一株产复合酶的菌株及用该菌株发酵生产复合酶的方法

摘要

一株产复合酶的菌株及用该菌株发酵生产复合酶的方法，属于生物工程技术领域。本发明的菌株为一株淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB－001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1314。该菌株在以玉米粉和大麦粉为复合碳源，豆饼粉为氮源的发酵培养基中能够制备具有较高酶活性的复合酶(包括β－葡聚糖酶和蛋白酶)。本发明为指导育种和最终实现工业化生产奠定基础。

说明书

技术领域

一株产复合酶的菌株及用该菌株发酵生产复合酶的方法，本发明涉及一种产复合酶(包括β-葡聚糖酶和蛋白酶)的菌株及发酵生产复合酶的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

在国外，β-葡聚糖酶最早应用于啤酒工艺，它可分解大麦及麦芽中的β-葡聚糖凝胶，降低麦汁粘度，提高麦汁的过滤速度、麦汁浸出率，减少胶状沉淀物，改善啤酒的混浊度，提高产品质量。而我国此工艺的大规模应用只是在20世纪末才开始的，效益显著。近年来，随着麦类饲料的发展，对含大麦的家畜、家禽饲料，大麦中的β-葡聚糖是一类非淀粉粘性多糖抗营养因子，在添加β-葡聚糖酶后，不仅可消除抗营养因子的影响，提高这些饲料的营养效价，而且可获得较好的社会效益。利用微生物发酵生产复合酶具有原料成本低、来源广泛等许多优点，引起了研究者广泛的兴趣。

发明内容

本发明的目的是提出一株产复合酶的菌株及用该菌株发酵生产复合酶的方法，本发明能够制备具有较高酶活性的复合酶(包括β-葡聚糖酶和蛋白酶)。

本发明的技术方案

一株产包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的复合酶的菌株，该菌株为淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1314。

利用该菌株发酵生产包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的复合酶的方法为：

斜面和种子培养基以g/L计：蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面培养再加琼脂20，pH7.0；

发酵培养基以g/L计：玉米粉36-44，大麦粉18-22，豆饼粉36-44，控制玉米粉与大麦粉的质量比为2∶1，Na₂HPO₄ 8，(NH₄)₂SO₄ 4，NH₄Cl 0.75，CaCl₂1.0，pH7.0；

培养条件为：

摇瓶发酵，250mL锥形瓶中发酵培养基为25mL，温度为35～40℃(最佳37℃)，培养基初始pH4.0～10.0(最佳7.0)，转速150～200r/min(最佳200 r/m)，发酵时间为60h；

发酵罐发酵，5L发酵罐中发酵培养基体积为3L，接种量为8％(v/v)，温度为37℃，通气量3L/L·min，搅拌转速为600r/min，发酵时间为35-40h。

以玉米粉和大麦粉以2∶1(质量比)复配作为培养基碳源时发酵产β-葡聚糖酶的活力较高。

以4％豆饼粉为氮源时发酵产β-葡聚糖酶的活力较高。

CGMCC No.1314在5L发酵罐产酶，从斜面上接一环CGMCC No.1314菌种入种子培养基(25mL/250mL锥形瓶)，在37℃、200r/min下培养12h后，以8％的接种量(v/v)接入5L罐中。5L罐中体积为3L，通气量为3L/L·min，搅拌转速为600r/mim，发酵温度为37℃。发酵设备为上海保兴生物设备工程有限公司的5L自动控制发酵罐(Biotech-2001)。发酵时间为35-40h，β-葡聚糖酶酶活最高值为123U/mL，蛋白酶最高酶活为3800U/mL。

在发酵液中添加不同的表面活性剂对产酶有一定影响，以大麦粉2％、玉米粉4％和豆饼粉4％及无机盐离子组成的基础培养基中，分别加入1％含量的不同表面活性剂SDS、Tween-80、聚乙二醇或消泡剂聚醚，摇瓶培养，结果表明，Tween-80，聚乙二醇或消泡剂聚醚均能促进β-葡聚糖酶的生成，尤以消泡剂聚醚的效果最为显著，比对照酶活提高了约20％。

分析方法

将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式高速离心机(TGL-16G)中，于10000r/min下离心5min，取上清夜备用。

