编码黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的D－赤糖酸4－磷酸－脱氢酶PDXR的DNA和维生素B

摘要

本发明涉及一种来源于苜蓿中华根瘤菌的、编码与维生素B

说明书

本发明涉及一种来源于苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium melioti)的、编码与维生素B₆的生物合成相关的新的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的D-赤糖酸4-磷酸(EN4P)(flavin adenine dinucleotide-dependent D-erythronate4-phosphate)脱氢酶的DNA，和一种用含有该DNA的载体转化的重组微生物。还涉及利用该重组微生物生产维生素B₆的方法。

本发明中使用的“维生素B₆”包括吡哆醇(PN)、吡哆醛和吡哆胺。维生素B₆是人类或其他动物所必不可缺的维生素，被用作药物的原料或食物添加剂。

使用中华根瘤菌属(Sinorhizobium)[又称根瘤菌属(Rhizobium)：DeLajudie et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.44：715-733(1994)]的苜蓿中华根瘤菌进行维生素B₆的发酵生产已有记载(EP 765,938)。但是在利用微生物制备维生素B₆的过程中维生素B₆的生产效率不够高，需要构建具有更高的维生素B₆生产能力的新微生物。

在大肠杆菌中的4-PHT途径如下：4-PHT合成起始于D-赤藓糖4-磷酸(E4P)，由E4P脱氢酶将其氧化为EN4P，进一步由EN4P脱氢酶氧化为2-酮基-EN4P，由转氨酶转氨形成4-PHT。这三个酶，E4P脱氢酶、EN4P脱氢酶和氨基转移酶，由三个基因编码，分别名为epd、pdxB和serC，对需要NAD⁺作为辅酶进行酶反应的大肠杆菌EN4P脱氢酶仅有一篇报导[Zhao etal.，J.Bacteriol.177：2804-2812(1995)]。

另一方面，在苜蓿中华根瘤菌中4-PHT是从甘氨酸和羟基乙醛合成的。但是与这个反应相关的基因仍然没有被鉴定出来。为了鉴定这一基因，我们获得了一个在形成4-PHT方面有缺陷的维生素B₆缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。并且我们获得了一个基因，命名为pdxR，其能补足该维生素B₆缺陷突变株，我们发现pdxR编码一个新的FAD依赖的EN4P脱氢酶。

根据本发明，通过利用具有包括含有pdxR的载体的重组质粒的中华根瘤菌属微生物进行发酵，有可能极大地提高维生素B₆的生产效率。通过培养所述微生物可以方便地在培养液中生产维生素B₆，并能以期望的纯度回收维生素B₆。

本发明提供了编码来源于中华根瘤菌属的FAD依赖的EN4P脱氢酶的DNA；携带含有编码该EN4P脱氢酶的DNA的DNA的表达载体；携带该表达载体的转化的宿主细胞；在该宿主细胞中产生的具有FAD依赖的EN4P脱氢酶活性的多肽；和利用该宿主细胞生产维生素B₆的过程。

除非另作说明，本发明中所使用的全部科学和技术术语都具有本领域通用的含义。

本发明是以定名为pdxR的基因的发现以及利用该基因改善维生素B₆的生产为基础的，pdxR基因编码FAD依赖的EN4P脱氢酶，该FAD依赖的EN4P脱氢酶与苜蓿中华根瘤菌的维生素B₆生物合成有关。

在本发明的验证过程中，我们发现了一个基因，名为pdxR，其补足了维生素B₆缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)，该突变株的生长需要4-羟基-L-苏氨酸(在下文中称为4-HT)或维生素B₆。pdxR与任何已公开的与大肠杆菌的维生素B₆生物合成有关的基因都没有同源性。

通过对苜蓿中华根瘤菌菌株1021[Galibert et al.，Science293：668-672(2001)]的基因组数据库的检索，pdxR的推测的氨基酸序列暗示PdxR是一种诸如脱氢酶、还原酶和氧化酶的氧化还原酶。但是很难预测PdxR的底物。已发现的是pdxR基因不仅能补足维生素B₆缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782，还能补足缺乏EN4P脱氢酶的大肠杆菌pdxB^-突变株。这些发现表明PdxR与苜蓿中华根瘤菌中维生素B₆生物合成的4-PHT途径有关，并且pdxR编码催化EN4P氧化成2-酮基-EN4P的氧化还原酶。

通过进一步的实验，发现本发明中苜蓿中华根瘤菌的pdxR基因编码的基因产物包含FAD并且利用电子受体催化EN4P的氧化，这些电子受体诸如细胞色素c、2，6-二氯酚吲哚酚(2，6-dichlorophenolindophenol)(DCIP)、或铁氰化物，但不是O₂，NAD⁺或NADP⁺。证据表明pdxR基因产物是一种有电子受体的脱氢酶而不是氧化酶，并且与大肠杆菌的有NAD⁺的EN4P脱氢酶完全不同。

本发明涉及包括编码PdxR的DNA序列的DNA序列，其中PdxR是一种与维生素B₆的合成有关的FAD依赖的EN4P脱氢酶，编码PdxR的DNA序列公开于序列表中，还涉及它们的互补链，或包括这些序列的DNA序列，与这些序列及其片段杂交、优选的在标准条件下杂交的DNA序列，和由于遗传密码的简并性、在标准条件下不与这些序列杂交但编码具有完全相同的氨基酸序列的多肽的DNA序列。

杂交的“标准条件”在本文中是指本领域的技术人员通常使用的、用以检测特定的杂交信号的条件，或优选的是指所谓的严紧杂交和非严紧洗脱条件，或更加优选的是指所谓的中度严紧条件，或进一步优选的是指所谓的严紧杂交和严紧洗脱条件。例如，2×SSC和0.5％ SDS在45℃杂交1小时、0.1×SSC和0.5％ SDS在60℃洗脱1小时的条件。

本发明还包括与SED ID NO：1的DNA序列或其片段具有至少80％到85％，优选的至少86％到90％，更优选的至少91％到95％，特别优选的超过95％的同一性的DNA序列。

本发明还涉及具有FAD依赖的EN4P脱氢酶活性的多肽，其是本案的多肽的功能性衍生物。这种功能性衍生物定义为根据本发明的氨基酸序列，通过添加、插入、删除和/或替换所述序列的一个或多个氨基酸残基，同时仍然具有所述FAD依赖的EN4P脱氢酶的活性的衍生物。这种功能性衍生物既可以通过已知的化学合成多肽法，也可以通过目前已知的方法、根据本发明公开的DNA序列通过重组法合成。目前已知许多通常不会改变分子活性的蛋白质和多肽中的氨基酸变换。最常发生的变换是：Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，以及它们的反向变换。

