大赖草的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物

摘要

本发明公开了大赖草的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。获取大赖草DNA指纹图谱的方法，包括以下步骤：(1)用EcoRI和MseI双酶切大赖草的基因组DNA，以所得的双酶切片段为模板，在序列表中SEQ ID №：13和SEQ ID №：14的DNA序列引导下进行非选择性预扩增；(2)以步骤(1)中得到的非选择性预扩增产物为模板，在选择性扩增引物对中的任意一对引导下进行选择性扩增，(3)将步骤(2)中得到的选择性扩增产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染法显示大赖草的DNA指纹图谱。本发明的大赖草DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富，将在大赖草种子纯度鉴定、大赖草基因作图和分子标记辅助育种等领域中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物，特别涉及大赖草的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。

背景技术

赖草属是小麦等农作物的近缘属，包括许多可以与小麦杂交的种。赖草属植物常具有发达的横走根茎，自交不亲和性变异大，存在着丰富的遗传变异，对改良农作物具有重要的资源价值。大赖草(Leymus racemosus(Lam.)Tzvelve)是赖草属的多年生牧草，其基因组是2n＝4x＝28，即NsNsXmXm。大赖草的分布区位于欧亚大陆。因为具有较强的适应性而被广泛地用于草原建设，也常用来与小麦杂交以改善后者的抗逆性。

随着PCR技术的日益完善，许多基于PCR的新技术大量涌现，其中，AFLP分子标记技术在农作物种子纯度鉴定、植物种属及品种亲缘关系分析、植物基因作图和分子标记辅助育种等领域具有巨大应用潜力。为了有效地开发利用大赖草的资源优势，需要建立大赖草的AFLP分子标记技术体系。

发明创造内容

本发明的目的是提供大赖草的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物。

本发明所提供的大赖草DNA指纹图谱，可由下述方法得到：

(1)用EcoRI和MseI双酶切大赖草的基因组DNA，以所得的双酶切片段为模板，在序列表中SEQ ID №：13和SEQ ID №：14的DNA序列引导下进行非选择性预扩增；

(2)以步骤(1)中得到的非选择性预扩增产物为模板，在下述引物对中的任意一对引导下进行选择性扩增：

1)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：5的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：6的DNA序列；

3)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：7的DNA序列；

4)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：8的DNA序列；

5)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：9的DNA序列；

6)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：10的DNA序列；

7)序列表中SEQ ID №：1和SEQ ID №：11的DNA序列；

8)序列表中SEQ  ID №：1和SEQ ID №：12的DNA序列；

9)序列表中SEQ  ID №：2和SEQ ID №：5的DNA序列；

10)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：6的DNA序列；

11)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：7的DNA序列；

12)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：8的DNA序列；

13)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：9的DNA序列；

14)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：10的DNA序列；

15)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：11的DNA序列；

16)序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：12的DNA序列；

17)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：5的DNA序列；

18)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：6的DNA序列；

19)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：7的DNA序列；

20)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：8的DNA序列；

21)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：9的DNA序列；

22)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：10的DNA序列；

23)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：11的DNA序列；

24)序列表中SEQ ID №：3和SEQ ID №：12的DNA序列；

25)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：5的DNA序列；

26)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：12的DNA序列；

27)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：7的DNA序列；

28)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：8的DNA序列；

29)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：9的DNA序列；

30)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：10的DNA序列；

31)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：11的DNA序列；

32)序列表中SEQ ID №：4和SEQ ID №：6的DNA序列。

(3)将步骤(2)中得到的选择性扩增产物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染法显示大赖草的DNA指纹图谱。

序列表中的SEQ ID №：1至4的DNA序列由18个碱基组成，SEQ ID №：5至12的DNA序列由19个碱基组成，SEQ ID №：13至14的DNA序列由16个碱基组成。

其中，步骤(1)中所述大赖草的基因组DNA可来自大赖草的任何器官，最好来自幼嫩叶片。步骤(2)中用于进行所述选择性扩增的引物对优选为步骤(2)中的1)至26)中的引物对中的任意一对。所述非选择性预扩增和选择性扩增的反应体系中的Mg²⁺浓度均为30-75mM，Taq DNA聚合酶浓度均为1.0-1.5U。步骤(3)中所述SDS聚丙烯酰胺凝胶的浓度为5.2-6.8％。

上述方法中，所述非选择性预扩增和选择性扩增均为PCR扩增。所述非选择性预扩增的反应程序可为94℃进行3min，94℃进行30sec，56℃进行30sec，72℃进行1min，68℃进行10min，共30个循环。所述选择性扩增的反应程序为94℃进行1min，94℃进行30sec，65℃进行30sec，72℃进行1min，共12个循环；再按以下循环程序进行28个循环：94℃进行40s、56℃进行40s、72℃进行1min、72℃进行10min。

