一种开口箭提取物、含有开口箭提取物的药物组合物及其制备方法和用途

摘要

本发明提供了一种开口箭Tupistra Chinensis Bak.提取物，它含有开口箭水溶物、开口箭脂溶物、开口箭皂苷。本发明还提供了含有该提取物的药物组合物及其制备方法。开口箭水溶物、开口箭脂溶物、开口箭皂苷三成分均发挥了药效，具有协同增效的作用，且安全、有效、可控性强、稳定，为临床提供了一种新的选择。

说明书

技术领域

本发明涉及一种开口箭提取物，具体地，是以天然药物原料制备的提取物，本发明还涉及含有该提取物为活性成分的药物组合物，属药物领域。

背景技术

咽喉炎在临床上是一种常见病、多发病，属于上呼吸道疾病，是咽喉部黏膜组织的炎性病变，常由受凉、劳累等诱发，以细菌、病毒侵犯咽喉部的黏膜而引起。根据发病的时间和症状不同，可分为急性咽喉炎和慢性咽喉炎。急性咽喉炎是由细菌或病毒引起的一种急性炎症，慢性咽喉炎是咽喉部的慢性非特异性炎症；且急性咽喉炎反复发作可转变为慢性咽喉炎。研究表明，炎症一般分为三期：炎症早期，又称血管反应期，表现为毛细血管扩张和通透性增高，渗出，水肿；炎症中期，又称细胞反应期，表现为白细胞向炎性部位集聚；炎症晚期，又称组织反应期，表现为纤维组织增生，炎症屏障形成。由此可见，咽喉炎的病因众多且病机涉及到多个层面、多个环节，从而提示药物治疗应该通过多途径起综合治疗的作用。

开口箭(Tupistra Chinensis Bak.)为百合科铃兰族开口箭属植物，其原植物又名开喉箭、万年青。中药大辞典记载，开口箭味甘微苦，性寒，主治劳热咳嗽、跌打损伤、风湿痹痛、月经不调等症^[1]。陕西中草药记载，开口箭除风湿，清热泻火，镇痛止血，调经活血，滋阴补虚。治疗风湿性关节炎，腰腿疼痛，跌打损伤，劳伤，月经不调，骨蒸劳热^[1]。成都中草药记载，开口箭益气活血，清肺，解毒^[1]。湖北中草药志记载，开口箭性味甘苦凉，有毒。具有清肺、利咽、活血、止痛的功效，主治头痛、咽喉痛、腰背疼痛、关节肿痛、咳嗽、跌打损伤、烧伤、烫伤等症^[2]。陕甘宁青中草药选记载，开口箭性味微苦，性寒，有小毒。具有祛风、止痛、散瘀之功效。用于风湿性关节炎、关节肿痛、跌打损伤、骨蒸痨热等症^[3]。全国中草药汇编记载，开口箭性味甘，微苦，凉，有毒。具有清热解毒、散瘀止痛之功效。主治白喉、风湿关节痛、腰腿痛、跌打损伤、狂犬咬伤等症^[4]。土家族和神农架民间用其漱口液治疗咽喉炎、扁桃体炎，疗效显著^[5]。开口箭甲醇提取物中氯仿萃取物的化学成分已经有报道^[6-8]。已经鉴定的结构主要为甾体皂苷元，黄酮，紫檀素等。开口箭其它提取部位的化学成分及提取部位的配伍使用尚未见报道。

发明内容

本发明的技术方案是提供一种开口箭提取物，本发明的另一技术方案是含有开口箭提取物的药物组合物及其制备方法和用途。

本发明提供了开口箭Tupistra Chinensis Bak.提取物，它含有下列重量配比的组分：

开口箭水溶物0～10份、开口箭脂溶物0～10份、开口箭皂苷1～10份。

进一步地，它含有下列重量配比的组分：

开口箭水溶物10份、开口箭脂溶物10份、开口箭皂苷3份。

其中，所述的开口箭水溶物、脂溶物、皂苷是由下述方法制备：

以百合科铃兰族开口箭属植物开口箭Tupistra Chinensis Bak.根茎为原料，以甲醇为溶剂，提取干燥得深棕色浸膏，即为甲醇提取物；该提取物与蒸馏水以体积比1∶1混匀，先用氯仿萃取、干燥得开口箭脂溶物；萃取后的水溶液用水饱和的正丁醇萃取、干燥得开口箭皂苷；余下水溶液干燥得开口箭水溶物。

