生物分析用近红外中位氮、硫七甲川菁类荧光染料

摘要

本发明涉及一类新型的近红外七甲川菁类荧光染料，该染料是传统七甲川菁染料与含氮、硫的亲核试剂在染料结构的中位进行取代所得到的新型染料。其中中位氮衍生物取代七甲川菁染料在激发态发生分子内电荷转移(ICT)效应，产生大斯托克斯位移(70－170nm)和良好荧光性能(荧光量子产率最大能超过0.4)，可用作高灵敏的蛋白质、糖、DNA等生物分子荧光标记探针。中位硫衍生物取代七甲川菁染料存在分子内光诱导电子转移(PET)现象。作为轻金属离子探针的荧光增强倍数超过10－12倍。

说明书

技术领域

本发明属于生物荧光分析技术领域所用的荧光染料。

背景技术

随着生物科学的飞速发展，荧光分析技术在基因测序、基因表达及临床诊断等方面的应用越来越多。在医学上，以荧光技术为核心的酶促免疫分析法和荧光偏振免疫分析法已经成为医疗诊断的标准手段。在细胞生物学上，荧光光谱被用于跟踪细胞内成分的位置和移动情况。另外，细胞的辨别和分类也是依靠以荧光技术为核心的流式细胞计。荧光染料的开发是发展荧光分析技术的最具决定性的因素。荧光染料应用在生物分析中，早期的标志性成就是在八十年代中期，DNA自动测序技术利用4种不同荧光染料的标示，能够自动快速获得C、G、A、T四类碱基的序列。这项成就也成为了现代分子生物分析技术发展的重要里程碑。之后随着激光技术，计算机处理技术及荧光光谱测定技术等新技术的不断进步，荧光染料在基因芯片、免疫分析检测、肿瘤细胞早期诊断和细胞内金属离子的识别等许多方面都得到了广泛的应用，而且每年都有大量文献和专利报道这些方面的研究进展。

为满足日新月异的生物分析应用对荧光染料的需求，研究开发出更多的具有良好荧光光谱性能的新型荧光染料，仍然是荧光分析技术发展的关键和核心。目前使用比较多的罗丹明类、荧光素类、BODIPY类和菁类等荧光染料，其中有些品种已经商品化了。但这些商品化的染料大部分光谱都处在紫外可见区，而生物样品自身在这个区域有很强的吸收，荧光检测时会显现出一定强度的自发荧光，造成强的荧光背景，从而极大地降低了检测的灵敏度。近红外荧光染料由于能避开这个问题近年来受到了广泛的重视。甚至有专家认为，在荧光技术从培养皿研究阶段发展到动物模型研究阶段过程中起最关键作用的就是近红外荧光染料和以它们为基础设计的分子探针。只有在近红外区，荧光分析技术才能在组织细胞体内得到充分的应用。

七甲川菁染料作为最主要的近红外荧光团是这方面研究和应用的焦点。开发具有良好光谱性质的七甲川菁染料对发展生物荧光标示技术起着至关重要的作用。

针对这类染料的光稳定性和水溶性差的缺点，前人在染料的分子结构设计上已经取得很多成果。第一、两端的芳香母核有很多种，包括噻唑、噻吩、2-喹啉、4-喹啉和3H-吲哚啉等，但以吲哚啉为母核被证明性能最好。第二、甲川链增长导致光稳定性下降已经得到证实。GaborPatonay等在甲川链上引入一个环己烯的结构单元，合成的染料被认为相对于直链七甲川染料有更好的光稳定性，同时荧光也得到增强。第三、AS Wangger等在分子中引入磺酸基，提高了染料的水溶性。同时还有提高稳定性的作用。这个方法已经成为提高这类染料的水溶性最常用的方法。