本发明的32个EcoRI-MseI引物组合的多态性带数变化范围为23-103条，优化后的引物组合有26个，每个组合的多态性带数等于或大于50。本发明获得的大赖草DNA指纹图谱多态性高、指纹丰富，将在大赖草种子纯度鉴定、大赖草基因作图和分子标记辅助育种等领域中发挥重要作用。

附图说明

图1为20对引物组合获得的AFLP DNA指纹图谱

具体实施方式

实施例1、用AFLP分子标记技术获取大赖草的DNA指纹图谱

操作流程为：提取DNA→双酶切→引物设计→DNA扩增→电泳→银染显色→获得清晰指纹图谱→统计分析结果。具体方法和过程如下：

1、DNA提取

本实施例采用的大赖草来自我国青海。在植株生长旺盛期，将幼嫩叶片剪下立即放入液氮冷冻储存，每份样品0.5克。按照Rogers and Bendich(Plant Mol.Biol.19855：69-76)的CTAB法提取基因组DNA。

2、双酶切及连接

用限制性内切酶EcoRI和MseI双酶切步骤1中的基因组DNA。反应体系包括：2μl 10×缓冲液(MseI的缓冲液II)；EcoRI(5U/μl)和MseI(10U/μl)各0.5μl；16μl ddH₂O；共20μl反应体系。37℃过夜酶切。

37℃连接5小时(20μl酶切反应液；2μl 10×缓冲液；0.2μl 10mmATP；0.33μlT₄DNA链接酶(3U/μl来自Promega Co.)；5pmol/μl EcoRI及5pmol/μlMseI接头各1μl；3.47μl ddH₂O)。

3、PCR反应

(1)非选择性预扩增

非选择性预扩增可为下一步的选择性扩增提供更为合适的模板，也能通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板的质量及数量。预扩增引物如下：

EcoRI(EOO)：5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；

MseI(MOO)：5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’。

反应体系20μl，其中包括2μl连接反应物(连接反应物包括：30μl步骤2中的酶切反应液；2μl 10×缓冲液；0.2μl 10mmATP；0.33μl T₄DNA链接酶(3U/μl来自Promega Co.)；5pmol/μl EcoRI及5pmol/μl MseI接头各1μl；3.47μl ddH₂O)；各0.6μl的EcoRI及MseI预扩增引物(50ng/μl)；0.2μl dNTP(10m M)；O.2μl TaqDNA聚合酶(5U/μl来自Promega Co.)；2μl 10×PCR缓冲液(无MgCl₂)；1.2μlMgCl₂(25mM)；13.2μl ddH₂O)。预扩增反应程序如下：94℃进行3min，94℃进行30sec，56℃进行30sec，72℃进行1min，68℃进行10min，共30个循环。PCR仪型号为PE9700 thermocycler(Perkin Elmer Corp.，NORWALK，CT，U.S.A)。预扩增产物用ddH₂O稀释20倍进行下一个PCR反应。

(2)选择性扩增

以非选择性扩增反应的产物为模板，所用引物对加入3个选择性碱基(MseI引物)或加入2个选择性碱基(EcoRI引物)：

          EcoRI(+2)，5’-GACTGCGTACCAATTCAN-3’；

          MseI(+3)，5’-GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’。

具体的接头及引物序列如表1所示。

          表1：AFLP反应接头及选择性引物

   引物或接头    序列   EcoRI接头    MseI接头    EcoRI选择性引物   E11   E12   E13   E14   MseI选择性引物   M47   M48   M49   M50  5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’   ，3’-CTGACGCATGGTTAA-5’    5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’    3’-GTAGTCACGTACGC-5’      5’-GACTGCGTACCAATTC AA-3’    5’-GACTGCGTACCAATTC AC-3’    5’-GACTGCGTACCAATTC AG-3’    5’-GACTGCGTACCAATTC AT-3’     5’GATGAGTCCTGAGTAA CAA-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CAC-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CAT-3’    M59    M60    M61    M62  5’GATGAGTCCTGAGTAA CTA-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CTC-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CTG-3’    5’GATGAGTCCTGAGTAA CTT-3’

采用2+3引物组合共选用64个AFLP引物对。每个选择性扩增反应总体积为20μl，其中包括0.2μl dNTP(10m M)、0.2μl Taq DNA聚合酶(5U/μl来自Promega Co.)、2μl 10×PCR缓冲液(无MgCl₂)、1.2μl MgCl₂(25mM)、0.4μl模板(10mM)、0.4μlEcoRI选择性扩增引物(25ng/μl)、1.2μl MseI选择性扩增引物(25ng/μl)、14.4μlddH₂O)。选择性扩增反应程序如下：94℃进行1min，94℃进行30sec，65℃进行30sec，72℃进行1min，共12个循环；再按以下循环程序进行28个循环：94℃进行40s、56℃进行40s、72℃进行1min、72℃进行10min；最后4℃保温。其中，PCR仪器的型号与步骤(1)同。