其中，所述的开口箭皂苷虽然可能为脂溶性或水溶性，但通过上述的制备方法可知，本发明所述的开口箭水溶物、脂溶物是指不含皂苷的水溶物及脂溶物。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由开口箭水溶物、脂溶物、皂苷之一或其混合为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分，制备而成的制剂。

其中，该药物组合物的HPLC指纹图谱如图1所示，由5个特征峰组成，

其中色谱条件为：色谱柱YMC-Pack ODS-AQ，s-6um，120，250mm×4.6mmI.D.；流动相为乙腈-K₂HPO₄/KH₂PO₄，梯度缓冲，其中K₂HPO₄/KH₂PO₄浓度为1mmol/L，pH值为5.83，乙腈与K₂HPO₄/KH₂PO₄的体积比初始值为20∶80，10min为22∶78，15min为25∶75，20min为28∶72，34min为34∶66，44min为43∶57，48min为80∶20，52min为85∶15，60min为20∶80；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为203nm。

所述的5个特征峰的保留时间RT值分别为：1号峰：23.2min±0.86；2号峰：24.6min±0.90；3号峰：27.2min±0.84；4号峰：30.4min±0.96；5号峰：33.8min±0.98。

本发明还提供了该药物组合物的制备方法，包括如下步骤：

a、开口箭提取物的制备：以百合科铃兰族开口箭属植物开口箭TupistraChinensis Bak.根茎为原料，以甲醇为溶剂，提取干燥得深棕色浸膏，即为甲醇提取物；该提取物与和蒸馏水以1∶1混匀，先用氯仿萃取、干燥得开口箭脂溶物；萃取后的水溶液用水饱和的正丁醇萃取、干燥得开口箭皂苷；余下水溶液干燥得开口箭水溶物；

b、取a步骤制备的开口箭水溶物、脂溶物、皂苷为活性成分，按下列重量配比加上药学上可接受的辅料或辅助性成分，制备而成的制剂：开口箭水溶物0～10份、开口箭脂溶物0～10份、开口箭皂苷1～10份。

本发明还提供了该药物组合物在制备抗炎药物中的用途。具体地，所述的药物是治疗咽炎的药物。进一步地，所述的药物是口含、口服药物、注射药物。

本发明还提供了该药物组合物在制备祛痰药物中的用途。

本实验采用开口箭水和甲醇提取物进行抗炎实验得甲醇提取物具有较好的抗炎疗效；由于中药成分复杂，为了进一步弄清楚开口箭抗炎的活性部位，由此将开口箭甲醇提取物进一步分离纯化得水溶液部分(即水溶性成分)、氯仿部分(即脂溶性成分)、正丁醇部分(即皂苷部分)，通过初步实验证实开口箭抗炎的活性部位在皂苷部分(molish反应呈阳性)；此外，急性毒性实验证实开口箭皂苷毒性极小，相当于人日用剂量的100倍，从而保证了临床用药的安全性；采用咽部喷雾氨水建立急性咽炎动物模型评价开口箭治疗急性咽炎的活性，结果表明，经开口箭皂苷治疗后大耳白兔咽部组织病理学和超微结构明显改善，且与草珊瑚组比较差异具有显著性(P＜0.01)。抑菌实验表明，开口箭皂苷对咽喉部常见致病菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等有较好的体外抑菌作用(MIC：0.063)。但在DNCB所致小鼠DTH中，用开口箭皂苷ig给药连续8天，对DNCB诱导的小鼠DTH无显著影响(P＞0.05)，说明开口箭的抗过敏作用较弱。在采用气管段酚红排泌法评价开口箭的祛痰活性中，开口箭高、中、低剂量组气管段酚红排泌量即OD值较NS组为高，有非常显著性差异(P＜0.001)，而NH₄Cl组较NS组比较仅有显著性差异(P＜0.05)。人日服剂量为皂苷5～20mg。每次5～10mg，一日2～3次。服用剂量小。开口箭水溶物、开口箭脂溶物、开口箭皂苷均发挥了药效，具有协同增效的作用，且安全、有效、可控性强、稳定，为临床提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1开口箭70％洗脱物中五种主要皂苷成分及其保留时间

具体实施方式

实施例1  本发明开口箭提取物的制备：

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以体积比1∶1充分旋转混匀，先用氯仿萃取干燥得褐色浸膏(脂溶性)于冰箱保存，萃取后的水溶液用水饱和的正丁醇萃取干燥得浸膏(皂苷)于冰箱冷冻保存备用，余下水溶液干燥得水溶液部分。三类有效部位的提取方法中，提取过程，温度，所用溶剂等为非常重要的参数如下：

