可形成颗粒的乙型肝炎病毒前核心蛋白

摘要

本发明提供了能形成颗粒的HBV前核心蛋白及检测该蛋白的方法。确定了形成HBV病毒(样)颗粒的新HBV前核心蛋白。本发明提供了该新HBV前核心蛋白。也提供了由该HBV前核心蛋白形成的核心样颗粒、病毒样颗粒。所述病毒样颗粒可用作疫苗、治疗剂。本发明也提供了该HBV前核心蛋白的测定法及抗HBV前核心蛋白抗体的测定法。

说明书

技术领域

本发明涉及可形成乙型肝炎病毒(HBV)核心样颗粒的HBV前核心蛋白。

技术背景

对病毒感染的诊断主要通过检测病毒或病毒相关成分(蛋白质或核酸)的方法以及检测由于病毒感染导致机体产生的特异性抗体的方法来进行。在乙型肝炎病毒(HBV)感染中，作为临床检查法引入了HBs抗原·抗体、HBc抗体、HBe抗原·抗体、HBV-DNA等诊断标志物。

通常，是否存在HBV感染可根据是否存在HBs抗原或HBc抗体得知。另外，不仅对于HBV的感染性，而且作为携带HBV的病态及恢复期、治疗效果的判断的指标，也使用对HBe抗原·抗体、HBV-DNA的量的测定。特别是由于HBe抗原·抗体免疫测定法操作简便且花费不高，所以该方法最为常用，但是对于不能产生·分泌HBe抗原的前核心突变株，发现存在HBe抗原为阴性而HBV的增殖旺盛，从而存在感染性及免疫原性强，病态也活跃的病例。另一方面，不论是野生株或突变株，反映HBV的增殖·复制状态的HBV-DNA量的测定都是重要的，因此存在预处理方法或测定方法繁琐、再现性和稳定性不够的问题。

最近，研发了不考虑HBV核心相关抗体(HBc抗体及HBe抗体)的存在及突变株的出现，而测定被认为是反映HBV的增殖·复制状态的HBV核心相关抗原的方法。Kimura等人(Journal of Clinical Microbiology，40，439-445，2002)研发了使用对HBV核心相关抗原(HBV前核心/核心基因产物，其包含HBc抗原和HBe抗原)具有特异性的单克隆抗体，通过简单的预处理法同时测定血清中HBc抗原和HBe抗原的免疫测定法，显示其与检测病毒基因组的NAT检测法存在相关性。

至今为止的文献中报道：HBV前核心/核心基因编码全长由212个氨基酸残基(氨基酸编号：-29～183(以HBc抗原的第一个氨基酸为1的情况，以下同样))组成的蛋白质，其N末端存在19个残基的信号肽。信号肽由疏水性氨基酸残基组成，信号序列的功能为将分泌蛋白与膜结合。此处信号序列是指由-29～-11位的氨基酸组成的序列。

前核心蛋白一旦被翻译，即穿过内质网膜，在切除19个残基的信号肽后，成为已被切掉了C末端核酸结合结构域的HBe抗原(氨基酸编号：-10～149)而分泌至血液中。以往认为该HBe抗原在血液中与白蛋白和γ-球蛋白等血清蛋白结合而存在，因此没有关于形成HBV颗粒的报道。另外，虽然见到HBe抗原参与维持免疫耐受、抑制病毒复制等的报道，但其对于HBV的复制不是必不可少的，关于其生物学功能还有诸多不清楚之处。

另外，HBV前核心/核心基因具有第二种转录起始信号，由该起始信号开始被转录翻译的产物成为HBc抗原(氨基酸编号：1～183)，其在摄入HBV前基因组的同时形成病毒壳体，装配上由HBs抗原组成的被膜后，以完整的病毒颗粒(丹氏粒)释放至细胞外。据报道，该HBc抗原中，如果存在1～144位氨基酸，则会导致形成核心颗粒，但认为形成感染性病毒核心颗粒的分子由1～183位氨基酸序列的蛋白构成。

如上所述，HBc抗原和HBe抗原虽然为具有大部分共同序列的蛋白质，但还具有很多不同的特性。对这些性质的不同起到重要作用的是位于HBe抗原的-7位氨基酸的半胱氨酸残基。该半胱氨酸与同一分子内的氨基酸61位处的半胱氨酸残基形成二硫键，从而产生e抗原性(M.Nassal和A.Rieger，Journal of Virology，67；4307-4315，1993)。如果将-7位处的半胱氨酸突变为其它的氨基酸使所述二硫键不能形成时，则不能产生HBe抗原的构象，由此可见所述二硫键的重要性。

另一方面，由于HBc抗原是从氨基酸第1位处开始转录并翻译的，所以不具有氨基酸-7位处的半胱氨酸残基而形成了HBc的构象，2分子HBc蛋白在氨基酸61位处的半胱氨酸残基之间形成分子间二硫键，从而产生同型二聚体，形成病毒壳体(核心颗粒)。

HBV患者血清中存在的HBV核心相关抗原主要为HBc抗原(氨基酸编号：1～183位)，其构成具有感染性的丹氏粒、以及与HBc抗原在氨基酸序列上大体上相同但与HBc抗原具有不同抗原性的分泌性HBe抗原(氨基酸编号：-10～149位)。但是，TAKAHASHI等人(Journal ofImmunology，147，3156-3160，1991)报道了除此之外血液中作为小分子也存在显示HBe抗原性前HBe抗原(氨基酸编号：-29～149位)。

他们将合并的血清超速离心分离后，从其上清用抗HBe单克隆抗体的亲和柱纯化，得到具有HBe抗原性的蛋白并确定了其序列。认为HBe抗原蛋白如前所述，不形成病毒颗粒而存在于血液中。他们不对作为HBV被膜蛋白的HBs抗原进行去除(破坏)处理或不对病毒颗粒、核心颗粒进行破坏性处理，对经纯化的HBe抗原测定了序列，认为具有他们确定的信号序列的HBe抗原(氨基酸编号：-29～149位)在血清中游离存在。