此外，根据本发明的多肽包括根据SEQ ID NO：2的多肽，特别是那些具有FAD依赖的EN4P脱氢酶的活性的多肽，以及那些与SEQ ID NO：2的多肽具有至少80％到85％，优选的至少86％到90％，更优选的至少91％到95％，特别优选的超过95％的同一性，并具有所提及的活性的多肽。

为了高效的表达pdxR或编码FAD依赖的EN4P脱氢酶的DNA序列，可以使用多种启动子；例如，存在于pdxR基因上游的原始启动子，抗性基因例如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的启动子(lac)，苜蓿中华根瘤菌的核糖体小亚基的启动子(pS1)，trp启动子，tac启动子，trc启动子，和任何能在包括诸如大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌的细菌的微生物宿主体内具有功能的启动子。

为了达到前述的目标，可以向编码序列中导入在宿主细胞中可操作的其他调控元件，例如Shine-Dalgamo(SD)序列(例如，AGGAGG等，包括在宿主体内可操作的自然的和合成的序列)和转录终止子(反向重复结构包括任何在宿主细胞中可操作的自然的和合成的序列)，与上述启动子共同使用。

可以使用各式各样的宿主/克隆载体组合来克隆该双链DNA。克隆载体通常是质粒或噬菌体，其包含复制起点、调控元件、包括多克隆位点的克隆位点和选择性标记，例如抗生素抗性基因，包括氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、庆大霉素、壮观霉素(在下文中分别称为Ap、Tc、Cm、Km、Nm、Sm、Gm、Sp)等。

用于在大肠杆菌中表达目的基因的优选的载体选自任何常用于大肠杆菌的载体，例如pBR322或它的衍生物包括pKK223-3、pUC18和pBluescriptII，pACYC184或它的衍生物，和来源于宽宿主范围质粒的载体例如RK2和RSF1010。用于在苜蓿中华根瘤菌中表达目的基因的优选的载体选自任何可以在这些微生物以及优选的克隆微生物例如大肠杆菌中复制的载体。优选的载体是宽宿主范围载体，例如pVK100、pRK290，pLAFR1，和RSF1010，或包含了在苜蓿中华根瘤菌中的复制起点功能以及在大肠杆菌中另一个起点功能的载体。

为了构建携带表达载体的宿主细胞，可以使用各种DNA转移方法，包括转化、转导和接合(conjugal mating)。构建转化的宿主细胞的方法可以选自分子生物学领域中公知的方法。通常的转化和转导系统可用于大肠杆菌。接合系统可广泛地用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌和苜蓿中华根瘤菌。

在4-PHT途径中具有突变点的维生素B₆缺陷突变株可以通过转座子诱变来构建。

转座子是一种独特的DNA片段，其具有移动到基因组中的能力。转座子之一的Tn5是一个5,818bp的复合转座子，包括两个反向重复和三个带来抗生素抗性的基因。Tn5具有低的插入特异性从而可以完成Tn5诱变[Meadeet al.，J.Bacteriol.149：114-122(1982)]。携带来源于假单胞菌属的Tn5并且不在苜蓿中华根瘤菌中复制的自杀载体pSUP2021，可用于介导Tn5插入到苜蓿中华根瘤菌的基因组中[Simon et al.，BIO/TECHNOLOGY 1：784(1983)]。帮助不动质粒转移到其他微生物内的辅助质粒，例如pRK2013(ATCC37159)，可以被使用。

自杀载体上的Tn5可以通过三亲接合法(tri-parental conjugal mating)按下述方式导入苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。以苜蓿中华根瘤菌作为受体菌株，携带辅助质粒的大肠杆菌作为辅助菌株，以及携带供体质粒的大肠杆菌作为供体菌株，分别培养并混合在一起。在平板上混合培养之后，具有Tn5的苜蓿中华根瘤菌已将Tn5整合到其基因组中，其可以在包含适当抗生素的琼脂平板上选择出来。在这些抗生素抗性的突变株中，那些很少产生或不产生维生素B₆的突变株可以利用维生素B₆检测平板检测它们产生的维生素B₆的量而被选择出来。很少产生或不产生维生素B₆的突变株也可以通过维生素B₆途径中对中间物的需求来检查。通过这些补充实验，可以提供在途径中的突变点。

补足维生素B₆缺陷突变株的DNA片段可以从苜蓿中华根瘤菌的基因库中筛选出来。基因库由大量连接到装配型质粒中的部分消化的染色体DNA组成，并转入维生素B₆缺陷突变株。目标DNA片段补足的转结合子可以通过使其在无维生素B₆的平板上生长来获得。该片段的DNA序列可以通过本领域目前已知的方法来测定。

过量表达PdxR来研究其在宿主细胞中的产物的功能。在准备PdxR的过量表达时，聚合酶链式反应(PCR)适用于添加限制酶识别位点以使pdxR处于一个强启动子的控制之下。PCR引物按照pdxR和侧翼区的DNA序列来合成，一个引物在其5′端包含限制酶识别序列。包含pdxR的DNA片段可以利用引物和苜蓿中华根瘤菌的染色体DNA通过PCR法扩增。扩增的DNA可以按照期望的结构连接到如上所述的可在大肠杆菌中复制的载体中。扩增的DNA所插入的质粒可以通过目前已知的方法来选择，扩增区域的序列也可通过目前已知的方法来确定。

为了从培养获得的细胞中制备无细胞提取物，可以使用一般的方法，如超声处理、玻璃珠细胞破碎，或French压力匀浆机。如果需要，也可以在用上述方法进行裂解之前使用水解酶例如溶菌酶或消解酶在15℃-45℃，优选的在20℃-40℃处理1-3小时。例如，在培养液进行离心之后，所获得的细胞使用0.85％(w/v)的盐水洗涤，悬浮于缓冲液中，例如pH7.5的Tris-HCl缓冲液。在细胞破碎之后，对所得溶液进行离心以分离细胞碎片，其悬浮物用作无细胞提取物。

