重组腺病毒p53制品在肿瘤治疗中的新用途

摘要

本发明阐述如下内容：应用重组腺病毒p53能拮抗包括但不限于抗肿瘤化学疗法和放射疗法相关的毒副作用，单用重组腺病毒p53亦能增进肿瘤病人的身体机能，包括改善病人的血像、肝功、肾功等生化指标，提高病人的生活质量包括增强食欲，改善精神状态等。

说明书

技术领域

本发明内容涉及了提高肿瘤患者的生活质量和降低肿瘤治疗方法包括化疗、放疗和其它疗法对病人产生的副作用的方法

背景技术

肿瘤是导致动物和人类死亡的主要原因之一。目前肿瘤治疗的常用手段有手术、放疗和化疗。尽管肿瘤治疗领域的技术日新月异，但是这些常见的肿瘤疗法均伴随有严重的副作用。例如，手术会使病人毁容或者干扰正常的身体机能。化疗或者放疗引发病人急性衰弱症状包括恶心、呕吐、腹泻、怕光及脱发等等。这些会引发细胞毒性的复合物产生的副作用经常使得其给药频率和剂量受到限制。

这些副作用产生的迹象可以通过生化和生理检查例如白细胞(WBC)，血红蛋白(Hb)，谷草转氨酶(AST)，谷丙转氨酶(ALT)等来说明。这些检查的结果表明，与那些没有接受这些肿瘤治疗方法的对照病人组相比，化疗和放疗导致病人的生化和生理指标均低于平均水平。大多数情况是当肿瘤患者接收化疗或者放疗时，他们都深受这些治疗的副作用之苦。有时候，对病人来说，这些副作用带给他们的疼痛和伤害比肿瘤的本身更大。

目前，已经有人尝试降低这些肿瘤治疗方法的严重副作用的方法。

美国专利(专利号US6,479,500)描述了一种化学试剂的结构和功能，该试剂能降低治疗肿瘤用药的副作用。

美国专利(专利号US5,017,371)描述干扰素在降低与放疗或化疗相关的毒副作用方面的应用。

美国专利(专利号US6,462,017)描述thymosina与化疗联合使用，能降低化疗在肿瘤治疗中产生的严重副作用。

显然很有必要发明一种新的、有效的方法，降低肿瘤治疗引起的副作用，提高肿瘤患者的生活质量，使病人经受化疗或放疗的整个过程。

发明内容

根据本发明，通过应用含有治疗有效量的重组腺病毒p53与传统的肿瘤疗法联合的方法，能有效降低肿瘤患者在接受譬如放、化疗等传统方法时产生的副作用。放、化疗副作用的缓解能提高接受放、化疗的病人的生活质量。生物学，生理和生化指标的检查可以证明这些提高的效果。

根据本发明，单用重组腺病毒p53治疗亦能提高肿瘤患者的生活质量。具体表现在肿瘤患者食欲增加，睡眠良好，精神状态转好，疼痛感减少，体重增加等情况。

附图说明

为了让上述发明的特征，优势和目的及其它方面阐述的更加清楚，上面的发明简述包含的详细内容或许会在附图中得到说明。这些附图成为发明详细内容的一部分。然而需要注意的是，这些附图仅是对本发明内容的进一步解释说明，因此对本发明范围不构成任何限制。

图1A、1B是本发明的重组腺病毒p53的构建过程示意图。

图2是本发明的重组腺病毒p53的技术路线框图。

图3是重组腺病毒p53经多次传代后，以5′CCACGACGGTGACA CGCTTC和5′caagcaagggttcaaagac为引物，以p53cDNA为模板，通过PCR扩增得到的p53基因的琼脂糖凝胶电泳图，以鉴定其稳定性。PCR扩增p53基因得到的1400bp的DNA片断。1，DNA分子量markers；2、3、4，p53 cDNA的PCR结果。

图4是重组腺病毒p53分别感染喉癌细胞Hep-2和非小细胞肺癌细胞H1299细胞后36小时，经细胞裂解、提取后经Western blot分析结果。1.蛋白质标准分子量；2-3.阴性对照：分别为未经Ad-p53感染的Hep-2和H1299细胞；4-5：分别为Ad-p53感染的Hep-2和H1299细胞。

图5是重组腺病毒p53对Hep-2细胞杀伤效应的曲线示意图。Hep-2细胞在6孔培养板培养至1×10⁶细胞/孔，用Ad-p53以100MOI感染Hep-2不同时间(24，48，72，96hr)后，台盼蓝染色记数蓝色(死亡)细胞百分数。

图6是重组腺病毒p53应用于肿瘤治疗及临床观察和效果评价流程图。

具体实施方式

我们用重组腺病毒p53进行临床试验，治愈了多种类型的肿瘤，如头颈部癌、非小细胞癌、肝癌、肺癌、甲状腺癌、宫颈癌，等等。除了发现重组腺病毒p53有肿瘤抑制功能外，我们还发现重组腺病毒p53还具有拮抗常规放化疗副作用的功能，以及提高肿瘤病人生活质量的功能。下面，我们首先描述重组腺病毒p53的构建过程，及其临床应用。在实施例中选用的重组腺病毒p53，其商品名为今又生(Gendicine)。