另外，已报道了丹氏粒中存在，不含有HBV-DNA的中空颗粒(SAKAMOTO等，Laboratory Investigation，48，678-682，1983)，以及含有较通常短的经剪接的HBV-DNA的不可复制型缺损颗粒(TERRE等，Journal of Virology，65，5539-5543，1991)，但对形成该颗粒的HBV蛋白并未进行详细的分析。

由此可见，在这些文献中解析的血液中HBV核心相关抗原的生物化学分析是不充分的，并且也未揭示被认为反映HBV增殖·复制状态的HBV核心相关抗原作为病毒标志物在血液中的存在形式。

发明的公开

对HBV具有高度临床有用性的NAT检测目前有PCR法及TMA法，但它们存在检测成本高而且操作繁琐这样的问题。另外，由于使用了基因扩增法，当扩增用引物与目的DNA不一致时会产生假阴性结果。另一方面，虽然免疫测定法操作简单且可进行廉价的测定，但在作为增殖标志物的现行HBe抗原测定法中，在HBe抗体存在下不能测定以免疫复合体形式存在的HBe抗原，而且对于不能产生·分泌HBe抗原的前核心蛋白突变株、核心蛋白启动子突变株所检测的HBe抗原为阴性。另外，HBc抗原测定法由于与HBV-DNA量相关，预处理繁琐且灵敏性不足，所以未得到临床应用。

因此，本发明的目的在于：对被认为可在筛查乙型肝炎、慢性乙型肝炎患者的治疗中的监测等中临床应用的HBV核心相关抗原进行生物化学分析、确定反映HBV增殖·复制状态的血液中HBV核心相关抗原的分子类型。

根据这些分析，可发现对HBV感染患者的诊断等有用的分子类型，以及开发出新的诊断试剂。

另外，根据对HBV核心相关抗原的存在形式以及对其功能的分析，可开发出新的HBV疫苗、治疗剂。

本发明涉及对血液中的HBV颗粒及HBV相关蛋白使用蔗糖密度梯度离心法、ELISA和电泳法等，分离纯化HBV核心相关抗原，分离与以前报道的HBe抗原及HBc抗原不同的抗原，通过质谱法确定形成核心样颗粒的新分子。在本发明的一个方案中提供含有全部或部分信号序列的可形成病毒样颗粒的HBV前核心蛋白。

此处部分信号序列是指在信号序列的19个残基中自N末端起多于或等于1个残基的序列。另外，所述HBV前核心蛋白的C末端为自氨基酸编号150位以后的RRRGR的任一位置处截断而产生。进一步地，在信号序列或HBe序列部分(氨基酸编号：-10～149位)中也可含有突变，所允许的突变范围为仍可形成核心样颗粒。所述HBV前核心蛋白最优选地为由序列号1所示的氨基酸序列组成的多肽。

另外，本发明提供含有上述HBV前核心蛋白组成的HBV核心样颗粒或HBV病毒样颗粒。

另外，本发明提供包含所述HBV前核心蛋白或由该蛋白形成的HBV核心样颗粒、HBV病毒样颗粒的HBV诊断试剂或试剂盒。

进一步地，本发明提供测定所述HBV前核心蛋白的方法、或诊断试剂、诊断试剂盒。

该HBV前核心蛋白的测定法可包括使HBV前核心蛋白暴露的步骤、使HBV前核心蛋白与识别其的探测剂结合的步骤。另外，使HBV前核心蛋白暴露的步骤可使用表面活性剂处理或添加表面活性剂。所述表面活性剂没有限定，虽然非离子型表面活性剂也有效，但特别适用的是阴离子型表面活性剂。另外，在阴离子型表面活性剂中加入了两性表面活性剂的表面活性剂、进而加入了非离子型表面活性剂的表面活性剂也是有效的。

进一步地，将与前述HBV前核心蛋白结合的探测剂也可为结合氨基酸编号为-28～-11位序列的探测剂。所述探测剂可为抗体。

另外，也可通过利用抗HBs抗体进行免疫沉淀，测定沉淀物中HBV前核心/核心蛋白，仅对已除去游离HBe抗原的颗粒状HBV前核心/核心蛋白进行特异性测定。所述免疫沉淀也可使用结合HBs抗原的探测剂实施分离的替代方法。

根据上述测定法所测定的HBV前核心蛋白的测定值中包含HBe抗原的测定值时，可通过减去HBe抗原的测定值算出样本中颗粒状HBV前核心蛋白的值而进行测定。进一步地，通过从所述值减去HBc抗原的测定值，可测定样本中颗粒状HBV前核心蛋白的正确值。这样测定的颗粒状HBV前核心蛋白的定量值可用作HBV感染的病态标志。

进一步地，本发明提供诊断试剂，其包含阴离子型表面活性剂和识别HBV前核心蛋白-28～150位氨基酸的抗体的测定试剂盒，以及测定HBe抗原的试剂盒。

作为本发明的其它形式，提供含有HBV前核心蛋白组成的HBV疫苗以及治疗剂。

此外，本发明提供测定针对颗粒状HBV前核心蛋白的抗体的方法以及诊断试剂、诊断试剂盒。

此外，上述HBV前核心蛋白颗粒可作为抗原使用。所述颗粒可通过自血清等中进行密度梯度离心、免疫沉淀等纯化获得，通过用表面活性剂等去除被膜，可暴露出HBV前核心蛋白抗原。另外，可自重组蛋白制备颗粒状HBV前核心蛋白。

通过使用该抗原，可测定与HBc抗体、HBe抗体不同的针对颗粒状HBV前核心蛋白的抗体。

附图的简单说明

图1是显示HBV前核心蛋白、HBe抗原、具有信号序列的HBe抗原和HBc抗原的氨基酸区域，并显示各抗原在血液中的形式的图。

图2是显示使用蔗糖密度梯度离心法分离后的HBe抗原阳性血清的HBV抗原、HBV DNA的动态的图。分别显示了各级分中HBV核心相关抗原(黑正方形)、HBc抗原(●)、HBs抗原(◇)、HBe抗原(□)和HBV DNA(○)，级分密度用虚线表示。

