molecular interactions of the hnRNP K protein.FEBSLett.1997，403，113-115；Habelhah，H.；Shah，K.；Huang，L.；Ostareck-Lederer，A.；Burlingame，A.L.；Shokat，K.M.；Hentze，M.W.；Ronai，Z.ERKphosphorylation drives cytoplasmic accumulation of hnRNP-K and inhibitionof mRNA translation.Nat.Cell Biol.2001，3，325-330；Miau，L.H.；Chang，C.J.；Shen，B.J.；Tsai，W.H.；Lee，S.C.Identification ofheterogeneous nuclear ribonucleoprotein K(hnRNP K)as a repressor ofC/EBPbeta-mediated gene activation.J.Biol.Chem.1998，273，10784-10791；Michael，W.M.；Eder，P.S.；Dreyfuss，G.The K nuclear shuttling domain：anovel signal for nuclear import and nuclear export in the hnRNP K protein.EMBO J.1997，16，3587-3598.)。

异种核糖核蛋白K的过表达在乳腺癌breast cancer和结肠癌colon cancer都有报道。但截止目前，还没有异种核糖核蛋白K与肝细胞癌的相关报道。

因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、在肝癌中高表达的人异种核糖核蛋白K(又称为“hnRNP K蛋白”)

本发明的另一目的是提供异种核糖核蛋白K在检测肝细胞癌方面的应用。

在本发明的第一方面，提供一种hnRNP K蛋白或其编码序列的用途，它被用于制备检测肝癌的试剂。

在本发明的第二方面，提供了一种体外确定待测肝细胞中hnRNP K基因表达量是否异常的方法，它包括步骤：

(a)抽提待测肝细胞的mRNA，并反转录为cDNA；

(b)用特异性扩增hnRNP K转录本的引物，以步骤(a)的cDNA为模板，通过定量PCR法扩增获得hnRNP K的扩增产物；

(c)将步骤(b)中待测肝细胞的hnRNP K扩增产物数量与正常肝细胞的hnRNP K扩增产物数量进行比较，高于正常肝细胞的hnRNP K扩增产物数量就表示待测肝细胞中hnRNP K基因表达量存在异常。

在另一优选例中，所述的定量PCR法是定量荧光PCR法。

在本发明的第二方面，提供了一种体外确定待测肝细胞中hnRNP K蛋白表达量是否异常的方法，它包括步骤：

(a)用特异性抗hnRNP K蛋白的抗体检测待测肝细胞中hnRNP K蛋白的数量；

(b)将步骤(a)中待测肝细胞的hnRNP K蛋白数量与正常肝细胞的hnRNP K蛋白数量进行比较，高于正常肝细胞的hnRNP K蛋白数量就表示待测肝细胞中hnRNP K蛋白表达量存在异常。

在另一优选例中，所述的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明的第三方面，提供了一种检测肝癌的试剂盒，它包括：特异性扩增hnRNP K转录本的引物和/或特异性抗hnRNP K的抗体，以及说明书。

在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的剂：

(a)阳性对照；

(b)阴性对照；

(c)特异性结合于hnRNP K的探针。

在本发明的第四方面，提供了一种hnRNP K蛋白或其转录本的用途，它被用作检测肝癌的标记物。

在本发明的第五方面，提供了一种抗hnRNP K的抗体的用途，它被用于制备检测肝癌的试剂或用于制备治疗肝癌的药物。

在本发明的第六方面，提供了一种检测肝癌或肝癌易感性的方法，包括步骤：

(a)用特异性扩增hnRNP K转录本的引物，以待检测个体肝细胞的cDNA为模板，通过定量PCR法扩增获得hnRNP K的扩增产物，检测形成的扩增产物数目是否高于正常对照；或者在适合形成抗体复合物的条件下，将特异性抗hnRNPK蛋白的抗体与待测个体的样品进行接触，并检测形成的抗体复合物数量是否高于正常对照；

(b)形成的扩增产物数目或抗体复合物数量是否高于正常对照，就表示该个体患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示异种核糖核蛋白K(hnRNP K)(点SSP 3709、3729)在肝细胞癌患者的癌组织中表达明显上调。

图2显示了对hnRNP K的免疫印迹分析结果。

具体实施方式

本发明人用非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)制备的肝细胞癌的癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以常规双向凝胶电泳技术筛选的差异表达蛋白质点并质谱鉴定。结果发现异种核糖核蛋白K(hnRNP K)在肝细胞癌癌组织中高表达。免疫印迹实验进一步证实异种核糖核蛋白K的确在肝细胞癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。用精细的激光捕获显微切割技术(laser-capturemicrodissection，LCM)制备的肝细胞癌癌组织与癌旁组织的肝实质细胞蛋白质样品，用同位素代码亲和标签技术(isotope-coded affinity tagging，ICAT)也进一步确认了hnRNP K的差异表达。在此基础上完成了本发明。

定义

如本文所用，“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。除非另外说明该术语已包括能够与天然核苷酸类似方式发挥作用的天然核苷酸的类似物。

