一种用于两水相体系的pH敏感型可再生两性离子聚合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种用于双水相分离系统、可回收并循环使用的pH敏感性聚合物及其制备方法，由单体化合物(1)、单体化合物(2)和单体化合物(3)经无规共聚而得，三种单体化合物的摩尔比为a∶b∶c＝3～6∶1～3∶1，得到的无规聚合物等电点为7.5－9.0，该高聚物的分子量为5×10

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于两水相分离体系的水溶性聚合物，尤其涉及一种用于两水相分离体系、可回收再利用的PH敏感型甲基丙烯酸酯类聚合物及其制备方法。

背景技术

两水相体系一般是指高聚物—高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解所形成的互不相溶的两个水相体系。由于两水相体系具有界面张力低，分离过程温和，设备投资少，能耗小，操作简单，易于放大，且不存在有机溶剂残留问题，因此在生物质及药物分离与提取中具有极具潜力的应用前景。但是，由于生物成本及环境原因，成相聚合物需要回收，循环再生利用。如何制备溶解可逆的高聚物，使其适用于两水相萃取或生物转化便成为两水相分离技术的关键。过去几十年，人们进行了各种努力，但始终未完全解决问题，这种状况阻碍了两水相萃取技术在工业上的应用。近十几年，关于两水相体系的成相聚合物回收利用问题成为研究热点。

其中一个引入注目的聚合物是环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)的无规共聚物EOPO，它是一种热促相分离的聚合物。Tjerneld等人将EO-PO两端用憎水基团(C₁₄H₂₉)修饰，单独用这种修饰过的共聚物(HM-EO-PO)就可形成两水相体系，上相几乎含100％水分，下相含5-7％的HM-EO-PO。成相高聚物可通过温度诱导来回收(Johansson H.O.，Persson J.，TjeneldF，Biotechnol.Bioeng.，1999，66(4)：247-257)。之后，Tjerneld等人又将这种修饰的HM-EO-PO与EO-PO组成两水相体系，则可使两种高聚物均得到回收，其中，EO-PO在两相中的回收率是73％，HM-EO-PO的回收率是97.5％(Persson J，Johansson H.O.，Tjerneld F.J.Chromatogr.A，1999，864：31-48)。这样组成的两水相体系由于两种高聚物在物化性质上十分相似，很难使生物分子在两相中有明显的分配差别，且生物分子大都不耐热，通过加温来实现高聚物的回收会造成生物分子失活，其应用受到限制。在其他研究方面，Berlo等利用挥发性盐类进行相体系回收(Mos V.B.，Karel C.A.M.L.，Lunk A.M.V.D.W.，J.Chromatogr.B.，1998，711：61-68)。将PEG加入到含蛋白质的水溶液中，通入CO₂和NH₃使之形成氨基甲酸铵(NH₄NH₂CO₂)，在其到达一定浓度时可形成两水相。进行相分离后，解除压力使NH₄NH₂CO₂挥发分解并加以重新回收。但这种靠压力变化来生成两水相体系在操作上并不方便，且另一相高聚物仍无法回收。Toboada等人将PEG与硫酸钠组成两水相，采用蒸发水分，获得结晶硫酸钠的方法来回收下相的无机盐，但这种方法蒸发耗能大，带来额外操作成本(Persson J，Johansson H.O.，Galaev I.，Mattiasson B.，Tjerneld F.Bioseparation，2000，9：105-116)。Asorf等人则以N，N-dially-N-carboethoxy-methylammoniumChloride为单体，用常规的方法合成了聚阴离子高聚物，这种聚合物在0.1M HCl中溶解度几乎为零，并可与PEG35000组成两水相体系，则可通过PH调节实现这种聚合物的回收。但回收需在强酸下进行(Hasan A.，Muallem A.，Mohamed I.M.W.，Asrof A.S.K.Polymer，2002，43：1041-1050)。

关于PH敏感型的可回收两水相体系，Patrickios等人利用甲基丙烯酸，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸-2-(二甲氨基)乙酯，甲基丙烯酸苯乙酯为单体通过接枝聚合得到ABC三聚体，与聚乙烯醇(PVA)形成两水相体系(Patrickios C.S.，Hertler W.R.，Hatton T.A.Fluid PhaseEquilibria，1995，108：243-245)。

上述方法是解决聚合物的回收问题的各种尝试。但由于生物活性物质对过热、极端PH、压力非常敏感，剧烈改变这些条件，对生物活性物质破坏很大。因此，研发一种用于两水相分离体系、既能保持生物质活性又可回收再利用的聚合物成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明目的在于，提供一种可用于两水相分离体系、既能保持生物质活性又可通过简单调节两性离子等电点的方法回收聚合物及其制备方法。

本发明的发明人经广泛且深入的研究，首次合成了一种可用于两水相分离体系且在温和PH值下沉淀并回收利用的共聚物。实现了既能保持生物质活性又可回收再利用的聚合物之目的。