尽管如此，目前长波长的七甲川吲哚菁染料在生物荧光分析的应用上仍然存在一些问题和不足。

第一、七甲川菁染料的光稳定性需要进一步提高。

第二、目前的多甲川菁染料一般都是对称结构，缺少单一的荧光标记反应的活性位点。在荧光标记时，荧光菁染料最好在分子中含有一个单一的羧基基团，用于特定地衍生反应得到理想的荧光探针分子。而为得到这样含单一羧基的多甲川菁染料，一般方法是合成出不对称菁染料，在分子的一端引入一个羧基。但这个方法使得染料的合成和分离提纯变得复杂和困难。

第三、菁染料的光谱性能也存在不足之处：荧光寿命短；荧光量子产率低；在水溶液中常出现自聚等。特别是菁染料的斯托克斯位移非常小，在20nm左右，这一方面造成菁染料在溶液中存在相当程度的荧光自淬灭，这是小斯托克斯位移形成光谱交盖的结果。另一方面在荧光检测中常出现因激发光源波长过于接近发射检测波长而引起测量误差。近期两篇文献均谈到常见多甲川菁染料存在斯托克斯位移小的弱点。文献如下：(1)Tolosa，L.；Nowaczyk，K.Lakowicz，J.An Introduction to Laser Spectroscopy，2nd ed.；Kluwer：New York，2002.(2)Zhang Z.，Achilefu S.Synthesis and Evaluation of Polyhydroxylated Near-InfraredCarbocyanine Molecular Probes.Org.Lett.2004，6(12)：2067-2070.

发明内容

本发明的目的是选定长波长的七甲川菁染料，设计合成出适用于生物荧光标示的结构新颖、性能优良的近红外七甲川菁染料作为研究目标。

第一、本发明首先设计了一个七甲川吲哚菁母体染料，结构充分考虑了前人工作成果，在染料结构中以吲哚啉作为芳香母核，在吲哚啉上引入磺酸基增加水溶性，在甲川链的中间引入六元桥环结构提高稳定性。

第二、本发明选定在七甲川菁染料的中位进行取代，合成出新型的七甲川菁染料，并将新染料的荧光光谱性能作为本发明研究的中心。

在最近常见的七甲川吲哚菁染料的结构中，由于甲川链引入含氯六元桥环结构来提高光稳定性，这样同时在染料分子的结构上产生了一个独特的用于衍生反应的位点，就是处于甲川链“中位”的氯原子，能被亲核试剂取代。

七甲川菁染料这种“中位”取代前人研究相对较少，并集中在用氧原子或硫原子取代中位氯原子。这类衍生染料解决了在分子中引入单一活性位点的难题，能更为方便地用作新型荧光探针应用于生物荧光分析中。本发明着重研究中位氮、硫取代七甲川菁染料的光谱性能及其应用。

本发明的近红外中位氮、硫取代七甲川菁类荧光染料的结构通式为

通式中：

X＝II、III、IV或V；

R₁、R₂＝(CH₂)_nR₇、(CH₂)_mOR₈、(CHR₉CH₂O)_pR₁₀、CH₂C₆H₄R₁₁或环己基；

R₃、R₄、R₇＝H、SO₃R₁₂、CO₂R₁₃或NCS；

R₅＝(CH₂)_nR₇、(CH₂)_mOR₈、(CHR₉CH₂O)_pR₁₀、CH₂C₆H₄R₁₁、环己基、间位或对位的C₆H₄R₁₄；

R₈、R₉、R₁₀＝H、C_1-18烷基或环己基；

R₁₁＝H、间位、对位的SO₃R₁₂或CO₂R₁₃；

R₁₂＝H或M；M＝Na、K或N(R₁₅R₁₆R₁₇R₁₈)；

R₁₃＝H、M、R₆、C_1-18烷基或环己基；

R₁₄＝H、NH₂、NHCOR₁₀、(CH₂)_nR₇、(CH₂)_mOR₈、(CHR₉CH₂O)_pR₁₀、CH₂C₆H₄R₁₁或环己基；

R₁₅、R₁₆、R₁₇、R₁₈＝H、C_1-18烷基、环己基、(CH₂)_qOR₉或(CHR₉CH₂O)_rR₁₀；

n、m、p、q、r＝0-18。

1、染料的合成

将起始原料对位取代苯肼与3-甲基-2-丁酮在冰醋酸中回流，吲哚化反应生成吲哚中间体，再与烷基化试剂于氮气保护下发生季铵化反应生成烷基取代的中间体吲哚季铵盐。然后与缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯在正丁醇/甲苯中脱水反应就得含氯六元桥环的七甲川3H-吲哚菁母体染料：