“杂交”指通过互补碱基的配对而使两个单链核酸结合在一起。

“基本结合于”或“特异结合”或“选择性结合”或“特异性杂交于”，指在寡核苷酸和靶序列之间的互补杂交反应，并可包括微小的错配，这些错配可通过降低杂交介质的严紧度来实现检测所需靶多核苷酸序列。该术语还指在严紧条件下，一分子结合、复合或杂交于特定核苷酸序列，当该序列存在于复合的混合物中(如总细胞NDA或RNA)时。术语“严紧条件”指探针杂交于靶定亚序列而不杂交于其他序列的条件。严紧条件是依赖于序列的，并且在不同情况下是不同的。较长的序列可在更高的温度下特异性杂交。通常，选定的严紧条件是比在限定的离子强度和pH下推定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。该Tm是在达到平衡时，有约50％与靶序列互补的探针与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。通常，对于短探针而言，严紧条件是这样的条件，其中盐浓度至少约0.02Na离子浓度(或其他盐)，pH7.0-8.3，且温度至少约60℃。严紧条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。

本领域的技术人员会理解，此处所述的具体引物和探针的确切序列可以被一定程度地修改(修饰)，以产生与所公开的引物或探针“基本相同”但保留基本结合于靶序列的能力。

hnRNP K蛋白和基因

基于本发明所揭示的hnRNP K与肝癌的相关性以及hnRNP K的序列信息，本领域技术人员可利用本领域的常规技术来产生hnRNP K基因、蛋白或其片段。

在本发明中，术语“异种核糖核蛋白K”、“hnRNP K蛋白”、“hnRNP K多肽”、“肝癌高表达蛋白hnRNP K”或“本发明蛋白”等可互换使用，都指具有人或其他哺乳动物的异种核糖核蛋白K(Genebank登录号为gi|13384620，NCBI的登录号为NP_079555)，它是一种高度保守的可溶性胞浆磷蛋白，主要存在于胞核内，可在核质间穿梭。一种特别优选的异种核糖核蛋白K是人的hnRNPK，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，ORF位于第210-1604位。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的hnRNP K蛋白或多肽”是指hnRNP K多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化hnRNP K蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明还包括人hnRNP K蛋白的片段、衍生物和类似物。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人hnRNP K多肽”指具有人hnRNP K蛋白活性的SEQ IDNO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人hnRNP K蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人hnRNP K蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人hnRNP K DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人hnRNP K多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人hnRNP K多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人hnRNP K多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人hnRNPK多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“人hnRNP K蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码hnRNP K蛋白的多聚核苷酸。

本发明的人hnRNP K核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的hnRNP K多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人hnRNP K多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

用于重组表达本发明蛋白的载体、宿主细胞、以及培养和分离技术等都是本领域技术人员熟知的。

抗hnRNP K蛋白的抗体

另一方面，本发明还包括对人hnRNP K DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人hnRNP K基因产物或片段。较佳地，指那些能与人hnRNP K基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人hnRNP K蛋白的分子，也包括那些并不影响人hnRNP K蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人hnRNP K基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人hnRNP K基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人hnRNP K蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人hnRNP K蛋白功能的抗体以及不影响人hnRNP K蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人hnRNP K基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人hnRNP K基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人hnRNP K蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人hnRNP K蛋白。此外，与人hnRNP K蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于检测与人hnRNP K蛋白相关的疾病，如肝癌。抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人hnRNP K蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人hnRNP K蛋白阳性的细胞(例如肝癌细胞等)。由于本发明的hnRNP K蛋白在肝癌细胞中是特异性高表达的，这种杂交抗体可用于定向地杀灭肝癌细胞。

多克隆抗体的生产可用人hnRNP K蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

药物组合物

本发明蛋白的拮抗剂(如抗体)，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供治疗的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明多肽的拮抗剂可用于肿瘤尤其是肝癌方面的治疗。在使用本发明hnRNP K蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α)、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的(如0.01-99wt％)本发明hnRNP K多肽的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的hnRNP K蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人hnRNP K蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于hnRNP K蛋白的表达异常的hnRNP K蛋白的表达所致的或所代表的细胞增殖、发育或代谢异常(如肝癌)。

抑制人hnRNP K mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如周相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

检测方法

本发明还涉及定量和定位检测人hnRNP K蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人hnRNPK蛋白水平，可以用作确定被检测个体患有肝癌或肝癌易感性的机率是否高于正常人群的指标之一。

一种检测检测样品中是否存在hnRNP K蛋白的方法是利用hnRNP K蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与hnRNP K蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在hnRNP K蛋白。

hnRNP K蛋白的多聚核苷酸可用于hnRNP K基因相关疾病的诊断。在诊断方面，hnRNP K蛋白的多聚核苷酸可用于检测hnRNP K基因的表达是否高于正常人群。相关技术包括定量PCR法(如荧光定量PCR)等，这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。