1.p53和肿瘤中的p53突变

目前p53被认为是一种肿瘤抑制基因(Montenarh，1992)。在给予化学致癌剂、紫外照射、包括SV40(猿病毒40)在内的几种病毒感染等处理后，许多细胞中p53蛋白的表达水平升高。在许多类型的人类肿瘤中，p53基因常常是突变失活的靶基因，并已发现，p53基因是迄今为止在人类肿瘤细胞中发现的突变频率最高的基因(Mercer，1992)，在50％以上的人非小细胞肺癌(Hollestein et al.，1991)和其他一大批肿瘤中发生突变。

p53基因编码一个长度为393个氨基酸残基的磷酸化蛋白，能与大T抗原和E1B蛋白结合。p53蛋白在正常组织和细胞中均有表达，但与转化细胞或肿瘤细胞相比，浓度极低。有意思的是，野生型p53在调控细胞生长和分裂方面有重要作用。在一些肿瘤细胞系中过表达的野生型p53蛋白已显示出抗增殖功能，因此p53能作为细胞生长的负调控因子(Weinberg，1991)，直接抑制失控的细胞生长，或激活下游靶基因而间接抑制这种失控的生长。因而，缺失或灭活野生型p53基因利于细胞永生性转化。但也有研究发现，突变型p53基因的存在，对于基因转化潜能的充分表达是必需的。

在许多类型的细胞中野生型p53被认为是相当重要的生长调控因子，是由于其遗传和生化特点在发挥作用。p53基因的错义突变很普遍，并且对癌基因发挥转化能力是必需的。点突变所致的单个遗传改变即能产生致癌性p53。但与其他癌基因不同，p53的点突变可在至少30个不同的密码子处发生，并且是显性突变，不需要累积成纯合子突变即可导致细胞表型改变。另外，机体能耐受许多这种显性负等位基因，并能通过生殖细胞传代。已发现有许多种p53的突变等位基因，功能改变从轻微失能到显性不等(Weinberg，1991)。

Casey与同事报道，向两株人乳腺癌细胞系转染编码野生型p53的DNA，能在这些肿瘤细胞中恢复生长抑制控制(Casey et al.，1991)。在转染野生型p53的人肺癌细胞系中也观察到类似效应，但转染突变p53的人肺癌细胞系中却没有(Takahasi et al.，1992)。在p53基因突变的细胞中转染野生型p53时，野生型p53对突变p53基因表现为显性，并能特异抑制细胞增殖。但对具有内源性野生型p53的细胞外源性野生型p53时，转染的p53牟正常表达，但对转染细胞的生长无影响。因此，本发明的这种构建体能被正常细胞吸收，但无副作用。

因此，用p53治疗p53突变相关的肿瘤，有可能减少恶性肿瘤细胞的数量。然而上述列举的研究远远没有达到这个目标，至少是因为DNA转染方法不能用于将DNA导入病人体内的肿瘤细胞内。

2.基因治疗技术

至今已提出了几种基因治疗的实验方案，但每种都有其特定的缺陷(Mulligan，1993)。如上面提到的基本的转染方法，含有目的基因的DNA片段是以非生物方式导入细胞的，而是以物理或化学的方法来穿透细胞膜。自然地，这种方案只能限于处理那些可暂时从身体内取出、并能耐受上述处理方式所致的细胞毒性的细胞，如淋巴细胞。脂质体或连接有某种脂类和两性肽段的蛋白质能用于转染，但其基因整合的效率非常低，大约在每1000至100,000个细胞有1个被成功转染的水平，并且转染基因的表达时间常限于增殖细胞中的数天或非增殖细胞中的数周。因此，DNA转染的方法显然不适用于肿瘤治疗。

第二种方案则利用了病毒进入细胞的天然能力，在将目的基因导入细胞的同时也带入了病毒载体自身的一些遗传物质。逆转录病毒可作为一个能指望的基因投送载体，因为它能整合入宿主基因组DNA，能携带大量的外源遗传物质，能感染多种动物和细胞类型，并能用特定的包装细胞进行生产和包装。但是，有三个主要问题阻碍了逆转录病毒的实际应用。第一，逆转录病毒的感染能力依赖于靶细胞表面病毒受体的存在；第二，逆转录病毒只能有效整合入增殖细胞；第三，在生产中，逆转录病毒难以浓缩和纯化。

3.基因治疗用腺病毒的构建

人类腺病毒是双链DNA病毒，基因组大小约36kb(Tooza，1981)。作为研究真核基因表达的模式系统，腺病毒已被广泛研究并被充分认识，使其成为研发基因转移系统的有吸引力的候选系统。这类病毒易培养和操作，在体内外均有较宽的宿主范围。在被裂解性感染的细胞中，腺病毒能关闭宿主细胞的蛋白合成，指导细胞机器合成大量的病毒蛋白，复制产生大量的病毒。