β-葡聚糖酶分析方法：0.1mL稀释酶液加0.4mL底物，于40℃反应10min，每个样品中加入3ml沉淀液，离心，测清液在590nm处的吸收值A，同样以0.1mL蒸馏水代替酶液做空白。

酶活计算公式：酶活(u/mL)＝[(A₅₉₀+0.001238)/0.8903]×n

                       n-发酵液稀释倍数

β-葡聚糖酶定义：1ml发酵液于40℃、pH6.5，每分钟分解大麦β-葡聚糖产生1μmol还原糖定义为1个酶活单位。

中性蛋白酶分析方法：Folin-酚法测定。

本发明的有益效果：所提供的复合酶产生菌CGMCC No.1314，能以大麦粉、玉米粉、豆饼粉等廉价原料为发酵基质发酵产生具有高β-葡聚糖酶酶活性的复合酶，降低了生产成本；5L罐试验中通过提高转速大大缩短了发酵周期。以上发现为指导设计育种和通过代谢调控优化发酵条件提高产量奠定了基础，亦为降低复合酶的生产成本提供了可能，促进了复合酶在工业生产中的实际应用进程。

附图说明

图1不同的表面活性剂对CGMCC No.1314产酶的影响

图2 CGMCC No.1314在5L发酵罐中的产酶过程曲线。酶活单位为U/mL。生物材料样品保藏

一株产包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的复合酶的菌株，该菌株为淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1314，保藏日期为2005年2月2日。

具体实施方式

以下实例更为详细地解释了本发明中的某些关键点，为更好的理解本发明提供了依据。

实施例1

分别选取几种不同的碳源，在其发酵工艺中(如说明书所述)相同的情况下进行发酵，CGMCC No.1314产β-葡聚糖酶和蛋白酶的结果见表1。

表1  不同碳源对CGMCC No.1314产β-葡聚糖酶及蛋白酶的影响

    碳源 β-葡聚糖酶相对酶活％    蛋白酶相对酶活％    大麦粉+玉米粉 100    100    大麦粉  92    56    玉米粉  93    123    葡萄糖  83    105    蔗糖  68    66    甘油  22    72    乳糖  42    81    淀粉  56    299

结果显示以玉米粉和大麦粉(质量比2∶1)复配为碳源时，产β-葡聚糖酶的能力较高。

实施例2

以玉米粉和大麦粉(质量比2∶1)复配为碳源，分别选择不同的氮源，在其发酵工艺(如说明书所述)相同的情况下，进行发酵，CGMCC No.1314产β-葡聚糖酶和蛋白酶的结果见表2。

 表2不同氮源对CGMCC No.1314产β-葡聚糖酶及蛋白酶的影响

    氮源β-葡聚糖酶相对酶活/％   蛋白酶相对酶活/％    (NH₄)₂SO₄42   72    NH₄Cl40   35    NH₄NO₃50   5    豆饼粉100   100    玉米粉25   80    蛋白胨78   11    牛肉膏75   6

结果显示，4％的豆饼粉作为氮源时，酶活较高。

实施例3

不同表面活性剂对产酶的影响

以大麦粉2％、玉米粉4％和豆饼粉4％及无机盐离子组成的基础培养基中，分别加入1％含量的不同表面活性剂SDS、Tween-80、聚乙二醇或消泡剂聚醚，摇瓶培养，结果表明，Tween-80，聚乙二醇或消泡剂聚醚均能促进β-葡聚糖酶的生成，尤以消泡剂聚醚的效果最为显著，比对照酶活提高了约20％。

实施例4

CGMCC No.1314在5L发酵罐产酶，从斜面上接一环CGMCC No.1314菌种入种子培养基(25mL/250mL锥形瓶)，在37℃、200r/min下培养12h后，以8％的接种量(v/v)接入5L罐中。5L罐中体积为3L，通气量为3L/(L·min)，搅拌转速为600r/mim，发酵温度为37℃。发酵设备为上海保兴生物设备工程有限公司的5L自动控制发酵罐(Biotech-2001)。发酵时间为35-40h，β-葡聚糖酶酶活最高值为123U/mL，蛋白酶最高酶活为3800U/mL。