蛋白质浓度通过Lowry法确定。

当本发明的EN4P脱氢酶与电子受体同时存在于适当的溶液中时，有电子受体的EN4P脱氢酶活性可以通过观察或测量由电子受体例如细胞色素c、DCIP或铁氰化物从氧化形式变为还原形式所产生的光度计颜色变化来验证。

本发明中获得的转化的宿主细胞培养在包含可同化的碳源、可消化的氮源、无机盐和其他生长所必须的营养的培养基中。关于碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、淀粉、糊精或甘油。关于氮源，可以使用例如蛋白胨、玉米浆、大豆粉末、酵母抽提物、肉膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿素或它们的混合物。进一步的，关于微量元素，可以使用钙、镁、锌、锰、钴和铁的硫酸盐、盐酸盐、或硫酸盐。必要时，也可以将常规的营养因子、磷酸盐离子的俘获剂，或防泡剂例如碳酸镁、氧化铝、铝英石、动物油、植物油或矿物油补充添加到发酵培养基中。培养基的pH值可以是约5.0至约9.0，优选的约6.5至约7.5。培养温度可以是约10℃至约40℃，优选的约25℃至约35℃。培养时间可以是约1天至约15天，优选的约2天至约9天。在培养过程中，通风和搅动通常会带来有利结果。

在培养之后，产生的维生素B₆也可以从培养液中分离和纯化。为了这个目的，利用维生素B₆的各种性质，可以使用通常的用于从培养液提取某产品的过程。如此，例如从培养液中除去细胞，使悬浮物中目标物质吸附在活性炭上，然后进一步用离子交换树脂洗提和纯化。或者，将培养物滤液直接加到离子交换树脂上，在洗提之后，从酒精和水的混合物中将目标产物重结晶。

通过对Tn5插入诱变的筛选从苜蓿中华根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)中获得了维生素B₆缺陷突变株苜蓿中华根瘤菌16C18。这个具有4-PHT途径上的突变点的突变株对于分离编码EN4P脱氢酶的pdxR基因是必不可少的，根据布达佩斯条约于2002年9月17日将其保藏在位于哥廷根(德国)的DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏公司)，登记入册号DSM 15210。

以下借助几个实施例更详细的解释本发明。下文是用来简要地说明所使用的材料和方法并用实验性的例子和比较性的例子来支持本发明，但是本发明不能被理解为是仅限于此的。

实施例1

[A]维生素B₆缺陷的Tn5插入突变株苜蓿中华根瘤菌16C18的分离

维生素B₆缺陷突变株是从具有天然的维生素B₆高产量的苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的Tn5插入突变株中筛选出来的。Tn5通过下述的三亲接合法导入苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。苜蓿中华根瘤菌IFO 14782作为受体菌株接种在5ml由1％胰化蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％ Bacto酵母抽提物(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％ NaCl、0.061％ MgSO₄·7H₂O和0.036％ CaCl₂·2H₂O组成的液体LBMC培养基中，在30℃、140rpm摇动孵育16小时。将培养物(400μl)转移到新鲜培养基中再孵育6小时。携带pRK2013(ATCC 37159)的大肠杆菌HB101作为辅助菌株，接种在5ml由1％胰化蛋白胨、0.5％ Bacto酵母抽提物和0.5％ NaCl组成的、包含50μg/ml Km的液体LB培养基中，在37℃、140rpm摇动孵育16小时。将培养物(100μl)转移到新鲜培养基中再孵育6小时。携带pSUP2021的大肠杆菌HB101作为Tn5供体菌株，接种在5ml包括50μg/ml Km的液体LB培养基中，在37℃、140rpm摇动孵育16小时。将培养物(100μl)转移到新鲜培养基中再孵育6小时。收获每一种菌株，将细胞以1∶1∶4(v/v/v)的比例混合。将混合物放在铺于LBMC琼脂平板上的硝化纤维滤纸上。平板在30℃孵育20小时之后，刮下滤纸上的细胞悬浮于0.85％无菌生理盐水中。适当稀释悬浮液，涂布在包含20μg/ml Nal(用于选择苜蓿中华根瘤菌IFO 14782)和50μg/ml Nm(用于选择Tn5)的LBMC平板上。将平板在30℃孵育4天后，在平板上出现了约10,000个菌落。Nm抗性菌落的频率为4.2×10^-8/受体。

将这些菌落在含有一些抗生素的LBMC平板上划线并在30℃孵育2天。将在平板上生长的细胞接种到包含作为维生素B₆指示菌的卡尔斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)ATCC 9080的维生素B₆检验平板(表1)上。30℃孵育2天后，获得了一个没有卡尔斯伯糖酵母ATCC 9080晕轮的菌落。该菌株被命名为苜蓿中华根瘤菌16C18。16C18菌株不能在EMM平板(表1)上生长，而亲本菌株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782能生长。进一步发现，苜蓿中华根瘤菌16C18能在补充了4mg/L的4-HT或400μg/L的PN的EMM平板上生长。这一结果表明，苜蓿中华根瘤菌16C18是一个在4-PHT途径中具有突变点的维生素B₆缺陷突变株。

        表1：培养基成分(维生素B₆检测平板和EMM平板)

    成分  维生素B₆检验平板  EMM平板葡萄糖无维生素的酪蛋白水解物L-精氨酸L-天冬氨酸L-谷氨酸甘氨酸L-组氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-赖氨酸L-甲硫氨酸L-苯丙氨酸L-苏氨酸L-酪氨酸L-缬氨酸KH₂PO₄MnSO₄·5H₂OMgSO₄·7H₂OCaCl₂·2H₂OKClFeCl₃·6H₂O盐酸硫胺素维生素H(biotin)去离子水Bacto-琼脂(Difco)pH    50g    -    160mg    20mg    200mg    40mg    80mg    180mg    400mg    280mg    80mg    160mg    160mg    80mg    280mg    550mg    2.5mg    125mg    125mg    425mg    2.5mg    250μg    8μg    1000ml    15g    6.0    10g    8g    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -    2.5mg    125mg    125mg    425mg    2.5mg    250μg    8μg    1000ml    15g    6.8