含氯桥环母体染料与不同的含氨基或巯基亲核试剂于无水无氧条件下，在DMF中搅拌反应，产物倒入乙醚中则析出大量固体，经过滤干燥后，采用反相填料柱以水/甲醇梯度洗脱，得到目标染料。

2、染料的特征

本发明的中位氮衍生物取代七甲川菁染料的光谱性能与普通多甲川菁染料完全不同。主要体现在：第一、新染料的斯托克斯位移最大能达到167nm，最少也能达到70nm，比普通菁染料的25nm左右大很多，而且荧光量子产率最大能超过0.4。第二、新染料的光谱相对于普通多甲川菁染料明显变宽，尤其是吸收光谱。第三、吸收光谱与发射光谱失去镜像对称关系。吸收光谱的宽度明显大于发射光谱。在光谱中存在这三个特征是染料分子存在分子内电荷转移(ICT)激发态的外在表现。染料具有大的斯托克斯位移对于荧光分析技术具有十分重大的意义。现在用于荧光分析技术的众多荧光染料中，绝大多数的斯托克斯位移不超过30nm。如罗丹明B在甲醇溶液中是23nm，BODIPY类染料约是20nm。小的斯托克斯位移造成的问题，一是使染料自淬灭，也称为染料的自吸收。这是因为小斯托克斯位移的染料的吸收光谱与发射光谱有很大的交盖，即染料有部分发射光能被其自身吸收，这样导致荧光强度下降。另一个问题是造成荧光分析技术的测量误差。这是因为小的斯托克斯位移使激发光波长与荧光检测波长太过接近，激发波长易对荧光检测狭缝造成散射光干扰。因而，这种具有大斯托克斯位移的荧光染料有着十分重要的应用价值。本发明的这类菁类荧光染料可用作高灵敏的蛋白质、糖、DNA等生物分子荧光标记探针。

本发明的中位硫衍生物取代七甲川菁染料的光谱与普通多甲川菁染料相似，但发现这类衍生染料存在分子内PET现象。这个现象在近红外的荧光团中极少发现。染料的PET效应与中位硫取代基团的供电能力直接相关。其中，一个取代基供电能力最强的染料表现出最有效的分子内PET，荧光量子产率最小。对这个染料进行的外加质子和金属离子的荧光滴定实验发现，在外加阳离子的一定浓度范围内，染料的荧光增强。这个结果有效验证了分子内PET的存在。对轻金属三价铝离子的荧光滴定实验结果，发现荧光增强倍数大于10倍。这是迄今发现的最有效的近红外荧光探针。这为设计基于这类染料的近红外荧光金属离子探针奠定基础。

表1是两个中位氮衍生物取代染料IIa，IIb和含氯母体染料Ib在水溶液(1×10^-6M)中的光谱数掘。可以看到，其中烷基氨基取代衍生染料IIb的斯托克斯位移比达到140nm。更为重要的是，它们的荧光强度比含氯母体染料Ib要强两倍以上。

图1给出染料IIb在水溶液中的谱图，图2是含氯母体染料Ib在水溶液中的谱图。通过比较可以看出，第一、新染料IIb的光谱相对于母体染料明显变宽，尤其是吸收光谱。第二、吸收光谱与发射光谱失去镜像对称关系。吸收光谱的宽度明显大于发射光谱。第三、新染料IIb的斯托克斯位移达到140nm，比普通菁染料大很多。

表2是中位硫取代的衍生染料IIIa-d及母体染料Ib在1×10^-6M的水溶液中的光谱数据。可以看出中位硫取代对染料光谱的影响结果。

(1)与母体染料相比，衍生染料的吸收和发射峰形保持不变，斯托克斯位移也没有明显变化，最大吸收和发射波长稍有红移。其中IIIa-c红移超过10nm，而IIId只红移了3-5nm。原因可能是IIIa-c中苯环延长了共轭体系，而IIId只有硫的p-π共振作用。