图3是显示对使用蔗糖密度梯度离心法分离的HBV核心相关抗原峰级分再次用蔗糖密度梯度离心法分离时，HBV抗原、HBV DNA的动态的图。分别显示了各级分中HBV核心相关抗原(黑正方形)、HBc抗原(●)、HBs抗原(◇)和HBV DNA(○)，级分密度用虚线表示。

图4是显示HBV抗原凝胶过滤的动态的图。上图为对使用蔗糖密度梯度离心法分离的HBV核心相关抗原峰级分不经处理而进行凝胶过滤的情况。下图为对同样的样品经3％NP-40处理后进行凝胶过滤的情况。显示了各级分中的HBV核心相关抗原(黑正方形)、HBc抗原(●)的量。分子量标志物的洗脱位置在上部显示。

图5是显示对HBe抗原阳性血清及其密度梯度离心级分进行Western印迹分析的结果的电泳图，是用照片代替该图的图。密度梯度离心级分1～20对应于蔗糖浓度10～60％。HB50为只与HBc抗原反应的单克隆抗体，HB91为与HBc抗原及HBe抗原均反应的单克隆抗体。

图6是显示在不同的病例情况下，颗粒状前核心蛋白相对于总前核心/核心蛋白的比率的图。HBe抗原阳性病例用(●)表示，HBe抗体阳性病例用(○)表示。

发明的实施方式

以下对本发明进行详细说明。

本发明新确定的HBV前核心蛋白是指包含信号序列并且可形成HBV病毒样颗粒的蛋白质。在血液中本发明蛋白质的主要分子为分子量22000道尔顿的p22抗原。p22抗原的代表性氨基酸序列为序列号1中所述的由178个氨基酸组成的HBV前核心抗原类似的抗原。通过获得特异识别该抗原的抗体，与样本的预处理法相结合构建的测定体系，可在抗体存在下测定HBV核心相关抗原。

在一般被称为HBV前核心/核心蛋白的蛋白中包括HBe抗原(HBV e蛋白)、HBc抗原(HBV核心蛋白)及其它的HBV前核心/核心基因产物。在本发明中所谈及的“HBV前核心蛋白”时，除非特别指出都是指包含信号序列的可形成颗粒的HBV前核心/核心基因产物。其代表性蛋白为序列表1所示的蛋白。另外，“HBV核心相关抗原”是指包含HBc抗原(HBV核心蛋白)、HBe抗原(HBV e蛋白)的HBV前核心/核心基因产物。

首先，对乙型肝炎患者血清进行蔗糖密度梯度离心分级，在测定各级分的HBV核心相关抗原时，可检测到与HBe抗原具有相同密度的位于1.05附近的一个峰，在密度1.17附近的与HBc抗原及HBV-DNA几乎位于同一级分中，还检测到了一个峰。接下来，对密度1.17附近的峰使用低密度蔗糖密度梯度离心再分级，HBc抗原与HBV-DNA在同一级分中显示出峰，但HBV核心相关抗原只在较低密度级分中显示峰，在该级分中检出了病毒被膜蛋白HBs抗原。

即，认为在乙型肝炎患者血清中，除了感染性的丹氏粒外还存在少量比重较小的由HBV核心相关抗原形成的病毒样颗粒。

另外，凝胶过滤包含由该HBV核心相关抗原形成的颗粒和丹氏粒的级分时，由HBc抗原及HBV核心相关抗原组成的颗粒分别洗脱至孔隙级分(void fraction)中。另外，对同一级分用ノニデツトNP-40(NP-40：ナカライテスク)处理，去除被膜蛋白HBs抗原后再凝胶过滤时，由HBc抗原和HBV核心相关抗原组成的颗粒仍然分别洗脱至孔隙级分。由此可见由HBc抗原及HBV核心相关抗原组成的各种颗粒形成了即使用会剥离被膜蛋白HBs抗原的表面活性剂处理也不会被破坏的坚固壳体结构。

接下来，使用Western印迹法进行分析表明该HBV核心相关抗原与HBc抗原具有几乎相同的分子量，为22000道尔顿，但是该HBV核心相关抗原不与单克隆抗体(HB50)反应，其中所述单克隆抗体(HB50)与HBc抗原具有的C末端核酸结合区域特异结合。即，由该分子量可见，所述HBV核心相关抗原不含有C末端核酸结合区域，可认为是未去除信号序列的前核心基因产物(p22抗原)。

p22抗原通过SDS-PAGE法分离后，从聚丙烯酰胺凝胶切出，使用基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱法(Carr等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York Units，1997)测定氨基酸序列，表明p22抗原为由序列号1所述的178个氨基酸组成的HBV前核心蛋白。

该确定了氨基酸序列的HBV核心相关抗原下文中称为HBV前核心蛋白，但本发明的HBV前核心蛋白与以前TAKAHASHI等人(Journal ofImmunology，147，3156-3160，1991)报道的HBV前核心蛋白(前HBe抗原)进行比较，发现不存在N末端(-29位)的甲硫氨酸，且-28位的谷氨酰胺被乙酰化。另外，C末端在作为HBe抗原C末端的149位的缬氨酸后结合有精氨酸，所以至少还存在第150位氨基酸。该HBV前核心蛋白不被单克隆抗体HB50识别，所以可能含有直至第154位的氨基酸，其中所述单克隆抗体HB50识别HBV核酸结合部位中含有SPRRR的部位。

由于本发明的HBV前核心蛋白形成不完整的病毒颗粒(病毒样颗粒)，因此容易推导出该蛋白质可在形成衣壳时与HBc抗原竞争而阻碍病毒复制。因此提示本发明的HBV前核心蛋白可用作HBV治疗剂。

本发明的HBV前核心蛋白在HBV感染患者体内形成HBV病毒样颗粒。另外本发明也教导了该HBV前核心蛋白在完整HBV病毒颗粒中存在。即，认为HBV前核心蛋白与HBc抗原共同形成了HBV核衣壳。因此认为对该HBV前核心蛋白的测定可起到对HBV感染的诊断、对肝炎、肝硬化或肝癌的病态诊断、标志物的作用。