[B]补足苜蓿中华根瘤菌16C18在EMM平板上生长的DNA片段的分离

构建苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的基因库作为获得能使苜蓿中华根瘤菌16C18在无4-HT或PN的EMM平板上生长的DNA片段的工具。利用QIAGEN基因组工具(QIAGEN，GmbH，Germany)制备苜蓿中华根瘤菌IFO14782的染色体DNA。使用EcoR I消化染色体DNA。部分消化的DNA在0.6％凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳。剪下包含15kb-35kb DNA片段的凝胶块，利用电泳将DNA片段从凝胶上洗脱下来。洗脱的DNA片段用乙醇沉淀并通过离心回收。同时，400ng的pVK100质粒用EcoR I完全消化，并用碱性磷酸酶脱去磷酸。处理过的pVK100利用连接试剂盒(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)与上述苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的染色体DNA片段(1μg)进行连接。对这些DNA进行噬菌体(Amersham Biosciences Crop.，NJ，USA)的体外包装。然后，使用包含苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的多个DNA片段的噬菌体，感染在指数生长期收获的大肠杆菌ED8767[Murray et al.，Mol.Gen.Genet.150：53-61(1977)]。将感染的大肠杆菌涂在包含10μg/l Tc的LB培养基上。在37℃孵育17小时之后，在平板上出现约10,000个菌落。将这些菌落同时刮下，在LB液体培养基中37℃孵育1小时，分配到带盖的小试管中，在-120℃保存。在大肠杆菌ED8767中的基因库通过下述三亲接合法导入苜蓿中华根瘤菌16C18用于筛选能在无PN的EMM平板上生长的转结合子。

苜蓿中华根瘤菌16C18作为受体菌株，接种到液体LBMC培养基中，在30℃、140rpm摇动孵育16小时。将培养物(400μl)转移到新鲜的相同培养基中再孵育6小时。携带pRK2013的大肠杆菌HB101作为辅助菌株，接种到包含50μg/ml Km的液体LB培养基中，在37℃、140rpm摇动孵育16小时。将培养物(100μl)转移到新鲜的培养基中再孵育6小时。冷冻保藏的携带苜蓿中华根瘤菌IFO 14782基因库的大肠杆菌ED8767作为供体菌株，接种到包含10μg/ml Tc的液体LB培养基中，在30℃、140rpm孵育2小时。在收获每一菌株之后，以1∶1∶1的比例混合，混合的细胞放在铺于LBMC琼脂平板上的硝化纤维滤纸上。在30℃孵育20小时后，刮下滤纸上的细胞悬浮于0.85％无菌生理盐水中。稀释悬浮液，涂布在包含20μg/ml Nal(用于选择苜蓿中华根瘤菌)和10μg/ml Tc(用于选择质粒)的EMM平板上。在30℃孵育8天后，出现了4个菌落。制备这些菌落中的质粒，用限制酶消化并在琼脂糖凝胶上进行分析。在这些质粒中，将一个具有23.0kb的插入物的质粒定为pSHT09。通过用EcoR I裂解pSHT09产生一个2.5kb的DNA片段，将该片段连接到在EcoR I位点打开的pVK100中，将连接混合物转化到大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)。制备出现的菌落中的质粒，用限制酶消化并在琼脂糖凝胶上进行分析。一个包含2.5kb插入物的质粒被命名为pVK-HTS1。通过如上所述的三亲接合法将该质粒转入苜蓿中华根瘤菌16C18。携带pVK-HTS1的苜蓿中华根瘤菌16C18(苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-HTS1)能在无PN或4-HT的EMM平板上生长。这表明在2.5kb DNA片段中有一个能补足苜蓿中华根瘤菌16C18的生长的基因。

[C]补足基因的详述

在实施例1[B]中获得的2.5kb片段的DNA序列使用ALFred DNA测序仪(Amersham Biosciences Crop.，NJ，US)测序。在这个序列中，有一个开放阅读框(下文称为ORF)，其长度为1491bp(SEQ ID NO：1)。ORF的序列与登记入册号为NC 003047的SMc00985(951316-952806，互补体(complement))的CDS区相同。CDS的推定的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)被预测是一推定的氧化还原酶，但是还没有鉴定出它的底物。将该ORF命名为pdxR。携带pdxR的重组质粒按如下方法构建。使用优势-HF PCR试剂盒(ClontechLaboratories，Inc.CA，USA)，用10pmol的两个引物SEQ ID NO：3和4，从100ng苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的染色体DNA中扩增出包含pdxR和侧翼区的DNA片段。用于氨基末端的引物被设计为包含紧跟在EcoR I位点之后的起始密码子。反应条件如下：在94℃保持15秒后，以94℃ 15秒、50℃15秒、68℃三分钟进行25个循环。将合成的2.2kb PCR产物使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen Japan K.K.，Japan)插入到pCRII-TOPO载体中。确定扩增区中的pdxR序列与登记入册号为NC 003047的SMc00985的相应CDS区(951316-952806，互补体)相同。用EcoR I切下相应于扩增区的1.7kb DNA片段，该片段使用QIAEXII(QIAGEN，GmbH，Germany)从琼脂糖凝胶中回收。将1.7kb片段连接到用EcoR I打开并用碱性磷酸酶脱去磷酸的pKK223-3表达载体(Amersham Biosciences Corp.，NJ，USA)。在用连接混合物转化大肠杆菌JM109感受态细胞(Takara Bio.Inc.，Shiga，Japan)之后，制备转化细胞中的质粒，用限制酶消化并在琼脂糖凝胶上分析。获得了一个重组质粒pKK-pdxR，其中pdxR基因被插入到pKK223-3的EcoR I位点并与载体上tac启动子处于相同的方向。使用QIAGEN Midi试剂盒(QIAGEN GmbH，Germany)利用大肠杆菌JM109/pKK-pdxR制备pKK-pdxR质粒。获得的pKK-pdxR质粒用BamH I消化。产生的包含tac启动子和pdxR的2kb片段从琼脂糖凝胶中提纯。将2kb片段连接到用BglII打开并用碱性磷酸酶脱去磷酸的pVK100上。用连接混合物转化大肠杆菌HB101感受态细胞(TakaraBio Inc.，Shiga，Japan)，制备转化细胞中的质粒，用限制酶消化并在琼脂糖凝胶上分析。获得了一个重组质粒pVK-PdxR，其中tac启动子和pdxR基因被插入到pVK100的BglII位点并与Km抗性基因反向。

通过如实施例1[B]所述的三亲接合法将获得的pVK-pdxR导入苜蓿中华根瘤菌16C18，但其中选择平板是包含20mg/L Nal和10mg/L Tc的LBMC平板。获得了在选择平板上生长的转结合子，查实了转结合子中的质粒具有pVK-pdxR相同的结构。然后，将转结合子在包含50mg/L Nm和10mg/L Tc的EMM平板上划线。在30℃孵育后，所有检验过的转结合子都能在平板上生长，而苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK100不能生长。这表明处在tac启动子下的扩增的pdxR能够补足苜蓿中华根瘤菌16C18。