用hnRNP K蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测hnRNP K蛋白的转录产物。

由于hnRNP K在肝癌中的很高表达率，明显高于目前用于肝癌诊断的AFP(其检出率约50-60％)，因此hnRNP K多核苷酸、hnRNP K蛋白及其抗体，以及hnRNPK蛋白相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗包括肝癌等多种疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

试剂盒

本发明还提供了诊断hnRNP K表达是否异常的诊断试剂盒。在优选例中，一种试剂盒包括特异性扩增hnRNP K转录本的引物和/或特异性抗hnRNP K的抗体。试剂盒还可含有描述如何使用试剂盒来检测hnRNP K的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种：用于协助检测的各种标记物或标记试剂；用于PCR的试剂(包括缓冲液)；用于免疫杂交的试剂；以及阳性和阴性对照等。

应理解，在本发明首次揭示了hnRNP K基因的表达异常与肝癌的相关性之后，本领域技术人员可以方便地设计出可特异性扩增出hnRNP K的引物，然后通过定量检测等方法确定其表达量。通常，引物的长度为15-50bp，较佳地为20-30bp。虽然引物与模板序列完全互补是优选的，但是本领域技术人员知道，在引物与模板存在一定的不互补(尤其是引物的5′端)的情况下，也能够特异性地扩增(即仅扩增出所需的片段)。含有这些引物的试剂盒和使用这些引物的方法都在本发明范围之内，只要该引物扩增出的扩增产物含有hnRNP K的全长或部分序列。一种优选的引物对具有SEQ ID NO：3和4的序列。

虽然扩增产物的长度没有特别限制，但是通常扩增产物的长度为100-3000bp，较佳地为150-2000bp，更佳地为200-1000bp。这些扩增产物都应含有对应于SEQ ID NO：1的序列。

与现行用于肝癌临床诊断和预后的其他方法比较，本发明的优越性主要表现在：鉴于hnRNP K与肝癌的密切相关性(在90％以上(在60例检测的肝癌病例中有55例)的肝癌病例中有高表达，肝癌细胞中的表达量∶正常肝细胞中的表达量＞2.5∶1)，本发明方法在检出的灵敏度，准确性都显著优于现有的肝癌基因诊断方法，不仅填补了检测的盲区，而且操作简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

材料

1.肝细胞癌标本：

11例肝细胞癌标本(10例用于非酶解样品制备，1例用于激光捕获显微切割)来自东方肝胆外科医院，由2个病理科医生明确为肝细胞癌。均为男性，平均年龄47.5岁(31-56岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，11例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的9例(81.8％)；10例肿瘤大于5cm。11例肝细胞癌标本的病理资料详见表1。

                 表1.11例肝细胞癌标本的病理资料。

   No.   性别   年龄   HBV   HCV 等级 (TNM分级)   AFP   肿瘤大小  f31  男性  56  +  - III  ＞1000  7×6  f32  男性  51  +  - III  ＞1000  14×12×12  f33  男性  50  +  - III  ＞1000  5×6  f39  男性  55  +  - III  ＞1000  5×5.5  327  男性  44  +  - III  ＞1000  8×8×7  328  男性  45  +  - III  ＞1000  7.5×6  415  男性  40  +  - III  ＞1000  10×8×6  418  男性  31  +  - III  3.7  8×5×8  422  男性  57  +  - III  ＞1000  3.5×4  429  男性  44  +  - III  ＞1000  7.2×6  H38  男性  50  +  - III  7.3  15×13×10.5

2.主要试剂和仪器：

尿素、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)购自Sigma公司；碘乙酰胺(IAA)、丙烯酰胺、N，N-甲叉双丙烯酰胺等购自Fluka公司。

过硫酸胺、TEMED、Tri-n-butylphosphat(TBP)、Bio-Rad Protean II电泳设备(180×3×0.5mm strips)、PDQuest软件等为Bio-Rad产品。

LOQ^TM Deca XP system和ProteomeX^TM Workstation购自Thermo Finnigan公司。

非线性固相pH梯度预制胶条(IPG dry strips，pH3-10NL，130×3×0.5mm或180×3×0.5mm)、IPGphore等电聚焦系统(Amersham Pharmacia Biotech)、Amersham Pharmacia Ettan Dalt II systems等为Amersham Bioscience公司产品。

Reflex^TM III MALDI-TOF质谱为Bruker产品。

Pixcell^TM laser capture microdissection系统购于Arcturus Engineering公司。

Cleavable ICAT轻链及重链试剂、亲和素柱等为Applied Biosystems公司产品。

方法

1.非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)：

手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用预冷的RPMI1640缓冲液洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，细胞沉淀分别溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/LTris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪(Soniprep 150，英国，MSE)冰浴间歇超声2min，15000r/min、4℃离心1h。取上清，改良的Bradford法进行总蛋白质定量，制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的蛋白质样品分装，-80℃保存。NESP法制备了10对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品。

2.双向凝胶电泳：

双向电泳主要按Sanchez等人的改进方法(Sanchez，J.C.；Rouge，V.；Pisteur，M.；Ravier，F.；Tonella，L.；Moosmayer，M.；Wilkins，M.R.；Hochstrasser，D.F.Improved and simplified in-gel sample application usingreswelling of dry immobilized pH gradients.Electrophoresis 1997，18，324-327.)进行。方法如下：