本发明的HBV前核心蛋白与已知的HBe抗原、HBc抗原在其功能和氨基酸序列上是不同的。但是由于存在功能上相似的性质和氨基酸序列的重叠，所以在测定所述HBV前核心蛋白时有必要与HBe抗原、HBc抗原进行区别而测定。但是如以下实施例7所示，所述HBV前核心/核心蛋白与HBc抗原的量的比为12∶1～158∶1，最少也相差12倍。

本发明的HBV前核心蛋白与HBe抗原或Takahashi等报道的具有信号肽的HBe抗原的不同之处在于：从功能上说，前者形成HBV核心样颗粒(病毒样颗粒)，而后者以游离状态在血液中与血清蛋白结合存在。关于形成核心样颗粒(病毒样颗粒)形成这一功能，该HBV前核心蛋白与HBc抗原几乎具有相同的功能。由于该HBV前核心蛋白具有形成颗粒的特性，可推测其与HBe抗原相比较而言，具有与HBc抗原更相近的结构，可认为在氨基酸-7位处的半胱氨酸与氨基酸61位处的半胱氨酸间未形成二硫键。

如下述实施例9所示，使用HBV核心相关抗原测定体系检测到的HBV核心相关抗原(HBV前核心/核心蛋白)用以前测定HBc抗原的方法或测定HBe抗原的方法测定时，不能检测到HBc抗原或HBe抗原。认为这表明了：(1)HBV核心相关抗原包含许多本发明的HBV前核心蛋白。(2)以前所获得的结合HBc抗原或HBe抗原的抗体有的不结合HBV前核心蛋白，HBV前核心抗原的抗原性与HBc抗原或HBe抗原不同。

这表明了本发明的HBV前核心蛋白用以前测定HBc抗原的方法或测定HBe抗原的方法几乎不能检测到。即认为根据木村等人所述的HBV核心相关抗原测定法才开始有可能对其进行测定。HBV前核心蛋白根据HBV核心相关抗原测定法可检测到。所述测定体系的特征在于：用表面活性剂处理含有HBV前核心蛋白的样本，在表面活性剂存在下与抗体反应。因此，HBV前核心蛋白中的抗原表位在表面活性剂存在下必须是稳定的。并且，抗体也必须使用在表面活性剂存在下功能稳定的抗体。

此类抗体识别的表位合适地为HBV核心蛋白的氨基酸1-19位、21-40位、31-49位、131-140位的线性表位、以及1-81位的结构表位。组合识别这些表位的抗体可测定HBV前核心蛋白。虽然组合两种或两种以上识别这些表位的抗体可检测出HBV前核心蛋白，但特别优选的组合为识别氨基酸21-40位和31-49位的表位的抗体的组合、识别氨基酸1-19位和21-40位的表位的抗体的组合、识别氨基酸21-40位和31-49位的表位的抗体的组合。向这些组合中加入识别其它表位的抗体可提高检测灵敏度。

检测所使用的抗体必需为在表面活性剂存在下能与上述表位结合的抗体。测定HBV前核心蛋白所使用的表面活性剂优选阴离子型表面活性剂，但将阴离子型表面活性剂与两性离子表面活性剂组合、以及将阴离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂以及非离子型表面活性剂组合可进一步提高灵敏度。阴离子型表面活性剂中虽然最优选SDS，但使用其它的阴离子型表面活性剂也是有效的，可将SDS用其它结构类似的阴离子型表面活性剂替换，使HBV前核心蛋白的上述表位暴露，处于能与抗体结合的状态。

另外，本发明的HBV前核心蛋白与已知的HBe抗原、Takahashi等人报道的具有信号肽的HBe抗原、HBc抗原在氨基酸序列上的不同点在图1中显示。认为代表性的HBV前核心/核心蛋白是由本发明-28位～150位氨基酸序列组成的多肽。与之不同的是，HBe抗原是由-10～149位氨基酸序列组成的多肽，具有信号肽的HBe抗原是由-29～149位氨基酸序列组成的多肽，HBc抗原是由1～183位氨基酸序列组成的多肽。

由上述可见，将本发明的HBV前核心蛋白与HBe抗原、具有信号肽的HBe抗原、HBc抗原进行分离并测定并非易事，但可利用是否可形成病毒(样)颗粒的功能以及氨基酸序列的不同而分离。

首先，为了将本发明的HBV前核心蛋白与HBe抗原或具有信号肽的HBe抗原进行分离，利用了所述HBV前核心蛋白可形成HBV样颗粒，而HBe抗原或具有信号肽的HBe抗原以游离状态(在本申请中，与抗体结合的Hbe抗原也游离)存在这一特点。实际操作中为：

(1)将破坏处理病毒颗粒前所测定的测定值与破坏处理病毒颗粒后所测定的测定值进行比较的方法。即，自破坏处理病毒颗粒后所测定的测定值减去破坏处理病毒颗粒前所测定的测定值而进行测定。

(2)此外，还有将病毒(样)颗粒分离，测定其中含有的HBV前核心蛋白的方法。所述分离病毒(样)颗粒的方法例如有通过密度梯度离心将游离的抗原级分与形成病毒(样)颗粒的级分分开的方法，在含有病毒(样)颗粒的级分中测定HBV前核心/核心蛋白即可。除了利用密度梯度离心法将游离抗原与病毒(样)颗粒分离的方法外，也可使用特异性浓缩病毒(样)颗粒的方法或使用特异性除去游离抗原的方法，在分离后测定HBV前核心/核心蛋白的量即可。

作为这样的方法之一可例举如使用抗HBs抗体实施免疫沉淀的方法。通过使用抗HBs抗体实施免疫沉淀，测定沉淀物中HBV前核心/核心蛋白，可只特异性测定除去了HBe抗原的颗粒状HBV前核心/核心蛋白。