实施例2：pdxR基因产物的酶功能和特点

[A]pdxR基因对大肠杆菌PdxB^-突变株的补足

将实施例1[C]中获得的pKK-pdxR转入大肠杆菌WG1012，大肠杆菌WG1012是PdxB^-突变株(Dempsey，W.B.，J.Bacteriol.，vol.100，p.295，1969)。将生成的转化细胞和亲本菌株大肠杆菌WG1012分别在含有和不含PN的EMM平板上划线。在37℃孵育16小时后，所有测试的转化细胞都可以在无PN的EMM平板上生长，而大肠杆菌WG1012不能生长。这表明苜蓿中华根瘤菌的pdxR基因产物具有大肠杆菌中pdxB基因产物相同的功能，pdxB基因产物能将EN4P转化为2-酮基-EN4P。

[B]EN4P氧化还原酶的酶反应系统

(1)产生pdxR基因产物的微生物的构建和无细胞提取物的制备

通过实施例1[C]所述的方法将pVK-pdxR导入苜蓿中华根瘤菌16C18获得了一个转结合子克隆苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR，使苜蓿中华根瘤菌16C18和苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR在包含6ml种子培养基(seed medium)的试管中于28℃生长17小时，该种子培养基由1％葡萄糖、0.5％ Polypepton(Nihon Pharmaceutical Co.，Osaka，Japan)、0.2％ Bacto酵母抽提物、0.1％ KH₂PO₄、0.05％ MgSO₄·7H₂O、0.001％ MnSO₄·5H₂O和0.001％FeSO₄·7H₂O组成。

将种子培养基(每个4ml)转移到包含200ml发酵培养基的500ml烧瓶中，该发酵培养基由4％葡萄糖、4％ Polypepton S(Nihon Pharmaceutical Co.，Osaka，Japan)、0.8％ Bacto酵母抽提物、0.05％ MgSO₄·7H₂O、0.05％MnSO₄·5H₂O、0.001％ FeSO₄·7H₂O和一滴Actocol(Takeda Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)组成。烧瓶在旋转摇动器(180rpm)中于28℃摇动。在培养72小时后，通过10,400×g离心10分钟，分别从2升培养液中获得了35.3g苜蓿中华根瘤菌16C18和35.5g苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR湿细胞，用200ml 0.85％NaCl溶液洗涤2次，保存在-30℃备用。

慢慢地解冻冻结的细胞，用200ml 10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液悬浮。使悬浮液以800kg/cm²的压力通过French压力筛。将匀浆以37,000×g离心90分钟除去细胞碎片，每个165ml的上清液被用作无细胞提取物(CFE)，苜蓿中华根瘤菌16C18和苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR中的蛋白质含量分别是5,030mg和5,042mg。

为了证实PdxR的表达，每个CFE(5ml)以4升10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液进行透析一整夜，在10％(w/v)凝胶上进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝(Rapid Stain CBB Kit，nacalai tesque Japan)着色。在苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR中检测到一个期待的分子大小(53.0kDa)的多肽的过表达，而在苜蓿中华根瘤菌16C18中没有检出。因此，将CFE用于进一步的研究。

(2)无细胞提取物的EN4P氧化还原酶活性

根据Horecker的方法[Methods in Enzymology 3：172-174(1957)]通过溴的氧化从E4P(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO.，USA)制备EN4P。产物通过负快原子轰击质谱分析(Jeol SX-102/102质谱仪)确定为m/z 215(M-H)^-，产物的色谱性质与用Zhao等人的方法[J.Bacteriol.177：2804-2812(1995)]制备的物质的色谱性质相同。

利用实施例2[B](1)中制备的CFE来研究PdxR的酶反应系统。如下述，利用Inouye等人用来分析肌氨酸氧化酶的、改进的4-氨基安替比林过氧化物酶系统，通过观测过氧化氢的形成所导致的颜色变化(从无色的到带粉红色的)，来检测CFE中用氧的EN4P氧化酶活性。反应混合物(150μl)包含50mM pH7.0的磷酸钾缓冲液、2.3mM EN4P、0.47mM 4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine)(Wako Pure chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)、2mM苯酚(Wako Pure chemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、19U马辣根过氧化酶(Sigma Chemical Co.)和CFE(0.16mg蛋白质)，在室温(21℃)或在37℃观察反应混合物的颜色变化。但是，10分钟之后，从苜蓿中华根瘤菌16C18或苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR制备的CFE的反应混合物在两种温度都没有发生颜色变化，而过氧化氢标准溶液产生相应于其浓度的粉红色。根据这个结果，确定了两种CFE在有氧的情况下都没有EN4P氧化酶活性。

通过NADH或NADPH的形成来检测含NAD⁺或NADP⁺的CFE中的EN4P脱氢酶活性，NADH或NADPH的吸收峰在340nm。用于分析EN4P脱氢酶活性的反应混合物(150μl)包含33mM pH7.0的磷酸钾缓冲液、2.3mMEN4P、1mM NAD⁺或NADP⁺和从苜蓿中华根瘤菌16C18或苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR制备的CFE(各0.16mg蛋白质)。在UV-VIS记录式分光光度计UV 2200(Shimadzu Instruments，Inc.，Kyoto，Japan)中，在室温监测一分钟内A340的升高，但是在任何CFE的酶反应混合物中都没有观测到A340的升高。因此，确定两种CFE都不具有NAD⁺或NADp⁺依赖的EN4P脱氢酶活性。

通过电子受体从氧化形式形成还原形式导致的颜色变化，在室温(21℃)检测有电子受体存在的CFE中的EN4P脱氢酶活性。反应混合物(150μl)包含33mM pH7.0磷酸钾缓冲液、2.3mM EN4P、CFE(0.16mg蛋白质)和例如2，6-二氯酚吲哚酚(0.091mM)(Wako Pure chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)(在下文中称为DCIP)或铁氰化物(1.3mM)(Wako Pure chemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)的电子受体。从苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR的细胞制备的CFE用于包含EN4P的酶反应系统时，DCIP和铁氰化物分别在30秒和1分钟的时间内发生了变色，但是当酶反应系统中存在苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR的CFE但不存在EN4P时，或酶反应系统存在苜蓿中华根瘤菌16C18的CFE、存在或不存在EN4P时，两种电子受体都不会发生变色(表2)。这些结果表明pdxR基因产物利用例如DCIP或铁氰化物的电子受体氧化EN4P。