1、提取溶剂：水，0-100％甲醇水溶液，0-100％乙醇水溶液。

2、提取方式：对于甾体皂苷元除了上述提取方法外，可以用二氧化碳超临界萃取、溶剂萃取或超声助溶萃取等替换。

温度控制：

    提取方式    温度参数(℃)    水    30-100℃    0-100％甲醇水溶液    30-70℃    0-100％乙醇水溶液    30-82℃    超声助溶萃取    室温    提取液浓缩温度范围    室温-65℃    药材干燥温度范围    室温-65℃

实施例2  本发明药物开口箭皂苷的制备

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以体积比1∶1混匀，先用氯仿萃取得褐色浸膏于冰箱保存，萃取后的水溶液用水饱和的正丁醇萃取干燥得黄色浸膏于冰箱冷冻保存备用。

实施例3  本发明药物片剂的制备

取实施例1制备的开口箭水溶物10kg、开口箭脂溶物10kg、开口箭皂苷3kg混合。取混合物，加入淀粉和1％硬脂酸镁，压片，使每片含皂苷5mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例4  本发明药物胶囊剂的制备

取开口箭水溶物8kg、开口箭脂溶物5kg、开口箭皂苷10kg。取混合物，加入淀粉，制粒，整粒，装胶囊，每粒胶囊中含有皂苷10mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等胶囊剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例5  本发明药物胶囊剂的制备

取开口箭水溶物8kg、开口箭脂溶物5kg、开口箭皂苷10kg。取混合物，加入淀粉，制粒，整粒，装胶囊，每粒胶囊中含有皂苷8mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等胶囊剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例6  本发明药物片剂的制备

取实施例1制备的开口箭水溶物10kg、开口箭脂溶物10kg、开口箭皂苷10kg混合。取混合物，加入淀粉和1％硬脂酸镁，压片，使每片含皂苷10mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例7  本发明药物片剂的制备

取实施例1制备的开口箭皂苷10kg混合。取混合物，加入淀粉和1％硬脂酸镁，压片，使每片含皂苷5mg。(所用的辅料可以是微晶纤维素、改性淀粉、乙基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等片剂常用的辅料中的一种或几种)。

实施例8  本发明药物HPLC控制

HPLC测试条件

Waters-2690泵，检测器；色谱柱YMC-Pack ODS-AQ，s-6um，120，250mm×4.6mmI.D.；流动相为乙腈-缓冲对梯度(K₂HPO₄/KH₂PO₄，浓度为1mmol/L，PH值为5.83)，乙腈与K₂HPO₄/KH₂PO₄的体积比初始值为20∶80，10min为22∶78，15min为25∶75，20min为28∶72，34min为34∶66，44min为43∶57，48min为80∶20，52min为85∶15，60min为20∶80；流速为1.0ml/min；柱温为40℃；检测波长为203nm.

结果见图1。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1  本发明药物开口箭活性部位的筛选试验

1、药品

1.1开口箭水提取物的制备

取200克开口箭粉末，加适量水提取得55.4g浸膏，作为水提取物组药物.

1.2开口箭甲醇提取物的制备

取150克开口箭粉术，加适量甲醇提取得到70g开口箭粉末，作为甲醇提取物组药物。

1.3试剂二甲苯(AR)，济南焦作市化工三厂。

2、动物  昆明种小鼠，体重(22±2)g，由三峡大学实验动物中心提供。合格证号：0035537

3、仪器

-60℃卧式低温箱，沈阳长城医疗器械厂；电子分析天平，METTLER TOLEDO公司；FD-1冷冻干燥机，北京博医康技术公司；卡介苗注射器，上海注射器厂。

4、方法和结果

小鼠30只，♂，随机分成5组。各组同上组剂量ig给药。每日一次，连续7天，末次给药后1h，将各组小鼠右耳上、下两面分别涂抹二甲苯20μl一次致炎，左耳对照(不涂)，20min后处死小鼠，剪下双耳，用6mm直径的打孔器冲下耳片，随即在电子天平称重并记录。用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度，计算肿胀抑制率。结果见表1。

肿胀抑制率＝(阴性对照组差值-给药组差值)/阴性对照组差值×100％

                 表1开口箭提取物抗炎作用比较(X±S)