(2)荧光强度顺序为：IIId＞Ib＞IIIa＞IIIc＞＞IIIb。说明硫取代后取代基的结构对荧光量子产率影响很大。吸电的羧甲基的引入使染料IIId荧光增强。苯环的引入使染料IIIa荧光一定程度减弱，而氨基苯则使染料IIIb荧光淬灭，但引入乙酰氨基苯则使染料IIIc荧光恢复到接近于染料IIIa的水平。

从染料IIIb的取代基结构和极小的荧光量子产率我们能容易地推断其发生了分子内PET。像其他的PET探针一样，光激发后N原子上的一个高能的非键电子能够转移到荧光团的HOMO上，从而淬灭了分子的荧光。

染料IIIb已经被证实发生了强的PET过程，这从它的荧光量子产率(Φf＝0.0065)远远低于IIIa(Φf＝0.038)和IIIc(Φf＝0.036)可以看出。

同理，染料IIa除了具有大的斯托克斯位移(87nm)，可以推断其发生了激发态的分子内电荷转移(ICT)外，根据它的弱的荧光量子效率(Φf＝0.025)，也可以推断其分子内发生一定程度的PET过程。

根据前面论述的PET原理，发生强PET将使染料的荧光淬灭，当供体氨基被质子化或与金属阳离子结合后，荧光恢复。这种荧光恢复增强过程在对于短波长荧光团能容易实现，但对于近红外荧光团，这个过程受制于客观因素，难于实现。

幸运的是，在外加质子或过渡金属离子后，染料IIIb观察到了较为明显的荧光增强。而母体染料Ib和染料IIIa，IIIc只能观察到荧光淬灭。见图3-7。这一方面，证实了这类分子中确实存在PET现象。另一方面为研究设计这类近红外区PET荧光探针奠定了基础。

在荧光滴定实验中，向染料IIIb加入质子或加入过渡金属阳离子超过一定的浓度后，荧光也将出现淬灭。说明染料IIIb在外加阳离子的条件下，也存在两种相反的效应。一是阳离子与氨基结合，抑制了PET过程，导致的荧光增强效应。二是这两类阳离子诱导的荧光淬灭效应。强酸使得菁染料褪色，过渡金属阳离子与染料分子间发生碰撞能量转移，淬灭荧光。在阳离子的低浓度范围，荧光增强效应占据了主导作用。但同时存在的淬灭效应使设计PET质子探针和过渡金属离子探针变得不可行，因为很难得到大的荧光增强倍数和良好的线性关系。

另外，还尝试了镧系金属离子，在染料IIIb中加入Ce(NO₃)₃后，也发现荧光先增强后淬灭的过程。但测试中发现，相对Zn离子，这类镧系金属离子荧光增强更难，淬灭现象在很低的浓度下就开始发生。这种淬灭选择性源自于发生Frster型碰撞能量转移的染料分子与金属离子间的能量匹配。这也是设计过渡金属离子的荧光淬灭探针的理论基础。

但要设计金属离子PET探针，就需要避开这种淬灭效应。图8给出了染料IIIb在外加Al离子的荧光滴定光谱。可以看到，染料IIIb在外加Al离子后，荧光增强达到12倍。这个结果说明轻金属离子与菁染料之间不会发生类似重金属离子的能量转移，从而避开了荧光淬灭效应。所以这类染料不适合设计成重金属离子的近红外PET荧光探针，但完全可用于轻金属离子或中性小分子的PET荧光检测。

附图说明

图1为染料IIb在水溶液(1×10^-6M)中的吸收和发射光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为发射强度。