另外，由于HBV前核心蛋白与HBc抗原在核心(样)颗粒(病毒(样)颗粒)的形成功能上相似，为了进行分离并测定，考虑使用与组成它们的氨基酸序列的不同部分特异结合(识别)的探测剂进行分离的方法。即，为了选择性测定HBV前核心蛋白，使用与-29～-10位的氨基酸结合的探测剂即可；为了选择性测定HBc抗原，使用与151～183位结合的探测剂即可。

另外，使用与HBV前核心蛋白及HBc抗原这两者均结合的探测剂可测定HBV前核心蛋白+HBc抗原的抗原量，此后特异性测定并减去其中任一抗原(蛋白)的量，可测定各抗原(蛋白)的量。

实际上，为了测定样本中的HBV前核心蛋白必需进行破坏病毒样颗粒、使HBV前核心蛋白暴露的步骤。在此步骤中使用了去除病毒被膜蛋白HBs抗原从而使HBV前核心蛋白游离的处理剂。处理方法包括碱处理法，通过使用NaOH等处理，使HBs抗原剥离，从而HBV内部抗原游离。此外，作为其它的处理剂可使用表面活性剂，使用Triton X-100或NonidetP-40这样的非离子型表面活性剂、或使用SDS或肌氨酸钠这样的阴离子型表面活性剂是合适的。进一步地，与日本专利3171827号中所述的那样，阴离子型表面活性剂及其它的表面活性剂的组合也是有效的。

不进行所述破坏病毒样颗粒、使HBV前核心蛋白暴露的步骤，使用识别-29～149位氨基酸的探测剂进行测定时，则成为测定游离的HBe抗原或具有信号肽的HBe抗原。因此当不对游离抗原与病毒样颗粒进行分离而测定样本中的抗原蛋白时，可认为自经表面活性剂等处理获得的测定值减去不经表面活性剂等处理获得的HBe抗原测定值即得到了颗粒状HBV前核心/核心蛋白的测定值。

在使用表面活性剂将病毒颗粒破坏、使HBV前核心蛋白暴露(露出)的步骤后，有使用识别HBV前核心蛋白的探测剂进行测定的步骤。在此步骤中，通过使用识别氨基酸序列-28～150位的探测剂可测定HBV前核心蛋白。作为探测剂，只要是为与所述前核心蛋白结合的探测剂即可，可使用抗体、受体、适配子(aptamer)、配体等。

作为测定法，只要是利用HBV前核心蛋白与探测剂结合的测定法即可，代表性的测定法有酶联抗体免疫法等。为了分离HBV前核心蛋白和HBc抗原并进行测定，可使用识别作为HBV前核心蛋白-28～-11位的探测剂、识别HBc抗原151～183位的探测剂。但是，也可使用识别作为HBV前核心蛋白和HBc抗原共有区域的1-150位的探测剂测定HBV前核心蛋白和HBc抗原的总量，然后使用识别151～183位的探测剂测定HBc抗原的量，再从总量中减去HBc抗原的量，从而确定HBV前核心蛋白的量。

实施例

以下的实施例是为了举例说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1使用蔗糖密度梯度离心法对HBV核心相关抗原进行分级

(A)使用10～60％蔗糖密度梯度离心法进行分级

在TNE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA]中溶解蔗糖分别产生10％、20％、30％、40％、50％、60％的蔗糖溶液，从密度最大的60％蔗糖溶液起依次取1.7ml小心地置于12ml超离心管底部，室温放置6小时。

将经制备的HBe抗原阳性血清1ml置于蔗糖密度梯度液上，使用Sw40Ti转头(Beckman)于33.4Krpm，4℃超速离心分离15小时后，自上面开始分别取300μl，获得40个级分。计算每一级分的密度并测定HBV核心相关抗原(PCT申请号：PCT/JP01/06947)、HBc抗原(PCT申请号：PCT/JP01/06947)、HBs抗原(ダイナボツド)、HBe抗原(ダイナボツド)、HBV-DNA PCR(罗氏·诊断技术公司)时，发现一部分HBV核心相关抗原与HBe抗原显示为相同的密度峰，但大部分HBV核心相关抗原在HBV-DNA PCR峰附近检出(图2)。

(B)使用低密度梯度的蔗糖密度梯度离心法进行再分级

将30％、40％、50％的蔗糖溶液从密度最大的50％蔗糖溶液起依次取3.4ml小心地置于12ml超离心管底部，室温放置6小时。将(A)的第24号与25号的峰级分用TE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]2倍稀释后置于所制备的蔗糖密度梯度液上，使用Sw40Ti转头(Beckman)于33.4Krpm，4℃超速离心分离15小时后，自上面开始分别取300μl，获得40个级分。计算每一级分的密度并测定HBV核心相关抗原(PCT申请号：PCT/JP01/06947，实施例5)、HBc抗原(PCT申请号：PCT/JP01/06947，实施例6)、HBs抗原、HBV-DNA PCR时，HBV核心相关抗原的峰与HBV-DNA PCR峰相比较位于低密度级分的位置，该级分中含有HBs抗原(图3)。每一峰经透析后于4℃保存。

实施例2用NP-40处理的凝胶过滤

将上述实施例1(A)中分级的峰级分(24-25号)用经含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)(PBS)平衡的Superose 6 HR(Amersham)进行凝胶过滤，HBV核心相关抗原和HBc抗原的颗粒分别洗脱入孔隙级分中(图4上图)。另一方面，向上述实施例1(A)中分级的峰级分(24-25号)中加入终浓度为3％的NP-40，在37℃加热15分钟去除HBs抗原。用经含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)(PBS)平衡的Superose 6 HR(Amersham)进行凝胶过滤，由HBV核心相关抗原和HBc抗原形成的裸颗粒分别洗脱入孔隙级分中(图4下图)。Superose 6 HR的孔隙级分分子量大于等于40,000,000，认为这些分子是构成病毒壳体样颗粒结构的成分。