组别                剂量(g·kg¹)      动物数    肿胀度         抑制率

生理盐水组                            10        1.60

甲醇提取物组        15                10        1.42±0.35^*    11.25

水提取物组          15                10        1.53±0.27     4.38

注：^*P＜0.05，与NS组比较。

5讨论

实验结果表明，开口箭具有一定的抗炎作用。其中，甲醇提取物的抗炎作用最强，且甲醇提取的效率高。为此，选择甲醇提取物做开口箭的药效学实验。

试验例2  开口箭抗炎作用实验研究

1、药品  甲醇(AR)；NH₄Cl(AR)，河南焦作市化工三厂；二甲苯(AR)，河南焦作市化工三厂。

2、仪器  旋转蒸发仪，无锡市星海王生化设备有限公司；电子分析天平，METTLERTOLEDO公司。

3、动物  昆明种小鼠，体重(22±2)g，由三峡大学实验动物中心提供。

4、方法和结果

小鼠72只，♂，随机分成6组，各组按文献[1]记录剂量ig给药。阳性对照组ig布洛芬0.15g.kg^-1，阴性对照组给同体积NS。每日一次，连续7天，末次给药后1h，将各组小鼠右耳上、下两面分别涂抹二甲苯20μl一次致炎，左耳对照(不涂)，15min后处死小鼠，剪下双耳，用6mm直径的打孔器冲下耳片，随即在电子天平称重并记录。用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度，计算肿胀抑制率。结果见表2。

肿胀抑制率＝(阴性对照组差值-给药组差值)/阴性对照组差值×100％

           表2开口箭各部分提取物抗炎作用实验研究

组别            剂量(mg·kg^-1)    肿胀度            抑制率(％)

生理盐水组                       4.87±0.66

布洛芬组        90               4.70±0.21^*       3.49

皂苷高剂量组    148.3            4.67±0.32^**      4.11

皂苷中剂量组    74.2             3.43±0.14^**      29.57

脂溶性成分组    7.2              3.63±0.37^**      25.46

水溶性成分组    110.62           3.93±0.58        19.30

注：^*与NS组比较，P＜0.05，^**P＜0.01，与布洛芬组比较。

5、讨论

由此可见，开口箭的抗炎作用是各类成分共同作用的结果，且其中正丁醇部分(即皂苷)的抗炎作用最强，由此选用正丁醇部分即总皂苷部分进行以下抗炎实验。

试验例3  开口箭水溶性成分、脂溶性成分、皂苷部分配比筛选

小鼠72只，♂，随机分成6组，灌胃给药。阳性对照组灌胃阿司匹林150mg.kg^-1，阴性对照组给同体积生理盐水。每日一次，连续7天，末次给药后1h，将各组小鼠右耳上、下两面分别涂抹二甲苯20μl一次致炎，左耳对照(不涂)，20min后处死小鼠，剪下双耳，用6mm直径的打孔器冲下耳片，随即在电子天平称重并记录。用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度，计算肿胀抑制率。结果见表3。

肿胀抑制率＝(阴性对照组差值-给药组差值)/阴性对照组差值×100％

表3开口箭各部分提取物抗炎作用配比筛选实验研究X±S

组别                   剂量(mg·kg^-1)         肿胀度(mg)         抑制率(％)

生理盐水组                                    6.72±0.74

阿司匹林组             150                    4.93±0.4**        26.6

水溶物、脂溶物、皂     50∶50∶5              5.08±0.57**       24.4

苷(10∶10∶1)

水溶物、脂溶物、皂     150∶50∶5             5.14±0.54**       23.5

苷(30∶10∶1)

水溶物、脂溶物、皂     50∶50∶15             3.96±0.43**       41.1

苷(10∶10∶3)

皂苷(10)               50                     5.29±0.48**       21.3

注：**与生理盐水组比较，P＜0.01

讨论

由此可见，开口箭的抗炎作用主要是脂溶性成分、皂苷部分协同作用的结果，水溶性成分影响较小，三类成分的最佳配比为水溶物、脂溶物、皂苷(10∶10∶3)。

试验例4开口箭皂苷治疗咽炎的实验研究

1、材料

1.1动物

大耳白兔15只，雌雄各半，体重2.02±0.17kg，以全价颗粒饲料饲养，每日定时清洁，由三峡大学实验动物中心提供。合格证号：0035537。

1.2药品  由实施例1制备的皂苷

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以1∶1混匀，先用氯仿萃取得褐色浸膏于冰箱保存，萃取后的水溶液用水饱和的正丁醇萃取干燥得黄色浸膏于冰箱冷冻保存备用。