本发明所说的聚合物，其由单体化合物(1)、单体化合物(2)和单体化合物(3)经无规共聚而得，单体化合物(1)、单体化合物(2)与单体化合物(3)均属于甲基丙烯酸酯类单体化合物。三种单体化合物的优选摩尔比为a∶b∶c＝3～6∶1～3∶1。得到的无规聚合物等电点为7.5-9.0，由凝胶渗透色谱法(GPC)测得该高聚物的分子量约为5×10³-1×10⁴，多分散性指数约为1.1。

其中：

其中：R₁、R₂分别选自H或C₁～C₆的烷基；R₃为C₁～C₆的烷基；R₄为H或C₁～C₃的烷基。

优选方案是：R₁、R₂分别选自C₁～C₃的烷基；R₃为C₃～C₆的烷基；R₄为C₁～C₃的烷基。

最佳方案为：R₁、R₂均为CH₃；R₃为异丙基；R₄为CH₃。

在本发明中：单体化合物(1)是以甲基丙烯酰氯为起始原料，与相应的二烷基氨乙醇，

单体化合物(2)是以甲基丙烯酰氯为起始原料，与相应的醇经酯化反应制得，

单体化合物(3)为市售品。

本发明提供的制备聚合物的方法主要包括如下步骤：

以四氢呋喃为溶剂，以三种单体总质量的0.5％-2％偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，将单体化合物(1)、单体化合物(2)及单体化合物(3)按摩尔比为a∶b∶c＝3～6∶1～3∶1(优选配比为4∶2∶1)加入三种单体总体积4-6倍的溶剂中，在有惰性气体(N₂)存在下于50～70℃反应12～24小时，然后加入到上述聚合物溶液体积15-20倍的石油醚中，将聚合物沉淀析出，所得沉淀物去除上层清液后真空干燥即为本发明所说的共聚物。

本发明合成的高聚物为一种两性聚合物，即大分子链上同时带有阴、阳离子基团的高分子。在从酸性环境过渡到碱性环境时，在一定的PH值时正负电荷基团的数目相等，分子内相互静电作用使大分子链净电荷为零。此时两性高分子所处的PH值称为等电点(PI)。在等电点下，两性聚合物的溶解度最小，可通过加入适量碱液调节溶液PH值使聚合物沉淀回收。

两性聚合物的等电点由其等离子点决定。本发明的甲基丙烯酸酯类三聚体的等离子点测定方法为：将中性的聚合物粉末(不含盐，酸，碱)溶于去离子水中，浓度为10％(w/w)达到平衡，测量其PH值即为等离子点。通过浊度计测量和理论计算均表明，等电点的PH与测得的等离子点的PH相似。经测量，本发明设计的聚合物的等电点稳定在7.5-9.0之间，最佳等电点为PI＝8.4。

本发明设计并合成的可用于两水相分离体系的PH敏感型聚合物，在等电点(PI＝7.5～9.0)(最佳等电点PI＝8.4)处可以沉淀并回收利用(回收率达到95％以上)。与现有的用于两水相分离体系的聚合物相比，本发明的聚合物既能保持生物质活性又可回收再利用，其相应的制备方法简便可行。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：

实施例1 ABC三聚体的合成：

在具塞三角烧瓶中加入33.7ml(0.2mol)甲基丙烯酸-2-甲氨基乙酯、16.2ml(0.1mol)甲基丙烯酸叔丁酯、5.3ml(0.05mol)甲基丙烯酸甲酯，在200ml四氢呋喃搅拌下充分溶解，加入三种单体总质量的2％的偶氮二异丁腈AIBN作为引发剂，充氮除氧15分钟。密封反应容器，于60℃，250rpm转速下水浴振荡反应24小时。反应结束，产物以石油醚沉淀，沉淀物干燥至恒重，得到最终产物。测定其等电点PI＝8.4。该聚合物在234nm处有最大紫外吸收。

实施例2

将质量比为5％ABC三聚体水溶液P_ABC与质量比10％聚乙二醇20000(PEG20000)水溶液配制成两水相，P_ABC与PEG20000溶液的最适体积比为3∶2，混匀，离心促进分相。上下相分别加入适量0.1M NaOH水溶液调节溶液PH值，使聚合物在等电点下沉淀。离心，取上清液在234nm处测定P_ABC的吸光度，通过标准曲线计算得聚合物的总回收率为94.5％。理论上可以使用40次以上。

实施例3

配制两水相体系，上相为P_ABC(5％w/w)3ml，下相为PEG20000(10％w/w)2ml，加入Na₂SO₄固体，最终浓度为200mM，分配溶质BSA(牛血清白蛋白)，初始浓度为0.6mg/ml，混匀后低速离心以促进两相形成，在280nm处分别测定BSA在上、下相中的吸光度，计算得BSA的分配系数为12.5。证明该聚合物应用于两水相萃取可以实行。

实施例4

两水相体系保持酶活性实例，以胰蛋白酶为溶质，将其溶解于两水相中(上相：P_ABC3ml，下相：PEG 2ml)。经过7.5小时，测得上下相胰蛋白酶的活性与加入时的酶活性保持一致，上相依然为350U/mg，下相依然为180U/mg。