         表2：反应混合物中电子受体的颜色变化

苜蓿中华根瘤菌    16C18    苜蓿中华根瘤菌    16C18/pVK-pdxR  DCIP¹)+EN4P²)  DCIP-EN4P    不变    不变    在30秒内变色    不变  铁氰化物+EN4P  铁氰化物-EN4P    不变    不变    在1分钟内变色    不变

DCIP¹⁾：2，6-二氯酚吲哚酚，EN4P²⁾：D-赤糖酸4-磷酸。

此外，在室温(21℃)通过测量细胞色素c从氧化形式形成还原形式所导致的400-600nm光谱区的吸收光谱的变化，检测了在上述有电子受体的EN4P脱氢酶酶反应系统中，用细胞色素c来代替DCIP或铁氰化物所可能出现的情况。反应混合物(150μl)包含33mM pH7.0的磷酸钾缓冲液、2.3mMEN4P、作为电子受体的80μM细胞色素c的氧化形式(来自马心脏，SigmaChemical Co.)和CFE(0.16mg蛋白质)。使用UV-VIS记录式分光光度计UV2200在室温(21℃)监测零时间和之后2、5、10、15和20分钟的反应混合物的吸收光谱。零时间的吸收光谱在525nm仅仅有一个宽峰，但是2分钟后的光谱在相应于还原形式的细胞色素c的550nm处出现了新的峰，并且550nm区的吸收在5、10、15和20分钟后随时间的增加而增加。这个结果表明在EN4P脱氢酶的酶反应系统中细胞色素c也充当电子受体。

[C]EN4P脱氢酶的性质

(1)有电子受体的EN4P脱氢酶的提纯

在CFE中具有有电子受体的EN4P脱氢酶活性的pdxR基因产物用下述层析法提纯。

(Q Sepharose HP层析法)

将在实施例2[B](1)中获得的苜蓿中华根瘤菌16C18/pVK-pdxR的CFE(3,055mg蛋白质)上样至用10mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡的Qsepharose HP柱(直径44mm、高12.5cm；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。在用100ml包含0.1M KCl的10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液冲洗之后，以KCl 0.1到0.4M的线性梯度进行层析(总量，800ml)。在对每一分级流出物的一小部分用10mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行透析一整夜后，通过在室温(21℃)在600nm处测量由还原的DCIP形成所导致的吸光率下降，来监测酶活性。分析混合物(150μl)包含33mM pH7.0磷酸钾缓冲液、2.3mMEN4P、0.091mM DCIP和2μl透析样品。活性级分在0.37M的KCl浓度时被洗脱下来，以10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液进行收集和透析。

(Resource Q层析法)

在Q sepharose HP层析法中获得的透析的活性级分(58mg蛋白质)用10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液平衡的Resource Q柱6ml柱(AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)进行层析。用70ml包含0.1M KCl的10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液冲洗后，以KCl 0.1到0.4M的线性梯度进行层析。在用10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液对每个流出物进行透析之后，用与Qsepharose HP层析法中相同的方法测量酶活性。活性级分在0.22M的KCl浓度时被洗脱下来，以10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液进行收集和透析。

(HiPrep 16/60聚丙烯酰胺葡聚糖S-200HR层析法)

从之前步骤中获得的透析样品利用超滤作用(Centriplus YM-10以及Microcon YM-10浓缩器，Amicon Inc.，Beverly，Mass.，USA)浓缩到300μl。将样品(21.6mg蛋白质)上样至用50mM包含150mM KCl的Tris-HCl缓冲液平衡的HiPrep 16/60 sephacryl S-200HR柱(直径16mm、高60cm；AmershamPharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)上。在用10mM pH7.5 Tris-HCl缓冲液对每个流出物进行透析之后，用与Q sepharose HP层析法中相同的方法测量酶活性。活性级分在10％(w/v)凝胶上进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝着色。分析表明活性的级分是几乎同质的，有一分子量为53kDa的多肽，其符合根据pdxR的DNA序列推测的基因产物的分子量。

(2)与PdxR蛋白质结合的黄素的表征

为了表征与PdxR蛋白质结合的黄素，根据Cammack的方法[Biochem.J.109：45-46(1968)]将硫酸铵分级分离法应用于实施例2[C](1)中最终纯化的酶溶液。用1升80％(w/v)硫酸铵溶液对酶溶液(1ml，包含4.74mg蛋白质)进行透析一整夜，以34,800×g离心30分钟收集在透析膜中生成的沉淀，溶于0.5ml的10mM pH 7.5 Tris-HCI缓冲液中，并用4升同样的缓冲液透析一整夜。用10mM pH 7.5 Tris-HCI将透析的酶溶液的体积补充到1ml。

在室温(21℃)观察酶反应混合物中DCIP的变色，酶反应混合物包含33mM pH 7.0磷酸钾缓冲液、2.3mM EN4P、用硫酸铵处理纯化的PdxR(2.37μg蛋白质)、0.091mM 2，6-二氯酚吲哚酚和不同浓度的黄素单核苷酸(FMN)(Sigma Chemical Co.)或FAD(Sigma Chemical Co.)。在3分钟时鉴定变色程度。

试验得知，在反应混合物中FAD浓度大于0.014μM时发生DCIP的变色，但是在不存在黄素以及在任何浓度的FMN下都不发生变色，如表3所示。这些结果表明FAD是苜蓿中华根瘤菌的PdxR EN4P脱氢酶的辅酶。

表3：黄素对反应混合物中DCIP变色的影响

    变色程度    终浓度(μM)    FAD    FMN    0    -    -    0.014    +    -    0.059    ++    -    0.24    +++    -    0.95    ++++    -    0.38    +++++    -    15.2    +++++    -    61    +++++    -