腺病毒基因组的E1区包含了E1A和E1B基因，其编码的蛋白负责对病毒基因组及几个宿主细胞基因的转录进行调控。E2区包含了E2A和E2B基因，其编码的蛋白产物如DNA结合蛋白、DNA聚合酶、作为复制引物的末端蛋白(TP蛋白)，负责病毒复制。E3区基因产物的功能则与腺病毒的免疫逃避有关，防止宿主细胞被细胞毒T细胞攻击而崩解，对腺病毒的生存及复制传代起重要作用。总括起来，各种E蛋白(早期蛋白)的功能与腺病毒的DNA复制、晚期基因表达及关闭宿主细胞某些功能有关。晚期基因产物包括大部分病毒衣壳蛋白，其表达主要发生在腺病毒复制基本完成之后，是由主要晚期启动子(MLP)引发的。在腺病毒的感染晚期，MLP有高效的转录启动功能(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。

由于只有一小部分基因组序列是顺式作用所需的(即是腺病毒复制、包装所需的)(Tooza，1981)，因此腺病毒载体在用293细胞进行生产时，可为在大片段的外源DNA提供插入空间。Ad5转化的人胚肾细胞系293细胞(Graham，et al.，1977)能为腺病毒载体的复制和包装提供反式作用元件。因此，腺病毒的特征使其成为研究人员进行invivo肿瘤基因治疗的优良载体(Grunhaus & Horwitz，1992)。

腺病毒系统递送外源基因进入细胞的优势包括：(1)能将其相当大部分的病毒DNA用外源DNA置换；(2)重组腺病毒的结构稳定；(3)人体注射腺病毒是安全的；(4)无已知的腺病毒感染致癌现象；(5)腺病毒能高滴度生产；(6)腺病毒具有高感染活性。

与逆转录病毒载体相比较，腺病毒载体具有更高的外源基因表达水平，并且其复制不依赖于宿主细胞基因的复制。由于腺病毒E1区的转化基因可方便地剔除，并且不影响外源基因的有效表达，因此腺病毒载体的致癌性危险是微乎其微的(Grunhaus & Horwitz，1992)。

总的来讲，腺病毒基因转移系统是一种经基因工程改造后的重组腺病毒，剔除了基因组中的E1区部分，无复制潜能，但保留了感染能力。对其基因组进行进一步缺失后，可表达较大片段的外源基因。如果同时缺失E1和E3区，可插入长达10kb的外源DNA，并能在293细胞中高滴度生长(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。也有研究报道称，腺病毒感染后，外源基因可令人惊讶地长期持续表达。

最近已对腺病毒载体介导基因转染真核细胞和实验动物的效力进行了评价。例如，在治疗患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺失这种罕见的退行性遗传疾病的小鼠时，发现腺病毒载体可以用来递送正常的OTC酶基因，但只在4/17例中检测到OTC酶的表达(Stratford-Perricaudet et al.，1991b)。因此，在大多数实验小鼠中，OTC缺陷只是得到部分纠正，而没有产生生理和表型的改变。这种结果当然不会对使用腺病毒载体治疗肿瘤产生积极影响。

在用腺病毒载体介导囊性纤维化跨膜转导调节子基因(CFTR)进入大鼠肺上皮细胞治疗囊性纤维化的研究中，虽然无法评价转移的基因在动物肺上皮细胞中的生物活性，但是也是仅仅取得部分成功(Rosenfeld et al.，1992)，CFTR蛋白在肺呼吸道细胞中的表达没能产生生理效应。

这类研究结果没能证明腺病毒可以在感染细胞中指导足够量的外源表达以取得生理效应，因此，研究者们也就不认为腺病毒系统可以用于肿瘤的基因治疗。另外，在本发明之前，普遍认为p53基因不能导入用于腺病毒生产的包装细胞，因为p53基因产物对包装细胞是有毒性作用的。由于腺病毒的早期表达蛋白E1B能与p53蛋白结合，这也被认为是腺病毒载体与p53基因不能结合在一起的一个技术上的理由。

4.构建Ad-p53及肿瘤抑制

本发明提供了一种新的、更有效的、供肿瘤基因治疗用的肿瘤抑制子与载体。这个重组病毒利用了腺病毒的优点，如高滴度生产、宽靶向感染、能有效转导、以及不整合入靶细胞基因组DNA。具体讲，本发明是一种在劳氏(Rous)肉瘤病毒启动子控制下可表达野生型p53基因的复制缺陷型、非辅助病毒依赖型的重组腺病毒。