60μg蛋白质样品与重泡涨液(8mol/L尿素、2％ CHAPS、0.5％ IPG缓冲液、18mmol/L DTTh和痕量溴酚蓝)混合，总体积250μl或350μl，使用130×3×0.5mm或180×3×0.5mm pH3-10NL胶条，在IPGphore等电聚焦系统上进行一向分离，总电压小时约为80000Vhrs。等电聚焦后胶条依次在平衡液I(6M Urea、30％G1ycerol、2％ SDS、1％ DTT)和平衡液II(平衡液I中DTT以2.5％ IAA代替)平衡，每次15min。胶条转移至SDS-PAGE系统(12％)，电泳条件为15mA/胶30min，然后30mA/胶保持至溴酚蓝离胶下缘0.5cm。制备型电泳，上样量为1.5mg，总Vhrs约为90000，采用可与质谱兼容的考玛斯亮蓝法检测，其它与分析型电泳方法相同。

3.图谱分析：

银染后胶以GS-710图像扫描仪(Bio-Rad)透射模式扫描，分辨率84.7μm/pixel。点的检测和匹配用PDQuest软件(Version 7.0，Bio-Rad)分析。蛋白质点的等电点pI和分子量M_r以2DE标准蛋白质(Bio-Rad)的作为Marker，输入软件用于分析其它蛋白的pI和M_r。

4.胶内酶解与质谱鉴定：

蛋白质点由质谱兼容的考染胶上手工切取，在100mM NH₄HCO₃，30％ ACN中脱色，真空冷冻干燥，5μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH8.3，蛋白质∶胰蛋白酶＝1∶5，W/W)中4℃放置2hr，加入20μl 50mmol/L NH₄HCO₃(pH8.3)，37℃酶解过夜。抽提蛋白(60％ ACN、0.1％ TFA)，真空冷冻干燥。LOQ^TM DecaXP系统(Thermo Finnigan)鉴定酶解好的样品，Bioworks软件进行数据库搜索。

或者，取0.5μL酶解好并复溶的样品与HCCA matrix(sigma，St.Louis，MO)混合，Bruker REFLEX III MALDI-TOF质谱(Bruker-Franzen Analytik，Bremen，German)分析，用Mascot(http://www.matrixscience.com，MatrixSicence Ltd，UK)软件分析确定蛋白质序列。

5.免疫印迹：

各取20μg蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自AmershamBiosciences公司)上，一抗使用羊抗人hnRNP K多抗(购自Santa Cruz公司，1∶1000)，二抗为猴子抗羊抗体(购自Santa Cruz公司，1∶10000)，ECLplus(Amersham Biosciences)试剂检测。

6.激光捕获显微切割技术(Laser Capture Microdissection，LCM)：

采用Emmert-Buck，M.R.；Bonner，R.F.；Smith，P.D.；Chuaqui，R.F.；Zhuang，Z.；Goldstein，S.R.；Weiss，R.A.；Liotta，L.A.Laser capturemicrodissection.Science 1996，274，998-1001；和Bonner，R.F.；Emmert-Buck，M.；Cole，K.；Pohida，T.；Chuaqui，R.；Goldstein，S.；Liotta，L.A.Lasercapture microdissection：molecular analysis of tissue.Science 1997，278，1481-1483中所述的方法。具体过程如下：

手术切除的新鲜组织块制成8μm冰冻组织切片，经甲苯胺兰染色，风干，用PixCell^TM Laser Capture Microdissection系统(Arcturus Engineering，Mountain View，CA)进行显微切割，使用直径7.5μm、70mW、持续2-3mS激光脉冲参数，切取约50,000个肝细胞癌癌组织细胞或相应癌旁组织细胞，搜集在微切割帽中并储存在-80℃，分别溶于适量裂解液(8mol/L尿素、4％ CHAPS、40mmol/L Tris和65mmmol/L DTT)中，超声细胞破碎仪冰浴间歇超声2min，15000r/min、4℃离心1h。取上清，以改良的Bradford法进行总蛋白质定量。制备好的肝细胞癌癌组织及相应癌旁组织的肝实质细胞蛋白质样品分装，-80℃保存。LCM技术制备了1对肝细胞癌癌组织及癌旁组织蛋白质样品(病例编号H38)。

7.同位素代码亲和标签技术(isotope-coded affinity tagging，ICAT)与质谱鉴定：

采用Li，J.；Steen，H.；Gygi，S.P.Protein profiling with cleavableisotope coded affinity tag(cICAT)reagents：The yeast salinity stressresponse.Mol.Cell Proteomics.2003和Gygi，S.P.；Rist，B.；Gerber，S.A.；Turecek，F.；Gelb，M.H.；Aebersold，R.Quantitative analysis of complexprotein mixtures using isotope-coded affinity tags.Nat.Biotechnol.1999，17，994-999中所述的方法。具体过程如下：