(3)PdxR的底物特异性

利用在实施例2[C](1)中制备的最终纯化的酶溶液检查PdxR的底物特异性。标准的酶活性测定按如下方式执行：基本的反应混合物(总容量150μl)包括33mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、2.4μg蛋白质、0.091mM DCIP和加水至总体积144μl，在室温(21℃)孵育1分钟。然后，添加表4列出的6μl 57mM底物溶液使终浓度为2.28mM，将全部溶液在室温孵育。用UV-VIS记录式分光光度计UV 2200读取并在21℃监视1分钟内EN4P脱氢酶的A₆₀₀的减少。酶活性的一个单位定义为在上述分析系统中在EN4P脱氢酶的作用下1分钟内还原1nmol DCIP所需酶的数量。试验得知，PdxR仅仅氧化EN4P，不氧化其他测试的α-羟基酸。

                  表4：PdxR的底物特异性

    底物    活性(nmol/min/mg蛋白质)    无    0    EN4P    946    乙醇酸    0    乙醛酸    0    D(+)甘油酸    0    L-(+)-乳酸    0    D，L-乳酸    0    D，L-柠檬酸    0    L-苹果酸    0    D-苏糖酸    0    乙醇酸-2磷酸    0    D-(-)-甘油酸3-磷酸    0

实施例3：通过重组苜蓿中华根瘤菌生产维生素B₆

通过实施例1[C]中描述的三亲接合法，将在实施例1[C]中获得的pVK-pdxR导入苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。获得了在包含20mg/l Nal和10mg/L Tc的LBMC上生长的转结合子。查实在转结合子中的质粒与pVK-pdxR具有同样的结构。这样获得的苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK-pdxR和亲本菌株苜蓿中华根瘤菌IFO 14782在LBMC琼脂平板上30℃孵育48小时，将一接种环量的每个菌株接种到包含8ml种子培养基的试管中，然后使试管在往复振荡机中在30℃以275rpm摇动，种子培养基由1％葡萄糖、1％玉米浆(corn steep liquor)(Nihon Syokuhin Kako Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)、0.2％ Bacto酵母抽提物、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.001％MnSO₄·5H₂O、和0.001％FeSO₄·7H₂O组成，pH 7.0。

在摇动17小时后，将4ml的每种培养液转入有两个折流板的包含200ml生产培养基的500ml烧瓶，在旋转振荡机中在30℃以180rpm摇动，生产培养基由6％葡萄糖、4％玉米浆、0.8％ Bacto酵母抽提物、0.05％MgSO₄·7H₂O、0.05％MnSO₄·5H₂O、1％ Allophosite(Shinagawa Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)、和0.025％ Actocol组成，pH 6.8。

在培养7天后，通过高压液相色谱法(在下文中称为HPLC)给每种培养液上清液中含有的维生素B₆定量，用如下所述的4′-脱氧吡哆醇内标准法计算产生的维生素B₆。为制备用于HPLC的样品，200μl 500mg/l的4′-脱氧吡哆醇作为内部物质、50μl 60％高氯酸和500μl水，与500μl的吡哆醇标准溶液(0-100mg/L)或来自培养液的上清液混合。然后将混合物在冰上放置10分钟。在18,000×g离心10分钟后，混合物的一部分加载到下列柱上。分析条件如下：柱，Capcell pak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)；流动相，0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾和2％乙腈(pH 3.5)；柱温度25-26℃；流速1.0ml/min；检测器，紫外线(UV)(在292nm)。结果，苜蓿中华根瘤菌IFO 14782/pVK-pdxR每升产生76mg的吡哆醇，比亲本苜蓿中华根瘤菌IFO 14782高约1.2倍(表5)。

表5：苜蓿中华根瘤菌IFO 14782和苜蓿中华根瘤菌IFO 14782/pVK-pdxR

                      的吡哆醇生产能力

          微生物  吡哆醇        数量的增加(magnitude of increasing) 苜蓿中华根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)    63    1.0 苜蓿中华根瘤菌IFO 14782/pVK-pdxR    76    1.2

实施例4：从培养液中分离维生素B₆

从按实施例3描述的相同培养条件制备的苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK-pdxR培养液中回收产生的维生素B₆。每个提纯步骤中的吡哆醇和它的浓度用如实施例3中描述的HPLC测定。

将两升包含74mg/L维生素B₆的培养了168小时的培养液在7,500rpm离心10分钟。生成的上清液的pH值用1N HCl调节到3.1，然后将上清液上样至塞满350ml Amberlite CG 120(H₊形式，100-200目，Rohm and HaasCompany，Philadelphia，Pennsylvania，USA)的柱(5.5×15cm)。用500ml去离子水洗柱，然后用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩维生素B₆级分。如此获得的剩余物溶于10ml去离子水中，将该溶液充满塞满380ml Dowex 1×4(OH-形式，200-400目，Dow Chemical Co.，Ltd.，Midland，Michigan，USA)的柱(5.5×16cm)，用500ml去离子水洗涤。用0.1N HCl洗脱。将包含吡哆醇的级分减压浓缩至小体积。将固体残余溶于少量的热乙醇后，使溶液在4℃保持过夜。生成的沉淀通过过滤收集，真空干燥得到119mg的粗结晶。从乙醇中重结晶得到熔点为160℃的91.6mg白色晶体。该产物的红外吸收、紫外吸收和NMR光谱与那些真正的吡哆醇相符。

                           序列表

<110>DSM IP资产公司(DSM IP ASSETS B.V.)

<120>编码黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的D-赤糖酸4-磷酸-脱氢酶PDXR的DNA和维生素B6的微生物生产

<130>pdxR的序列(case19)