在哺乳动物细胞中表达外源基因时，表达载体的控制功能通常由病毒提供。如通常用的启动子来自polyoma(多瘤病毒)、2型腺病毒、SV40。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为二者均可容易地从病毒的一个片段上获得，并且该片段还含有SV40病毒的复制起始原点。小一点或大一点的SV40片段都有应用，因为上面的片段中有一个从HindIII酶切位点至位于复制原点的BglI酶切位点的约250bp的序列，可根据需要选择保留或去除该250bp序列。另外，也可能经常使用，并且经常是希望使用与选用的目的基因有天然联系的启动子或调控序列，这种调控序列与宿主细胞系统的相容性很好。

复制原点可由载体中包含的来源于SV40的或其他来源(如polyoma，adeno病毒，疱疹性口炎病毒VSV，牛乳头瘤病毒BPV)的外源原点提供，也可由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体会整合入宿主细胞染色体，后者通常是足够有效的。

重组腺病毒p53的设计和构建如Fig1所示。与此相关联，我们提出了构建和鉴定这种重组腺病毒的改进方案。鉴定后，重组腺病毒p53经PCR方法进行结构确认。经分离和结构确认的重组腺病毒p53用于感染已剔除了同源p53基因的人喉癌Hep2细胞和非小细胞肺癌H1299细胞。Western印迹检测，表明外源p53蛋白呈高水平表达。

在此披露的研究结果显示，重组腺病毒p53具有肿瘤抑制特性，这表现为在肿瘤细胞内恢复p53蛋白的功能时。这些研究结果对将Ad5RSV-p53病毒子作为一种肿瘤治疗制剂提供了支持。

作为一种新的基因转移系统，重组腺病毒在基因治疗和疫苗研制中有许多潜在的应用。重组腺病毒的扩增也因而是一个重要的分子生物学工具。已有的重组腺病毒扩增方法是用磷酸钙沉淀法介导的293细胞转染及后续的转染细胞的噬斑分析。这种方法的转染效率需要提高，程序也需要简化。

5.拮抗肿瘤放、化疗副反应的改进方案

过去20年以来，肿瘤的治疗已成为研发的焦点，人们已尝试过多种肿瘤治疗方法。从实际应用来看，肿瘤治疗方法有多种，包括手术切除、放疗、化疗、以及骨髓移植(治疗某些恶性造血系统肿瘤，尤其是急性粒细胞白血病)、中医中药等。特定肿瘤的治疗方案的制定取决于该类肿瘤的本质、部位和类型。目前，手术切除仍是最有效的肿瘤治疗方法之一，约60％的肿瘤以手术为主要治疗手段。然而，作为一个完整的治疗方案，手术切除通常需要与放疗和/或化疗联合。在肿瘤为已转移的非局部肿瘤或该局部位置难以成功手术切除时，常需联合放、化疗治疗。

化疗已被证明能有效治疗某些类型的肿瘤病人，包括何杰金病、急性淋巴细胞和粒细胞白血病、睾丸癌及非何杰金氏淋巴瘤等。在其他一些类型的肿瘤，化疗能在手术前有效地缩小肿瘤体积。化疗时通常需要联合使用多种化疗药物。医学界一直在探讨和试验联合化疗的新方案。

但化疗药物除了能杀死肿瘤细胞外，也能损伤正常组织。即便已进行了广泛深入的研究，仔细地确定了化疗药物的剂量和给药程序，由于化疗药物存在固有的毒性，化疗时仍然经常出现令人不快的甚至是危险的副反应。放疗也产生类似的副作用问题。最常见的这些副作用包括恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制。这些副作用通常是但并不总是可逆的。有些抗癌药物会永久性地损伤神经系统、心、肺、肝、肾、性腺或其他器官的功能。甚至有些抗癌药物自身即是致癌剂。接受放/化疗的病人通常需同时接受预防药物或预防手段，以防因抗癌治疗导致的免疫抑制状态而带来致命性的感染。

目前，已研发了一些治疗手段来拮抗肿瘤放化疗的副作用。比如，可给予药物来减轻恶心感，给予抗生素或居住在层流病房来防治感染，必要时可通过输血来增加血细胞和血小板数量，等等。

化疗药物有很多类型，在人类肿瘤的治疗中起了很大作用。这些化疗药物包括但不仅仅限于烷化剂(如氮芥)、抗代谢药(如嘧啶类似物)、放射性同位素(如磷、碘)、激素(如雌激素、肾上腺皮质类固醇)、万能试剂(如羟基脲)及天然药物(如紫杉醇、长春碱、抗生素)。尽管前述化合物不是根治性药物，但在医疗界仍被广泛认为在肿瘤治疗中可起到抑制、缓解、迟滞和控制恶性肿瘤的作用。在这些化合物被发现有效并广泛用作临床抗增生药物的同时，也充分认识到了它们作为抗癌药物的缺点。烷化剂毒性强烈，这类药物干扰正常细胞有丝分裂和增殖的能力是致死性的。抗代谢药会导致食欲减退、进行性消瘦、抑郁、昏迷。长期给予抗代谢药会导致严重的骨髓抑制。烷化剂和抗代谢药一般都对免疫系统有抑制作用。长期给予天然药物如长春碱也会导致骨髓抑制。羟基脲和其他化学衍生物能导致肾上腺皮质类固醇及其代谢产物水平迅速降低。给予激素类或放射性同位素也是不受欢迎的，同样会对免疫系统产生抑制作用，因而削弱机体抵抗普通感染的防护能力。在大多数情况下，如果一种化疗药物能在抑制、缓解、迟滞和控制恶性肿瘤的同时还能刺激和促进病人的免疫系统功能，这将是最可取的。