激光捕获显微切割技术制备的肝细胞癌癌组织与相应癌旁组织蛋白质样品分别取100μg，先用TBP还原蛋白质，而后分别用cleavable ICAT试剂(C₁₂和C₁₃)标记，混合后，胰蛋白酶酶解16-20小时。酶解后的肽段混合物经Avidin亲和柱纯化出已标记肽段后，再用LOQ^TM ProteomeX^TM Workstation进行2D-LC-MS/MS质谱鉴定，Bioworks软件进行数据库搜索和x-press数值计算。

结果

1.癌组织与相应癌旁组织的2DE-PAGE差别蛋白质表达谱的建立和hnRNP K的差异分析：

本实施例以非酶解样品制备法共制备10对肝细胞癌患者的癌组织与相应癌旁组织的蛋白质样品，共得到2-DE图谱40余幅，其中5对样品重复3次PDQuest软件进行了癌组织与癌旁组织的蛋白质差别表达谱分析(分析结果见表2)。

表2.PDQuest软件分析结果。

  样品名  称   匹配点  统计分析  (t测试，  p＜0.05)    定量分析   定性分析              相关系数  在T中  更多 在N中 更多  仅在  T中  仅在  N中   T-T或N-N   T-N   3  27   1283   230   35  54   16   22  r[0.82718-  0.86666]  r[0.69826-  0.76055]   3  28   1316   97   24  9   9   6  r[0.75556-  0.84765]  r[0.63577-  0.73870]   4  15   1121   393   51  56   48   75  r[0.82165-  0.85401]  r[0.66092-  0.72361]   4  18   1125   362   41  74   46   57  r[0.827149-  0.863555]  r[0.673221-  0.729310]   4  29   1213   264   67  46   44   95  r[0.79004-  0.86468]  r[0.60064-  0.68952]

在T中更多＝在肝癌组织中表达上调的蛋白质点

在N中更多＝在肝癌组织中表达下调的蛋白质点

仅在T中＝仅在肝癌组织中检测到的蛋白质点

仅在N中＝仅在非肝癌组织中检测到的蛋白质点

T-T＝肿瘤之间的相关系数。

N-N＝成对的非肿瘤之间相关系数。

T-N＝肿瘤组织和成对的非肿瘤组织之间的相关系数

应用制备型电泳、胶内酶解技术、MALDI-TOF-MS和1D-LC-MS/MS技术已经鉴别出116个差别点，对应102种差别表达的蛋白质。其中，肝细胞癌癌组织高表达或仅在其中表达的为61个差别点，对应54种蛋白质；肝细胞癌癌旁组织高表达或仅在其中表达的为55个差别点，对应48种蛋白质。其中，点SSP 3709和SSP 3729(图1)在癌组织中表达上调，经切点、胶内酶解，点SSP 3729用1D-LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得9个肽段与hnRNP K相符，氨基酸覆盖率为24.62％。点SSP 3709用MALDI-TOF质谱鉴定，数据库搜索6个肽段与hnRNP K相符，得分值为64，蛋白覆盖率为18％；用1D-LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得20个肽段与hnRNP K相符，氨基酸覆盖率为44.49％。并且，hnRNP K在癌组织中的上调表达在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中得到良好的重复(SSP 3709为50％，SSP 3709为80％)。

2.hnRNP K差异表达的免疫印迹验证：

为确认hnRNP K在双向凝胶电泳中的差异表达，对肝细胞癌患者的癌组织及相应癌旁组织蛋白质样品(NESP法制备)，用购买的抗hnRNP K抗体(购自SantaCruz公司)进行免疫印迹分析，结果与双向凝胶电泳结果一致(图2)。

3.LCM技术与ICAT技术的联用进一步验证hnRNP K的差异表达：

激光捕获显微切割技术制备的肝细胞癌癌组织与相应癌旁组织蛋白质样品(病例编号H38)分别取100μg，分别用cleavable ICAT试剂(C₁₂和C₁₃)标记，混合后胰蛋白酶酶解、亲和素亲和柱纯化、质谱鉴定、Bioworks软件进行数据库搜索和x-press数值计算。经一次实验(test 903)获得283种有定量信息的蛋白质，其中包括了hnRNP K的定量信息(癌组织∶癌旁组织＝1.80∶1)，与双向凝胶电泳中hnRNP K在癌组织中表达上调的结果一致。

讨论

本实施例所用癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肝细胞癌患者的成对样品，所有11例肝细胞癌病例有极相似的病例诊断指标：均为男性，平均年龄47.5岁(31-56岁)，血清检测hepatitis B病毒感染阳性，11例(100％)属TNM分级III级。其中，AFP高于25μg/L的9例(81.8％)；10例肿瘤大于5cm。这种取样方法有利于降低个体间差别对实验分析工作的影响。本实施例运用双向凝胶电泳技术结合质谱鉴定检测肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织在蛋白质表达方面的整体差异。