图2为染料Ib在水溶液(1×10^-6M)中的吸收和发射光谱，横坐标为波长(nm)，纵坐标左边为吸收值，右边为发射强度。

图3为染料IIIb在含不同浓度HCl的水溶液中荧光发射光谱(λex＝795nm)，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；HCl浓度：a：0mM，b：0.096mM，c：0.0192mM，d：0.480mM，e：0.720mM，f：0.960mM，g：1.200mM；

图4为染料Ib在含不同浓度HCl的水溶液中荧光发射光谱(λex＝767nm)，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；HCl浓度：a：0mM，b：0.048mM，c：0.096mM，d：0.240mM，e：0.960mM，f：2.400mM，g：4.800mM，h：9.600mM；

图5为染料IIIa在在不同浓度ZnSO₄的缓冲溶液中荧光发射光谱(λex＝795nm)，缓冲体系是乌洛托品-盐酸，pH＝7.04，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；ZnSO₄浓度：a：0mM，b：0.04mM，c：0.08mM，d：0.20mM，e：0.40mM，f：0.80mM，g：2.00mM；

图6为染料IIIb在在不同浓度ZnSO₄的缓冲溶液中荧光发射光谱(λex＝795nm)，缓冲体系是乌洛托品-盐酸，pH＝7.04，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；ZnSO4浓度：a：0mM，b：0.08mM，c：0.16mM，d：0.32mM，e：0.60mM，f：0.80mM，g：1.20mM，h：1.40mM；

图7为染料IIIc在在不同浓度ZnSO₄的缓冲溶液中荧光发射光谱(λex＝795nm)，缓冲体系是乌洛托品-盐酸，pH＝7.04，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；ZnSO₄浓度：a：0mM，b：0.10mM，c：0.20mM，d：0.40mM，e：0.80mM，f：2.00mM，g：4.00mM；

图8为染料IIIb在在不同浓度Al₂(SO₄)₃的缓冲溶液中荧光发射光谱(λex＝795nm)，缓冲体系是乌洛托品-盐酸，pH＝7.04，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度；Al2(SO4)3浓度：0mM---22.0mM.

具体实施方式

                              实施例1

含氯桥环母体染料Ib的合成路线

(1)中间体2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾的合成

1000ml三口烧瓶中，依次加入150ml冰醋酸，84ml(0.8mol)3-甲基-2-丁酮和50g(0.26mol)对肼基苯磺酸。混合物加热回流3小时，反应物倒入烧杯中，静置冷却后有粉红色固体析出。过滤，真空干燥，得2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐48克，产率75％，R1＝0.58，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶5)。

250ml园底烧瓶中，依次加入50ml甲醇，50ml异丙醇，48g(0.2mol)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸盐和12.3克(0.22mol)KOH。混合物加热回流，粉红色迅速退去，冷却有大量黄色固体析出。过滤，真空干燥，得中间体2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾54克，产率97％。

(2)中间体N-苄基-2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸的合成

在100ml圆底烧瓶中，依次加入15.6g(0.06mol)2，3，3-三甲基-3H-吲哚啉-5-磺酸钾，9.8g(0.063mol)苄基溴，甲苯65ml，在氮气保护下加热回流反应5小时，得到粉红色固体，超声使壁上固体进入液体中，过滤，用甲苯洗涤，真空干燥。

(3)缩合剂2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯的合成

在冰浴(0-5℃)下将37ml三氯氧磷的35ml干燥的二氯甲烷的混合液滴加入80ml由干燥的二氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺(1∶1，V/V)的混合液中，然后再逐滴加入10g环己酮。撤下冰浴，将反应液加热到回流，反应3h后，用冰水浴冷却，然后分批倒入200g碎冰中。放置过夜，得到红色固体，过滤，固体以冰冻的丙酮分批少量洗涤至黄色。产品于氮气保护下置于冰箱中保存，备用。