实施例3使用Western印迹法进行分析

对HBe抗原阳性血清使用实施例1(A)所述的相同方法进行蔗糖密度梯度离心，自上清开始分别取600μl，获得20个级分。对这些级分及HBe抗原阳性血清进行SDS-PAGE并转移至PVDF膜(Immobilon，Millipore)后，使用单克隆抗体HB91及单克隆抗体HB50进行Western印迹，其中所述HB91识别HBc抗原与HBe抗原这两者，HB50为对HBc抗原C末端核酸结合区特异的单克隆抗体，检测到了分子量约为22000道尔顿的HBV核心相关抗原(图5上图)。另外还明确了该HBV核心相关抗原与HB91反应而不与HB50反应(图5下图)。

将HB50抗体进行表位分析，发现其不仅识别168-176位的氨基酸(SQSPRRRRS)，此外还与141-159位的肽(STLPETTVVRRRGRSPRRR)以及150-167位的肽(RRRGRSPRRRTPSPRRRR)反应。这些肽共有序列为SPRRR，这些序列是与HB50抗体结合的最小必需序列。即，由于所述SPRRR序列在155位之后存在，认为本发明的HBV前核心/核心蛋白不存在155位之后的序列。由此可见单独以HB50抗体作为标识抗体的HBc抗原测定体系所测定的峰与HBV前核心/核心蛋白的峰不重叠(图2、图3)。

实施例4  使用MALDI质谱法分析氨基酸序列

由实施例1(A)所述方法获得的HBV核心相关抗原级分用经含有0.15M NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH7.3)(PBS)平衡的Superose 6 HR(Amersham)进行凝胶过滤时，由HBV核心相关抗原和HBc抗原形成的颗粒洗脱入孔隙级分中。将该孔隙级分置于含有1％NP-40、20％蔗糖的TNE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 7.5)，150mM NaCl，1mM EDTA]上，使用Sw40Ti转头(Beckman)于33.4Krpm，4℃超速离心分离15小时后，回收含有HBV核心相关抗原颗粒的沉淀物。

将所述沉淀物经SDS-PAGE分离，切下22kDa的HBV核心相关抗原带，用胰蛋白酶消化后，用Voyager-DE STR(Applied Biosystems)进行MALDI-TOP质谱分析。结果检测到与序列号2、3、4、5和6的序列对应的5种肽。其中序列号2的肽N末端被乙酰化。

实施例5 HBV核心相关抗原(前核心/核心蛋白)的检测及测定法

将抗HBV核心抗原的单克隆抗体HB44(识别位点为31-49位氨基酸)、HB61(识别位点为131-140位氨基酸)以及HB114(识别位点为1-81位氨基酸)用0.5M NaCl、0.1M碳酸缓冲液(pH9.6)稀释至终浓度分别为2μg/ml、1μg/ml、1μg/ml，以100μl/孔分别加至黑色96孔微孔板(ヌンク社)中，4℃静置过夜。用0.4ml含有0.15M NaCl的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗两次，加入0.4ml封闭液(0.5％酪蛋白钠，3％蔗糖，150mM NaCl，10mM磷酸缓冲液(pH7.4))，然后室温静置2小时。弃去封闭液后，真空干燥。

向100μl血清中加入50μl处理液(15％SDS、2％吐温60)，70℃处理30分钟，取50μl用作测定样本。

向上述孔中加入100μl反应缓冲液和50μl测定样本，室温反应2小时。

用0.4ml洗液(0.05％吐温20，0.15M NaCl，10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4))洗，洗5次后，将碱性磷酸酶(AP)标记的单克隆抗体HB91(识别部位1-19位氨基酸)及HB110(识别部位21-40位氨基酸)分别稀释至0.1μg/ml、0.5μg/ml，以100μl/孔添加，室温反应1小时。用0.4ml洗液洗6次后，加入100μl用作发光底物的CDP-Star with EmeraldII(TROPIX社)溶液，室温反应20分钟后测定发光。

实施例6 测定HBc抗原

(A)制备固定有抗体的板

将与HBc抗原及HBe抗原均反应的3种单克隆抗体HB44(识别部位31-49位氨基酸)、HB61(识别部位131-140位氨基酸)及HB114(识别部位1-81位氨基酸)敏化并固定在微量滴定板孔中。用PBS洗，然后用含有酪蛋白的溶液封闭，除去封闭液并干燥。

(B)样本的预处理

将50μl预处理液(15％十二烷基硫酸钠[SDS]、3％CHAPS、1％十六烷基三甲基溴化铵)与100μl样本(血清、血浆等)混合，70℃处理30分钟。

(C)一级反应

向固定有抗体的各孔中加入100μl反应缓冲液(pH8.0)及50μl经预处理的样本，温和搅拌下室温反应2小时。

(D)二级反应

洗孔后，加入100μl含有碱性磷酸酶标记的HB50(识别部位168-176位氨基酸)单克隆抗体的溶液，室温反应1小时。

(E)底物反应

洗孔后，加入100μl CDP Star with Emerald II(Applied Biosystems)溶液，室温反应20分钟后，用微量板发光计测定各孔的发光量。

实施例7 样本中HBV前核心蛋白、HBe抗原、HBc抗原的测定及其比值的计算

根据上述实施例1(A)的方法，对7个血清样本进行蔗糖密度梯度离心而分级。对每一样本，将含有低密度游离HBe抗原的级分(如图1中的1-19级分)和含有高密度病毒颗粒的级分(如图1中的20及其以后级分)分开；用实施例5及实施例6的方法分别测定各抗原。

低密度级分用实施例5的方法测定时，测定的级分是不含有病毒颗粒的游离HBe抗原。另外，高密度级分用实施例5的方法测定时，由于该测定方法测定的是HBc抗原与颗粒状前核心蛋白的和，用实施例5所测定的值减去实施例6的值可计算出颗粒状HBV前核心蛋白的值。在各样本中将这样测定并计算出的HBe抗原、HBc抗原、HBV前核心蛋白计算它们的比值(表1)。