在pH 3-10胶条上，银染条件下两类组织样品均显示约1200个银染点。癌组织间银染点匹配率为O.75-0.86，癌组织与癌旁组织间银染点匹配率为0.60-0.76，一定程度上说明两类组织样品取样方法的科学性。PDQuest软件分析和质谱鉴定已得到多个差异表达蛋白质。

在已鉴定差异表达蛋白中，hnRNP K在癌组织的上调表达在不同肝细胞癌患者的癌组织与癌旁组织的2-DE图谱中得到良好的重复(SSP 3729为50％，SSP 3709为80％)。hnRNP K的过表达在乳腺癌和结肠癌中都有报道，但截止目前，还没有hnRNP K与肝细胞癌的相关报道。本实施例提示hnRNP K是肝细胞癌中重要的肿瘤相关蛋白质。另外，2-DE胶上检测到的是两个平行的点(SSP 3709和SSP3729)，均为hnRNP K，提示hnRNP K不同形式的磷酸化修饰也是重要的变化指标。

本实施例中在双向凝胶电泳后，应用常规的免疫印迹检测了癌组织与癌旁组织两类组织样品中hnRNP K的表达情况，结果与双向凝胶电泳一致，差异表达得到了验证。

LCM技术可以很好的解决组织样品制备中异质性与异污染性两大难题，可以对癌组织细胞或癌旁组织细胞等单一类型细胞实施精确的显微捕获，从而实现对癌组织和癌旁组织蛋白质样品的精确制备。ICAT技术可以提供蛋白质在不同样品间整体水平上的定量关系，结合LCM技术和2D-LC-MS/MS质谱检测技术就可同时实现精细化、规模化和定量化。而2-DE胶有时会将一种蛋白质分在不同的位置，例如，本实施例中2-DE胶上检测到的就是两个平行的hnRNP K蛋白质点-SSP 3709和SSP 3729。本实施例中以LCM技术特异分离肝实质细胞进一步证实了2DE结果中hnRNPK的差异表达，表明在全组织样品中得到的hnRNPK的差异表达至少部分是由肝实质细胞的表达差异引起的，这为后期从细胞水平探讨肝细胞差异表达hnRNPK的意义和价值奠定了基础。

已有研究表明，hnRNP K的302位Ser的磷酸化受PKCδ的调节，有着重要的生物学功能，hnRNP K还包括若干潜在的磷酸化位点，而且hnRNP K参与多种重要的生物学过程，广泛参与基因转录翻译的调控，其在肝细胞癌的差异表达可能对癌变的发生和发展起一定作用，因为肝癌和其它肿瘤一样，是多基因多步骤的过程。另外，一种含RNA结合Motif的胞浆蛋白质-p62蛋白，含有四个hnRNP K同源结构域(KH结构域)，有文献报道它是肝细胞癌的一种自身抗原(Autoantigen)(Zhang，J.Y.；Chan，E.K.；Peng，X.X.；Tan，E.M.A novelcytoplasmic protein with RNA-binding motifs is an autoantigen in humanhepatocellular carcinoma.J.Exp.Med. 1999，189，1101-1110.)。虽然有关异种核糖核蛋白K(hnRNP K)不同形式磷酸化修饰的细节问题、动态的生物学功能及肿瘤相关机制还有待进一步研究，但是将其作为检测肝癌或肝癌易感性的标记物却是肯定的。

本实施例表明hnRNP K可作为肝细胞癌的潜在标志，而其在胞内的生物学功能提示hnRNP K可能作为肝癌的预后分子标记和临床治疗的靶分子。

实施例2

检测试剂盒的制备

如实施例1所述，hnRNP K蛋白的表达异常与肝癌疾病密切相关。因此，可据此设计HP基因特异性引物在以病人的DNA为模板进行扩增进行检测。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

 名称 序列 浓度 有义引物 SEQ ID NO：3(对应于SEQ ID NO：1中177-196位) 100pmol 反义引物 SEQ ID NO：4(对应于SEQ ID NO：1中2245-2264位) 100pmol PCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

抽取待检测男性病人的肝组织1ml，使用常规方法(或使用特定的试剂盒)从中提取mRNA，并转录为cDNA。将肝癌检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所制备的cDNA为模板与所提供的引物进行定量PCR反应，并与正常对照进行比较，从而确定hnRNP K蛋白的表达量高低。

检测结果，hnRNP K蛋白的表达量高于正常对照(表达量高2.5倍)的检测对象的肝癌易感性高于正常人群。

实施例3

检测试剂盒的制备

在本实施例中，用抗hnRNP K蛋白的抗体制备以下检测试剂盒：

如实施例1所述，hnRNP K蛋白的表达异常与肝癌疾病密切相关。因此，可据此应用商品化或自备的HnRNP K抗体，组织免疫组化方法检测癌组织及癌旁组织的HnRNP K表达。