4、电泳

将步骤3中得到的选择性扩增产物在95℃变性5min，然后在6％的SDS聚丙烯酰胺胶上电泳。其中，上样量为4.5ul(含1.8ul上样缓冲液：98％甲酰氨，10mM乙二胺四乙酸(pH8.0)，0.25％二甲苯青，0.25％溴酚蓝)。聚丙烯酰胺胶大小0.4mm×50cm。电泳条件80W下大约2.5h，电泳缓冲液0.5×TBE(上槽液)及1×TBE(下槽液，10×TBE：90mM Tris-Cl，pH8.0，90mM硼酸，2mM乙二胺四乙酸，pH8.0)。

5、染色显示

扩增产物用银染的方法显示(J.Genet.Breed.1997，51：175-177.)。然后用molecular Imager FX(Bioi-RAD)扫描胶板，并进行条带的统计。AFLP分子量标记选用MspI/PBR322 marker。结果表明采用2+3引物组合共选用64个AFLP引物对，其中的32对可以获得重复性好的多态性，如表2所示，Leymus racemosus的AFLP结果共计出现2178条带，变化范围为23-103条带。条带出现最少的引物组合是E14M61，而E11M47和E13M59出现条带最多。可以获得重复性好的多态性的32对引物组合中每对引物组合平均产生68.1条带。不同的引物组合产生的带数差别很大。EcoRI引物E11，E12，E13，E14与八个MseI引物进行组合后分别获得的指纹条带数是643、565、675、295个。引物M47、M49、M50、M60、M61和M62与四个不同EcoRI引物组合获得的条带数分别是290、235、269、261、304及265。相同的EcoRI引物与不同的MseI引物组合产生的带数与位置是不同的，反之亦然。图1中，M为MspI消化的pBR322 DNA(622bp-9bp)；1为E14M61；2为E14M47；3为E13M48；4为E14M49；5为E13M47；6为E12M62；7为E12M47；8为E11M49；9为E11M48；10为E12M61；11为E13M60；12为E11M62；13为E12M60；14为E11M61；15为E12M49；16为E13M61；17为E11M50；18为E11M47；19为E13M50；20为E11M59。

          表2EcoRI-MseI引物组合在大赖草上获得的AFLP条带数统计

         引物组合   条带数        引物组合   条带数  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E11(AA)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  E12(AC)  M47(CAA)  M48(CAC)  M49(CAG)  M50(CAT)  M59(CTA)  M60(CTC)  M61(CTG)  M62(CTT)  M47(CAA)  M48(CAC)  M49(CAG)  M50(CAT)  M59(CTA)  M60(CTC)  M61(CTG)  M62(CTT)   103   89   62   74   85   60   96   74   59   75   70   72   66   78   95   50  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E13(AG)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  E14(AT)  M47(CAA)  M48(CAC)  M49(CAG)  M50(CAT)  M59(CTA)  M60(CTC)  M61(CTG)  M62(CTT)  M47(CAA)  M48(CAC)  M49(CAG)  M50(CAT)  M59(CTA)  M60(CTC)  M61(CTG)  M62(CTT)   70   90   58   83   102   96   90   86   58   23   45   40   24   27   23   55

实施例2、用AFLP分子标记技术获取大赖草的DNA指纹图谱中的PCR条件的优化

在试验过程中，PCR条件优化很重要，尤其是合适的Mg²⁺浓度，为此做了一系列Mg²⁺的浓度梯度：20、30、50、75及90mM，并对来自不同公司的DNA聚合酶(Promegaand TaKaRa)进行了优化试验。研究结果显示，30-75mM的Mg²⁺效果最好；1.0-1.5U的Taq酶效果较好；而且Promega的DNA聚合酶产品比较经济实用。

                         序列表

<160>14

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gactgcgtac caattcaa    18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gactgcgtac caattcac    18

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

gactgcgtac caattcag    18

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gactgcgtac caattcat    18

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gatgagtcct gagtaacaa    19

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gatgagtcct gagtaacac    19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>    

<400>7

gatgagtcct gagtaacag    19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

gatgagtcct gagtaacat    19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

gatgagtcct gagtaacta    19

<210>10

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

gatgagtcct gagtaactc    19

<210>11

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

gatgagtcct gagtaactg    19

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

gatgagtcct gagtaactt    19

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

gactgcgtac caattc    16

<210>14

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

gatgagtcct gagtaa    16