表1

 样本 HBV前核心蛋白/HBe 抗原HBV前核心蛋白/HBc抗原 BBI PHM935A-14 BBI PHM935A-16 BBI PHJ201-04 BBI PHJ201-07 BBI PHJ201-13 ProMedDex#101499 ProMedDex#99077 13.437 6.321 0.589 1.367 0.296 0.025 1.65327.236158.35222.07044.85333.74312.03112.779 平均 3.38444.438

HBV前核心蛋白：HBe抗原为13∶1～1∶40，根据样本的不同，各抗原、蛋白的含量也不同。另一方面，HBV前核心蛋白：HBc抗原的范围为12∶1～158∶1，在所有样本中HBV前核心蛋白的含量均较多。

表2根据密度梯度离心分别测定HBe抗原、HBc抗原及颗粒状HBV前核心蛋白

    样品名称           HBc抗原   低密度  高密度  高密度比      A       B    B/(A+B)    pg/ml    pg/ml    ％       HBV前核心/核心蛋白  低密度  高密度     高密度比    C        D       D/(C+D)  pg/ml     pg/ml      ％    颗粒状前核心蛋白                 比  E＝D-B      E/(C+D)  pg/ml         ％ BBI PHM901-06 BBI PHM907-10 BBI PHM921-06 BBI PHM922-12 BCP HBV6278-11 Nabi SB0408-J BBI PHM935A-14 BBI PHM935A-16 ProMedDx#9990776 ProMedDx#10149975 01 1670 01 1351 01 3567 01 2296 01 1188 01 2877    100    902       90％    672    137,407   100％    3,066  164,303   98％    1,685  171,323   99％    107    3,511     97％    1,921  63,059    97％    117    3,605     97％    3,199  105,916   97％    98     13,630    99％    539    22,518    98％    31     2,172     99％    12     578       98％    108    4,863     98％  809       1,038      56％  22,735    2,297      9％  1,436     1,410      50％  12,977    9,910      43％  2,217,048 1,027,110  32％  753,697   1,771,119  70％  291,285   4,690,058  94％  63,713    573,768    90％  487,502   805,856    62％  1,708,934 43,372     2％  226,685   137,038    38％  768,967   351,768    31％  1,639,314 354,521    18％  386,067   36,338     9％  1,393     2,088      60％  79,403    72,987     48％  1,038         56％  2,297         9％  1,410         50％  9,007         39％  889,703       27％  1,606,816     64％  4,518,735     91％  570,257       89％  742,797       57％  39,767        2％  31,122        9％  338,138       30％  332,004       17％  34,166        8％  1,509         43％  68,124        45％

各级分中HBc抗原、HBV核心相关抗原的测定值以及由此计算的颗粒状前核心蛋白浓度在表2中给出。在可定量的所有例子中，90％或其以上的HBc抗原在高密度级分中存在。低密度级分中存在的HBV前核心/核心蛋白为HBe抗原，高密度级分中存在的HBV前核心/核心蛋白为HBc抗原与颗粒状HBV前核心蛋白。因此自高密度HBV前核心/核心蛋白浓度中减去HBc抗原浓度可计算出颗粒状前核心蛋白浓度。

实施例8 对样本中游离的及颗粒状HBV前核心/核心蛋白以及HBc抗原的分别测定及其比值

将HBVダイレクト-Mag试剂盒(JSR株式会社)中的反应缓冲液50μl、捕获HBV的粒子(固定有抗HBs抗体的磁珠)50μl、以及样本200μl在室温混合振荡30分钟，使含有HBs抗原的HBV相关颗粒结合。将所述混合物用强磁石分离磁珠，弃去上清。所述上清中包含游离的HBe抗原。向残留的磁珠加入60μl 15％SDS溶液，70℃加热10分钟，使其上结合的颗粒状HBV前核心/核心蛋白洗脱下来。将所得混合物用强磁石分离出磁珠，获得提取物。

将所得上清及沉淀提取物中的HBV前核心/核心蛋白及HBc抗原分别以实施例5、实施例6的方法测定，分别计算样本中HBe抗原、HBc抗原、颗粒状HBV前核心蛋白的浓度及比值。结果示于表3。

表3使用HBs抗体进行免疫沉淀从而分别测定HBe抗原、HBc抗原及颗粒状HBV前核心蛋白

    样本名称            HBc抗原    上清    沉淀粉     沉淀比     C        D        D/(C+D)    pg/ml     pg/ml      ％         HBV前核心/核心蛋白    上清       沉淀      沉淀比     C          D        D/(C+D)    pg/ml      pg/ml      ％     颗粒状前核心蛋白                 比    E＝D-B      E/(C+D)    pg/ml        ％ BBI PHM901-06 BBI PHM907-10 BBI PHM921-06 BBI PHM922-12 BCP HBV6278-11 Nabi SB0408-11 BBI PHM935A-14 BBI PHM935A-16 ProMedDx #9990776 ProMedDx #10149975 01 1670 01 1351 01 3567 01 2296 01 1188 01 2877    5         69        93％    5         207       98％    3         76        96％    46        749       94％    5,238     118,840   96％    4,296     116,834   96％    8,671     188,535   96％    959       7,800     89％    6,264     52,270    89％    477       4,522     90％    2,877     137,930   98％    535       32,615    98％    1,409     40,800    97％    198       5,319     96％    23        692       97％    555       11,692    95％    2,151      948        31％    29,728     2,219      7％    2,723      1,307      32％    20,025     10,364     34％    4,958,186  941,077    16％    1,382,054  1,829,461  57％    1,636,481  3,370,973  67％    482,713    591,319    55％    1,646,640  1,184,289  42％    2,094,278  146,459    7％    540,397    177,755    25％    2,168,349  414,203    16％    5,325,365  325,486    6％    1,036,210  59,531     5％    5,171      2,151      29％    161，907   126,510    44％    879         28％    2,012       6％    1,231       31％    9,615       32％    822,237     14％    1,712,627   53％    3,182,438   64％    583,519     54％    1,132,020   40％    141,937     6％    39,825      6％    381,588     15％    284,686     5％    54,212      5％    1,460       20％    114,818     40％