化疗可一次或分几次地大剂量给予。更普遍的是，化疗药物可1-4次/天小剂量地给予，连续数周或数月。有许多细胞毒性药物用于癌症治疗，但其作用机制却普遍不清楚。

不管其作用机制如何，有效的化疗药物对肿瘤和正常组织的细胞都会同时损伤和杀死。化疗药物治疗肿瘤的成功应用依赖于其对肿瘤细胞的杀伤效应和对关键的正常组织的副作用有差异。这些副作用中，对造血细胞及白细胞的杀伤会引起感染。对骨髓的急慢性毒性也限制肿瘤化疗药物使用的主要因素。骨髓的急慢性毒性均与细胞毒药物或放疗的致死性效应导致的造血细胞(如多能干细胞和其它祖细胞)数量减少有关，并且由于细胞毒药物或放疗的致死性效应导致更多成熟骨髓成份的耗竭，又反馈性地促进干细胞分化，结果，干细胞数量进一步减少(U.S.Pat.No.5,595,973 incorporated by referenceherein in its entirety)。骨髓刺激分子和抑制分子在骨髓损伤或修复的动态变化中起决定作用(Tubiana，M.，et al.，Radiotherapy andOncology 29：1，1993)。

对肿瘤病人而言，预防或保护其免受化疗的副作用损伤，其好处是明显的。但先前减少这些副作用的许多努力都没有成功。对危及生命的副作用，预防或保护的努力都集中在改变剂量和给药程序。其他选择也正成为可能，如在化疗前先使用粒细胞克隆刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(GM-CSF)、上皮生长因子(EGF)、白介素11、促红细胞生成素、促血小板生成素、巨核细胞发育生长因子、pixykines、干细胞因子、FLT配体、以及白介素1，3，6，7以增加各组织中正常细胞的数量(参考Jimenez and Yunis，Cancer Research52：413-415；1992)。这些因子的保护机制尽管没有被完全掌握，但可能主要还是通过在化疗前增加正常的关键靶细胞的数量来对抗化疗时的数量减少，而非增加各细胞在化疗时的生存能力。

已充分认识到，细胞毒性化疗导致的急性骨髓抑制是肿瘤化疗的一个剂量限制因子(U.S.Pat.No.5,595,973)。尽管其他正常组织的功能也能被可逆地影响，但骨髓对化疗或放疗这种抗增殖特异性的治疗尤其敏感。对某些肿瘤病人而言，化疗药物产生的造血系统毒性经常限制了化疗剂量的增加。反复的或高剂量的周期性化疗可能造成严重的干细胞缺失，导致严重的长期造血功能低下和骨髓耗竭。

本发明的方法适宜于与化疗联合应用，化疗药物可以是任何类型的药物，包括但不限于环磷酰胺、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、顺铂、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、丝裂霉素C、强的松、vindesine(长春地辛)、卡铂、长春新碱。其中，细胞毒性药物也可以是能破坏增殖细胞的抗病毒化合物。关于化疗中使用的细胞毒性制剂的总论，请参见Sathe，M.eta1.，Cancer Chemotherapeutic Agents：Handbook of Clinical Data(1978)，并引用于此。

本发明的方法也特别适用于那些需要反复的或高剂量的放/化疗的病人。对某些肿瘤病人而言，化疗药物产生的毒性经常限制了化疗剂量的增加。反复的或高剂量的周期性化疗可能造成严重的干细胞缺失，导致严重的长期造血功能低下和骨髓耗竭。本发明的方法与化疗联用时，能有效降低病人的死亡率，提高血细胞计数。

该活性制剂(此处指重组腺病毒p53)，可经任何适当的途径施用，包括但不限于局部瘤内注射、腹腔内注射、膀胱内滴注、支气管内滴注、肝动脉内注射及外周静脉滴注等，各种给药方式均安全有效。目前推荐的给药方式是局部瘤内注射。局部给药的制剂配方，可使用制药领域常用的载体、佐剂及赋形剂。

该活性制剂可以制成固体形态(颗粒剂、粉剂或栓剂等)或液体形态(即溶液、悬液或乳液等)；可溶在多种溶液中，这些溶液应是无菌的、含有足够的肽类并在推荐的应用中无有害作用，且在这些条件下非常稳定，但可被强酸或强碱所降解。