1.3试剂  氨水，浓度25％-27％；草珊瑚含片，江西江中制药厂。

1.4仪器  大佛喉露喷雾器，香港美加康医药保健公司。

2、方法

2.1动物模型的建立

将15只大耳白兔随机分为模型对照组、开口箭高剂量组、开口箭低剂量组、草珊瑚组、正常对照组，每组各5只。模型对照组：第1-3天上午、下午各用15％氨水喷其咽部1次，每次用喷雾器喷3掀，第4-7天喷蒸馏水，第8天断尾取血涂片。开口箭高、中剂量组：咽部喷氨水同模型对照组，第4-7天用喉头喷雾器给大耳白兔喷开口箭皂苷混悬液(用蒸馏水配成，根据人与大耳白兔体表系数折算)，第8天断尾取血涂片。草珊瑚组：咽部喷氨水同模型对照组，第4-7天用喉头喷雾器给大耳白兔喷草珊瑚混悬液(用蒸馏水配成，根据人与大耳白兔体表系数折算)，第8天断尾取血涂片。正常对照组：喷等量蒸馏水，第4天断尾取血涂片。各组动物取血涂片后，股动脉放血处死动物后立即取下咽部粘膜及其下组织作切片观察。

2.2观察指标

2.2.1客观指标

将大耳白兔咽部粘膜及其下组织切片作病理形态学和超微结构观察。各组动物处死前断尾取血涂片测定血常规。从造模第2天开始每日观察动物咽部情况，包括粘膜形态、色泽等，第8天处死动物，取咽部粘模及其下组织作切片观察。

2.2.2辅助指标实验每日观察记录各组动物外观形态，每日观察1次动物咽部情况，包括粘膜形态、色泽等。

2.3检测方法

实验第8日各组动物给药结束后拉脊处死，立即取咽部粘膜及粘膜下组织分成两份分别进行病理形态学及超微结构观察。观察病理形态学的组织固定48h后取出，切为2mm厚度，按常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，于光学显微镜下观察、摄片。观察超微结构的组织经2.5％戊二醛固定，丙醛脱水，包埋，超薄切片，电子染色，置于H-500透射电子显微镜下观察、摄片。

2.4统计方法

采用SPSS11.0统计软件，结果以x±S表示，组间差异比较采用t检验。

3、结果

3.1一般状态

模型对照组从造模第2天开始，大部分大耳白兔逐渐出现骚抓口部、频饮水而量多、咽部充血呈鲜红色、肿胀等症状与体症，第3天症状较明显；正常对照组则未出现上述情况；开口箭高剂量组，草珊瑚治疗4天后，上述症状、体征基本恢复正常；低剂量组恢复稍差；模型对照组的上述症状、体征则仍然存在。

3.2血常规指标变化

结果见表4

表4各动物组血常规变化(x±S)

              动物数   白细胞总数

组别          (只)     (10⁹/L)

正常对照组    5        5.12±1.21^**

模型对照组    5        9.46±1.34

高剂量组      5        6.56±1.12^**※※

低剂量组      5        8.23±1.14^**※

草珊瑚组      5        7.36±1.13^**

注：与模型对照组比较，^**P＜0.01；与草珊瑚组比较，^※P＜0.05  ^※※P＜0.01

3.3咽部组织病理学变化

正常对照组：大耳白兔咽部组织粘膜上皮于不同部位形态各异。本研究大耳白兔粘膜上皮为复层扁平上皮，粘膜上皮下为固有膜，由致密结缔组织组成，固有膜内有分散的淋巴小结与弥散淋巴组织，还有较多的粘液腺，固有膜下层为肌层，弹性纤维较多，形成弹性纤维膜。模型对照组：咽组织的粘膜上皮外层角质化，部分脱落，粘膜上皮复层明显增生，粘膜下层甚薄与固有膜无明显界限，固有膜内的小血管扩张充血，水肿，部分粘液腺上皮细胞坏死，坏死的粘液腺体形成空泡或形成无结构的粘液网状；固有膜区域与粘液腺间有大量的炎性细胞浸润，固有膜下层为肌层，肌层肌纤维排列不规则。草珊瑚组：咽组织粘膜复层扁平上皮，上皮外层角质化，部分脱落，粘膜上皮下为固有膜，由致密结缔组织组成，固有膜内有许多粘液腺，粘液腺上皮细胞坏死很少，固有膜内及粘液腺间有轻度的炎性细胞浸润。高剂量组：咽组织粘膜复层扁平上皮，上皮外层角质化，复层扁平上皮增生不明显，固有膜内有较多的粘液腺，固有膜及粘液腺间有轻度的炎性细胞浸润，表明咽组织有较大的改善。低剂量组：咽组织的粘膜复层扁平上皮，不增厚，粘膜下固有膜，在其中有许多粘液腺分布，固有膜及粘液腺间有中度的炎性细胞浸润，固有膜下层为肌层，肌纤维排列不甚规则，其病变与正常对照组比较稍差，但与模型组比较也有所改善。