(4)含氯母体染料Ib的合成及表征：

在250ml圆底烧瓶中依次加入8mmol季铵盐5和4mmol(692mg)缩合剂6(2-氯-1-甲酰基-3-羟甲基环己烯)，再加入正丁醇∶甲苯(7∶3)300ml，加上分水器，分水器中加入甲苯溶剂，氩气保护下，加热回流5小时，溶液逐渐由浅红色变成深红色，最后出现大量绿色组分。旋转蒸发除去正丁醇和苯，加入甲醇，超声溶解，加入相对于甲醇量1.5-2倍激烈搅拌中的乙醚，立即有大量的固体析出，用砂心漏斗过滤，乙醚洗涤，粗品干燥后用水重结晶两次，密封避光保存。染料Ib：¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ1.58(m，2H，CH₂)，1.72(s，12H，CH₃)，2.09(t，4H，CH₂)，5.52(s，4H，CH₂)，6.36-6.40(d，2H J＝13.6Hz，CH)，7.26-7.40(m，12H，CH)，7.62-7.64(d，2H，CH)，7.85(s，2H，CH)，8.22-8.25(d，2H，J＝13.6Hz，CH).Q-TOFMS：M^-1计算值：793.2173，测试值：793.2186。

                                实施例2

目标染料IIa的合成及表征：

母体染料Ib预先在50-60℃下真空干燥8小时，亲核试剂苯胺预先减压蒸馏精制。所用玻璃仪器预先在120℃下干燥3小时，50mL的三口圆底烧瓶在氮气氛下冷却后，加入100mg(0.12mmol)原料染料Ib和1.2mmol的亲核试剂和一个磁力搅拌子。氮气氛下用注射器加入无水DMF约15mL。反应混合物在氮气保护下保温100℃搅拌2小时。反应液倒入快速搅拌的300mL乙醚中，大量绿色固体沉淀生成。用砂芯漏斗过滤掉滤液，得到固体用甲醇从漏斗上溶解下来，蒸干甲醇，得到染料粗品用反相填料柱提纯。

染料IIa，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.35(s，12H，CH₃)，1.72-1.74(m，2H，CH₂)，2.39-2.42(t，4H，CH₂)，5.32(s，4H，CH₂)，5.99-6.02(d，2H J＝13.6Hz，CH)，6.79-6.83(t，1H，CH)，6.97-6.99(d，2H，CH)，7.14-7.16(d，2H，CH)，7.20-7.22(d，4H，CH)，7.24-7.28(t，4H，CH)，7.30-7.34(t，4H，CH)，7.55-7.57(d，2H，CH)，7.63(s，2H，CH)，7.90-7.93(d，2H，J＝13.6Hz，CH).MS，m/z：851.3(M-)

                               实施例3

目标染料IIb的合成及表征：

合成方法同实例2，其中亲核试剂使用γ-氨基丁酸，反应温度为40℃。

染料IIb，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ0.86(m，2H，CH₂)，1.25(m，4H，CH₂)，1.63(s，12H，CH₃)，1.93(m，2H，CH₂)，2.29(t，4H，CH₂)，5.20(s，4H，CH₂)，5.72(d，2HJ＝13.2Hz，CH)，7.00-7.02(d，2H，CH)，7.25(m，6H，CH)，7.34(m，4H，CH)，7.53(m，4H，CH)，7.64(s，2H，CH).MS，m/z：861.3(M-).

                               实施例4

目标染料IIIa的合成及表征：

合成方法同实例2，其中亲核试剂使用苯硫酚，反应温度为室温。

染料IIIa，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ1.48(s，12H，CH₃)，1.80(m，2H，CH₂)，2.56(t，4H，CH₂)，5.48(s，4H，CH₂)，6.36-6.39(d，2H J＝13.2Hz，CH)，7.13-7.17(t，1H，CH)，7.23-7.26(t，6H，CH)，7.29-7.33(t，6H，CH)，7.34-7.38(t，4H，CH)，7.59-7.61(d，2H，CH)，7.74(s，2H，CH)，8.59-8.62(d，2H，J＝13.2Hz，CH).Q-TOFMS：M^-1计算值：867.2596，测试值：867.2598.