该活性制剂的用药方案取决于多种因素，如肿瘤类型、年龄、体重、性别、个体医疗条件、病情、给药途径以及使用的药物配方等。

该活性制剂首选局部瘤内注射，剂量范围从1×10⁷VP-7×10¹³VP/次剂量，没有摸到最大耐受量。目前国内外进行的临床试验一般选用1×10¹²VP/次/周剂量，这一剂量足以使该制剂产生最大治疗效果而将激动剂的用量降至最低。这一方案使得治疗费用及可能出现的毒副反应均最小化。

首选方案中，剂量为1×10¹²VP/支/周的局部注射可以在放疗或者化疗前72小时开始。另一些方案中，该制剂可以多疗程反复使用。最好是患者血象(白细胞、血小板和中性粒细胞)恢复到可以接受再次化疗的水平(主治医生决定)，前一个疗程一结束紧跟着开始后一个疗程。

除活性组分外，该药物成分还可含有包括赋刑剂和辅剂等在制药学上用于将活性组分加工成实用剂型的载体。制备工艺的详尽资料参见最新出版的雷明顿制药学(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)。

下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，但对本发明不构成任何限制。

实施例1

今又生(Gendicine，重组人p53腺病毒制品)的制备

我们利用商品名为今又生的重组人p53腺病毒制品进行了临床试验。今又生详细制备过程已在中国专利(专利号：ZL 02115228.4)说明。

如图1和图2所示构建和生产重组人p53腺病毒。腺病毒载体与携带有p53基因的穿梭载体在大肠杆菌内重组，经筛选获阳性重组体。重组体在293细胞中扩增，经多步骤纯化过程获得临床级的重组人p53腺病毒制品。重组人p53腺病毒的结构稳定性鉴定结果见图3，该结果表明经多次传代后该重组腺病毒体仍结构稳定。重组人p53腺病毒在喉癌细胞Hep-2和非小细胞肺癌细胞H1299中高表达，Western印迹实验结果见图4。重组人p53腺病毒对Hep-2细胞杀伤效应的曲线示意图，以台盼蓝染色记数蓝色(死亡)细胞百分数，结果见图5。

实施例2

材料  重组人p53腺病毒注射液(今又生，Gendicine)由深圳市赛百诺基因技术有限公司提供。批号S010731，规格：1×10¹²VP/支，2ml西林瓶包装，每小盒装1支。

本临床试验为多中心、同期对照、单药开放、随机临床试验。

病人的入选标准为：签署知情同意书；经病理组织学证实为头颈部肿瘤；肿瘤经TNM分期；具有临床易于观察和局部注射用药的可测量病灶；年龄18～70岁，预计寿命至少3个月；男性和女性患者均可入选。

排除标准主要包括如下内容：患急性上呼吸道感染或因此而发热未得到控制者；观察疗效的病灶同时接受其它药物局部治疗；有严重心、肝、肺、肾疾病，有出血倾向者；孕妇和哺乳期妇女。

退出标准：因使用试验药物而出现高烧不能耐受者；出现不可预见的毒副作用而中断试验者；因患者个人原因而中途退出者。

自2001年6月至2003年5月，4家医院共完成临床试验病例155例。

临床试验方案如下：

1)基因治疗联合放疗治疗组：

每周五瘤内注射今又生1次，10¹²VP/次，第3天放疗，肿瘤病灶区采用常规或三维适形照射，予70Gy/35f/7～8w，第5周(40Gy)为第一周期完成，第8周(70Gy)为第二周期完成，第12周为采用CT确认疗效。按WHO(世界卫生组织)实体肿瘤客观疗效评定标准，计算40Gy、70Gy和确认疗效时肿瘤缩小率(％)，疗效评定为CR(完全缓解)、PR(部分缓解)、SD(稳定)、PD(进展)。

2)基因治疗联合化疗治疗组：

每周瘤内注射今又生1次，10¹²VP/次，疗程8周，共8支。在今又生瘤内注射后第3天开始化疗，DDP(顺铂)80mg/m²，静脉注射d1。5-Fu(氟脲嘧啶)500mg/m²，连续静脉注射，d1-5。

3)临床常规化验

患者入组1周内及治疗开始后，每周做1次体格检查及KPS评分和血常规、尿常规及大便常规检查；每月进行一次血生化包括血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、AST、ALT和心电图、X光胸片检查。每周按WHO抗癌药物急性与亚急性毒性反应分级标准进行评价，即轻(I)、中(II)、重(III)、威胁生命(IV)评价和记录。根据I期临床研究结果，重点观察体温变化。