3.4咽部组织超微结构变化

正常对照组：大耳白兔咽部粘膜下细胞的细胞核(N)核膜呈双层，并有核膜孔(NP)，胞质中散在着较多的核糖体(RI)，核糖体附着在囊状膜上构成粗面型内质网(RER)，有些区域偶见有核糖体囊状膜光面型内质网(SER)，线粒体(MI)形状为圆形或椭圆形，由双层膜包围，内膜内褶构成嵴，嵴间基质中有深染的嗜碱颗粒，单层包围的内容物形态多样的溶酶体(LY)。模型对照组：咽部粘膜下层细胞固缩，超微结构被破坏，细胞器已解体，其中间有细胞核染色质呈不规则网状；线粒体明显变性，排列紊乱，肿胀，嵴减少而断，有的形成髓鞘样结构，少数形成管桩嵴，有的基质电子密度降低，使基质呈斑点状、空泡变；胞质粗面内质网显著扩张。草珊瑚组：咽部粘膜下细胞的线粒体轻度变性，大多数线粒体嵴不减少和变短，只有少数嵴减少和变短，基质电子密度降低，其他细胞器变化不明显。高剂量组：咽部粘膜下细胞的细胞核(N)核膜呈双层，核染色质分布均匀，大部分细胞的线粒体结构变化不明显，多为圆形或椭圆形，由双层膜包围，内膜内褶构成嵴，但也有少数线粒体轻度变性，嵴减少或变短，表明细胞的超微结构有所改善和恢复。

上述试验说明，本发明药物开口箭皂苷具有治疗咽炎的作用，阳性药物为草珊瑚含片，说明本发明药物具有与阳性药物相同的功效，都具有口服、口含治疗咽炎的作用。

试验例5  本发明药物开口箭皂苷抑菌实验

1、材料

1.1培养基

肉汤培养基和营养琼脂培养基均按使用说明配置。

1.2细菌

1.2.1菌种

金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希氏菌(ATCC25922)，铜绿假单孢(ATCC27853)，由三峡大学医学院微生物学与免疫学教研室提供；乙型溶血性链球菌，肺炎克雷白氏菌，表皮葡萄球菌，由宜昌市第二人民医院提供。

1.2.2菌悬液制备

实验前将各种细菌分别取1白金耳(或接种环)接种于10ml肉汤培养基中，于37℃培养18h。将此菌悬液接种于营养琼脂，培养24 h后挑取单个菌落接种于5ml肉汤培养基，培养18h后用NS从原液稀释至10^-7共7个稀释度，然后用平板菌落记数得到浓度为105CFU·ml^-1的菌悬液备用。

1.3抗菌药物：由实施例1制备的皂苷。

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以1∶1充分旋转混匀，先用氯仿萃取，将萃取后的剩余水溶液用水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇萃取物浓缩干燥得总皂苷(molish反应呈阳性)，即为受试药。取开口箭皂苷20g加20ml蒸馏水稀释成1000mg/ml的原液，以巴氏德法冷藏备用。

2、方法和结果(试管二倍稀释法)

将装有1.0ml肉汤的带塞灭菌试管60支，按1-10编号，分6组排列于试管架，按无菌操作，分别在第一排试管中加入开口箭原液1.0ml，混匀后取出1.0ml放入第2管，同样混匀后从第2管取1.0ml放入第3管，依此法逐管稀释到第9管。第10管不加药物作为对照管，各管均加入浓度约为5×10⁵CFU·ml^-1的各病原指示菌菌液0.1ml，混匀后放入37℃培养箱中培养24h。将上述试管培养液分别取100μl涂布于营养琼脂平板，每管平行做2皿，37℃培养18h后观察结果。重复2次，无菌生长，表示该管药量即是受试药的最低抑菌浓度(MIC)。结果见表5。

                表5开口箭的体外抑菌活性

菌种                  稀释度        最低抑菌浓度(g·ml^-1)

金黄色葡萄球菌        64            0.063

表皮葡萄球菌          64            0.063

铜绿假单孢            64            0.063

乙型溶血性链球菌      8             0.25

大肠杆菌              8             0.25

肺炎克雷白氏菌        8             0.25

结果表明，开口箭对咽喉部常见致病菌如金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等有较好的体外抑菌作用。