可确定的是在所有情况下90％以上的HBc抗原在沉淀中存在。即，被HBs抗原覆盖的颗粒几乎全部被免疫沉淀。上清中存在的HBV前核心/核心蛋白为HBe抗原，沉淀中的HBV前核心/核心蛋白为HBc抗原和颗粒状HBV前核心蛋白。因此用沉淀中HBV前核心/核心蛋白浓度减去HBc抗原浓度可计算出颗粒状前核心蛋白浓度。所述浓度及比值与实施例7所示根据密度梯度离心分别测得的结果非常相似，这表明用这两种测定法分别可测定颗粒状前核心蛋白。

实施例9 根据病态不同颗粒状HBV前核心蛋白的比值不同

与实施例8同样的方法，分别测定81例来自HBV携带者及乙型肝炎各种病态个体的血清样本中游离的及颗粒状HBV前核心/核心蛋白及HBc抗原，比较了颗粒状HBV前核心蛋白与总前核心/核心蛋白(HBe抗原+HBc抗原+颗粒状HBV前核心蛋白)的比值。结果见图6。

对于HBe抗原阳性个体，认为上述比值存在急性肝炎高、无症状携带者及肝硬化者低的趋势。另外对于HBe抗体阳性个体，认为上述比值存在慢性肝炎及肝癌的个体高、急性肝炎治愈后及肝硬化者低的趋势。由这些结果可见通过测定颗粒状前核心蛋白可诊断乙型肝炎，并对治疗获得有价值的了解，进一步地可起到明确HBV及乙型肝炎病态的作用。通过这样的了解，可获得对开发乙型肝炎治疗剂有用的了解。

实施例10  对样本处理方法的比较

制备不同的样本预处理液，除了预处理液不同外，用与实施例6相同的方法对5个HBV阳性血清进行样本处理并测定HBc抗原，对不同处理法的效果进行了比较。

其中SDS、N-月桂酰基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠为阴离子型表面活性剂，溴化正癸基三甲基铵为阳离子型表面活性剂。样本处理时各种表面活性剂的终浓度为预处理液中的1/3，在HBc抗原测定体系一级反应中的终浓度为预处理液中的1/9。

表4不同处理法通过ELISA测定的HBc抗原反应(发光量)

预处理液 无 15％SDS15％N-月桂酰基肌氨酸钠7.5％脱氧胆酸钠15％溴化正癸基三甲基铵阴性 180 154158156503样本1样本2样本3样本4样本5 364 212 151 167 153 46656 4249 2157 2487 16094208510132343030013754591411431801381357311292378

由上述结果可见，SDS、N-月桂酰基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠等阴离子型表面活性剂作为处理液是合适的。其中特别合适的是SDS。另一方面，单独使用溴化正癸基三甲基铵等的阳离子型表面活性剂使得在阴性样本中的本底高，对该测定体系不适用。

表5不同处理法通过ELISA测定的HBc抗原反应(发光量)

预处理液15％SDS15％SDS，1.5％CHAPS15％SDS，1.5％CHAPS，0.3％Triton-X100阴性292642样本1样本2样本3样本4样本53500923235411327532453683739903204869050818431610462158773

由上述结果可见，加入15％SDS及兼性表面活性剂CHAPS或进一步加入非离子型表面活性剂Triton-X100作为预处理液使预处理效果进一步提高(表5)。

实施例11 颗粒状HBV前核心蛋白的抗原性

将抗HBc单克隆抗体(Anti-HBc(β)2A22特殊免疫研究所)用0.5MNaCl，0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml，以100μl/孔加至96孔微量滴定板(NUNC社)中，4℃静置过夜。用PBS洗净后，加入含有酪蛋白的溶液封闭，除去封闭液后将样本液以100μl/孔加入，室温反应1小时。用洗液洗后，加入1μg/ml生物素标记的2A22单克隆抗体，每孔加100μl，室温反应1小时。用洗液洗后，以100μl/孔的量加入10000倍稀释的过氧化物酶标记的亲和素(Vector社)，室温反应1小时。用洗液洗后，以100μl/孔的量加入OPD(SIGMA公司)/过氧化氢溶液，室温反应30分钟显色。以100μl/孔的量加入1M硫酸终止反应，于420nm处测定吸光度。

由该测定体系可检测出约2ng/ml的HBcAg。将实施例1(A)的HBV核心相关抗原的峰级分用1％NP-40处理除去被膜后，10倍稀释(HBV核心相关抗原的含量约为150ng/ml)并进行上述测定，结果没有检测到HBc抗原。

另外，将同一样本用临床使用的HBe抗原测定体系(ダイナボッド社)检测，也没有检测到HBe抗原。由此认为本发明的颗粒状HBV前核心蛋白与HBc抗原、HBe抗原相比较具有不同的抗原性。

序列表

<110>株式会社先端生命科学研究所

<120>可形成颗粒的乙型肝炎病毒前核心蛋白

<130>1024582

<160>

<210>1

<211>178

<212>TRP

<400>1

Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr Val

                  5                  10                  15

Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile Asp

             20                  25                  30

Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu Pro

         35                 40                   45

Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala

     50                  55                  60

Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His

 65                  70                  75                  80

Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Asn Leu

                 85                  90                  95

Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Glu Leu

            100                 105                 110

Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln Leu

        115                 120                 125

Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu

    130                 135                 140

Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr

145                 150                155                  160

Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val

                165                 170                 175

Val Arg

<210>2

<211>20

<212>PRT

<400>2

Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr Val

                  5                  10                  15

Gln Ala Ser Lys

             20

<210>3

<211>11

<212>PRT

<400>3

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg

                  5                  10

<210>4

<211>17

<212>PRT

<400>4

Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His His Thr Ala Leu

                  5                  10                  15

Arg

<210>5

<211>14

<212>PRT

<400>5

Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys

                  5                  10

<210>6

<211>23

<212>PRT

<400>6

Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu

                  5                  10                  15

Pro Glu Thr Thr Val Val Arg

             20