                              实施例5

目标染料IIIb的合成及表征：

合成方法同实例2，其中亲核试剂使用对氨基苯硫酚，反应温度为室温。

染料IIIb，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.58(s，12H，CH₃)，1.72(m，2H，CH₂)，2.55(t，4H，CH₂)，5.46(s，4H，CH₂)，6.31-6.35(d，2H J＝13.6Hz，CH)，6.50-6.52(d，3H，CH)，6.95-6.98(d，2H，CH)，7.05-7.07(d，2H，CH)，7.23-7.25(d，3H，CH)，7.28-7.31(t，3H，CH)，7.33-7.37(m，3H，CH)，7.60-7.62(d，2H，CH)，7.77(s，2H，CH)，8.69-8.73(d，2H，J＝13.6Hz，CH).Q-TOFMS：M-1计算值：882.2705，测试值：882.2742.

                              实施例6

目标染料IIIc的合成及表征：

合成方法同实例2，其中亲核试剂使用对乙酰氨基苯硫酚，反应温度为室温。

染料IIIc，¹H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ1.51(s，12H，CH₃)，1.79(m，2H，CH₂)，1.98(s，3H，CH₃)，2.55(t，4H，CH₂)，5.47(s，4H，CH₂)，6.35-6.38(d，2H J＝13.6Hz，CH)，7.17-7.19(d，2H，CH)，7.23-7.25(d，4H，CH)，7.29-7.31(t，4H，CH)，7.34-7.38(t，4H，CH)，7.51-7.54(d，2H，CH)，7.59-7.61(d，2H，CH)，7.75(s，2H，CH)，8.60-8.63(d，2H，J＝13.6Hz，CH)，9.95(s，1H，NH).13C NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ20.5，23.9，25.7，27.3，47.0，48.9，102.7，110.7，119.9，120.3，126.3，126.6，126.9，127.8，129.0，130.0，134.1，135.0，137.6，140.4，142.4，145.4，145.6，151.1，168.3，172.7.Q-TOFMS：M-1计算值：924.2811，测试值：924.2845.

                              实施例7

目标染料IIId的合成及表征：

合成方法同实例2，其中亲核试剂使用巯基乙酸，反应温度为室温。

染料IIId，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ1.63(m，2H，CH₂)1.71(s，12H，CH₃)，2.40(t，4H，CH₂)，5.48(s，4H，CH₂)，6.31-6.34(d，J＝13.6Hz，2H，CH)，7.26-7.27(m，8H，CH)，7.33-7.35(d，4H，CH)，7.61(d，2H，CH)，7.80(s，2H，CH)，8.79-8.82(d，2H，J＝13.2Hz，CH).¹³C NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ20.5，25.6，27.6，47.0，49.0，102.3，110.5，120.0，126.3，126.6，127.8，129.0，133.5，135.0，140.3，142.7，144.8，145.6，157.3，172.4.Q-TOFMS：M-1计算值：849.2338，测试值：849.2297.

表1染料IIa，IIb和母体染料Ib在水溶液(1×10^-6M)中的光谱数据

  染料  吸收波长  λ_ab(nm)  发射波长  λ_em(nm)  斯托克斯位  移(nm)  ε  (×10⁵)^a  Φ_t^b  IIa  IIb  Ib  713  617  783  800  757  803  87  140  20  0.8  0.7  2.0  0.025  0.41  0.17

^a摩尔消光系数单位为cm^-1M

^b荧光量子产率的测量溶剂为甲醇，参比染料为罗丹明B的甲醇溶液(Φ_f＝0.69).

表2硫取代的衍生染料及母体染料在水溶液(1×10^-6M)中的光谱数据。

  染料  吸收波长  λ_ab(nm)  发射波长  λ_em(nm)  斯托克斯位  移(nm)  ε  (×10⁵)^a  φ_t^b  IIIa  IIIb  IIIc  IIId  Ib  794  795  798  786  783  817  820  823  808  803  22  25  25  22  20  2.3  0.9  1.6  1.6  2.0  0.038  0.0065  0.036  0.11  0.078

^a摩尔消光系数单位为cm^-1M

^b荧光量子产率的测量溶剂为二甲基亚砜，参比染料为IR-125的DMSO溶液(Φ_f＝0.13).