试验例6本发明药物开口箭皂苷祛痰作用实验

1、材料

1.1开口箭提取物的制备

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以1∶1充分旋转混匀，先用氯仿萃取，将萃取后的剩余水溶液用水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇萃取物浓缩干燥得总皂苷(molish反应呈阳性)，即为受试药。

1.2药品  甲醇(AR)；NH₄Cl(AR)，河南焦作市化工三厂；酚红，光复精细化工研究所；NaHCO₃武汉市江北化学试剂厂。

1.3仪器  卡介苗注射器，金坛市城西乡南瑶注射器厂制造；UV-754型紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂。

1.4动物  昆明种小鼠，体重(22±2)g，由三峡大学实验动物中心提供。合格证号：0035537

2方法和结果

小鼠50只，♀♂各半，随机分成5组。各组按不同剂量(剂量按LD₅₀的1/10计算，2、3组较前一组递减一半)ig给药，给药体积为10ml·kg^-1体重，阳性对照组给0.15g·kg^-1的NH₄Cl溶液，阴性对照组给同体积的NS，每天一次，共给7次，术次给药前饥饿16h，给药后30min，腹腔注射5％酚红NS溶液0.5ml，注射30min后，处死动物，背位固定，分离气管，用5％NaHCO₃溶液冲洗，每次1.0ml，共洗3次，合并冲洗液，在546nm波长处测定OD值，与对照组进行比较。结果见表6。

表6开口箭提取物对小鼠气管断酚红排泌的影响(x±S，n＝10)

组别            剂量(mg·kg^-1)    OD值

生理盐水                        2.49±0.04

开口箭皂苷      2.45            2.72±0.02^***

开口箭皂苷      1.23            2.68±0.01^***

开口箭皂苷      0.62            2.67±0.01^***

氯化铵          0.15            2.57±0.03^**

^**P＜0.05   ^***P＜0.001 vs NS

结果表明，开口箭高、中、低剂量组气管段酚红排泌量的0D值较NS组为高，有非常显著性差异(P＜0.001)，而NH₄Cl组较NS组比较仅有显著性差异(P＜0.05)。

试验例7本发明药物开口箭皂苷对迟发型超敏反应的影响

1、材料

1.1开口箭提取物的制备：按实施例1的方法制备

开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以1∶1充分旋转混匀，先用氯仿萃取，将萃取后的剩余水溶液用水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇萃取物浓缩干燥得总皂苷(molish反应呈阳性)，即为受试药。

1.2药品  DNCB(AR)，上海浦江化工有限公司；丙酮(AR)，武汉市江北化学试剂厂。

1.3仪器  微量进样器，上海医用激光仪器厂。

1.4动物  昆明种小鼠，体重(22±2)g，由三峡大学实验动物中心提供。合格证号：0035537

2、方法

2.1对DNCB所致小鼠DTH的影响

小鼠40只，♀♂各半，随机分成4组。每只小鼠腹部剪毛，面积约2cm×2cm大小，将1.25％DNCB丙酮溶液50μl均匀涂抹在剪毛区致敏，(剂量按LD₅₀的1/10计算，2、3组较前一组递减一半)ig给药及致敏每天1次，连续8天，致敏后第8天将1.25％DNCB丙酮溶液20μl均匀涂抹于小鼠右耳两面攻击，左耳涂相同体积丙酮对照，24h后颈椎脱臼处死，用直径6mm打孔器冲下左右耳片，随即在电子天平上称重，用右耳重量减去左耳重量作为肿胀度，计算肿胀抑制率。结果见表7。

肿胀抑制率＝(阴性对照组差值-给药组差值)/阴性对照组差值×100％

3、结果

表7开口箭提取物对DNCB所致小鼠DTH的影响(x±S，n＝10)

组别          剂量(mg·kg^-1)   肿胀度        抑制率(％)

生理盐水                      8.82±0.55

开口箭皂苷    2.45            5.91±1.39    32.99

开口箭皂苷    1.23            6.55±0.90    25.74

开口箭皂苷    0.62            8.20±0.74    7.03

注：和生理盐水组相比，P＞0.05

结果表明，开口箭皂苷ig给药连续8天，对DNCB诱导的小鼠DTH无显著影响(P＞0.05)，说明开口箭皂苷具有一定的抗过敏作用，但作用较弱。

试验例8本发明药物开口箭皂苷急性毒性实验

1、材料

1.1药品制备  开口箭根茎48℃干燥过夜，药物粉碎机粉碎后过60目筛，以甲醇为溶剂，采用多功能强制渗漉罐在常压、65℃下提取，提取液过滤后用旋转蒸发仪浓缩(温度：48℃)，干燥得深棕色浸膏。将此浸膏和蒸馏水以1∶1充分旋转混匀，先用氯仿萃取，将萃取后的剩余水溶液用水饱和的正丁醇萃取，将正丁醇萃取物浓缩干燥得总皂苷(molish反应呈阳性)，即为受试药。

1.2动物  昆明种小鼠，体重18-22g，雌雄各半，孕鼠不用，给药量0.2mL/10g。

1.3仪器  卡介苗注射器，上海注射器厂.