制备一试剂盒(100人次)，它含有：

  成分 数量  羊抗人hnRNP K多抗(购自Santa Cruz公  司)(置于一容器中) 50微升，浓度为200ug/ml， 使用前作1∶1000稀释

使用时，取临床新鲜肿瘤标本常规制备石蜡切片，经脱蜡，抗原修复处理，HnRNP K抗体(1∶1000)，4℃敷育过夜，Envision法检测阳性信号，镜下计算阳性细胞比例及强度并评分，癌组织评分值大于癌旁2.5倍为有显著差异。

在90％以上(在60例检测的肝癌病例中有55例)的肝癌病例中有高表达，肝癌细胞中的表达量∶正常肝细胞中的表达量＞2.5。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                        序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

第二军医大学东方肝胆外科研究所

<120>肝细胞癌相关的蛋白质分子标记异种核糖核蛋白K的筛选及其应用

<130>041286

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2830

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

agggcgctcc aggcgacagc attgcagacg ccattatcct ctgtttctct gctgcaccga    60

cctcgacgtc ttgcctgtgt cccacttgtt cgcggcctat aggctactgc agcactgggg   120

tgtcagttgt tggtccgacc cagaacgctt cagttctgct ctgcaaggat atataataac   180

tgattggtgt gcccgtttaa taaaagaata tggaaactga acagccagaa gaaaccttcc   240

ctaacactga aaccaatggt gaatttggta aacgccctgc agaagatatg gaagaggaac   300

aagcatttaa aagatctaga aacactgatg agatggttga attacgcatt ctgcttcaga   360

gcaagaatgc tggggcagtg attggaaaag gaggcaagaa tattaaggct ctccgtacag   420

actacaatgc cagtgtttca gtcccagaca gcagtggccc cgagcgcata ttgagtatca   480

gtgctgatat tgaaacaatt ggagaaattc tgaagaaaat catccctacc ttggaagagg   540

gcctgcagtt gccatcaccc actgcaacca gccagctccc gctcgaatct gatgctgtgg   600

aatgcttaaa ttaccaacac tataaaggaa gtgactttga ctgcgagttg aggctgttga   660

ttcatcagag tctagcagga ggaattattg gggtcaaagg tgctaaaatt aaagaacttc   720

gagagaacac tcaaaccacc atcaagcttt tccaggaatg ctgtcctcat tccactgaca   780

gagttgttct tattggagga aaacccgata gggttgtaga gtgcataaag atcatccttg   840

atcttatatc tgagtctccc atcaaaggac gtgcacagcc ttatgatccc aatttttacg   900

atgaaaccta tgattatggt ggttttacaa tgatgtttga tgaccgtcgc ggacgcccag   960

tgggatttcc catgcgggga agaggtggtt ttgacagaat gcctcctggt cggggtgggc  1020

gtcccatgcc tccatctaga agagattatg atgatatgag ccctcgtcga ggaccacctc  1080

cccctcctcc cggacgaggc ggccggggtg gtagcagagc tcggaatctt cctcttcctc  1140

caccaccacc acctagaggg ggagacctca tggcctatga cagaagaggg agacctggag  1200

accgttacga cggcatggtt ggtttcagtg ctgatgaaac ttgggactct gcaatagata  1260

catggagccc atcagaatgg cagatggctt atgaaccaca gggtggctcc ggatatgatt  1320

attcctatgc agggggtcgt ggctcatatg gtgatcttgg tggacctatt attactacac  1380

aagtaactat tcccaaagat ttggctggat ctattattgg caaaggtggt cagcggatta  1440

aacaaatccg tcatgagtcg ggagcttcga tcaaaattga tgagccttta gaaggatccg  1500

aagatcggat cattaccatt acaggaacac aggaccagat acagaatgca cagtatttgc  1560

tgcagaacag tgtgaagcag tatgcagatg ttgaaggatt ctaatgcaag atattttttc  1620

ttttttatag tgtgaagcag tattctggaa agtttttcta agactagtga agaactgaag  1680

gagtcctgca tctttttttt tttatctgct tctgtttaaa aagccaacat tcctctgctt  1740

cataggtgtt ctgcatttga ggtgtagtga aatctttgct gttcaccaga tgtaatgttt  1800

tagttcttac aaacagggtt ggggggggga agggcgtgca aaaactaaca ttgaaatttt  1860

gaaacagcag cagagtgagt ggattttatt tttcgttatt gtggtggttt aaaaaattcc  1920

ccccatgtaa ttattgtgaa caccttgctt tgtggtcact gtaacatttg gggggtgggc  1980

cagggaggaa aagtaacaat agtccacatg tccctggcat ctgttcagag cagtgtgcag  2040

aatgtaatgc tcttttgtaa gaaacgtttt atgattttta aaataaattt agtgaaccta  2100

tttttggtgg tcattttttt tttaagacag tcattttaaa atggtggctg aatttcccaa  2160

cccaccccca aactaaacac taagtttaat tttcagctcc tctgttggac atataagtgc  2220

atctcttgtt ggacataggc aaaataactt ggcaaactta gttctggtga tttcttgatg  2280

gtttggaagt ctattgctgg gaagaaattc catcatacat attcatgctt ataataagct  2340

ggggattttt tgtttgtttt tgcaaatgct tgcccctact tttcaacaat tttctatgtt  2400

agttgtgaag aactaaggtg gggagcagta ctacaagttg agtaatggta tgagtatata  2460

ccagaattct gattggcagc aagtttatta atcagaataa cacttggtta tggaagtgac  2520

taatgctgaa aaaattgatt atttttatta gataatttct cacctataga cttaaactgt  2580

caatttgctc tagtgtctta ttagttaaac tttgtaaaat atatatatac ttgtttttcc  2640

attgtatgca aattgaaaga aaaagatgta ccatttctct gttgtatgtt ggattatgta  2700

ggaatgtttg tgtacaattc aaaaaaaaaa aagatgaaaa aagttcctgt ggatgttttg  2760