<140>

<141>

<160>4

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>1491

<212>DNA

<213>苜蓿中华根瘤菌

<400>1

atggccatcg gcacgcttga agcaaccacg ttgatccgag gcagggccat gaccaccgta  60

cttccttctc ccgaactcat cgcctccttc gtcgatatcg tcgggcctgg caatgccctc  120

accgcacccg ccgacacggc accctacctc gtcgagtccc gcgggctcta ccgcggcacg  180

acgccgctcg tgctcaggcc cggctccgtc gaggaagttt cgctggtgat gcggcttgcg  240

agtcagaccc gaacggcagt cgtgccgcag ggcggcaata ccggacatgt ggccggacag  300

attccacgcg agggcaaagc cgacgtggtc ctttccctcg agcggctgaa ccgcatccgc  360

gacatcgacc cggtcggcaa cgtgatcgtg gccgacgccg gctgtatcct ggcggacatc  420

cagaaggccg ccgatgacgt cgaccggctt tttcccctgt cactcggctc ggaaggctct  480

gcccggatcg gcggcaatct ttcgaccaat gccggcggca ctgccgtgct tgcctatggg  540

aacatgcgcc agctctgcct ggggctggaa gtcgtgctcc cgaccgggga gatctgggat  600

gggctcagac gcctcaggaa ggacaatacc ggctacgatc tgcgcgatct tttcatcggc  660

gccgagggaa cgctcggcgt cataaccggc gccgttttga agctctttcc gaaaccgcgc  720

ggccaccagg tggcctttgc cggcctcagg agcgtcgagg acgcacttac gcttttcgat  780

cgggcaacaa gcgtctgcgg gccggccctg acgggcttcg aactgatgcc gcggctcggc  840

atcgagttca ccacccggca catcgccggc gtcagagatc cgatggaaac gacgcatccg  900

tggtacgcgc tgatcgatat ctccacctcg gataccgccg aaagcgcgga acggatggtg  960

caagaccttc tcgaagccgt cattgccgac ggtctcgtcg aaaacgcggt catcgcccag  1020

aacgaagcgc aacgcagagc gctctggcac atgcgagaaa gcatgtcgcc ggcacaaaag  1080

cctgagggtg gctccatcaa gcatgacgtt tcggtcccgg tgtcgagcat tccggccttc  1140

atgacggagg cggatgcgct ggtctccaag gccatccccg gcgcgcgcat ctgcgccttc  1200

ggccatatgg gcgacggcaa tatccactac aacatctccc agcccgtcgg cgcggacaag  1260

cagagctttc tcgatcggtg gcgcgagatc aatgcgatcg ttcacgccgt cgtgctcaaa  1320

catgacggct cgatctctgc cgagcatggc atcggccagt tgaagcgaga cgaactcgcg  1380

gcgatccgct cgccgatcga gatcgagctc atgcgacgga tcaagcacgc cttcgacccg  1440

gcggggatca tgaaccccga taaggtgctg cgcgaggatc gaggcgagta a           1491

<210>2

<211>496

<212>PRT

<213>苜蓿中华根瘤菌

<400>2

Met Ala Ile Gly Thr Leu Glu Ala Thr Thr Leu Ile Arg Gly Arg Ala

                  5                  10                  15

Met Thr Thr Val Leu Pro Ser Pro Glu Leu Ile Ala Ser Phe Val Asp

             20                  25                  30

Ile Val Gly Pro Gly Asn Ala Leu Thr Ala Pro Ala Asp Thr Ala Pro

         35                  40                  45

Tyr Leu Val Glu Ser Arg Gly Leu Tyr Arg Gly Thr Thr Pro Leu Val

     50                  55                  60

Leu Arg Pro Gly Ser Val Glu Glu Val Ser Leu Val Met Arg Leu Ala

 65                  70                  75                  80

Ser Gln Thr Arg Thr Ala Val Val Pro Gln Gly Gly Ash Thr Gly His

                 85                  90                  95

Val Ala Gly Gln Ile Pro Arg Glu Gly Lys Ala Asp Val Val Leu Ser

            100                 105                 110

Leu Glu Arg Leu Asn Arg Ile Arg Asp Ile Asp Pro Val Gly Asn Val

        115                 120                 125

Ile Val Ala Asp Ala Gly Cys Ile Leu Ala Asp Ile Gln Lys Ala Ala

    130                 135                 140

Asp Asp Val Asp Arg Leu Phe Pro Leu Ser Leu Gly Ser Glu Gly Ser

145                 150                 155                 160

Ala Arg Ile Gly Gly Asn Leu Ser Thr Asn Ala Gly Gly Thr Ala Val

                165                 170                 175

Leu Ala Tyr Gly Asn Met Arg Gln Leu Cys Leu Gly Leu Glu Val Val

            180                 185                 190

Leu Pro Thr Gly Glu Ile Trp Asp Gly Leu Arg Arg Leu Arg Lys Asp

        195                 200                 205

Asn Thr Gly Tyr Asp Leu Arg Asp Leu Phe Ile Gly Ala Glu Gly Thr

    210                 215                 220

Leu Gly Val Ile Thr Gly Ala Val Leu Lys Leu Phe Pro Lys Pro Arg

225                 230                 235                 240

Gly His Gln Val Ala Phe Ala Gly Leu Arg Ser Val Glu Asp Ala Leu

                245                 250                 255

Thr Leu Phe Asp Arg Ala Thr Ser Val Cys Gly Pro Ala Leu Thr Gly

            260                 265                 270

Phe Glu Leu Met Pro Arg Leu Gly Ile Glu Phe Thr Thr Arg His Ile

        275                 280                 285

Ala Gly Val Arg Asp Pro Met Glu Thr Thr His Pro Trp Tyr Ala Leu

    290                 295                 300

Ile Asp Ile Ser Thr Ser Asp Thr Ala Glu Ser Ala Glu Arg Met Val

305                 310                 315                 320

Gln Asp Leu Leu Glu Ala Val Ile Ala Asp Gly Leu Val Glu Asn Ala

                325                 330                 335

Val Ile Ala Gln Asn Glu Ala Gln Arg Arg Ala Leu Trp His Met Arg

            340                 345                 350

Glu Ser Met Ser Pro Ala Gln Lys Pro Glu Gly Gly Ser Ile Lys His

        355                 360                 365

Asp Val Ser Val Pro Val Ser Ser Ile Pro Ala Phe Met Thr Glu Ala

    370                 375                 380

Asp Ala Leu Val Ser Lys Ala Ile Pro Gly Ala Arg Ile Cys Ala Phe

385                 390                 395                 400

Gly His Met Gly Asp Gly Ash Ile His Tyr Asn Ile Ser Gln Pro Val

                405                 410                 415

Gly Ala Asp Lys Gln Ser Phe Leu Asp Arg Trp Arg Glu Ile Asn Ala

            420                 425                 430

Ile Val His Ala Val Val Leu Lys His Asp Gly Ser Ile Ser Ala Glu

        435                 440                 445

His Gly Ile Gly Gln Leu Lys Arg Asp Glu Leu Ala Ala Ile Arg Ser

    450                 455                 460

Pro Ile Glu Ile Glu Leu Met Arg Arg Ile Lys His Ala Phe Asp Pro

465                 470                 475                 480

Ala Gly Ile Met Asn Pro Asp Lys Val Leu Arg Glu Asp Arg Gly Glu

                485                 490                 495

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>3

gaattcatgg ccatcggca                                                  19

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的引物序列

<400>4

ccacttccct tgtagtacga gct                                             23