2、方法和结果

本试验方法采用孙氏改良冠氏法测半数致死量LD₅₀，分为预试实验和正式实验。

2.1预试实验

预试实验：小白鼠10只，用100％，200％，300％的开口箭进行实验。结果：100％：4只全部正常。200％：3只实验，全部正常。300％：3只实验，死亡2只。(24小时后观察)。灌注200％：灌注100％药液后4小时，禁食5小时后再灌注同样剂量的100％药液。灌注300％：将100％药液灌注3次，每5小时灌注一次，灌注前1小时禁食。

一星期后观察，200％全部死亡，300％仅只1只幸存，另领取15只小白鼠，配17.5ml100％开口箭液，做100％，200％的实验。实验结果：100％全部正常，200％全部死亡。(每组5只)

预试结果：初步测出死亡率在0％-100％的剂量范围，实验结果表明。死亡率在0％的最大浓度为100％，死亡率在100％的最小浓度为200％。

2.2正式实验

小鼠50只，随机分为5组，称重并标记，组间浓度组公比为0.7，灌胃给药后，观察24小时后各死亡数。

2.2.1计算每组药量

V＝10(组数)×20(每组动物体重)×0.2ml/10g＝4ml为防止浪费，每组配5ml药液。

2.2.2计算母液体积及浓度

V母液＝5/(1-0.7)＝17ml    C浓度＝200％(最大致死量时的药液浓度)

2.2.3配溶液—低比值系列稀释

母液：取34g加蒸馏水至17ml，即得200％药液。

从17ml母液中吸取5ml置于干燥1号药瓶(浓度200％)供第一组用；向余下12ml母液(含药量24.0g)中加5ml蒸馏水至17ml，吸取5cm放于2号瓶中(浓度142.2％)，供第二组使用；向余下12ml药液(含药量16.9g)中加5ml蒸馏水至17ml，吸取5ml放于5号瓶(浓度49.6％)，供第五组使用。

2.2.4计算半数致死量

LD50＝lg-1[Xm-I*(∑P-0.5)]

其中Xm为最大剂量的对数值，I即相邻两组剂量比值的对数值，P为各组死亡数。

2.2.5实验相关记录

               表8开口箭急性毒性实验(n＝10)

剂量(mg·kg^-1)    死亡数       死亡率

159.9            4            0.4

113.6            2            0.2

79.6             1            0.1

56.4             0            0

39.7             0            0

由公式计算得LD₅₀＝37.19g·kg^-1，相当于生药148.7g·kg^-1，即相当于人日用剂量的2974倍，由此可知，开口箭的毒性很小。

纵上所述，本发明开口箭水溶物、开口箭脂溶物、开口箭皂苷三成分均有效，且在提取物配伍使用，发挥了协同增效的作用，且安全性高、可控性强，稳定，为临床提供了一种新的选择。

参考文献如下：

1.江苏新医学院编，中药大词典，上册，上海：上海科学技术出版社，1985，10。pp 907

2.湖北省革命委员会卫生局编，湖北中草药志(一)，武汉：湖北人民卫生出版社，1978，6。pp 146

3.兰州军区后勤部卫生部编，陕甘宁青中草药选，1971。pp 236

4.全国中草药汇编组编，全国中草药汇编，上册。北京：人民卫生出版社，1975，9。pp 365

5.瞿士辉，土家族药开口箭漱口液临床应用治疗咽喉炎45例[J]，中国民族民间医药杂志，1999，(3)：140

6.黄丽，廖全斌，邹坤，阮浩，聂丹丹，胡超林，胡艳亮。开口箭中甾体皂苷元的含量测定。三峡大学学报(自然科学版)2003，25，6，562-564(指导本科生论文)

7.Pan，W.B.；Chang，F.R.；Wu，Y.C.J.Nat.Prod.2000，63，861-863.

8.Pan，W，B.；Chang，F.R.；Wu，Y.C.Chem.Pharm.Bull.2000，48，1350-1353.

9.Pan，W.B.；Chang，F.R.；Wei，L.M.；Wu，Y.C.J.Nat.Prod 2003，65，232-239.