4)结果分析与统计处理

全部数据的统计分析，采用SPSS11.0统计软件，按ITT检验方法，瘤灶缩小率比较采用t检验，疗效比较采用Pearson卡方检验。

5)对血、尿、便常规和肝、肾功能的影响。检查数据见表1

表1.GTRT试验组37例病人血象和血液生化检查

    检  验项目        治疗前         (A)    治疗4周       (B)       治疗8周         (C)   P值  (A-B)  (A-C)    WBC    (109/L)    HB    (g/L)    Plt    (109/L)    AST    (U/L)    ALT    (U/L)    BUN    (μmol/L)    Cr    (μmol/L)    6.81±2.10    134.05±15.08    250.49±69.67    27.59±13.70    31.14±29.39    5.51±1.12    80.59±12.37    5.48±1.47    126.03±14.73    242.19±86.74    25.51±12.82    27.84±28.44    4.83±1.21    78.64±11.21    5.41±1.58    127.28±14.51    250.58±110.33    26.08±11.16    26.76±27.06    4.80±1.66    77.53±11.41  0.003  ▲  0.040  ▲  0.893  0.701  0.835  0.046  ▲  0.698  0.002  ▲  0.095  1.000  0.829  0.734  0.110  0.429

注：^▲表示两组间比较有差别(P＜0.05)。

以上结果表明各项血常规、血生化检查在治疗前和注射今又生两周期后均在正常范围；ALT、AST、BUN和Cr值治疗前均属正常，经注射今又生两周期后仅略下降。治疗前后胸片检查和心电图检查无改变。

实施例3

基因治疗联合化疗治疗肝癌患者

重组人p53腺病毒注射液(今又生，Gendicine)同实施例1和2。

本临床试验为单中心、同期对照、单药开放、随机临床试验。

病人的入选标准为：签署知情同意书；经病理组织学证实为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)；符合《(中国常见恶性肿瘤诊治规范》中的HCC的诊断标准；具有临床易于观察和局部注射用药的可测量病灶；年龄18～75岁，预计寿命至少3个月；男性和女性患者均可入选。

排除标准主要包括如下内容：患急性上呼吸道感染或因此而发热未得到控制者；观察疗效的病灶同时接受其它药物局部治疗；有严重心、肺、肾疾病；孕妇和哺乳期妇女。

退出标准：因使用试验药物而出现高烧不能耐受者；出现不可预见的毒副作用而中断试验者；因患者个人原因而中途退出者。

自2004年3月至2004年7月，共完成基因治疗联合化疗病例35例。

1)治疗方案：

中晚期HCC共75例，男51例，女24例。

随机分为2组：

单纯肝动脉栓塞化疗(transcatheter hepatic arterialchemoembolization，TACE)组40例。常规股动脉穿刺，将导管置于腹腔动脉或肝总动脉，肠系膜上动脉或膈动脉造影，明确肿瘤数目、位置、类型、大小及供养血管、动静脉瘘情况，确定肝癌其它供血动脉，先行明胶海棉栓塞，在肝动脉注入5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)、顺铂/羟基喜树碱(DDP/HCPT)行灌注化疗，然后将导管超选至肝动脉对肿瘤的供血分支，将ADM 10mg与碘化油10-30ml充分乳化，在X-线监视下缓慢注入。TACE间隔4周进行1次，2次后评价疗效。

基因治疗联合TACE组(GT-TACE)35例。在行TACE前48-72小时在CT引导下经皮穿刺肿瘤内多点注射重组人p53腺病毒制品(今又生)，每次根据肿瘤体积大小，用量1～4×10¹²VP/次，1次/周，连续3-4次。TACE方法与单纯TACE组相同。

按WHO实体肿瘤客观疗效评定标准评定疗效。分为CR(完全缓解)、PR(部分缓解)、SD(稳定)、PD(进展)。

2)临床常规化验

患者入组1周内及治疗开始后，每周做1次体格检查及KPS(karnofsky)评分和血常规、尿常规及大便常规检查；每月进行一次血生化(BUN、肌酐、AST、ALT)和心电图、X光胸片检查。每周按WHO抗癌药物急性与亚急性毒性反应分级标准进行评价，即轻(I)、中(II)、重(III)、威胁生命(IV)评价和记录。重点观察体温变化。一般状况评价采用KPS评价方法。

3)结果分析与统计处理

全部数据采用SPSS11.0统计软件进行统计。

4)对病人白细胞、症状和KPS评分的影响

对白细胞的影响见表2。从表中可见，单纯TACE组白细胞下降明显，两组间有显著性差异，p＜0.05。

表2.白细胞下降情况(×10⁹/L)及例数(％)

    组别                   下降程度    下降.总    例数    4.0～3.0    3.0～2.0    2.0以下    GT-TACE组    TACE组    12(25.0)    8(13.3)    4(8.3)    20(33.3)    2(4.2)    11(18.3)    18(37.5)    39(65.0)

病人症状改善情况见表3。从表中可见，治疗一个月后，GT-TACE组症状改善明显，两组间有显著性差异，p＜0.05。

表3.肝癌治疗1月后临床症状观察例(％)

  例数    发热胃肠道反应  癌性疼痛缓解    GT-TACE组    TACE组    35    40    25(71.4)    18(45.0)    16(45.6)    24(60.0)    30(85.7)    21(52.5)