tgtagtatct tggcatttgt attgatagtt aaaattcact tccaaataaa taaaacaccc  2820

atgatgctag                                                         2830

<210>2

<211>464

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Glu Thr Glu Gln Pro Glu Glu Thr Phe Pro Asn Thr Glu Thr Asn

1               5                   10                  15

Gly Glu Phe Gly Lys Arg Pro Ala Glu Asp Met Glu Glu Glu Gln Ala

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Ser Arg Asn Thr Asp Glu Met Val Glu Leu Arg Ile Leu

        35                  40                  45

Leu Gln Ser Lys Asn Ala Gly Ala Val Ile Gly Lys Gly Gly Lys Asn

    50                  55                  60

Ile Lys Ala Leu Arg Thr Asp Tyr Asn Ala Ser Val Ser Val Pro Asp

65                  70                  75                  80

Ser Ser Gly Pro Glu Arg Ile Leu Ser Ile Ser Ala Asp Ile Glu Thr

                85                  90                  95

Ile Gly Glu Ile Leu Lys Lys Ile Ile Pro Thr Leu Glu Glu Gly Leu

            100                 105                 110

Gln Leu Pro Ser Pro Thr Ala Thr Ser Gln Leu Pro Leu Glu Ser Asp

        115                 120                 125

Ala Val Glu Cys Leu Asn Tyr Gln His Tyr Lys Gly Ser Asp Phe Asp

    130                 135                 140

Cys Glu Leu Arg Leu Leu Ile His Gln Ser Leu Ala Gly Gly Ile Ile

145             150                     155                 160

Gly Val Lys Gly Ala Lys Ile Lys Glu Leu Arg Glu Asn Thr Gln Thr

                165                 170                 175

Thr Ile Lys Leu Phe Gln Glu Cys Cys Pro His Ser Thr Asp Arg Val

            180                 185                 190

Val Leu Ile Gly Gly Lys Pro Asp Arg Val Val Glu Cys Ile Lys Ile

        195                 200                 205

Ile Leu Asp Leu Ile Ser Glu Ser Pro Ile Lys Gly Arg Ala Gln Pro

    210                 215                 220

Tyr Asp Pro Asn Phe Tyr Asp Glu Thr Tyr Asp Tyr Gly Gly Phe Thr

225                 230                 235                 240

Met Met Phe Asp Asp Arg Arg Gly Arg Pro Val Gly Phe Pro Met Arg

245                             250                     255

Gly Arg Gly Gly Phe Asp Arg Met Pro Pro Gly Arg Gly Gly Arg Pro

            260                 265                 270

Met Pro Pro Ser Arg Arg Asp Tyr Asp Asp Met Ser Pro Arg Arg Gly

        275                 280                 285

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Ser Arg Ala

    290                 295                 300

Arg Asn Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Gly Gly Asp Leu

305                 3l0                 315                 320

Met Ala Tyr Asp Arg Arg Gly Arg Pro Gly Asp Arg Tyr Asp Gly Met

                325                 330                 335

Val Gly Phe Ser Ala Asp Glu Thr Trp Asp Ser Ala Ile Asp Thr Trp

            340                 345                 350

Ser Pro Ser Glu Trp Gln Met Ala Tyr Glu Pro Gln Gly Gly Ser Gly

        355                 360                 365

Tyr Asp Tyr Ser Tyr Ala Gly Gly Arg Gly Ser Tyr Gly Asp Leu Gly

    370                 375                 380

Gly Pro Ile Ile Thr Thr Gln Val Thr Ile Pro Lys Asp Leu Ala Gly

385                 390                 395                 400

Ser Ile Ile Gly Lys Gly Gly Gln Arg Ile Lys Gln Ile Arg His Glu

                405                 410                 415

Ser Gly Ala Ser Ile Lys Ile Asp Glu Pro Leu Glu Gly Ser Glu Asp

            420                 425                 430

Arg Ile Ile Thr Ile Thr Gly Thr Gln Asp Gln Ile Gln Asn Ala Gln

        435         440                         445

Tyr Leu Leu Gln Asn Ser Val Lys Gln Tyr Ala Asp Val Glu Gly Phe

    450                 455                 460

<210>3

<21l>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

taactgattg gtgtgcccgt                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gaactaagtt tgccaagtta                                                20