病人KPS评分改善情况见表4。从表中可见，治疗一个月后，GT-TACE组KPS评分有改善明显。

表4.治疗1个月后KPS评分变化

    组别例数  +20  分  +10  分  不  变  下  降升高总计(％)    GT-TACE    组    TACE组    35    40    7    9    15    10    9    8    4    13    22    (53.3)    19    (47.5)

上述结果显示，基因治疗联合化疗治疗组(GT-TACE)病人的肿瘤缩小情况、临床症状改善情况、白细胞变化、KPS评分升高均优于单纯化疗治疗组(TACE)。此外，病人还表现出食欲增加，睡眠状况改善等。表明重组人p53腺病毒制品(今又生)联合化疗治疗肝癌时，重组人p53腺病毒制品可减轻单纯采用化疗治疗肿瘤时所产生的副反应；改善病人的一般状况和精神状态等。

实施例4

单用“今又生”治疗能提高肿瘤患者生活质量

患者资料：女性，40岁。2001年确诊为左侧局部晚期乳腺癌并接受了手术治疗。方案是乳腺癌根治术，乳房切除+腋窝下淋巴结清除。在清除的12个淋巴结中有10个发现有癌细胞转移。联合放疗(45Gy/25f/25w)和化疗(Ciclofosfamid+Erubicin+5-Fluracil，9疗程)。治疗6个月后MR扫描检查发现，颈椎、胸椎和腰椎多处转移。此后15个月相继接受了Taxotere(泰索帝)、Vinoralbine化疗及新的口服肿瘤化疗药物Xeloda的治疗。在化疗的间歇期，使用了Zometa(一种二磷类药物)维持骨质稳定。但上述治疗效果欠佳。至2004年1月，患者的血象、转氨酶开始升高，全身状况开始恶化，出现周身疼痛、乏力、体重减轻、精神抑郁等症状，表明患者肿瘤已进展。

在当地医院放/化疗治疗无效后，患者在医院接受了Gendicine治疗1次，之后带药回国治疗。每次用药后都来信报告检查结果。患者接受Gendicine注射1个月后，CT和MRI检查显示过去6个月来一直在进展的肿瘤得到了控制。“药物注射当天我非常疲劳，但下一次注射前的几天里，我感觉非常好，精力旺盛，毫无疼痛感”，患者认为这是很好的迹象。Gendicine治疗3个月时，MRI扫描结果显示患者胸11、12，腰3等处病灶脂肪变性，其它转移区也未见进展。血液检查正常，胆红素水平略高。背部已无疼痛，食欲好。Gendicine治疗5个月时，患者称他们一家人正在度假，自感无不适症状，精神状态好。Gendicine治疗7个月后，MRI检查结果显示胸11椎骨瘤块已消失，其他部位的瘤灶无进展，未出现新的瘤灶。胸部X光片无阴影，血象完全正常，已无疼痛症状。精神状态好。Gendicine治疗9个月后，MRI检查结果显示肿瘤无恶化迹象。肺部X光片状况良好，血像完全正常。无疼痛症状。自我感觉较前明显好转。

实施例5

患者资料：女，60岁。确诊为侵袭性胰腺癌，肿瘤直径为5cm，生存期只有1年。由于怕承受不住化疗的毒副作用，患者决定不接受常规化疗。患者经今又生静脉注射治疗，20个剂量/8周。

治疗后经CT检查确认患者的胰腺癌病灶没有继续生长，肝脏的轻微损伤消失。经进一步观察，发现患者病灶稳定，可疑的各处损伤消失，肿大的淋巴结缩小。

结论

我们发现重组人p53腺病毒制品治疗肿瘤病人时会产生令人意想不到的作用。即联合化疗或放疗时，重组人p53腺病毒制品可减轻单纯采用化疗或放疗治疗肿瘤时所产生的副反应。

这一特性非常明显，因为注射今又生后，肿瘤病人特别是晚期肿瘤病人的身体状况明显改善。例如，病人的心理状况和精神状态变好，食欲增加。我们推测，这一效应归因于今又生对神经-内分泌-免疫系统的整体调节。因此，今又生可以增强和改善肿瘤病人各系统器官的功能，全面提高健康状况。

可能的机制如下：

今又生是经过基因工程改造的病毒颗粒。它能刺激、调节机体的神经系统、内分泌系统和免疫系统，从而产生多种神经因子、激素和细胞因子。可以从上面的实施例看出，患者经今又生注射治疗后体温升高，即发热症状。这种现象可以解释为今又生激发了患者的免疫系统。通过对神经-内分泌-免疫系统的整体调节，病人的免疫功能改善，从而有效提高抗肿瘤体液免疫和细胞免疫能力，增加NK细胞和细胞毒T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤。今又生也可调节病人的生理机能，全面改善病人的身体状况。

尽管本发明对有关今又生治疗作用的新发现，已经通过图表和例证作了较为详细的说明以便理解，但从事基因治疗的技术人员将在实践中对其做出新的修正。因此，上述描述和例证不应理解为对本发明涵盖范围的限定，详见附加声明。